Cuantificación de glucósidos cianogénicos en plantas de consumo habitual a través de la reacción de Guignard y titulación alcalina.

Universidad Nacional Autónoma de México

Laboratorio de Toxicología, Sección de Bioquímica y Farmacología Humana, Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México

Cruz, S. Martínez, M. Medina, L.

Estado de México 27 de agosto de 2014

Grupo 1751 Eq. 8

ResumenLa presente investigación experimental trata de proporcionar una visión general sobre los glucósidos cianogénicos y la poca información general existente sobre los mismos, cuantificando los niveles de HCN contenido en diferentes muestras de plantas cianogénicas habituales en los alimentos.Mediante la utilización de técnicas como la reacción de Guignard y la titulación alcalina se identificó y cuantificó el cianuro en semillas de frutos de consumo común en la población mexicana. Encontrado como valor más alto 4.2ug de cianuro en 1 gramos de frutos (alrededor de 6 piezas) de Nectarina, seguido de 3.8ug de cianuro en 1 gramo de semillas de manzana (amarillas, verdes y rojas). Sin embargo se conoce que el valor LD50 por ingestión del cianuro de hidrógeno es de 50-200 miligramos, o de 1-3 miligramos por kilo de peso. Se concluye que una posible intoxicación por cianuro en humanos es poco probable.Palabras Clave.

Abstract.

Keywords.

Introducción

Muchas plantas sintetizan compuestos llamados cianogénico glucósidos, que son capaces de liberar cianuro de hidrógeno tras hidrólisis [1]. Esta capacidad, conocida como cyanogénesis, ha sido reconocida desde hace siglos en las plantas, tales como

albaricoques, melocotones, almendras y otras plantas alimenticias importantes [2]. Hay por lo menos 2.650 especies de plantas que producen cianoglucósidos.El cianuro es fuertemente tóxico para los humanos. Puede ingresar al cuerpo por inhalación, ingestión o absorción a través de los ojos y la piel. Una exposición aguda al HCN culmina con la inhibición de la oxidación mitocondrial a través de

la detención por el HCN de la cadena de transporte de electrones de la membrana interna mitocondrial [3]. El ion de cianuro inhibe las enzimas asociadas con la oxidación celular y causa la muerte a través de la pérdida de energía. Los síntomas, que se producen en unos minutos, pueden ser dolor de cabeza, náuseas, vómitos, vértigo, palpitaciones, y seguidamente disnea, bradicardia, inconsciencia y convulsiones violentas, seguido de la muerte [4].

El grado de toxicidad del cianuro de hidrógeno (HCN) para los humanos depende del tipo de exposición. La inhalación de altos niveles de cianuro causa la muerte en 10 a 60 minutos, teniendo en cuenta que mientras más alta sea la concentración más rápido se produce la muerte. La inhalación de 2.000 partes por millón de cianuro hidrogenado puede ser fatal en tan solo un minuto. El valor LD50 por ingestión del cianuro de hidrógeno es de 50-200 miligramos, o de 1-3 miligramos por kilo de peso. En contacto con la piel normal, el valor LD50 es de 100 miligramos por kilo de peso. [5] El cuerpo posee diversos mecanismos para expulsar el cianuro de forma efectiva. El cianuro reacciona con el tiosulfato y produce tiocianato en reacciones catalizadas por enzimas de azufre como la rodanasa. El tiocianato es liberado por la orina en cuestión de días. Si bien el tiocianato es siete veces menos tóxico que el cianuro, en concentraciones altas provenientes de una exposición crónica al cianuro puede afectar la glándula tiroides. El cianuro tiene más afinidad por la metahemoglobina que por la citocromo oxidasa, y juntos forman cianometahemoglobina.

La ingestión crónica de ácido hidrociánico, a dosis tóxicas subagudas, puede estar implicada en la patogénesis de ciertas afecciones, incluida la alteración de la función tiroidea y neuropatías. Las poblaciones que consumen plantas cianogénicas o derivados de las mismas corren un elevado riesgo de presentar síntomas oftalmológicos y neurológicos que están asociados con la exposición al ácido hidrociánico. [6]

Informes previos han aducido que la ingestión de raíces de yuca procesadas deficientemente está asociada con la aparición de neuropatía atáxica (konzo) en países africanos. [7].En la experimentación se utilizó la reacción de Guignard que detecta la presencia de ácido cianhídrico (CNH) al actuar éste sobre una tira de papel absorbente impregnada con ácido pícrico y carbonato de sodio (picrato de sodio). Los reactivos de Guignard, son compuestos que están formados por una parte orgánica y otra metálica, se preparan a partir de un halogenuro de alquilo y magnesio en éter o tetrahidrofurano (THF) como disolvente. Es uno de los reactivos más versátiles e importantes en la química orgánica, de forma general se conocen como RMgX o ArMgX donde R y Ar denotan grupos alquilo o arilo, respectivamente.La reacción de Guignard es una reacción química organometálica en la que haluros de alquilo arilmagnesio agregan a un grupo carbonilo en un aldehído o cetona. El radical R de reactivo de Guignard actúa como un nucleófilo adicionándose al carbono del grupo nitrilo, el agua proporciona el oxígeno necesario para la formación del grupo

carbonilo de la acetona que es lo que medimos al espectrofotómetro. [8]En la titulación alcalina se lleva acabo La hidrolisis de los nitrilos conduce a la formación inicial de una amida y luego a acido carbónico. En este caso desprende amoniaco como producto secundario. La reacción ocurre en medio acido o medio básico. [9] La presente investigación experimental trata de proporcionar una visión general sobre los glucósidos cianogénicos y la poca información general existente sobre los mismos, cuantificando los niveles de HCN contenido en diferentes muestras de plantas cianogénicas habituales en los alimentos.

Materiales y Métodos

Material:- 1 Vaso de precipitado de 50 mL

- 1 Vaso de precipitado de 200 mL

- Matraz Erlenmeyer de 150 mL

- 1 Tubo de ensaye grande

- 2 Tapones de hule

- Un mortero

- Aparato de destilación

- Mechero

- Matraz de bola de 500 mL

- 1 Bureta de 15 mL

- Espectrofotómetro

- 1 Probeta de 50 mL

Reactivos:- Semillas de sorgo

- Semillas de manzana verde

- Cloroformo

- Agua destilada

- HCL 0.5N

- Solución patrón de HCN

- Tiras reactivas

- NaOH

- NH4OH 6N

- KI al 5%

- AgNO3 0.02 N.

Reacción de Guinard: Se pesó un gramo de almendra de la muestra problema. Se trituró en un mortero hasta obtener una papilla fina. Se introdujo a un matraz Erlenmeyer con 25 mL de agua destilada, 1 mL de HCl 0.5N y 2 gotas de cloroformo. Se colocó con cuidado la tira de papel reactivo humedecida y se tapó. Se mantuvo en u n baño de agua a 40°C por una hora, agitándolo cada 15 minutos. Pasado este tiempo, si la tira adquirió siquiera una leve coloración café-rojiza, se consideró como positiva y se introdujo a un tubo de ensaye con 20 mL de agua destilado, se tapó y agitó vigorosamente. Se filtró y se determinó la absorbancia de la muestra filtrada a 520 nm.Titulación alcalina: Se pesaron 15 gramos de semilla de sorgo, se colocó en un matraz de bola de 500 mL con 200 mL de agua destilada y se tapó. Al día siguiente se destiló la muestra en un vaso de precipitado con una solución de 0.5 g de NaOH en 20 mL. Se tomaron dos alícuotas de 100 mL y se le adicionó 9 mL de NH4OH 6N y 2 mL de solución de KI al 5% a cada una. Se tituló la mezcla con una solución de AgNO3

0.02N, en el punto final de la titulación se observó una turbidez verde lechosa. Se calculó la concentración de HCN de acuerdo a la siguiente equivalencia:1.04mLde AgNO3 (0.02N )=1.08mg HCN

Resultados -Técnica de GuignardTabla 1.- Relación entre el número de equipo, la muestra que se trabajó, el color que se obtuvo en la prueba de Guignard, la dilución que se hizo para poder cuantificar y la absorbancia correspondiente.

Equipo Muestra Color AbsDilució

n

1Manzana amarilla

Rojo ladrillo

0.050 1:10

2 PeraNaranja tenue

0.005 -

3 DuraznoCafé rojizo

0.055 1:10

4 AlmendraSin

cambio- -

5 NectarinaCafé rojizo

0.073 1:10

6 Ciruela Café 0.089 1:2

rojizo

7 Uva rojaSin

cambio- -

8Manzana

verdeCafé rojizo

0.050 1:10

9Manzana

rojaRojo

ladrillo0.050 1:10

Tabla 2.- Relación entre la concentración de cada sistema de la curva patrón y su absorbancia registrada.

Concentración (µg/ml)

Absorbancias

Blanco 0

0.4 0.052

0.8 0.099

1.2 0.118

1.6 0.162

2 0.167

Gráfico 1.- Curva patrón que muestra la absorbancia registrada con respecto a la concentración en los sistemas.

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 60

0.020.040.060.08

0.10.120.140.160.18

Concentración (µg/ml)

Abs

orba

ncia

*CálculosMediante regresión lineal se conoce:r: 0.9774 Por lo tanto, no se descarta ningún punto en la curva patrón. Sí:a: 0.015b: 0.0845

Entonces podemos ocupar [µg/ml]: 0.015 + 0.0845(abs) para conocer la concentración de CN en la muestra que se trabajó.Mediante sustitución de las absorbancias en la ecuación resultante de la regresión lineal se conocen las concentraciones de

cada muestra. Sin embargo posteriormente se realizan los siguientes cálculos tomando en cuenta las diluciones usadas:µgml:0.015+0.0845 (0.050 )=0.019µg/ml

0.019µgml

(10mldilución ) (20mltirareactiva )

= 3.8µg en 20 mlEs decir, existen 3.8µg en 1 gramo de semillas del fruto.Éstos resultados se realizaron con los datos de las respectivas muestras encontrando las siguientes concentraciones:Tabla 3: Concentraciones reales de las muestras usadas.

Equipo

Muestra

Abs

Concentración

(µg/ml)

Concentración c/

dilución (µg/ml µg/ml)

1

Manzana

amarilla

0.050

0.019 3.8

2 Pera0.005

0.015 0.015

3Duraz

no0.055

0.019 3.8

4 Almendra

- - -

5Nectar

ina0.073

0.021 4.2

6Ciruel

a0.089

0.022 0.44

7Uva roja

- - -

8Manza

na verde

0.050

0.019 3.8

9Manzana roja

0.050

0.019 3.8

-Titulación alcalina

Tabla 4.- Cantidad de mg de HCN encontrados en las diferentes muestras en cada equipo.

Equipo Muestra mg HCN

1 Hoja sorgo -

2 Yuca -

3 Hoja sorgo -

4 Tallo sorgo 1.19

5 Yuca 1.35

6 Sorgo 1.04

7 Semilla sorgo 1.00

8 Semilla sorgo -

9 Yuca 1.14

Discusión

Las muestras empleadas en esta técnica son pertenecientes a la familia de las rosáceas. Al macerar las semillas de estos frutos comienza la liberación de glucósidos cianógenos Estos compuestos están formados por un azúcar y una cianhídrica El HCN se libera a partir de la interacción entre un glucósido cianogénico (no tóxico) y una enzima hidrolítica (β-glucosidasa), en un proceso conocido como cianogénesis. El hecho de que el glucósido y la enzima se encuentren en compartimentos diferentes de la planta restringe su contacto y así, la liberación de HCN. Por lo tanto, la ruptura de las células de la planta sería necesaria para la interacción entre estos compuestos y, consecuentemente, para liberar el HCN.Para poder cuantificar los mg de HCN presente en las diferentes muestras se utilizó la técnica de Guignard la cual se produce cuando los gases cianhídricos reaccionan sobre una banda de papel impregnada con ácido pícrico y carbonato de sodio. En estas condiciones, el picrato de sodio (amarillo)

se reduce a isopurpurato de sodio (rojo). [11] Si no se presenta un cambio la prueba es considera negativa. En este caso las únicas muestras que dieron negativas fueron las semillas de

almendra y uva roja. Sin embargo en la literatura se reporta que en las semillas de almendra se puede encontrar hasta 785ppm; como se muestra en la tabla 5

Tabla 5: Comparación de la concentración total de HCN en plantas utilizando hidrolisis ácida y picrato. [12]

La titulación alcalina se realizó con muestras de yuca y sorgo, se trabajaron distintas partes de la panta; hoja, raíz, tallo e interior de la corteza. Este método está basado en la formación del ion complejo Ag(NO)2 por la adición de nitrato de plata a la solución a analizarse, teniendo la siguiente reacción:

2CN- + Ag+ Ag(CN)2

En el momento en el que la reacción se completa, el exceso de plata precipita como AgCN o reacciona con el indicador (KI) para formar AgI. En ambos casos, el punto final de la titulación lo proporciona la aparición de una turbidez permanente opalescente. [8] La Yuca es una planta de la familia de la eufirbiaceas nativa de las Américas tropicales donde se cultiva extensamente al igual que en Asia y África tropicales. Tanto las hojas como las raíces contienen cantidades apreciables de glucósidos cianogenicos y deben ser

procesadas adecuadamente para evitar la aparición de efectos tóxicos. La planta de yuca produce una sabia o jugo lechoso que contiene el glucosido cianogenico venenoso; la linamarina Con la destrucción de las células que componen la yuca se produce la liberación de la linamarina que estaba dentro de las células del vegetal. De este proceso salen la linamarina (97%) y la lotaaustralina (3%) los dos componentes cianogenicos. [13]En cuanto al sorgo, es importante tener en cuenta que el mayor potencial toxico se encuentra en los sorgos jóvenes, los cuales tienen mayor concentración de glucosidos cianogenicos y enzimas y, por lo tanto, vana a ser potencialmente letales después de haber sufrido daño celular. Existe una importante variación genética en el potencial toxico de los distintos materiales de sorgo. En términos generales los sorgos graníferos tienen un mayor potencial tóxico que los

forrajeros. Es necesario tener presente que la maleza sorgo de Alepo tiene también un elevado potencial tóxico, además de los sorgos cultivados. [14]En la tabla 6 aparecen los alimentos para los seres humanos y animales que contienen cianuro, entre ellos las dos plantas estudiadas; sorgo y yuca.

Tabla 6. Alimentos para los seres humanos y animales que contienen cianuro [14]Para la yuca el JECFA concluye que un nivel hasta 10 mg/kg de HCN permite su consumo [10] cantidad que no está asociado con toxicidad aguda. Sin embargo el JECFA no ha establecido un nivel inocuo de ingestión para los glucósidos cianogénicos de las demás especies trabajadas. Una dosis de entre 30 y 210 mg de HCN puede causar la muerte de una persona adulta. Además la ingestión continua de esta substancia, en la utilización de estos alimentos como como básicos sin procesarla adecuadamente, puede tener consecuencias muy graves para la salud. [15] Se puede observar en las tablas 3 y 4 de los resultados que ninguna de las muestras rebasan los 5mg/g de muestra. Lo cual indica que una intoxicación por la ingesta de estos alimentos es poco probable. Sin embargo la base de datos relativa a la toxicidad del ácido cianihídrico y los glucósidos cianogénicos es incompleta y limitada, en particular en lo referente a la ingestión crónica o al consumo habitual de estos alimentos que forman parte de las

costumbres gastronómicas o medicinales de diversas poblaciones.

ConclusionesSe aplicó la reacción de Guignard y titulación alcalina como técnicas de identificación y cuantificación de cianuros en semillas de frutas de la familia Rosaceae, para conocer si dichos frutos pueden llegar a ser potenciales fuentes de intoxicación por cianuro. Encontrando queReferencias:

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9. Castillo García, Encarna, 2007, Manual de Fitoterapia, Editorial Elsevier Masson, Barcelona, España.

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11. Trabajo Práctico: Detección de Ácido Cianhídrico en Plántulas de Sorgo, Universidad Nacional de Mar del Plata Facultad de Ciencias Agrarias Bioquimica II, documento electrónico en pdf,

Disponible en http://www.mdp.edu.ar/agrarias/grado/710_Bioquimica_II/archivos/practicos/10_a_TP_deteccion_cianhidrico_sorgo_2014.pdf

12. M. Rezaul Haque, J. Howard Bradbury, “Total cyanide determination of plants and foods using the picrate and acid hydrolysis methods” Analytical, Nutritional and Clinical Methods Section; Food Chemistry 77 (2002) 107–114.

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14. Bretscheneider Gustavo , 2008, “Intoxicación del ganado con ácido cianhídrico” EEA INTA Rafaela, Santa Fe, Argentina, documento electrónico en pdf , disponible en http://www.produccion-animal.com.ar/sanidad_intoxicaciones_metabolicos/intoxicaciones/106-cianhidrico.pdf

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REACCIÓN DE GUIGNAR

Pesar 1g

Triturar cuando la curva estándar esté lista

Agregar a un matraz con 25 mL de agua destilada, 2 gotas de cloroformo y 1 mL de HCl

0.5 N

Colocar la tira de papel reactivo humedecida, tapar.

Colocar el matraz en baño maría a 40°C por 1Hr agitando cada 15 min.

Las tiras de las muestras problema positivas (aunque sea una leve coloración café-rojiza) se

introducen a un tubo de ensaye.

Se le adicionan 20 mL de agua destilada, se tapa se agita y filtra

Se filtra y el filtrado se lee a 520 nm

FIN

R3

R2

Agua destilada, papel whatman

R1 y R2

Tira de papel reactivo

Matraz, agua destilada, cloroformo HCl 0.5 N

Mortero

Semillas problema secas y sin cáscara

MÉTODO DE TITULACIÓN ALCALINA

En el matraz adicionar entre 10 y 20 g de muestra y 200 mL de agua destilada. Tapar y

dejar en reposo un día

Destilar el contenido del matraz a un vaso con 0.5g de NaOH en 20 mL de agua destilada.

Recibir 150 mL

Aforar

Tomar 2 alícuotas de 100 mL y adicionar 8 mL de NH4OH 6N y 2 mL de solución de KI

5% a c/u

Titular con AgNO3 0.02N. El punto final de la titulacion es una turbidez verde lechoza.

Calcular la concentración de HCN de acuerdo a:

FIN

R6

AgNO3 0.02N

NH4OH 6N y solución de KI 5%

Matraz aforado de 250 mL

R4 y R5

Aparato de destilación, NaOH

Sorgo o yuca, matraz de bola de 500 mL y agua destilada

R1: Cloroformo, ácido clorhídrico – Depositar en un frasco de vidrio debidamente identificado.R2: Tiras de Gignard – Depositar en la basura municipal.R3: Picrato de sodio, carbonato de sodio y ácido picrámico – Depositar en un frasco de vidrio debidamente identificado.R4: Residuos de sorgo o yuca – Depositar en la basura municipal.R5: Agua con la que se remojó el sorgo o yuca – Verter a la tarja.