1981, Varela. El problema de la determinación de clorofila-a en el fitomicrobentos...discusión...

8/13/2019 1981, Varela. El problema de la determinación de clorofila-a en el fitomicrobentos...discusión sobre la metodología.

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Oecologia aquatica, 5: 7-1 9. 1981

E probema de a eteminación e corofia a ene fitomirobens: discusión sobrea meodología *MANU VALAInstitut Español de Oceanografía. Muelle de nimas s/n. Aptdo 3 La Coruña

INTRODUCCiN

Esá demosado qe os podcos

de degadación de a cooia epesen-

an en e benos na acción impoane

de oa de pigmenos vedes pesenes

Esas omas degadadas o inacivas ab-

soben z en a pae oja de especo

y esa absoión no es di s ingi b e de

a de as omas acivas Las éc nic as

empeadas paa a deeminación de pig-

menos deben po ano ee en cena

esa cicnsancia poqe de o cona

io os esados obenidos sean poco

iabes

E esqema de a degadación de

a cooi aa es e s igiene ( YENTSCH

967) :

-Mg - Fitol

Feof ia-� Crofia-�

Coofiia-a-ito -Mg

La pédida de núceo magnésico

y de a cadena io degada a cooi

* ate tr o ha sid

zd dsdel program cooperativo hispo-americno " B nº de royeco 020

aa a eoóbidoa a avés de a

eoi inaa o de a cooi i daa según

e esqema señaado

La cooiida y ss omas oida-

das pesenan n especo de absoción

idénico a de a cooiaa y po

ano en os anáis is especooomé

icos esas cooas egadadas se

vaoaán como cooia aciva Po

oa pae eoi ina y eoób ido ( eo

pigmenos pesenan n especo igea-

mene dieene a de a cooia aci-

va La absoción en a pae oja de

especo se despaza de 665 a 667 nm

y decece apoimadamene en n 50 %

( ig . Sin embago es a dieencia

es an escasa qe no pemie na caa

di sinc ión ene os pigmenos y poano os eopigmenos peden ineei

seiamene as deeminac iones especo

ooméicas de cooiaa ya qe es-

os podcos se incián como si casi

a miad de a coespondiene canidad

de c ooia esviese p esene

La cooaa pede se anso

mada en eoiinaa y a cooiida

en eoóbido ac idi icando os eac-

os de pigmenos con ácidos mineaes

di idos Paiendo de esa base se



8

sd pcdis spc

éics c s fcs d c-

ccó dcds p pii disci

i cfi iclyd c

id y fs xidds) y fpi

s s d fi y ffóbid)

LORNZN, 1967; TT 975).

L cidd d pis pd s b

s dic d l lció

s bsbcis s y dspés

d cidiicció Es l ció pd

i dsd i d , cs

d xisci xclsi d pi

s s l áxi s éss s

c ss

ELECCN DEL SOLVENTE

Ls cis c

p cció d s l sá

bsds cp ci dd xc , p

Fig. spectros de absorió de u extrato

de aceona al 100 procedete de aga verde

cenedesmus dimorphus, tratado co diferetes

ANE VAA

Taa - Eficncia d man aoo de a acetona a 9 a etracción de clo�

rofia-a, en diatomeas cianofíceas (de HOL

-HANSEN & RIEMAN 978)

GRUPO TI E MP O (h) p g CL O R O FA -a/ MU ES T RA

TAXONMCO EXTACCN ACETNA 9 METANO

Diatomeas 342!O,4 37,0 06

6 5,1!,8

2 362!0,7

20 368!O6

Cianoíceas 286!02 34, 0,4

6 29,4!0,4

2 298!0,8

2 30OO,

d , y sbil dd d l s p

s él d ls pcss d x

cció y cidifccó , p

CAPACIDAD DE EXTRACCIN

s sls ás pl i

lids s , cf c

i , l l bsl y

c 0 %. xc , l

l s ch ás ápid y fic

q l c , c pd s l

b Al cb d h , l xc

có f cp l l , p i

cp l l cs d l c Ds

pés d 20 h ls ss d ds

s pxi l 00 % d xcció ,

is q cifcs s sól

88 % cpds c ls ss d

l S b , s l s ss

s ds y xds d s

concen tacons d ClH (MOE & H E RE pcs hs , ls slds s cp

1978

. Abso:tio specra f

on ex-r

h geen lg Senede smus morphu, eed

w sussvy nesn mo o C1H

(MOE HALEGRAEF

bIs bs sl s P ,

cd s p l c, s i s ds xcció cpl , l s ss

db s bi xs d



DTERMNACIÓN DE CLOROFLA EN EL FITOMICROBNTOS 9

te a menos 24 anqe en es te caso

a etacción no sea competa en agnos

gpos e spec iamente c oofíceas y cia-

nof ceas . Como se compobaá pos tei o-

mente a ace tona pesent a dante os

pocesos de acidificación nmeosas ven-

tajas compaada con e metano ac iendo

qe s so sea pefeib e a de éste .

Además dado qe as diatomeas cons tit-

yen en genea e gpo más abndante

de fitomicobentos e empeo de aceto

na no condce a gandes sbestimaciones

de a canti dad de c oofia I ncsoen e caso de a pesencia de oganismos

en os qe a etacción sea incompeta

con acetona pede incementase a efi-

cacia de ésta asta e n ive de a de

metano ti izando na mezca de dime-

ti s fóido ( DMO ) y acetona a pates

igaes ( V/v ) ( taba 1) Po ota pa-

te e DMSO o modific a e especto de

absoción de . coofiaa

SABLDAD D OS PGMNOSN DSNOS SOVNS

Como ya se a señaado e cambio

en a absobancia de na oción de

pigmentos despés de a ac idi ficación

es a base de os métodos espec tofoo

méticos paa a estimación de coofia

en pesencia de feofi tin Los métodosestán basados en a sposición de qe

e coeficiente de absoción de a feofi

tina póimo a 665 nm no vaa con

a acidi icación. Esta spos ición es

sin embago incoecta y e coeficiente

de absoc ión pede vaia amp iamente

dependiendo de tipo de sovente s

contenido en aga y a moaidad de

ácido en e etacto y po tanto de

pH.

La figa mesta caamente a

infencia en e especto de distintas

concentacio nes de ácido . Si a mo ai

dad fina de ácido se mantiene po de-

bajo de ci etos vaoes a degadación

de a c oofi aa a feofiti naa povoca

e despazamiento de máimo de abso

ci ón en a pate oja de especto

de 665 a 667 nm . n incemento en a

concentación de ácido oigina n coi-

miento de máimo a 657 nm . Po a ob

sevac ión de a figa eslta evidente

qe a apicación de bajas concentacio

nes de ácido j nto con cotos tiempos

de eacción es insfic iente paa aseg-

a a convesión de toda a coofia

Taba Comparaión de a efia ia etat

a de aetona a 90 % dimeti sfóxido DMS

+ aetona 90 %, v/v) ( de SHA & UM 1976 ) .

mg/

GUP TAXNMC EXTACT CLA-a

Diatomeas

Nitzsha sp . D 1 ,32

Aetona 1 31

Cclotel sp DMS 0,86

Aetona 0,86

Coofíeas

Choea renoidos DMS 2 ,66

Aetona 0,64

Seenasum c Ericornutum DMS 1 , 18

Aetona 002

Ankistodesmus baun DMS 1 05

Aetona 0,21

Ciofíeas

An cl st i s niduans DMS 0 ,40

Aetona 0,40

Anabaena flos-aquae DMS 245

Aetona 2,45Fremell diplosihon DMS 3 ,28

Aetona 3 ,16



esene en eoiina , en es caso

se obendían aoes de eoiina muy

eeados y aoes de a eación ene

as absobacias anes y después de a

cdcació (R) muy bajos De oo

ado , ua uee acid cación hace que

p c o de absoc ón se de sace de 667

a 6 m so se debe ( USACHEVA , 971

a l esecia d un equ bo , depe

d e de e re a oma eu a

d eo s mooaó su d

ca a apac ó de p co de abso-

có a

6: sea idcaa de a

acó de dcaioes de eoina

a aue os casos en que es as as

a oes o aa s o dee cadas

e eaa a 1& obecó de oes

de eogmeo mu os , cuso nega

os y aoes de � na concen-

acó de ácido eeada puede incuso

UZO(

,

' � o

40

00 0LNGIT DE DA

MANUEl VARLA

llega a incemena de oa considea

be a absoción de ondo uiizada

aa coegi a ubidez de a sou

ci ón nodci endo de e sa oma nueos

eoes en e cácu o de gmenos . Ese

cemeno de a absoción a 7 nm se

debe a a escisió de a ucoxanna

en oducos de i o uano ( g E emo de meano como soene

pesea pobemas semejanes a de a

aeona , con desazam enos de os m

imos de absoción hacia ongiudes de

nda menoes de a eseada ( g 3 )

sa eacción es mucho ms pida

en meao acuoso que en aceona acuosa

La ansomación de monoca " oes de

eoiina en sus esecos dicaiones

ene uga a un pH < en meano acuo

so y sóo a H < en ace ona acuosa

Ese desazamieno de esco es com

ucxnn

00 0 0

F g 2 Espes de absn de a fuxan na anes () y después de se adfad

e exa 100 % de aena hasa una aidd fna de lH d e 4 , 4 2

M ME & HEE,

98 Abo spectra of ux nd t () iiio w Finl mol"ity

o ci. 4 4XIO2

M MOED L['CRA



üzmO

1

DERMINACI6N DE CLOOFILA EN EL FITOMICOBENTOS

/

psente fomación de daiones . HOM-

HANSEN & RIEMANN ( 1978 aconsejan e

e mp l e o d e 2 5 m g d e C 03

Mg por ml de ex

tracto , pa ra una conc entrac ión final

de ácido 3x103M, con un tiempo de reac-

ci ón de 10 minutos y agitac ión suave

MEDIDAS DE pH ANTES Y DESP�SDE A ACIDIFICACIÚN

MOED & HALEGA ( 1978 n l l e

LG

vado a cabo un completo estud acerca

de la influenc ia del pH del extracto

en la absorbanci a de los pi gmentos , que

F. 3 . Epctros ' de absorció n de pgmntos

extraídos n mto de u n cult ivo de Dunaie-

ll tertiolecta ( HOLM-HANSEN & RI E NN , 1978 ) .

Fi. 3 . Absortion specta _f pigm t extacted

in mthol ro a cutur of Du aia tertioecta

(HOLM- HASEN & RIEA, 1978).

pletamente rersible mediante neutrali

zación con C

3

Mg , l o c ual i nd i c a l a

xistencia de un cambio fsico más que

de uno químico de transomación en feo-

fórbi do .

Estos cambios espectrales de la

feofi tina en rel ación c on e l p H , han

si do señalados para metanol al 80 , 90 ,

95 100 % ( LIVINGSTONE et al , 19�3;

MARKER , 1972 100 % de acetona ( MOED

& HALLEGRAEFF , 1978 ,

no fueron de

tectados en acetona al 80 , 90 9 5 %

Esto e s deido a que e n acetona acuosa

es necesario alcanzar un pH tan bjo

como 0 , 5 para que comiece la formación

de di catione s de feofi tina , mientras

que en metanol acuoso esta transforma-

ci ón tiene lugar a a un pH de 2. Por

tanto , cuando se empl ee el metanol como

b l ven te spu

s la aci di ficac ión

es necesario neutralizar el extacto

hasta un niel de pH en el cual no se

permite explicar de forma clara numero

sos problema que plantea la acidifica-

c ión , en un i ntento de cara cterizar l as

condiciones óptimas de la misma en rela

ción con la molaridad final del ácido .

En este sentido , la determinación del

pH en los extractos parece ser un crite-

rio más adecuado que el cálculo de la

molaridad del ácido puesto que aquél

no depende únicamente de la cantidad

de ácido añadido sino también del con

teni do en agua del sol ente . De todas

formas las medid de pH en solentes

acuosos orgánicos deberían ser interpre-

tadas con grndes precauciones , a que

el concepto de pH ha sido definido úni-

camente en relación con el agua como

solente .

La adición de inluso pequeñas can-

ti dads de CH di lui do a sol ntes orgá-

nicos con un bajo contenido en agua

( " 5 % hace descender el pH , en sólo

un mi nuto , a alores comprendi dos entre

0 , 5 2 , 0 ; mentras que la misma canti-

dad de ácido en solentes con un mayor

contenido en agua ( 1020 % da 1ugar

a alores de pH que osc i lan entre 2 , Y 3 , dependi endo de la naturalza de

solente ( fig. 4 . El consumo de ácdo



e pue mayor cuanto mar ea la can-

tidad de agua , y e uperior en metanol

ue en ac etona para ·a mma cantidad

de agua En olucione acuoa de meta

nol y acetona la completa degradación

de c l orofila en feofi tina tene lugar

a un pH comprendido entre 2 6 y 2 8

a rotura d e la fucoantina e n furano

y e incremento ubiguiente de la ab

orión a 750 nm e dependiente del

iempo y cmenza a un p ,5, veri-

n ts

Metl •

g. Vic de H e eci co

cidd de ácido CH 04 ñdido 2 m

de difeetes xtctos de ceto meto

co ist its coctc ioes de gu ED

& HALLEGAE 1978) .

h dd n

mn d C1H) 0: he pH

( ) mhl w

w nn' MOE AGAEF, 978)

ANUE VAREA

ficndoe de forma muy lenta y iendo

mucho má rápida a un p comprendido

entre y ,5Dado que el pH final del etracto

no e únicamente función de la molaridad

de ácido ino del contenido en agua

del mimo lo cáculo de l p de l e

tracto a partir de la concentración

del ácido e'el mimo no correponden

al va lor real Por eta raón aun cuan

do teóricamente una con centracón de

ácido en e etracto entre 2 y 303

daría el rango de p eñalado como idó

neo ( 2 6 2 8 ) en la práctica eto no

e cierto a figura 4 re pre e nta la

diminución de l pH e n re lación con la

cantidad de ácido añadido a ditinto

olvente con diferente concentracione

de agua A partir de la mima e pue de

deducir el volumen de ácido a añadir

a dtinto vol úmene de etracto Mu-

cho autore acidifican directamente

en la cubeta del epectrofotómetro aun

que ería preferible utilizar etracto

de mayor volumen con obeto de poder

añadir cantidade eacta de ácido Ade

má dado que numeroo invetigadore

uan acetona metanol e incluo etanol

con variada concentracione de agua

ería conveniente que en cada cao

e etableciee el volumen de ácido re-querido para alcanzar el p eñalado:

2628

CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓ

DE PG MENTOS

Una vez obtenido lo etracto

en acetona del 90 % la lectura e

realian n el epec�rofotómetro a 665nm ante y de pué de la acidificación

con CIH corregida por la l ec tura a



DERMINACÓN DE COOFA a EN EL FTOMICOBENOS 13

750 nm y con l as precauciones anterior-

mente señal adas en re laci ón con la can

tidad de ácido añadido

cálculo de la concentración de

clorofilaa se otiene a partir de las

si guientes ecuaciones L�NEN , 197):

Clorofila'a (mg/m 2

) AxKx(6650-665axvxLxS

Feoftina a (mg/m 2

)= AxKxRx665a6650xvxx

A , coeficiente de sorción d l a clo

rofila a=

; K , ctor para igualarla reducción en la asorancia a la con-

centración inicial de clorofila = 2 , 4 3 ;

665 , asorancia antes de la aci difica-

ción , corregida; 665a, a soranci a des-

pués de la acidi ficación , corregida;

v , volumen de extracto acetónico en m;

10 , factor de conversi ón a m2

; L , longi-

tud de paso d' la cueta en cm; S , su-

perficie de l muestra, en m2

; R , má xi -ma relación de 665/665a en ausencia

de feopigmentos 1,7).

LMTACONES DE LOS M�TODOS

NORMALMENTE UTLZADOS

Los métodos espectrofotométricos

empleados para la de terminación de pig-

mentos , tal como e l descrito anterior-

mente LORENZEN , 197) u otros similares

( HOL M HANS EN & R IEMANN , 1978; T ETT e t

a l ., 1975), así como los de fl uo rescen-

cia ( Y ENTSCH & M ENZ EL , 1 963; HOLM-

HANSEN et al . , 196 5 ) , proporc ionan e s-

timac iones po co vál i das ya que la medida

de c or ofi l aa c orresponde a l a s uma

d c orofi l a-a y c l orofi lidaa y la de fe ofi tinaa a la suma de feo fi t inaa

y feofórbidoa . Esto supone un serio

inconveniente , espec ialmente en muestras

entón icas , en donde e sto s pr od uc to s

de degradación pueden representar un

elevado porcentaje de la cantidad total

de pi gmentos Por otra parte , si la clo-

rofil a es tá presente , se oti ene un

val or de feofi ti naa muy al to , ya que

el espectro de asorción de la feofitina

a y de la feofi tina en los extractos

acidificados s muy se me j ante f i g 5 )

J EFFR EY 1974) comenta estas limitacio

nes y señala que cualquier método que

no implique la separación fsica de los

pigmentos porporciona resultados poco

precisos y está comprometido por la pre

sencia de productos de degradación nue

vos , resultantes de la acidificación

de las muestras . Este autor propone la

utilización de técnicas de cromatografa

en c apa fina, las cuales permiten la

separación de las formas principales

de clorofila a , y c ) y carotenoides ,as como feofit inas , feofóridos y clo-

rofil idas Sin emargo , en la estimación

de la iomasa de la microflora entóni-

ca , en la que el prolema de la patchi-

ness exige la toma de numerosas mues

tras son quizá preferiles a aquéllos

más exactos pero lentos

UNA APROXMACIÓN AL PROBLEMA

El emp l eo de técni ca s de sp arac ió n

de fase es sugeri do por J EFFREY 1974)

como una opción para mejorar la metodo-

loga normalmente ut il izada WHITN

& DARLE 1979) desarrollan en este sen

tido un procedimiento para la determina-

ción precisa de clorofilaa en muestras

que contienen grandes cantidades de pro

ductos de degradación La partición con



1 4

ean de un etrat aetón da lugar

a un s stema de s ases a perase

ntene ls artens , lrlas a

b Y e t nas a b , debd a que

ests mpnentes retenen la adena

n plar ( tl ) a pase nt ene

la l rl a parte de artens y

ls p rduts de degrada ón de l a l

rl a que areen de grup tl l -

rldas a y b Y eórbds a b

De es ta rma , l a part ón n ean

separa las rmas degradads de la l

rl a atva a lrl a a puede en

tnes ser alulada en la apa de e

an , en presena de e tnaa pr

una gra mdaón de as eua

A

Feofitin

(655)

600 650

Clorofl (665)

700

c(zcc

MANUEL VARELA

es de ORNZN 196 ) Dad que es te

predment supne una mprtante me

ra en l a metdlga , es más s mple

rápd que ls ténas rmatgrá-

as en us , n requere equp espe-

al será desrt en detalle

a partón n ean es m

s gue : 10 ml de un etrat aetón

90 % de atna) se añaden a 3 , 5 ml

de CNa al 0 , 05% Y 1 3 , 5 ml d e e an

( de grad espe tsóp rang de ebu

ll ón : 68 ,068, 8) en un embud de de-

anta ón de 60 ml l embud es agtad

uertemente durante 5 mnuts en una

agtadra reípra a 60 vbranes

pr m nut , para al anzar una má ma

B

600 650

oofil b(655)

_Feofitin b(653)

700LONGITUD DE ONDA

Fi 5 Espectro de absorción de las corofilas a y b feofitinas a y b en metano. Acidifica

ción hasta una moardad de 3X10- 2

M HOLM- HANSEN&

RIEMANN, 1978).

Fig 5. Absortion speca fr hloophyls a and b and phaeoph a d n mehanol. Mola 0' hcd n he exrac 3X0-2M (HOLMANSEN & RIEMA 1978).



16 NUE VEl

Ta II oparn e s andes de orofa-a feofa- oendas por os

odo d aeon xan, en aros pos d sras Conenraones en g de pgnto

por ro de ex'aco aeno d WIUTN & AR 179

Aena

R

66: 66a a

Cooª ra ,80 ,896

Clindrothec srms ,768 37,89

Fpaon 1569 5,400

Fano ,544 9,58

es 1,054 0,525eona ua 1 08

e de ht e 2 % (tb cuo

e e ogítmc e cuto e

Crothec fuform e orcetj e

e ducto degro e corof

- ede czr el O % tb

Ü!

�

�1

9 70

�Q--_

-3

_

•

HX "

r ofVCO l _ DE aSO.NCI M"X4

i S Vació e val e eacó de

la a!aca a 66 ate é e

aca a t e a aa a

ca-a a e acet a Y hxan

WITY & DAR Y 97).

Hexano

R

feoftna 66 663a Ca ofn

0,00 ,227 3898 0009

1,18 2,105 3,083 7,139

,15 1,798 3,59 1,926

4548 7,648 55

7,70 ,57 0,00 4,085

465 ,050 0 16 358

aba IV - maraión e s valres e clr

fla-a feigentos btenis or s métd

de aetna hexano. e cas e la clrf

a ls porcentajes rrespnden a la reaión

etre os valores e hexano y aetona consie-

rado que ls rieros reresent a frma

ativa del igeno os segundos el ttal

(activa + degraada = clorofla clorofília)

En e caso de los feopentos ls prcentajes

exresan a relación entre ls aores obteni

dos por uno otr métdo Las uestras señala

as cn un * reresent catidades de feopig

mentos más eleas en aena ue en ex.

Muestras proedentes e a ra de Arosa (VAR

& PENAS en reparaión) N , núero de mues

tra

% l-a ativa

rfiaa OPIGMENTOS

m/m2

mg /m2

N acetna hexan % aetna hexan %

3 7 3 198 3 2851 3 4 8 5 22

2 2573 1331 51 1 38 32

3 3778 2 1 7 7 58 2 8 3 2 4537 60

Fig Dpndec af bare-ta cidn ' 133 5 2 3 39 658 6285 71

raic wavlngth f' pur hlaIapyl1-

: ' ac'an nó xn (WHITNEY DARL,

7)

5 23

6 52

1 8 5 8 229 2, *

123 226 204 *110



DRMNACIÓN DE CLOOFLA . EN EL FITOC OBENTOS 1 9

A method for the spc�rophotoetrc e•u

reen of chlorophyl-! and phaeophyUn

! in bnth icroala . Liol . Ocogr

20 796

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1981, Varela. El problema de la determinación de clorofila-a en el fitomicrobentos...discusión...

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