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TÉCNICAS ANALÍTICAS USADAS EN EL CONTROL DE CALIDAD DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS

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CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS ANALÍTICAS

Técnicas de separación Técnicas cromatográficas Electroforesis capilar

Otras técnicas instrumentales Espectrofotometría ultravioleta-visible Espectroscopía de infrarrojo cercano Análisis termogravimétrico Análisis térmico diferencial Calorimetría diferencial de barrido Volumetría Difracción de rayos X RMN Microscopía óptica Rotación óptica Polarografía

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1. VOLUMETRÍA

Se añade un exceso conocido de reactivo estándar a la disolución, y luego se valora el exceso (no se valora el analito).

Es útil si el punto final de la valoración por retroceso es más fácil de identificar que el punto final de la valoración normal.

También se usa si la reacción entre el analito y la sustancia titulante es muy lenta.

Titulación o valoración ácido-base (antiácidos)

Titulación a valoración por retroceso (antibióticos)

Titulación o valoración por retroceso

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2. ESPECTROFOTOMETRÍA

Es la medida de la cantidad de

energía radiante que absorbe un

sistema químico en función de la

longitud de onda de la radiación, y

las mediciones a una determinada

longitud de onda.

Espectro ultravioleta (UV)

Espectro visible (Vis)

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CROMATOGRAFIA

Es una técnica capaz de separar compuestos basada en diferencias de su afinidad por una fase estacionaria y una móvil.

Sistema Cromatografico:

Fase Móvil

Fase Estacionaria

Soluto

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Los componentes de una mezcla se disuelven en una fase móvil que se desplaza a través de una fase estacionaria. Cada molécula interacciona en distinta forma con la fase móvil y la fase estacionaria. La interacción depende de las propiedades físicas de cada molécula (separación).

Mikhail Tswett 1906

CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)

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PROCESO FÍSICOQUÍMICO QUE RIGE LA SEPARACIÓN

-Adsorción:

El soluto se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno superficial, aumentado con la formación de puentes de hidrógeno.

- Partición o Reparto:

El soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad hasta llegar a un equilibrio

- Intercambio Iónico:

Los aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones (resina).

- Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel:

No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamaño de partícula.

1 2 4 5 6 7 8 9 3

resp

uest

a d

el dete

ctor

fracción

PERFIL DE ELUCIÓN

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN/PERMEACIÓN EN GEL

Molec. GRANDES RÁPIDAS * Avanzan con mayor velocidad a través de los espacios intersticiales (con f. móvil).

grande

Molec. PEQUEÑAS LENTAS * Son retenidas por los poros de las micropartículas y avanzan con menos velocidad (con f. móvil).

pequeña

APLICACIÓN MUESTRA

ELUCIÓN

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Fase

estacionaria Fase

móvil

Proceso

cromatográfico

Capa fina

Columna

Adsorción

Interc. Iónico

Exclu. Molecular

Adsorción Columna

Papel

Capa fina

Columna

Partición

Partición Columna

Líquida

Líquida

Líquida

Sólida

Gas

Gas

Técnica

cromatográfica

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TERMINOLOGÍA Y PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Eluente: así se denomina a la fase móvil portadora de la muestra.

Eluato: es el término con el que se define la salida del solvente y el analito.

ELUENTE

columna ELUATO

(entra) (sale)

Proceso de elución

Flujo: mide la velocidad de la fase móvil, se expresa como gasto en volumen (mL/min) o gasto lineal (cm/min).

Cromatograma: Gráfica que expresa la respuesta del detector en función del tiempo de elución.

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ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

Análisis cualitativo: se basa en la medida de parámetros cromatográficos como tiempos y volúmenes de retención (identificación). Análisis cuantitativo: se basa en la medida de alturas o áreas de picos que se relacionan con la concentración (cuantificación).

Muestra

Estándar

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Los parámetros cromatográficos en análisis cualitativo: tiempo de retención(tR) y volumen de retención (vR). Tiempo de retención - TR: tiempo transcurrido desde el instante de inyección de la muestra al máximo de pico. Tiempo ajustado T´R: (TR- tM): tiempo que va desde el pico en el que no se retiene la sustancia hasta el máximo de elución. Tiempo muerto – tM: tiempo necesario para que la fase móvil atraviese la columna.

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TIEMPO DE RETENCIÓN

tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm

CROMATOGRAFIA PLANA

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a - distancia recorrida por

el analito.

b - distancia recorrida por

el frente del solvente. a b

Es muy semejante a la cromatografía líquida tanto en

aplicaciones como en funcionamiento.

La fase móvil se mueve por capilaridad, gravedad o bajo

la acción de un campo eléctrico (electro-cromatografía).

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Cromatografía en Capa Fina (TLC)

Sembrado:

Puntiforme Banda

Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)

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x

Cualitativa

x x x x x

Identificación Pureza Ausencia

Cuantitativa

x x x x

Preparativa

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Exclusión molecular Tierras de Diatomea

Sephadex (geles)

Adsorción:

Silica Gel (Oxido de Silicio).

Alumina (Oxido de Aluminio).

Celulosa.

Florisil (Silicato de Magnesio).

Sulfato de Calcio.

Fase Estacionaria:

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Intercambio Iónico:

Resinas

Catiónicas

Aniónicas

Acido sulfónico

RSO2- H+

Acido carbóxilico

Ión amonio cuaternario

Grupo amina

RCO2- H+

R3NR+ OH-

R3NH3+ OH-

Fase Estacionaria:

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Fase Móvil

COOH

OH

NH2

SH

CHO

CO

COOR

OCH3

Hidrocarburos No Saturados

Hidrocarburos Saturados

Acidos carboxílicos

Alcoholes

Aminas

Tioles

Aldehídos

Cetonas

Esteres

Eteres

Alta

Baja

Polaridad

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Cromatografía en Capa Fina

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El revelado difiere de acuerdo al objetivo planteado.

Clasificación de reveladores

H2SO4

I2

Lámpara ultravioleta

No Destructivo

Destructivo

Técnica de bañado

Aplicación

Técnica de pulverización

Revelado

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H2SO4

Lámpara ultravioleta

I2

Ftalato de anilina (azúcares)

Ninhidrina (Amino-ácidos)

Resorcina (Cetosas)

Difenilamina + U.V. 254 (Clorados)

Generales

Selectivo

Específico

Revelado

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Estimación del área de la mancha (por medida, pesada)

Determinación indirecta (raspado y valoración)

Determinación directa (Densitómetro)

Detector Fuente de luz

Placa

cromatográfica

Cromatografía Cuantitativa

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Agua

Metanol

Etanol

Acetona

Piridina

Eter dietil.

Cloroformo

Benceno

Tetracloruro

de Carbono

Ciclohexano

Eter de

petróleo

Polaridad Compuesto a

Cromatografiar Técnica

Compuestos

iónicos

Acidos

Fenoles

Alcoholes

Aminas

Esteres

Aldehídos

Cetonas

Nitro deriv.

Halogeno deriv.

Hidrocarburos

alinfáticos

Disolventes

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CROMATOGRAFÍA SOBRE COLUMNA

Cromatografía Gas - Líquido

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

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CROMATOGRAFÍA SOBRE COLUMNA

Cromatografía de Gases (sustancias volátiles).

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) – cualquier tipo de sustancias.

Fundamento

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Todo el proceso de separación se lleva a cabo en la

columna.

A la salida de la columna existe un detector que detecta

cada componente eluído.

La respuesta adopta la forma de un pico más o menos

Gaussiano.

Entre más resueltos aparezcan los picos es más eficaz la

separación.

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CROMATOGRAFÍA DE GASES

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

(HPLC)

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PICOS CROMATOGRÁFICOS

Cuando se desea cuantificar se debe garantizar que los

picos estén bien resueltos.

Debe distinguirse muy bien el inicio y el final de cada pico

y su máximo.

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ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

Separa

Identifica

Cuantifica

Análisis cualitativo: Factor de reparto Tiempo de retención Volúmenes de retención Análisis cuantitativo: Altura de pico Área de pico

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ANÁLISIS CUANTITATIVO

Todos los detectores de cromatografía producen señales

que son medidas, registradas e integradas.

Para HPLC y GC se usan los mismos métodos de

cuantificación.

En ambas cromatografías, la respuesta depende del tipo

de sustancia por lo que siempre se requieren

estándares.

Los detectores cromatográficos de una respuesta/unidad

de concentración.

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INSTRUMENTACIÓN

EQUIPO DE HPLC

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FASE ESTACIONARIA

Todos los tipos de cromatografía: modo de alta resolución.

Soporte común: partículas microporosas de sílice (diámetro de 5 a 10 m.

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SOLVENTES

Los solventes utilizados deben ser muy puros (grado cromatográfico).

Se puede utilizar un solo solvente (elección isocrática).

Se puede cambiar continuamente de composición del disolvente (elección por gradiente).

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BOMBAS

La calidad de una bomba es determinada por el grado de estabilidad y reproducibilidad del flujo que genera.

Se trabaja hasta 10 mL/min a presiones hasta de 40 Mpa (400 atm).

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Inyector Manual (Rheodyne): Válvula de Inyección

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DETECTORES PARA HPLC

Se usan dispositivos que sean capaces de medir una

propiedad que responda a la concentración de la

sustancia a analizar.

TIPOS DE DETECTORES

Universales: miden cualquier cambio producido en la

fase móvil.

Otros: miden una propiedad de los solutos.

DETECTOR ULTRAVIOLETA

Es el detector más utilizado (muchos solutos absorben luz UV).

El sistema más simple emplea la emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio y detección a una sola longitud de onda.

También se utilizan una lámpara de deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de onda variable.

El intervalo lineal comprende cinco órdenes de magnitud de concentración de soluto.

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DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN

Es casi universal, responde a casi cualquier soluto.

La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un detector ultravioleta, y no es útil en gradiente.

DETECTOR ELECTROQUÍMICO

Es bastante selectivo, porque sólo ciertos analitos se oxidan o se reducen con facilidad.

Pueden detectarse por oxidación: fenoles, aminas aromáticas, peróxido y mercaptanos. Y por reducción: cetonas, aldehídos y nitrilos.

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OTROS DETECTORES

ultravioleta 0.1 - 1 si

índice de refracción 100 - 1000 no

elctroquímico 0.01 - 1 no

fluorescencia 0.001 - 0.01 si

conductividad 0.5 - 1 no

espectrofotometría de masa 0.1 - 1 si

infrarrojo de tranformada de Fourier 1000 si

Detector

Límite de

detección

¿Util con

gradiente?