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Separacin de las clases de l pidos neutros de polen apcola

mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

Por S. Muniategui*, M. T . Sancho, J. Lpez, J. F. Huidobro y J. Simal.

Departamento de Qumica Analtica, Nutr icin y Bromatologa.

Area de Nutr icin y Bromatologa. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de Compostela.

15706 Santiago de Compostela (Espaa)

RESUMEN

Separacin de tas clases de lpidos neutros del polen apcola

mediante cromatografa lquida de alta resolucin HPL C).

Se describe un mtodo rpido mediante HPLC para la

separacin de las diferentes ciases de lpidos neutros del

polen apcola en condiciones socrticas, con deteccin UV a

206 nm e inyeccin directa de la muestra en columna de silica.

Conrio fase mvil se usa n-hexano-2-propanol-cido actico

(100:0,5:0,1). Se aislaron 3 fracciones de lpidos neutros en las

35 muestras analizadas: Esteres de esterles y otros compo

nentes no polares tales como carotenoides y ceras; trlglcridos

y cidos grasos.

PALABRAS-CLAVE: Cromatografa lquida de alta eficacia

- Deteccin UV - Lpidos neutros separacin) - Polen apcola.

SUMMARY

Separation of neutral lipid classes from bee-collected po

llen by high performance liquid chromato graphy HPL C).

A fast method for the separation of neutral lipid classes of

bee-collected pollen by isocratic HPLC is described using ultra

violet detection at 206 nm and direct injection of the sample into

a si lica column. The mobile phase was n-hexane-2-propanol-

acetic acid (100:0.5:0.1). Three fractions of neutral lipids were

isolated from 35 samples: Sterol esters and other nonpolar

compounds such as carotenoids and waxes; triglycerides; and

fatty acids.

KEY WORDS Bee collected

pollen - High

performance

liquid

ctiromatography - Neutral lipids separation) - UV detection.

1 . IN TR OD U C C IN .

En la separacin de las distintas clases de lpidos

del polen apcola, empleando la cromatografa en capa

fina (TLC), se han aislado diferentes fracciones como:

Fosfo l p idos, ester les, c idos grasos, tr ig l icr idos,

esteres de esterles y ceras (1).

A pesar de las ventajas y posibil idades de la TLC,

esta tcnica presenta inconvenientes en la precisin

y en la reproducibil idad de la medida, adems de

necesitar para la cuantitativa, el empleo de tcnicas

como densitometras y otros mtodos que precisan

una extraccin previa de los componentes como la

GLC y HPLC. Por lo cua l , en este trabajo se ha

prefer ido emplear la cromatografa l quida de a l ta

resolucin, por su mayor precisin y rapidez.

Al no hallarse referencias bibliogrficas donde se

aplique esta tcnica al estudio de los lpidos neutros

del polen apcola, se han considerado las descritas

para otros tipos de muestras (tejidos animales, cerea

les y otros).

En la identificacin de los lpidos mediante HPLC

se uti l izan distintos detectores. El ms frecuente es

el detector UV, operando a longitudes de onda de 206

nm (2) (3), 213 nm (4) y 220 nm (5); tambin son

util izados el detector de ndice de refraccin (6) (7),

el detector de masas (8) y diode array (5).

En la mayora de los casos la determinacin se

realiza con una fase mvil constante en condiciones

isocrticas, aunque la aplicacin de un gradiente de

elucin es util izada en el caso de la separacin de

lpidos polares y apelares en un mismo cromatograma

(5) (8) (9) (10).

Las co lumnas empleadas son generalmente de

silica, trabajando a temperatura ambiente y en ciertas

ocasiones se util iza un gradiente de flujo (2) (4) (5)

para aumentar la resolucin y la rapidez del anlisis.

Algunos autores (3) (6) el iminan previamente los

componentes polares (fosfol pidos) por adsorcin en

cido silcico antes de inyectar las muestras al cro-

matgrafo .

En este trabajo se describe un mtodo rpido para

determinar la fraccin de l pidos neutros del polen

apco la comerc ia l mediante HPLC, con inyecc in

directa de la muestra en condiciones isocrticas.

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Grasas y Aceites

2 .

PARTE EXPERIMENTAL.

2 . 1 .

Muestras.

El estudio se ha realizado sobre 35 muestras de

polen apco la comerc ia l . Las muestras anal izadas

incluyen plenes de las famil ias Cistaceae 43,9 %

(Cistus ladanferus L. 39,5 %); Borraginaceae (Echium

sp. 10,3 % ); Com posi tae 9,3 %; Fagaceae 8.6 %

(Quercus sp. 6,8 %) y en menor cuanta Rosaceae,

Campanulaceae, Paponaceae, Cruciferae, Papavera-

ceae, Ericaceae y otros.

Con el fin de facil i tar las determinaciones es

necesario emplear las muestras pulverizadas. La

fragmentacin se real iza en una atmsfera inerte y

exenta de humedad durante uno a dos minutos (11)

(12).

2 .2 .

Extraccin de la grasa .

Se realiza segn el anlisis de la grasa total en

chocolates norma UNE 34-082-76 (13). En el desa

rrol lo del mtodo se distinguen tres etapas:

a) desecacin de la muestra a 60 C durante 12

horas.

b) hidrlisis clorhdrica para liberar los componen

tes lipideos ligados.

c) extraccin de los lpidos en Soxhiet, durante 4

horas con ter de petrleo.

2.3.

Cromatagrafa lquida de alta resolucin.

Reactivos.

Solventes cal idad HPLC Lichrosolv Merck fi l tra

dos a travs de un fi l tro Mil l ipore de 0,2 |im, dega-

sificados y almacenados en atmsfera de Hel io.

Patrones de lpidos Sigma Art.

178-1:

Mezcla de

colesterol, oleato de colesterol, oleato de metilo, cido

oleico y triolena; en cantidades del 20 % para cada

componente .

La deteccin se realiza a 206 nm y temperatura

ambiente usando el siguiente gradiente de flujo:

1-12 minutos: 1,0 ml/min; 13 min: 1,2 ml/min; 16

min:

1,5 ml/min; 20-30 min: 1,7 ml/min.

Tanto las muestras como los patrones se disuel

ven en el solvente de elucin para disminuir al mnimo

las seales del pico de solvente.

Se inyectan directamente en e l cromatgrafo

cantid ade s d e 10 tg de lpdos/1 0 M-I de diso lucin .

Despus de cada inyeccin se lava la columna

con 20-25 mi de solventes de una serie de polaridad

creciente: hexano, acetona y metanol. Diariamente se

reactiva la columna con 30-40 mi de cada uno de los

solventes anteriores en orden inverso.

Identificacin y comprobacin de las fracciones.

La identificacin de los componentes lipideos se

realiza por comparacin y coincidencia de los tiempos

de retencin con los de una mezcla de patrones

disueltos en la fase mvil .

Adems como comprobacin fueron colectadas las

distintas fracciones separadas y desarrolladas en TLC

de silicagel G 60 de 0.20 mm de espesor, previamen

te activadas durante una hora a 110 C.

Como l quidos de desarrol lo se emplean las

siguientes mezclas en un desarrollo doble unidimen

sional:

a) ter etlico-cido actico (50:1) hasta R^= 0,4.

b) ter de petroleo-ter etl ico-cido actico (80:

20:3).

Precisin

La precisin de los porcentajes de rea para cada

uno de los componentes lipidios separados, ha sido

estudiada efectuando 8 determinaciones sobre la

misma muestra. Los coeficientes de variacin se

recogen en la Tabla I. La precisin del mtodo es

suficiente si se real iza la inyeccin por dupl icado.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN.

Material y aparatos.

Cromatgrafo de l quidos Spectra-Physics com

puesto por:

- Bomba 8700 XR para tres gradientes.

- Inyector Rheod yne de 10 |i l .

- Detector UV/VIS de longitud de onda variable

Spectra-Physics 8440 XR.

- Integrador Spectra-Physics 4290.

Columna Lichrosorb Merck Si 60 de tamao de

partcula 7 |xm (25 x 0,46 cm).

Condiciones cromatogrficas.

Como fase mvil se usa una mezcla de n-hexano-

2-propanol-cido actico (100:0,5:0,1).

En la Figura 1 se presenta el cromatograma de

una mezcla patrn compuesta por: oleato de coles

terol, oleato de metilo, triolena, cido oleico y coles

tero l . El tiempo total de la determinacin es de 26

minutos aprox imadamente.

Tabla I

Precisin (% area) obtenida en la determinacin de

lpidos neutros del polen apcola comercial.

Estars a Esteras da Triglioridos ci dos Colastarol

astarolas cidos grasos grasos

7,0

0,738

1,6

9 1

0,252

2,8

8,1

0,189

2,3

6,9

0,250

3,6

27,2

1,429

5,4

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Vol. 42 Fa so. 4 1991)

279

1 15 2 25 3

M I N .

Figura 1

Cromatograma de una mezcla patrn de l p idos

neutros: (1) Oleato de colesterol. (2) Oleato de metilo.

(3) Tri lena. (4) Acido oleico. (5) Colesterol .

Cuando se compara la muestra (Figura 2) con la

mezcla patrn, se puede observar que en las condi

ciones de trabajo empleadas, los esteres de cidos

grasos y los esterles no estn presentes en canti

dades detectables. Por lo tanto, en el caso de las 35

muestras analizadas, no sera necesaria la util izacin

del gradiente de flujo descrito, pudindose l levar a

cabo la determinacin en unos 8 minutos a flujo

constante de 1 ml/min.

En las muestras anal izadas se han aislado tres

fracc iones:

- Componentes ms apelares como esteres de

esterles.

- Trigl icridos.

-f cidos grasos, que aparecen separados en dos

picos segn el grado de insaturacin y/o el peso

molecular.

La identificacin de las distintas fracciones sepa

radas por HPLC ha sido corroborada mediante TLC.

En la Tabla II se recogen los valores de R^ obtenidos

para los componentes de la mezcla patrn, as como

para las fracciones colectadas de la muestra.

En la primera fraccin (TR=2,61) aparece una

coloracin amaril la al concentrarla en la cromatopla-

ca, debida a la presencia de carotenoides. (Con

10

15 20 25 30

M I N .

Figura 2

Cromatograma de las clases de lpidos neutros en una

muestra de polen apcola: (1) Esteres de esterles, carote

noides y ceras. (3) Triglicridos. (4),cidos grasos TR =

7,42. (4') cidos grasos TR = 7,69.

Ta bla II

Valores de R, de las fracciones de lpidos neutros colec

tadas mediante HPLC y desarrolladas por TLC.

Colesterol 0,30

Acido oleico .' 0,40 0,38 (3^ fraccin HPLC )

Triolena 0,54 0,52 (3 fraccin HPLC)

Oleato de metilo 0,57 -

Colesteril oleato 0,66

0,64 0,68

(l^ fraccin HPLC)

relacin a estos compuestos est en preparacin un

estudio (14) donde se aisla y cuantifica la fraccin de

carotenos del polen apcola mediante HPLC). Al revelar

las cromatoplacas con vapores de iodo se obtuvieron

dos componentes en la primera fraccin: uno coincide

con el R de los esteres de esterles d el patrn y el

otro corresponde al de las ceras. Por lo tanto, la primera

fraccin engloba tambin a los carotenoides y a las

ceras.

Para los triglicridos (TR= 3, 77) se observa una

clara coin cidencia con el R^ del patr n.

Con relacin a los dos picos que fueron separa

dos mediante HPLC con tiempos de retencin de 7,42

y 7,69, corresponden como se observa por TLC, a

una nica fraccin de cidos grasos. La composicin

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Grasasy Aceites

de esta fraccin

ha

sido determinada

por GLC (12),

siendo

el

cido palmtico

el

cido graso mayoritario

con

un 27,2 .

As mismo,

por TLC se ha

verificado

la

ausencia

de esteres de cidos grasos y esterles en cantida

des apreciables.

Por

otra parte,

se ha

determinado

mediante

GLC (11) los

diferentes componentes

de la

fraccin esterlica

de las

muestras

de

polen apcola,

siendo el principal esterol el5-avenasterol (46,4 ).

En

la

Tabla

III se

muestran

los

valores

del

por

centaje

en

rea para cada

uno de los

componentes

aislados en las muestras analizadas.

El componente mayoritario corresponde

a la

frac

cin de esteres de esterles y otros componentes

apelares

con un 40,6 de

valor promedio, oscilando

entre

el 23,9

(muestra

21) y el 66,0

(muestra

8).

La proporcin de cidos grasos ytriglicridos en

las muestras

es muy

similar, donde

los

primeros

presentan

un

promedio total

de 29,5 (11,0 + 18,5

% ),

oscilando entre

el 19,0 en la

muestra

7 (9, 9

+ 9,1 ) y el 46,1 en la muestra 19 (14,2 + 31,9

% ) .

Por su

parte

los

triglicridos, tienen

un

valor

promedio

de 29,2 ,

cuyos valores extremos

son

9,9

(muestra

8) y 41, 6

(muestra

18),

respec

tivamente.

Tabla

III

Contenido

(

rea)

de

lpidos neutros

de las

muestras

de polen apcola anal izadas.

N> de

nuestra

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

*n-1

Hlnfmo

X)

Naxfm)