Gentica y Biologa Molecular en BioqumicaRicardo Fujita, Ph.D.Centro de Gentica y Biologa MolecularInstituto de InvestigacinFacultad de Medicina USMPPrimera parte: DNA

Informacin Gentica

2 X 1014 clulas adulto2X1023 60 aos

Clulas madreFertilizacinInformacin Gentica

Qu molcula pasa informacin gentica?Tiene que ser compleja, hereditaria: Carbohidratos: azcares, polisacridos Lpidos: cidos grasos, cerasAcidos nucleicos: 4 nucletidos, 1 azcar, fsforoProtenas: 20 aminocidosmas complejocandidato

Antecedentes caracterizacin del material hereditarioTeora celular: Omnis cellula ex cellulaMendel (informacin gentica)Teora cromosmica de la herenciaComposicin qumica de la clula

Composicin qumica del ncleoFriedrich Miescher, 1869: ncleos y esperma citoplasma: sustancia fosfrica poco proteicaPhoebus Levene, 1920s[P] = [D-ribosa] = [4 bases nitrogenadas]P:D-ribosa:base => nucleotidoExtraccin fibrilar => cadena.Robert Feulgen, 1920, tincin nuclear especfica, cuantitativa= gametos 1/2 de otras clulas.ProtenasFsforo

Neumococos: Streptococcus neumonieRugosa (R) (inocua)mutante no producemucopolicridosLisa (smooth S)(patgena)Proteccin cpsulamucopolisacridos Cepas en placa PetriInformacin Gentica del Principio TransformanteRS

Transformacin SVirulentaRinocuainocuaR vivas + S muertas = transformacin virulentaGriffith, 1928S muertas

Avery, McLeod y McCarty (1944)

Es DNAEn la poca (1944) se pensaba que por su complejidad, solo las protenas podran ser el material gentico

Alfred Hershey y Marta Chase(1952).Virus bacteriofago (protena y DNA)

- Marcacin con radioactividad = 32P : DNA, 35S : protenas

- Infeccin a bacterias: introduccin de material gentico

Anlisis de interior bacteriano: 35S si protenas. 32P si DNA.

Solo se encuentran bacterias con interior marcado en P32P (rojo)35S (rojo)

CONCLUSION: corrobora DNA es material gentico

Carbonos de la desoxi/oxi ribosa1 Base nitrogenada2 H (ADN) / OH (ARN)3 OH-Interaccion con P (5) de otro nucletido45 PPP- interaccion con OH (3) de otro nucletido

La formacin de nucletidos de DNAfosfato + desoxirribosa + base nitrogenada = Deoxinucletido513

123456789123456Bases Nitrogenadas

R. Franklin y M. Wilkins, 1953Estudios de Difraccion de rayos X

- Hlice- bases perpendiculares al eje- 0.34 nanometros (nm)/base-peldao- 1 vuelta completa ~ 3.4 nm => 10 bases / vuelta- 2 nm (20 Amstrong) de anchoFOTO 51

Qumica del ADN Distancias (rayos X) Helice (1, 2, 3?) Esqueleto ribosa-fosfato Bases perpendiculares Chargaff [A]=[T], [C]=[G]

Modelos moleculares(Rompecabezas con fierros y cartulinas) doble cadena

Para tener 2 nm de ancho solo se puede arreglar de una forma: antiparalela

A frente a T (2 enlaces de Hidrgeno)G frente a C (3 enlaces de hidrgeno)

DOBLE CADENA ANTIPARALELA

Las 2 bases complementarias soncoplanares: pares de basesLos esqueletos azucar-fosfato estanal exterior-barandas- (cido) y las bases al interior-peldaos.

Las cadenas complementarias, antiparalelas forman la doble hliceCada cromosoma cientos de millones de pares de bases. Barandas repeticiones idnticas, secuencia de bases: informacin gentica

El DNA es doble cadena antiparalelaSi se conoce una hebra se conoce la otra

Toda la informacin gentica se escribe en una secuencia 4 letras de DNA:

Inicio de replicacin Estructura del cromosoma: telmero, centrmero Gen: Exones/intrones Inicio y final de trascripcin Regiones promotoras Regiones reguladoras

Secuencia Parcial del Gen de la Insulina

Qu somosdepende cmo estamos escritosATTTGCAGTTCCAGTCATTGCAATTGCCATTGCCAAC

Propiedades fisicoqumicas del DNADoble cadena complementaria antiparalelaA:T 2 enlaces de hidrgeno, G:C 3 (mas fuerte)Denaturacin: apertura de doble cadenaRenaturacin: cierre de doble cadenaHibridacin: una hebra se aparea con otra complementaria

DenaturacinAgentes qumicos (hidrxidos), alta temperatura (> 90C), baja salinidad

Secuencias ricas en AT (doble enlace) ms fciles de denaturar que las ricas en GC (triple enlace)Se rompen los enlaces de hidrgeno y se separan las cadenas5`353

Dos cadenas se aparean por reconocimiento de bases y vuelven a formar enlaces de hidrgenoRenaturacinRENATURACIN

Hibridacin renaturacin o apareamiento con otras molculas externas complementarias de DNAcompetencia con hebra complementaria

Apareamiento 1 vs. ?5 ACCCTAATTTAACAAAC 35 GGCCACCACGGCCC 35 GTTTGTTAAATTAGGGT 35 TGGGATTAAATTGTTTG 3123

3CAAACAATTTAATCCCA 55 GTTTGTTAAATTAGGGT 35 GTTTGTTAAATTACAGC 35 GTTTGTTACATTAGGGT 3Apareamientos perfectos e imperfectos

Diagnstico gentico glaucoma familia AndahuaylasGuevara-Fujita, Perez-Grosman, Estrada, Pawar, Vargas, Richards & Fujita (2008). Journal of Glaucoma 17:1 67-72Normal (perfecto)

Afectado (imperfecto/heterocigoto)CSGE-Conformational Sensitive Gel electroforesisdetecta mutaciones apareamiento imperfecto AC

El patrn CSGE de los miembros de la familia muestra una sola banda para los no afectados y muestra control (ctD), mientras los afectados muestan doble banda, as como tambin el paciente 203 portador asintomtico de la mutacin

CSGE familiaG

ReplicacinPrincipio UniversalReproduccin individuo, preservacin especie Objetivo: 2 copias exactas para 2 clulas hijas. De cigoto a indivduo (1014) vida (1023). Alta fidelidad, verificacin y reparacin: estabilidad gentica individuo y especieFase S ciclo celular Semiconservativa, bidireccionalVarias DNA polimerasas (varias: replicacin, reparacin, ambas)Otras protenas reconocen DNA, estructura, mutaciones, protenas entorno celular, etc.) Una cadena continua y la otra discontinua (Okazaki en eucariotes cada tira tiene distinta polimerasas y protenas)Fallas en replicacin: enfermedades degenerativas, cncerhttp://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

Replicacin necesita:Deoxinucletidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP, dTTP Origen de replicacin (secuencia especfica). Reconocimiento 200-300 bp una cadena rica en A yTs. DNA polimerasa: siempre sintetiza 5 -> 3 varias replicacin, reparacin. Procariota/eucariota. Mitocondrial/nuclear. Primer (iniciador): necesita 3OH para iniciar. RNA cebador, DNA (virus), telomerasa, protenas (virus). Complejo con otras protenas: ligasas, helicasa, SSB, primasa, topoisomerasa, etc.

Origen de Replicacin

Esquema de las burbujas de replicacin en eucariotas(E. coli) 1 sola horquilla de replicacin 30 Genoma 4.5 millones bp (4.5 Mb)Genoma humano (3, 200 millones de pares de bases), cuanto tiempo? 500 horas (20 das?). Linfocitos en cultivo 20 horas => varios puntos a la vez, 20,000 puntos, 150 kb c/u

Incorporacin de BrdU en distintos momentos

primer RNASSB (RP-A)topoisomerasashelicasasDireccin deldesenrrollamientoEsquema general de la replicacin(cadena contnua)(cadena discontnua)

Antibiticos y replicacinActan en precursores o maquinariaSulfonamidas: inhibe cido flico bacterianoAgentes alquilantes: ciclofosfamidas, mitomicinaArabinsidos: imita ribosa (no tiene 3OH) en nucletido. Citarabina (antileucmicos), ara A (antiviral). Primasa y DNA Polimerasa afectados Inhibicin topoisomerasas: quinolonas bacterianas, ciprofloxacina, norfloxacina. Irinotecn cncer. Mitosis: Taxol, vinblastina, mitomicina

IrinotecanTopoisomerasa

Tipos de mutaciones a nivel molecular

AACGTTGACCC

Sustituciones: AACGTCGACCC

Deleciones: AACGTACCC

Inserciones: AACGTTAAGTGACCC

Repeticiones AACGTTGTTGTTGACCCTG

Causas de MutacionesInternas (espontneas): oxidacin, metilacin, desaminacin, depurinacin, depirimidinacin.

Externas (inducidas): radiacin: X, g, UV,policclicos aromticos (benzopireno, humo, brea, naftalina)

ReparacinIntegridad de la informacin genticaFuncionamiento normalTransmisin de los caracteresChequeo:Replicacin: DNA polimerasa 3endonucleassaReparacin de daoProblemas de reparacin: enfermedades degenerativas (envejecimiento celular) y cncer

Sistema de reparacinMs de 150 genes conocidosVarios complejos proteicos en sistema de recombinacin (sensores moleculares)Homologa de genes de reparacin conservada en evolucinPasos: reconocimiento, endonucleasa, exonucleasa/helicasa, DNA polimerasa, ligasa

Reparacin por desigualdad

Si la nueva hebra est equivocada, cmo reconocemos la correcta, (antigua?)

5 CCATTGATTATT 33 GGTACCTAATAA 5

Defecto de apareamiento

hebra antigua es metilado, nueva todava

(BER) Escisin de 1 base-Depurinacin (rotura de enlace glucosdico) espontnea-Desaminacin de A y C yremocin por N-glucosidadasa

(NER) Reparacin por escicin de nucletidos- Dao a varias bases(hasta ~ 30)-UV: dmeros de timina,- Dao con distorsin fsica - Xeroderma pigmentosa Sndrome de Cockayne

Double strand breakNon homologousEnd joining Secuencia parecidaSecuencia idnticaTraslocacin, inversinRecombinacin homloga y NO homloga

Xeroderma pigmentosaTricotiodistrofiaSndrome de Cockayne

Sndromes debidos a fallas en reparacin (1)

Sndromes debidos a fallas en reparacin (2)hMSH2, MLH1, PMS1, 2: reconoce mal apareamiento (mismatch)BRCA: reconocimiento mutaciones doble hebra y supresor de tumor (paro ciclo celular)

Mutaciones asociadas a XP, CS y TTD3p259q22.313q225q12.311

Fig. 5.4. Genes conocidos, cuyas mutaciones se asociana xeroderma pigmentoso (XP) y sndrome de Cockayne (CS).

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