LABORATORIO N 6

EXTRACCIN Y DETERMINACIN DE COLESTEROL

INTRODUCCIN

Los lpidos comprenden una amplia gama de compuestos qumicos insolubles en

agua y solubles en solventes orgnicos (ter, acetona, cloroformo, benceno, etc.). Los

lpidos presentes en las estructuras biolgicas generalmente se encuentran asociados a

otras biomolculas como protenas e hidratos de carbono.

Por otra parte, aunque los lpidos se consideran sustancias hidrofbicas o apolares,

presentan diferente grado de polaridad. Los triglicridos totalmente apolares, no tienen

ningn grado de interaccin con el agua, en tanto que los fosfolpidos son molculas

bipolares e interactan con el agua formando monocapas, bicapas y micelas.

El colesterol es tambin una molcula bipolar debido al grupo OH unido a su anillo

esteroidal, pero es de menor polaridad que un fosfolpido. El colesterol se encuentra libre o

como colesterol esterificado con cido graso, siendo este ltimo menos polar. As por

ejemplo la acetona extrae principalmente triglicridos y colesterol, ya que los fosfolpidos,

ms polares, son poco solubles en acetona. Por lo tanto, cualquier mtodo de extraccin de

lpidos requiere utilizar mezclas de solventes orgnicos que permitan solubilizar todos los

lpidos y precipiten protenas e hidratos de carbono para su mejor separacin.

Aprovechando la solubilidad diferencial de los lpidos se puede realizar una extraccin

fraccionada con distintos solventes, lo que permite la separacin de los diferentes lpidos.

El colesterol es un compuesto de origen animal, cuyo contenido vara de organismo a

organismo, pero se encuentra principalmente como colesterol esterificado, asociado a

protenas celulares o como lipoprotenas en la circulacin.

En este trabajo prctico estudiaremos el contenido de colesterol en una muestra

biolgica, yema de huevo de gallina. La yema representa entre el 30-40% del peso total del

huevo, con alrededor 6 y 6,5 g de lpidos totales.

La determinacin del colesterol se realiza por mtodos qumicos y enzimticos. Los

mtodos qumicos utilizan una mezcla de sales frricas, cido actico y cido sulfrico

(reactivo de Liebermann-Burchard), que en presencia de colesterol dan origen a un producto

coloreado estable, cuya concentracin se puede determinar por lectura a 540nm en un

espectrofotmetro.

Los mtodos enzimticos (menos corrosivos) usan la enzima colesterol oxidasa, la

que en presencia de O2 oxida colesterol generando H2O2. En presencia de una peroxidasa,

fenol y aminoantipirina, el H2O2 origina un producto rojo, cuya concentracin es proporcional

al contenido de colesterol y que se lee a 500nm.

En este trabajo prctico se determinar el colesterol por un mtodo qumico y se

realizar la extraccin con una mezcla de acetona: ter (1:1).

OBJETIVOS

1. Conocer mtodos generales de extraccin de lpidos.

2. Comprender las propiedades fisicoqumicas de los lpidos involucradas en la extraccin

con solventes orgnicos.

3. Conocer mtodos de identificacin de colesterol en muestras biolgicas

ACTIVIDADES

Experimento I: Extraccin de colesterol

1. Tome 2 vasos de precipitado de 100ml y rotlelos con las letras H1 y H2. Agregue

aproximadamente 0,3g de yema de huevo a cada uno de los vasos (tome un vaso pre-

pesado). Agregue a ambos vasos 10ml de mezcla acetona: ter (1:1) y agite con varilla

de vidrio por 5 minutos.

2. Vace el contenido de los vasos a tubos de centrifuga, tapar con tapn de goma y

centrifugue por 5 minutos a 3.000rpm. Sacar los tubos con cuidado para no remover el

contenido. El sobrenadante ser utilizado para la medicin del colesterol.

Experimento II: Determinacin de colesterol total.

1. Rotule 2 tubos de ensayo (1 y 2) y adicione a cada uno de ellos 0,5ml de sobrenadante

anterior y evapore a sequedad en un bao termoregulado a 60 C.

2. Agregue 0,5ml de cloroformo a cada tubo (1 y 2). En este momento incluir un tubo

blanco que contiene 0,5ml cloroformo.

3. Agregar 2ml de cido sulfrico concentrado (H2SO4 conc) por la pared del tubo. Tapar bien

con tapa de goma, mezclar suavemente a homogeneidad y esperar 5 minutos.

4. Determine la absorbancia de cada tubo, leyendo en el espectrofotmetro a una longitud

de onda de 540nm, utilice el tubo blanco para calibrar el equipo a cero. Anote sus

resultados.

5. En base a sus resultados determine el contenido de colesterol en miligramos/gramo de

yema de huevo y por yema entera. Para ello realice los clculos correspondientes.

6. Compare sus datos con la informacin de sus compaeros. Discuta todas las posibles

causas de variacin.

Soluciones y materiales:

1. Huevos enteros (se ocupar la yema como fuente de colesterol)

2. Mezcla Acetona Eter (1:1 v/v)

3. Solucin de Colesterol 0,5mg/ml.

4. cido sulfrico concentrado.

5. Papel Parafilm.

6. Bao termoregulado a 60C.

7. Bao termoregulado a 100C

8. Tubos de centrifuga y centrifugue.

9. Gradilla con tubos de ensayo.

10. Pipetas graduadas de 5 ml.

11. Pipetas Pasteur con bulbo.

12. Vasos de precipitado de 100 mL

13. Peras de gomas y pro-pipetas.

14. Cinta para rotular.

15. Varillas para agitacin.

16. Bagueta

17. Balanza

18. Agitador de tubos

19. Agua destilada.