CRECIMIENTO DE CRECIMIENTO DE POBLACIONES POBLACIONES MICROBIANASMICROBIANAS

CONCEPTOSCONCEPTOS::

Crecimiento en sistemas vivos Crecimiento en sistemas vivos :: Incremento equilibrado de la masa de un organismoIncremento equilibrado de la masa de un organismo

Crecimiento de poblaciones microbianasCrecimiento de poblaciones microbianas:: Incremento en el número de células del microorganismoIncremento en el número de células del microorganismo Aumento de la masa microbiana totalAumento de la masa microbiana total

Parámetros poblacionales característicosParámetros poblacionales característicos:: Tiempo de generación (g): Período en el que se duplica la Tiempo de generación (g): Período en el que se duplica la población, en masa o número de células del microorganismopoblación, en masa o número de células del microorganismo Velocidad de crecimiento (dx/dt): Incremento en el número Velocidad de crecimiento (dx/dt): Incremento en el número de células o biomasa que ocurren por unidad de tiempode células o biomasa que ocurren por unidad de tiempo

Eventos Bioquímicos Asociados al Eventos Bioquímicos Asociados al CrecimientoCrecimiento::

Reacciones generadoras de energíaReacciones generadoras de energía

Reacciones biosintéticas de precursoresReacciones biosintéticas de precursores

Polimerización para formar macromoléculasPolimerización para formar macromoléculas

Ensamblado supramacromolecularEnsamblado supramacromolecular

División celularDivisión celular

¿Cómo se dividen las células ¿Cómo se dividen las células microbianas?microbianas?

Microorganismos Eucariotas:Microorganismos Eucariotas: - Mitosis - Meiosis- Mitosis - Meiosis

Microorganismos Procariotas:Microorganismos Procariotas: - - Fisión BinariaFisión Binaria

FISIÓN BINARIA EN UN BACILOFISIÓN BINARIA EN UN BACILO-INICIO DE LA DIVISIÓNINICIO DE LA DIVISIÓN

- REPLICACIÓN DEL ADNREPLICACIÓN DEL ADN- CRECIMIENTO LONGITUDINALCRECIMIENTO LONGITUDINAL

- SEGREGACIÓN DE CROMOSOMASSEGREGACIÓN DE CROMOSOMAS- ELONGACIÓN FINALELONGACIÓN FINAL

- FORMACIÓN DEL SEPTOFORMACIÓN DEL SEPTO- EXTENSIÓN DE LA ENVOLTURAEXTENSIÓN DE LA ENVOLTURA

- TABICACIÓN COMPLETATABICACIÓN COMPLETA

- SEPARACIÓN DE CÉLULAS HIJASSEPARACIÓN DE CÉLULAS HIJAS

Proteínas Esenciales para la División Proteínas Esenciales para la División Celular en ProcariotasCelular en Procariotas

Fts (filamentous temperature sensitive)Fts (filamentous temperature sensitive) - FtsZ (- FtsZ (E. coliE. coli) forma un anillo en el plano ) forma un anillo en el plano

de división celular (divisoma)de división celular (divisoma) - Homología con tubulina de eucariotas- Homología con tubulina de eucariotas

Proteínas de síntesis del peptidoglucanoProteínas de síntesis del peptidoglucanoDirigen la síntesis de membrana y paredDirigen la síntesis de membrana y pared Se alcanza longitud umbral (doble)Se alcanza longitud umbral (doble) Se produce constricción (septo)Se produce constricción (septo) Separación de células hijasSeparación de células hijas

Estructura del DivisomaEstructura del Divisoma

Proteínas del divisoma

Anillo FtsZ Membranacitoplásmica

Plano de división

Proteínas Determinantes de la Forma Proteínas Determinantes de la Forma Celular en ProcariotasCelular en Procariotas

Proteína MreB de Proteína MreB de BacteriaBacteria y y ArchaeaArchaea

Homología con actina de eucariotasHomología con actina de eucariotas

Forma bandas filamentosas en espiral Forma bandas filamentosas en espiral bajo la membrana plasmáticabajo la membrana plasmática

Los cocos carecen de MreBLos cocos carecen de MreB

Eventos en la Síntesis de Pared Celular Eventos en la Síntesis de Pared Celular durante la Fisión Binariadurante la Fisión Binaria

Agregado de nueva pared a la existenteAgregado de nueva pared a la existente

Acción de autolisinas (simil lisozima)Acción de autolisinas (simil lisozima)

Formación de bandas de pared (cicatriz)Formación de bandas de pared (cicatriz)

Fenómenos coordinados:Fenómenos coordinados:

- control sobre la presión de turgencia- control sobre la presión de turgencia

- se evita autólisis- se evita autólisis

Síntesis de Pared Celular durante la Síntesis de Pared Celular durante la Fisión BinariaFisión Binaria

Zonas de crecimiento

Anillo FtsZ

Bandas de pared

Streptococcus hemolyticus

¿Cómo medimos el crecimiento ¿Cómo medimos el crecimiento microbiano?microbiano?

Midiendo la masa de la población microbiana Midiendo la masa de la población microbiana en su conjunto:en su conjunto:

- Medida de biomasa poblacional- Medida de biomasa poblacional

Determinando el número de individuos que Determinando el número de individuos que componen la población:componen la población:

- Recuento del número de células microbianas- Recuento del número de células microbianas

MEDIDA DE LA BIOMASAMEDIDA DE LA BIOMASA MÉTODOS DIRECTOSMÉTODOS DIRECTOS1) Determinación del peso húmedo1) Determinación del peso húmedo2) Determinación del peso seco2) Determinación del peso seco

3) Determinación del nitrógeno total3) Determinación del nitrógeno total (Kjeldahl)(Kjeldahl)4) Determinación de un componente característico4) Determinación de un componente característico

 MÉTODOS INDIRECTOSMÉTODOS INDIRECTOS1) Medida del consumo de nutrientes o de producción 1) Medida del consumo de nutrientes o de producción

de algún metabolito por unidad de tiempode algún metabolito por unidad de tiempo 2) Métodos turbidimétricos (ópticos)2) Métodos turbidimétricos (ópticos)

Medidas turbidimétricasMedidas turbidimétricas

Real

Recuento del número de células Recuento del número de células microbianasmicrobianas

MÉTODOS DIRECTOSMÉTODOS DIRECTOS: Número Total de Células: Número Total de Células

1)1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser o NeubauerCámara de recuento de Petroff-Hauser o Neubauer

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter)2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter)

MÉTODOS INDIRECTOSMÉTODOS INDIRECTOS: Número de Células Viables: Número de Células Viables

1)1) Recuento por dilución seriada y siembra sobre Recuento por dilución seriada y siembra sobre

medio sólidomedio sólido

2)2) Recuento por dilución seriada en medio líquidoRecuento por dilución seriada en medio líquido

3) Recuento sobre filtros3) Recuento sobre filtros

Cámara de recuento de Petroff-Hauser o Cámara de recuento de Petroff-Hauser o NeubauerNeubauer

Cámara de Petroff-HausserCámara de Petroff-Hausserexcavación con 0.02 mm de profundidadexcavación con 0.02 mm de profundidad áárea de 1 mmrea de 1 mm22

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/mln x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml

Sólo sirve para suspensiones relativamente Sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml)concentradas (>10x106 céls./ml)

Recuento de células viables por dilución Recuento de células viables por dilución seriada y siembra en medio sólidoseriada y siembra en medio sólido

Muestra Muestra originaloriginal

Mezclar con medio Mezclar con medio agarizado fundidoagarizado fundidoy vertiry vertir

Recuento de células viables por dilución Recuento de células viables por dilución seriada y siembra en medio sólidoseriada y siembra en medio sólido

Recuento de células viables utilizando Recuento de células viables utilizando filtros incubados en medio sólidofiltros incubados en medio sólido

¿Qué modelos matemáticos ¿Qué modelos matemáticos describen el crecimiento microbiano?describen el crecimiento microbiano?

Población se origina a partir de una sola Población se origina a partir de una sola

célula microbianacélula microbiana

Condiciones óptimas para multiplicarseCondiciones óptimas para multiplicarse

Tiempo generación (g) es constante:Tiempo generación (g) es constante:

p. ej. 30 minutosp. ej. 30 minutos

Crecimiento ExponencialCrecimiento Exponencial

nnN = 2N = 2

n = n = tt/g/g

t/gt/gN = 2N = 2

nnN = NN = No o 22

Crecimiento ExponencialCrecimiento Exponencial

t/gt/g N = NN = Noo 2 2

log N/Nlog N/No o = = tt/g log 2/g log 2

t log 2 t log 2 ……

log N – log Nlog N – log Noo

log 2 log 2 ……

pendientependiente

g =g =

g =g =

5 x 107

Tiempos de generación de diferentes Tiempos de generación de diferentes bacterias en condiciones específicasbacterias en condiciones específicas

¿Cómo se comportan las ¿Cómo se comportan las poblaciones microbianas en poblaciones microbianas en

crecimiento?crecimiento?

Sistemas de cultivo en el laboratorioSistemas de cultivo en el laboratorio

Curvas de crecimientoCurvas de crecimiento

CINÉTICA DEL CRECIMIENTO DE CINÉTICA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES MICROBIANASPOBLACIONES MICROBIANAS

Sistemas de cultivo en el laboratorio:Sistemas de cultivo en el laboratorio:Cultivo cerrado, monofásico, ó en “lote”Cultivo cerrado, monofásico, ó en “lote”

- sistema cerrado- sistema cerrado - medio de cultivo no renovado- medio de cultivo no renovado

Cultivo continuoCultivo continuo - sistema abierto- sistema abierto - ingreso constante de medio fresco- ingreso constante de medio fresco - egreso constante de cultivo- egreso constante de cultivo

1

2

3

4

5

6

7

Fases de crecimiento en un cultivo cerradoFases de crecimiento en un cultivo cerrado

Exponencialó logarítmica

Estacionaria

Latenciaó lag

Muerte

Tiempo

Log

núm

ero

de c

élul

as v

iabl

es

Eventos que definen las fases de Eventos que definen las fases de crecimiento en un cultivo cerradocrecimiento en un cultivo cerrado

Fase de latencia:Fase de latencia: Las células:Las células: - carecen de componentes esenciales para crecer- carecen de componentes esenciales para crecer - deben recuperarse de condiciones desfavorables- deben recuperarse de condiciones desfavorables

Fase exponencial:Fase exponencial: - las células están en condiciones óptimas para crecer- las células están en condiciones óptimas para crecer - el tiempo de generación es mínimo- el tiempo de generación es mínimo

Eventos que definen las fases de Eventos que definen las fases de crecimiento en un cultivo cerradocrecimiento en un cultivo cerrado

Fase estacionaria:Fase estacionaria: - depleción de nutrientes esenciales para crecer- depleción de nutrientes esenciales para crecer - acumulación de productos tóxicos de desecho- acumulación de productos tóxicos de desecho - se estabiliza la población:- se estabiliza la población: población en división activa = población muriendopoblación en división activa = población muriendo

Fase de muerteFase de muerte - la cinética de muerte es exponencial- la cinética de muerte es exponencial - puede haber lisis celular- puede haber lisis celular

Fases de crecimiento en un cultivo cerradoFases de crecimiento en un cultivo cerrado- Densidad ópticaDensidad óptica- Recuento de viablesRecuento de viables

Curva diáuxica de crecimientoCurva diáuxica de crecimiento

E. ColiE. Coli creciendo en un medio con concentración creciendo en un medio con concentración limitante de glucosa y conteniendo lactosalimitante de glucosa y conteniendo lactosa

Cinética del CrecimientoCinética del Crecimiento MicrobianoMicrobiano en en Cultivo ContinuoCultivo Continuo

Sistema en equilibrio de composición constanteSistema en equilibrio de composición constante por largos períodos:por largos períodos: - composición química del medio- composición química del medio - densidad celular - densidad celular - estado fisiológico de las células- estado fisiológico de las células - volumen constante- volumen constanteSistema abierto:Sistema abierto: - ingreso constante de medio fresco- ingreso constante de medio fresco - egreso constante de cultivo- egreso constante de cultivo

SR

D = f/v

v

Reservorio de medio fresco, con un sustrato limitante (SR)

Válvula de control del flujo

Suministro de aire

Filtro de aire

Cámara de cultivo

Receptor del efluente rebosado

EL QUIMIOSTATO

Características del QuimiostatoCaracterísticas del QuimiostatoParámetros de control:Parámetros de control:

- flujo del medio de cultivo fresco que ingresa (F)- flujo del medio de cultivo fresco que ingresa (F) - volumen de cultivo en el quimiostato (V)- volumen de cultivo en el quimiostato (V) - velocidad de dilución D = F / V- velocidad de dilución D = F / V - concentración nutriente esencial del medio fresco- concentración nutriente esencial del medio fresco

Controles del crecimiento microbiano a través de:Controles del crecimiento microbiano a través de: - la velocidad de dilución:- la velocidad de dilución: controla la velocidad de crecimiento (ó g )controla la velocidad de crecimiento (ó g ) - la concentración limitante del nutriente esencial:- la concentración limitante del nutriente esencial: controla la densidad celular (X)controla la densidad celular (X)

Permite mantener una población microbiana en Permite mantener una población microbiana en fase exponencial por tiempos prolongadosfase exponencial por tiempos prolongados

x

DC DM

Tiempo deGeneración

Densidad celular o biomasa

Velocidad de dilución (h-1) Lavado

Tiem

po d

e ge

nera

ción

(h)

Den

sida

d ce

lula

r o b

iom

asa

(g/l)

I--------- Equilibrio--------I

Parámetros en un cultivo cerradoParámetros en un cultivo cerrado

Tiempo de generación

Concentraciónde nutriente

Densidad celular o biomasa

Velocidad de dilución

Valo

r med

ido

Relaciones en un Quimiostato en Equilibrio

Aplicaciones del quimiostatoAplicaciones del quimiostatoProvisión de células en fase exponencial para:Provisión de células en fase exponencial para:

- Estudios fisiológicosEstudios fisiológicos- Reproducibilidad de condicionesReproducibilidad de condiciones

Simulación de condiciones naturalesSimulación de condiciones naturales- Baja concentración de nutrientesBaja concentración de nutrientes- Competencia poblaciones mixtasCompetencia poblaciones mixtas

Enriquecimiento de poblaciones mixtasEnriquecimiento de poblaciones mixtas- Establecimiento de condiciones favorables para uno - Establecimiento de condiciones favorables para uno

de los microorganismosde los microorganismos

Medio fresco desde reservorio

Válvula para controlar el flujo

Flujo (en ml/h)

Flujo (en ml/h)

v x

Pérdida neta de células: -dx/dt = x·D

Crecimiento bruto: dx/dt = x· μ

Crecimiento neto: dx/dt = x· μ - x·D = = x (μ-D)

En equilibrio μ = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante

D = f/v (en h-1)

Aire estéril u otro gas Atmósferagaseosa

Fermentador

Cultivo

Rebalse

Efluente con células microbianas

Expresión matemática del Expresión matemática del crecimiento en cultivos cerradoscrecimiento en cultivos cerrados

Expresión matemática del crecimiento Expresión matemática del crecimiento exponencialexponencial

Velocidad específica de crecimiento

Valo

rVa

lor d

e

Factores Ambientales que afectan Factores Ambientales que afectan el crecimiento de poblaciones el crecimiento de poblaciones

MicrobianasMicrobianas

Temperaturas CardinalesTemperaturas Cardinales

Rangos Temperaturas óptimasRangos Temperaturas óptimas

Efecto del pHEfecto del pH

Actividad de aguaActividad de agua

Relaciones microbianas con el oxígeno

Relaciones microbianas con el oxígeno

Disponibilidad de oxígenoDisponibilidad de oxígeno

AerobioEstricto

AerobioFacultativo

AnaerobioEstricto

Microaerófilo AnaerobioAerotolerante

Formas Tóxicas del oxígenoFormas Tóxicas del oxígeno

Enzimas detoxificantesEnzimas detoxificantes

Cultivo de AnaerobiosCultivo de Anaerobios

Curva diáuxica: represión por catabolitoCurva diáuxica: represión por catabolito

La glucosa reprime la síntesis de cAMP, nucleótido necesario para la La glucosa reprime la síntesis de cAMP, nucleótido necesario para la

iniciación de la transcripción de sistemas de enzimas inducibles, iniciación de la transcripción de sistemas de enzimas inducibles,

incluido el operón lactosaincluido el operón lactosa

Se requiere cAMP para activar una proteína alostérica denominada Se requiere cAMP para activar una proteína alostérica denominada

CAP CAP ((catabolite activator proteincatabolite activator protein))

CAP activado se une al promotor y estimula la unión de la CAP activado se une al promotor y estimula la unión de la

RNApolimerasa al promotor para iniciar la transcripciónRNApolimerasa al promotor para iniciar la transcripción

Para promover efectivamente la transcripción de los genes del operón Para promover efectivamente la transcripción de los genes del operón

lac se necesita lactosa para inactivar al represor lac y cAMP para lac se necesita lactosa para inactivar al represor lac y cAMP para

unirse a CAPunirse a CAP

Proteínas alostéricasProteínas alostéricas

Con sitio efector negativoCon sitio efector negativo Con sitio efector positivoCon sitio efector positivo