1994. Conceptos Basicos Del Cultivo de Tejidos. CATIE. Esquivel

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; CONCEPTOS BASICOS DEL CULTWO DE TEJIDOS VEGETALES

,/Ana Abdelnour- Esquivel

Jean Vincent Escalant

1994

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CONTENIDO

Prefacto __

Agradectmtento

Introduccton ii

Ttpos de crectmtento in vitro 1

Crectmtento orgaruzado

Crectmtento desorgantzado

Termtnos para tdenUftcar los prtnctpales ttpos de propagacton invitro

Organos

Callos

Suspension de celulas 2

Protoplastos

Anteras

Prtnctpales apltcactones del culUvode tejtdos

MtcropropagactonObtencton plantas ltbres de vtrus 4

MeJoramtento genettco

Conservacton de gennoplasma 6

Factores que tntervtenen en el culUvode tejtdos

EI ln6culo 0 explante

Factores fistcosFactores quimtcos 8

EImedto de culUvo

Sales organtcas 9

Compuestos organtcos

Preparactones naturales complejas 10

Matertalestnertes

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Formulacton de sales de Murashlge y Skoog ll

La preparacton del medto de cuIUvo 12

EJemplos de medlos de culUvo 15

Mtcropropagactcn de apices de Musa

Mtcropropagaclon de estacas de cafe

Mtcropropagacion de vaJnilla

Mtcropropagacton de Dioscotea

Mtcropropagacton de Xanthosoma

Mteropropagacton de Ipomoea batata

Mtcropropagacton de orquideas

Metodos de destnfeccton 18

EI material vegetal

EI medlo de culUvo

La crtstaleria

La camara de transferencla

Los Instrumentos de trabajo

EI cuarto de transferencta

Embrtogenests somattca y suspenstones celulares 21

Embrtogenests somattca

Suspenstones celulares 26

Metodos de conservacton de los recursos fttogeneticos 30

Conservacton in situConservacton ex situ

Los bancos de semtllas

Las colecctones de campo

Conservacton in vitro

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PREFACIO

AGRADECIMIENTO

EI presente documento se prepare como ayuda didacttca para aquellos

estudtantes que se Intctan en el culttvo de tejtdos a traves de los cursos decapacttacion y entrenamlentos en servteto del Centro. En este encontraran

conceptos y terrnmos ruttnartos expl1cados de una manera senctlla, asi como

los prtnclpales campos de apltcacion de estas tecmcas. Tambten podra ser

uUl1zado como una guia practtca para la preparacton de soluclones madre.

medtos de culUvo y metodos de destnfeccton.

Los autores desean hacer un reconoclmlento:

AKenneth G. Royo O. por su gran ayuda en la edtcton de este documento.A Domingo Loaiza por la dtagramacion y dtsefio de portada.

AI personal del Laboratorto de Cultivo de TeJldos de C.A.T.I.E. por su

valtosa colaboracton,

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INTRODUCCION

El concepto de cultivo de tejidos 0propagacton in vitro (del latin en vidrioI

abarca tanto el cultivo aseptlco de tejidos como de celulas y organos. Se lellama in vitro debido a que se cultiva en recipientes de vidrio 0 plasttco

trans parente. Esta tecnlca consiste en cultivar un Inoculo con potencialidad

de dtferenclacton bajo condiciones asepttcas en presencia de una dieta

balanceada de nutrientes y hormonas. Esta capacidad de regenerar no

solamente tejidos y organos, sino tarnblen una planta entera es unlca en

plantas. no puede encontrarse un fenorneno similar en animales superiores.

Podemos definir el cultivo de tejidos como un conjunto de tecntcas con las

cuales podemos ejercer un control relativo sobre los procesos morfogenetlcos,

flstologtcos y bioquimicos que se llevan a cabo en los tejidos bajo estudio.

Al igual que en otros metod os de multlpltcaclon vegetativa 0asexual. los

individuos descendientes de una planta madre propagada in vitro son clones.

es declr, son copias genetlcamente ldentlcas entre ellas e Identicas a la planta

madre. En plantas propagadas por semilla (propagaclon sexual). la descen-

dencia no es clonica ya que cada semilla tiene su propia base genettca que

resulta de la mezcla de ambos progenltores, por 10 tanto. cada individuo esunlco.

Cuando el explante (material inicial en cultivo in vitro. que puede ser un

pedacito de tallo, hoja, yema 0 raiz) se coloca en un tubo de ensayo bajo las

condiciones antes descritas. produclra pequenas plantltas, replicas del

progenitor. Produclra un nurnero tan alto de plantulas que se necesttara

separarlas frecuentemente para que puedan sobrevivlr. El nuevo crecimlento

es generalmente iniciado en tejido merlstematlco (conjunto de celulas no

dlferencladas para su ultima funclonl. Las celulas mertstematlcas se encuen-tran localizadas en los apices de los tallos y raices, en las axllas de las hojas,

en el cambium de tallos, en los margenes de las hojas y en callos, asi. estas

celulas dependiendo de su base genetlca y locallzaclon e Influencladas por la

luz, temperatura. hormonas y probablemente otros factores se diferencian en

hojas. tallos, raices y otros organos y tejidos de una manera organizada.

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TIPOS DE CRECIMIENTO IN VITRO

I. CRECIMIENTO ORGANIZADO

Se refiere al tipo de cultlvo que se lnicia con una parte organlzada de la

planta (apices, hojas, brotes, semlllas, etc.) y esa parte u organo stgue

creciendo in vitro manteniendo sus caracteristlcas estructurales. Se aplica

tamblen cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejido desorgani-

zado (organogenesis).

II. CRECIMIENTO DESORGANIZADO

Este tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos de

tejidos u organos se produce un tejido sin estructura especifica que contiene

un numero limitado de algunos tlpos de celulas especializadas encontradas

en una planta intacta. Un tejido desorganizado (0 callo) puede crecer con

subcultivos y puede ser mantenido en medio solido 0 liquido durante varios

meses 0 anos. Puede ser usado para inlciar suspension de celulas y

protoplastos.

TERMINOS PARA IDENTIFICAR LOS PRINCIPALEST1POS DE PROPAGACION IN VITRO

1. Cultivo de organos

Corresponde al cultivo de un organo de la planta con el fin de propagar

la planta. Cultlvo de meristemas 0de apices, microestacas, cultlvo de

embriones.

2. Callos

Corresponde a un conjunto de celulas procedentes de la desorganlzaclon

de un tejido 0de una suspension de celulas. El calla tiene la pecuUaridad de

presentar celulas no diferenciadas para su ultima funclon pero que conservanel poder de dividirse (celula mertstematica 0 embnogenlca).

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3. Suspenswn de celulas

Las suspensiones celulares conslsten de celulas libres y microagregado

de celulas en medio liquido en movimiento.

4. Cultivode protoplastos

Es el cultivo de celulas sin pared pectocelulostca, Es deelr, celulas con

los componentes vivos rodeados solamente por la membrana cttoplasmlca.

Debido a la ausencia de pared celular los protoplastos son adecuados para

trabajos en mantpulacton genettca que no serian posibles con plantas 0

celulas intactas. ademas son muy utilizados para estudios flstologicos.

btoquimlcos y biofisicos.

5. Cultivode anteras

Consiste en el cultivo de anteras enteras con polen Inmaduro, el polen

se divide para formar embriones 0callo. Cuando estes se transfleren a los

medios de regeneraclon se forman plantas. Por 1 0 general el cultlvo de anteras

se utiliza para la obtenclon de plantas haploides. Estas se regeneran a traves

de la embrlogenests somatlca a partir del polen, directamente 0por la via de

organogenesis a partir de un callo. Algunas veces se cultiva el polen una vez

aislado de la antera y se le llama cultlvo de polen 0de microesporas.

PRINCIPALES APLICACIONES DEL CULTIVO DE TEJIDOS

El cultivo de tejidos puede utilizarse para diversos proposltos como son:

la mtcropropagacton, la obtenclon de plantas libres de virus y otros patogenos,

el mejoramiento genettco y la conservaclon de germoplasrna.

I. MICROPROPAGACION

La mtcropropagaclon es la tecnlca que ha logrado raplda aceptaclon en

la industria y se esta practicando tanto en especies horticolas como en

ornamentales y aun en lefiosas. Esta metodologia presenta lmportantes

ventajas sobre los metodos tradicionales de propagacton, entre elIas se puede

citar:

- Incremento acelerado del numero de plantas derivadas por genotipo:

cuando se usan metod os de propagacton convencionales un esqueje

produce una plantay una semilla produce una planta. sin embargo. un

explante teorlcamente puede prod ucir un infinito nurnero de plantas. Es

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por esta razon que se necesitan muy pocas plantas de donde tomar los

explantes que produclran miles de plantas.

- Reducclon del tlempo de multtpltcaclon.

- Posiblldad de multlpllcar grandes cantidades de plantas en una superfl-cie red uclda, a bajos costos y en un tiempo economlcamente costeable.

- Mayor control sanitario del material que se propaga.

- Facllldad de transportar el material in vitro de un pais a otro, con menos

restricciones aduaneras.

- PosibUidad de multiplicar rapldamente una varied ad de la cual existen

pocos individuos.

Debido a que la mlcropropagacton se refiere a un fenomeno de reproduc-

cion asexual. el riesgo de tener "varlantes" fenotipicas 0genettcas es bajo. Sin

embargo eso puede suceder cuando no se domina el proceso in vitro. Las

plantas que vienen de un mismo mertstema, spice. 0estaca son llamadas

Melones".

La obtenci6n de una planta entera:

La obtenclon de una planta entera puede ocurrir a traves de tres vias

diferentes:

a) a partir de brotes, prtmordlo. meristema y embriones pre-existente en el

"explante" utilizado.

b) a partir de un brote 0meristema iniciado dentro de un callo 0dtrecta-

mente sobre el explante inicial. En este caso los brotes 0meristema seforman in vitro (brotes adventicios 0de novo).

c) a partir de un embtioti somalico (embrion similar al embrion ctgottco 0de

la semilla) que se forma a partir de un tejido somatlco (embrtogenests

somatlca = asexual).

Para la mayoria de las especies que se multiplican in vitro. las vias mas

usadas son las a) y b). Muy pocas especies se multipllcan al nivel industrial

por la tercera via (ejemplo de la palma africana). sin embargo. la apllcaclon deesta tecnlca va en aumento.




La ventaja mayor de esta tecnlca es poder prod ucir a partir de un explante

de una variedad 0especie un numero teoricamente indefinido de plantas de

esta mlsma variedad 0especie.

II. OBTENCION DE PLANTAS LIBRES DE VIRUS

EI cultlvo de tejidos permite en muchos casos producir plantas Ilbres de

patogenos y de virus. En generalla tecnlca consiste en aislar el meristemo de

plantas que fueron 0no tratadas con termoterapia. Entre mas pequefio sea

el meristema inoculado mas exlto se tendra en Ia erradlcaclon del virus. Es

necesario establecer para cada tipo de virus y de planta unas pruebas

serologtcas I''Test Elisa") que permiten revelar de manera sencilla la presencia

del virus en la planta in vitro. Estas precauciones son indispensable para el

intercambio de materiales vegetales entre paises.

III. MEJORAMIENTO GENETICO

La creaclon de hfbrldos con las tecnlcas de hlbrldacton clastcas en el

campo puede ser dificil debido a problemas de esterilidad 0 incompatibilidad

de variedades. Algunas de las tecnlcas del cultivo de tejidos pueden ayudar

y facilitar la creaclon de nuevas variedades. Un incremento de la variabilidad

natural puede ser logrado usando tecnlcas como: callogenests, cultivo de

celulas y el cultivo de protoplastos. asociadas 0no a tecntcas de ingenieria

genettca (Introducclon de genes 0 transformaclon). Ya hemos vis to ladefinicion de algunos de estos termlnos. La regeneraclon de plantas a partir

de callos, celulas 0 protoplastos se hace via organogenesis 0 embrtogenesls

somatlca.

Obtenci6n de protoplastos:

En el transcurso de la expertmentaclon. los blologos constataron que se

podia lograr la agregaclon de celulas una vezeliminada la pared pectoceluloslca,permitlendo asi Ia fusion de material nuclear y cttoplasmatlco. Asi nacto el

principio de Ia hlbrldaclon somatlca.

EI primer paso para Ia obtenclon de protoplastos es la destrucclon de la

pared pectlnoceluloslca para obtener celulas de forma redondeada y Iimitadas

untcamente por Ia membrana cltoplasrnatica. Para esto se hace necesaria la

utillzacton de enzlmas pectinasas y celulasas. Una vez obtenidos los

protoplastos se puede manipular el material para prod ucir hibrtdos somatlcos.

EI protoplasto puede regenerar rapldamente Ia pared celular y por medio de

callogenests, organogenesis 0embrtogenesls somatlca producir plantas. La




- el intercambio de material no siempre es total. se pueden obtener

adlciones incompletas.

htbrtdaclon somatlca 0 fusion consiste en la agregacton de protopastos.

Cuando se produce la fusion de dos protoplastos. todo el contenido celular es

comun y se puede alcanzar la adlclon total de del material genetlco en los tres

compartlmentos que 10 contienen tnucleo, mitocondria y cloroplasto). Esto

incrementa el nivel de ploidia. sin embargo. varios eventos pueden perturbar

la fusion:

- una vez ocurrida la fusion es posible que se den competiciones y

ellminaciones crornosomlcas. Por ejemplo, en cada mitosis subsecuente

puede suceder que algunos pares de cromosomas sean desechados.

Ejemplo de hibridos: entre tomate y papas; tomate y berenjenas; tomatey tabaco (disminuir la cantldad de nicotina); tomate y trtgo: etc ... ) muchas

veces el paso mas dificil es la regeneracton de la planta.

Introducci6n de particulas:

Hoy en dia existen un buen numero de tecnlcas para introducir el ADN

en las plantas y de esta manera obtener nuevos materiales (materiales

transformados):

a. Vso de vectores naturales

El m as comun es Agrobacterlum (A. tumefaciens y A. rhlzogenes).

Tamblen se han utilizado virus como vectores (esto por medlo de afldos). El

primer paso es la Incorporaclon de un ADNforaneo por medlo de una bacteria

infectante que porta un virus latente "el plasmldo" (porclon de gen en el

cltoplasma de la bacteria que se dupllca de manera independiente). Se

provoca una herida en la planta para que las bacterias penetren. Agrobacterlum

se pega a las paredes de la herida para formar una tnteracclon "llave-cerradura". Los genes de la bacteria son activados (los del plasrnldol y

transferidos a la planta (solo los de la region T)y son incorporados al nucleo

y al genoma de la planta. Decimos entonces que la planta fue transformada

y se evalua la expreston de los genes. Existe otro metodo en el cual se

transforman directamente protoplastos. se Ie llama tamblen "cocultivo".

Consiste en incubar las bacterias con protoplastos. la transformaclon es muy

lenta y el metodo no es muy eficiente.




b. Transferencia directa de genes

Entre estas tecnlcas esta la absorclon de ADNpor protoplastos mediado

por procedlmlentos quimlcos (Ca-PEG. fusion de protoplastos). electroporaclon

(Gene Pulser), bombardeo de ADN (Biolistics) y mtcrotnyeccton,

Sin Importar la tecnlca usada, es necesario evaluar la transformacton y

por supuesto la regeneraclon del tejido.

Haplometodos:

Consisten en el cultivo de anteras u ovulos para la obtenclon de plantas

haploides las cuales despues de doblar sus lotes de cromosomas nos llevan

a la obtenclon de plantas homoclgotas. Estos metodos presentas c1ertas

ventajas durante el proceso de mejoramiento:

a) la fljacion de un hibrido por haplornetodos permite acortar 5 afios el

proceso.

b) facilita el anallsls genetlco debido a que los genes recesivos se expresa-

ran en la primera generaclon.

c) la dlploldizaclon permite recombinaciones genettcas nuevas que no se

observaban naturalmente.

La tecnica m a s usada pero tamblen la mas dlficil es la androgenesis que

consiste en el desarrollo de un tejido haploide a partir del polen seguldo por

la formaclon de una planta haploide.

IV. CONSERVACION DE GERMOPLASMA

La conservaclon de plantas es un componente integral de los sistemas

de agrtcultura sostenible y des de la perspectiva del mejoramiento de loscultlvos, la conservaclon de germoplasma valioso se ha considerado de alta

prioridad por el Consejo Internacional de los Recursos Fttogenettcos (lBPGR.

en Ingles). Se ha estimado que de mas de 240.000 especies de angtospermas

en el mundo, algo mas de 300 se han utilizado en un tiempo u otro, sinembargo. son doce cultivos principalmente los que proveen a la' poblaclon

mundial de allmento. 10 que indica que el hombre depende para su alimenta-

cion de unas pocas especles de los miles de angtospermas en el planeta. Como

resultado de conocer su Importancla, se ha dado gran enfasls a la necesidad

de preservar los recursos fltogenetlcos como forma demantener la biodiversidad.Mas adelante se comentara sobre los metodos de conservaclon de germoplasma

dando enfasts a la conservaclon in vitro.




FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVODE TEJIDO:

Ventajas que presenta el cultivo de tejidos para la conservaci6n de

germoplasma:

a) se puede almacenar un gran numero de clones en espacio reducido.

b) el germoplasma se encuentra libre de patogenos. virus 0Insectos.

c) los costos de mantenimiento se reducen sensiblemente.

I. EL INOCULO 0 EXPLANTE

Es el organo, tejido 0 fragmento de tejldo, celulas, etc. exclsado del

material parental para Iniciar el cultivo in vltro. La elecclon del explante

adecuado constituye el primer paso para el establecimlento de los culttvos,

este vartara de acuerdo al objetivo perseguido. En general. factores como el

genotipo. edad de la planta y su estado fisiologico son lmportantes de

considerar.

II. FACTORES FISICOS

pH. Intercambios gaseosos. humedad, luz y temperatura.

- pH: el grado de acidez 0alcaUnidad (pH)del medio de cultivo es importan-

te y especiflco para cad a tipo de plantas. al Igual que ocurre en el suelo,

por 10 que se hace necesario ajustarlo a los requerimlentos de la especie

en estudio. Sin embargo. el pH adecuado estara en un rango de 4.5 a 7

para las plantas.

- Intercambio gaseoso: los gases mas corrientes son 02 (oxigeno),CO2

(dloxtdo de carbone). y C2H

4(etileno).

- La humedad: en condiciones invitro la humedad dentro de los recipientes

es casi 100 %. Por eso la planta in vltro en general no desarrolla

adecuados sistemas de regulaclon hidrlca tales como cera. estomas.

cuticula. etc.

- La luz: en condiciones in vitro clastcas, la Intensidad y calldad de la luz

es muy bajo (10 W1m2 en comparaclon de condiciones naturales dondela Iuz puede representar hasta 900 W1m2). La caUdad de la luz tamblen

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es muy baja y se recomienda mezclar diferentes tipos de luz en una

misma sala para tener diferentes longitudes de ondas. El espectro uttl

para los vegetales es de 400 a 700 nanornetros. Dos fenomenos

importantes dependientes de la luz son: fotosintesis y fotornorfogenests.

Fotosintesis: es el proceso por medio del cuallas plantas en presenciade luz, agua y en los doroplastos incorporan el dloxldo de carbona para

formar los compuestos organlcos que le permlttran crecer y reprod ucirse.

CO2 + 1\0 -- CARBOHIDRATOS + 02

Fotomorfogenesis: La luz es un factor importante en la morfogenests.

La morfogenests funciona con la presencia de ptgmentos suceptibles a

radlacion azuly roja. Las funciones mas conocidas son las del plgmento

suceptible al rojo: fitocromo (rojo 660 nm y rojo lejano 730 nm);

expansion foliar, elongaclon de entrenudos, dlferenclacton de estomas,

sintesis de cloroflla. etc.

ID. FACTORES QUlMlCOS

- EImedio de cultivo: consiste de una mezcla de determinadas sustancias

sobre 0dentro del cual crecen los explantes Un6culos). Para su usc, el

medio de cultivo se esteriliza ya sea en autoclave 0por flltraclon a traves

de filtros de papel miliporosos.

EL MEDIO DEL CULTIVO

Como se menclono anteriormente, para mantener la viabilidad de un

cultivo de tejidos, estimular su dlferenctaclon y gutar su crecimiento, este

requerlra de una dieta balanceada de nutrientes y hormonas.

Los medios de cultivo son combinaciones de sustancias quimlcas que los

Investtgadores han descrito despues de numerosos experimentos y que

permiten que las plantas crezcan y se multipUquen in vitro,

Los ingredientes de un medio de cultivo vegetal pueden clasificarse en:

1) sales Inorganlcas (minerales), 2) compuestos organtcos, 3) preparaciones

naturales complejas y 4) materiales inertes.




I. SALES INORGANICAS

Los esfuerzos realizados para optimlzar las necesidades de plantas

especificas. han dado como resultado numerosas formulas de mezclas de

sales. Sin embargo. los elementos mayores esenciales que todas las plantas

requiereny que estan presentes en los fertillzantes comunes. tamblen forman

parte de los medios de cultivo: Nltrogeno (N).Fosforo (P). Potasio (K).Azufre

(5). Calcio (Ca). Magnesio (Mg)y Hierro (Fe).

Adernas de los elementos menores, que tamblen son esenciales pero que

se requiere en cantidades extremadamente pequefias: Boro (B). Mollbdeno

(Mo).Manganeso (Mn).Cobalto (Co).Zinc (Zn).Cobre (Cu). Cloro (Cl)y Iodo (I).

Una de las mezclas de sales mas usadas es la descrita por Murashtge y

Skoog. Esta es conocida como formula MSy es descrita mas adelante.

II. COMPUESTOS ORGANICOS

En esta categoria se encuentran sustancias comocarbohidratos. hormo-

nas 0reguladores de crecimiento. vitaminas y algunos otros compuestos que

se han descrito como beneflciosos para el cultivo de tejidos: arnlnoactdos,

amldas, purinas y pirimldinas y acidos organlcos.

- Los carbohidratos: son sustancias organtcas como los azucares que

proveen tres de los elementos mayores esenciales: Hldrogeno (H).Carbono (C)

y Oxigeno (0).

Los azucares son producto de la fotosintests, proceso por medio del cual

la planta convierte el dloxtdo de carbono y agua en carbohidratos con la ayuda

de la cloroflla y la luz. Sin embargo. las plantas que crecen in vitro. debido a

la baja intensidad lurninlca, no pueden fabrtcar todo el azucar que requieren.

por 10 que se adicionan altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo.

- Hormonas: las sustancias hormo-nales criticas en el cultivo de

tejidos son las auxinas y las citoquininas. Estas intervienen en la elongacton

y division celular, formaclon de brotes y rakes y en la germlnacton de las

semillas.

Entre las auxinas mas utillzadas en el cultivo de tejidos se encuentra:

acldo lndolacetlco (A.I.A.).acldo naftalenacetlco (ANA).2.4-D. picIoram. Entre

las citoquininas se encuentra: benzilaminopurina (BA).la kinetina y zeatina.




Las glbereltnas y el acldo absfclco son tamblen utUizadas en algunos

casos.

- Vitaminas: la vitamina que se ha demostrado consistentemente

como importante en el cultivo de tejidos es la tiamina. Sin embargo. otras han

sido utillzadas con frecuencia por estimular procesos especificos: blotlna,acldo mcotinlco, plrldoxlna, pantolenato. riboflavina.

- Aminoacidos: entre los arnlnoacldos y amidas que se han mostrado

mas frecuentemente como beneficiosos esta Lvarglnlna, L-acido asparttco, L-

glutamlna, L-acido glutamlco y L-tirosina.

Otros compuestos organlcos comunmente empleados en el cultivo de

tejidos son el inositol. adentna, sulfato de adenlna. el acldo citrico y el

asc6rbico (para evitar la oxldaclon de los tejidos).

ID. PREPARACIONES NATURALES COMPLEJAS

Una gran variedad de sustancias de composlclon indefinida han side

utUizadas para enriquecer los medios de cultivo. Entre elIas se menciona:

extracto de malta. agua de coco. extracto de levadura. pulpa de banano,

case ina hidrolizada y jugo de naranja y tomate.

IV. MATERIALES INERTES

- Geles hurnedos que actuan como agentes de soporte: agar. gelrtte, fltogel.

- Carbon actlvado que en bajas concentraciones contrarresta efectos

negativos que producen algunas sustancias liberadas al medio por el

cultivo (fenoles).




FORMULACION DE SALES DE MURASIDGE Y SKOOG t

Debido a que esta formula es frecuentemente usada en la

mlcropropagacton de un gran numero de especies vegetales, se describe a

contmuaclon:

Macroelementos

Compuestos mg/L

1650

1900 .,.

440

370

170

Microelementos

6.2

MnS04·I\O 16.8

8.6

KI 0.83

0.25

0.025

0.025

Hierro

37.3

27.8

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LA PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO

Se expllcara con detalle el procedimlento de preparaclon de los medlos

de cultlvo, de manera que el estudiante que se inicia en el area del cultivo de

tejidos encuentre aqui una guia. Debe tener en cuenta que exlsten en el

mercado formulas completas listas para su uso que podran usarse cuando el

proceso es rutlnarto, sin embargo. estas son mas costosas. Debido a que el

medio de cultivo es uno de los factores mas importantes en el exlto del proceso

es importante trabajar con cuidado y despacio al principio para poder

anticipar las consecuencias de cada accton y famlliarizarse con el equtpo,

crtstaleria. etc.

Preparacion de las soluciones madre:

Por 1 0 general. la preparaclon del rnedto de cultivo se inicia preparando

soluciones concentradas (madre) de uno 0mas compuestos. Determinado

volumen de cada una de estas soluciones se mezclara mas tarde para preparar

el medio de cultivo final. Es recomendable preparar las soluciones madre en

cantidades relativamente altas y con antelaclon para ahorrar el tiempo y el

trabajo que implica pesar cada uno de los ingredientes cada vezque se prepara

un medio de cultlvo. Ademas, como muchos de los componentes(mlcroelementos. vttamlnas, hormonas) son requeridos en pequenas cantida-

des. si se multi plica esa cantidad por un determlnado numero de veces para

preparar la solucion madre. la labor de pesado sera mas facll y m a s precisa.

La concentraclon de la solucion madre debe ser un factor a considerar.

Soluclones madre muy concentradas tienden a formar precipitados. En

algunos cas os estos precipitados son el resultado de mezclar suatanctas

incompatibles, por ejernplo, calcio y fosfato 0sulfate, magnesio y fosfato. Es

recomendable que la soluclon madre no sea mayor de 100 veces (1OOX ) la

concentracton final del medlo, sin embargo. el volumen de medio a prepararpor semana en el laboratorto dara la pauta para considerar el grado de

concentracton de la solucion madre. 51 la soluclon madre presenta preclpl-

tados es mejor des carta rIa ya que no poseera el balance adecuado de

sustancias. alguna proporclon de estas. estara en el fondo con el precipitado .

. La caUdad del agua:

Otro punto importante de tener en cuenta es el uso de agua destonfzada

(desmineralizada), destilada 0bidestilada para la preparaclon de los medios

de cultivo.

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-Almacenamiento de las soluciones madre:

Las soluciones madre deben ahnacenarse en el refrtgerador. Nose puede

dar un dato exacto de cuanto tiempo pueden permanecer almacenadas sin que

sufran detertoro, pero como regla general. los compuestos Inorgarucos son

mas estables que los organtcos, por 10 que se ha recomendado almacenarauxlnas y citocininas por un maximo de 2 semanas y los otros componentes

por 2 meses, sin embargo. si se observa un precipitado la soluclon debe

descartarse inmediatamente.

Con un ejemplo se explicara como seprepara una solucioti madre (50X)

tomando como base Iaformula de sales minerales de Murashige y Skoog.

Preparacion de los macroelementos y microelementos:

NH.NOsla formula indica 1650 mg/I en el medio de culttvo, por 10 tanto.

para preparar una soluclon SOX (50 veces mas concentrada. que sera

suflctente para preparar 50 litros de medio de cultivo) multipUque 1650 mg x

50 = 82500 mg (82.5 g).De Iamisma manera multlpllque la cantidad indicadapara cada uno de los otros macroelementos. En un halon aforado de 1 litro

que contenga aproxtrnadamente 500 ml de agua destilada agregue las

cantidades pesadas de cada uno de los macroelementos. aglte y Ilene el halon

con agua hasta la marca de aforo. Vuelque el balon de manera que quede unaburbuja en el fondo y agite varias veces. Replta unas 2 veces. Transfiera la

solucion de macroelementos a una botella para su almacenamiento en el

refrtgerador, Etiquete la botella. Noolvide escribir la formula que uso (Macro

MS). concentraclon (SOX).fecha, nombre de la persona que los prepare. Para

recordar la cantidad a agregar por litro de medio de cultivo a preparar recuerde

dividir 1000 mI / 50 = 20 ml de la solucion madre / 1 litro de medio de cultivo.Repita la operacion pero con los microelementos.

Preparacton del Hierro:

Para preparar la solucion madre de hierro. ponga a hervir aproxlmada-

mente 700 ml de agua bidestilada (destilada 0desionizada dependiendo de las

facilidades con que disponga) en un erlenmeyer de 1000 mi. cuando esta

hirviendo agregue la cantidad pesada de Na~EDTAy FeS04.7f\O (recuerde

que esta preparando una soluclon madre SOX. por 10 tanto. multiplique la

cantidad indicada en la formula por 50) hasta que desarrolle color. Tapela y

dejela enfriar en un lugar oscuro. Cuando este a la temperatura ambiente

transflerala a un balon aforado y agregue agua hasta Ia marca de aforo.

Digitized byGoogle3



Almacene en el refrtgerador en una botella ambar para evitar la

fotodescompostclon. Si no dispone de botella arnbar forre una botella con

papel aluminio. Identifiquela.

Preparaci6n de la soluci6n madre de 1 a hormona:

Cada hormona se prepara por separado y las mas frecuentemente usadas

se preparan de manera similar. Ejemp)o. Soluclon madre de Benciladenina:

Pese 25 mg de BA. en un balon aforado de 250 mi. agregue la hormona y 5ml

de agua. Con un gotero agregue lentamente y con agttacion HCII Mhasta que

el BA se disuelva. Agregue agua para completar el volumen. Esta solucton

provee 0.1 mg de BApor mlde soluclon madre. Si para el medio de cultivo que

prepara se indica adicionar 1 mg de BA por lltro. se deberan tomar 10ml de

la soluclon madre para obtener la cantidad recomendada. Para aquellas

concentraciones que se indiquen en ppm (partes por mlllon) recuerde que 1mg/l equivale a Ippm.

Preparaci6n del medio de cultivo:

Yase han preparado las soluciones madre. ahora se procedera a preparar

el medio de cultivo. Para esto tomaremos como ejemplo el medio de Inlclaclon

para banano.

Se pre para 1 litro de medio de lnlclacton de banana el cual consiste en

las sales MS. 100 mg/l de mlo-Inosttol, 1 mg/l de BAP. 30 mg/l de sacarosa

y 7gil de agar. EI pH se ajusta a 5.7. En su libreta de trabajo en ellaboratorio

ordene cada componente de la stgutente manera y ponga una marca de visto

bueno despues de agregar cada uno. asi podra revisar en caso de error 0duda:

Sacarosa

Macro MS

Micro MS

Fe-EDTA

Vitaminas

BAPIO.IllIg/1)

pH

Agar

30 g

20 ml (solucton madre 50X)



10ml (soluclon madre 100X)

10 ml

5.6 - 5.8

7g

En un balon aforado de 1 lltro, agregue cerca de 400 mi de agua. Pese

Ia sacarosa y disuelva en el balon. Con la ayuda de pipetas graduadas mlda

el volumen de soluclon requerlda (no debe plpetear directamente de los frascos

que contienen las soluciones madre. transflera volumenes pequefios de estas




a erlenmeyers y pipetee de estos). Una vez que se han agregado la sacarosa,

los macro, microelementos, el hierro, las vitaminas y hormonas afore con

agua. Transfiera a un erlenmeyer y ajuste el pH (puede usar HCI0KOH 1M

o 0.1M). Agregue el agar y dtsuelvalo calentando la soluclon ya sea usando

el horno de microondas (aproximadamente 9 minutos por litro de medio de

cultlvo)0

una hornllla0

quemador. EI medio esta listo para transferir a losfrascos 0tubos de cultivo (el medio debe transferirse estando caliente ya que

al enfriarse se solldfflcaral. Esterilice en autoclave. 51no se va a usar el medio

de cultlvo Inmedlatamente es recomendable guardarlo en refrtgeraclon.

EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO

A conttnuaclon se detallaran los medios de cultivo utlllzados en el

Laboratorio de Cultlvo de Tejldos de CATIE para la mlcropropagacton de

bananos y platanos, cafe, orquideas, flame, camote, tlqulsque, valnillay yuca.

Medios de cultivo para la micropropaci6n de lipices de Musa sp. (Bananos Y

Platanos):

Iniciaci6n Multiplicaci6n Desarrollo

S a c a r o s a 30 gIl 30 gIl 30 gIL

M a c r o M S M S M S

M i c r o M S M S M S

V i t a m i n a s M S M S M S

BAP 1mgll 3 mgll

pH 5.7 5.7 5.7

agar 7 gIl 7 gIl 7 gIl 7 gIl




Mediosde cultivo para la micropropagaci6n de microestacas de car~:

Iniciaci6n Multiplicaci6n Enraizamiento

* ** ***

Sacarosa 15 gIl 30 gIl 15 gIl

MacroMicroelementos MS MS 1 1 2 MS

Vitaminas Morel Morel Morel

PVP 10 gIl

Benlate 1 gIl

BAP 5 mgll 1 mgll

AlB 100 mgll

ANA 25 mgll

Kinetina 5 mgll

pH 4 . 8 5.6 5.6

Agar 7 gIl7 gIl

• EI benJate debe permanecer en el medio 15 diaa, despues de este

periodo se prepara el mlsmo medio pero sin benlate y el pHse ajusta a 5.6. Los

explantes permanecen en la oscuridad. Una vez que brotan las estacas se

transfieren al medio de multtpllcaclon .

•• Este medio tarnblen se utillza como medlo de desarrollo de las

microestacas. antes del enraizamiento pero la concentraclon de BAPse red uce

a 0.3 mg/I. Duranteestos periodos los explantes permanecen a la luz.

••• Las plantulas deben permanecer en este medio por 15 horas en la

oscuridad.




Medios de cultivo para la mtcropropagacton de vainilla:

Para preparar este medio de cultivo se agregan 30 gil de sacarosa, las

sales minerales y vttamlnas MS. 125 mgl Ide carbon actlvado y se ajusta el pH

a 5.8. Se adiciona 7gil de agar. Para la etapa de desarrollo se ellmina el carbon

activado del medio.

Medios de cultivo para Ia mtcropropagacfon de Dioscorea (name):

Para la etapa de Inlciaclon se prepara un medio de cultlvo con las sales

mlnerales y vitaminas de Murashtge y Skoog. se agrega 0.1 mg/I de BAP. Se

ajusta el pH a 5.7 y se adiciona 7 gil de agar. Para la etapa de desarrollo se

pre para el mlsrno medio pero se ellminan los reguladores de crecimiento.

Medios de cultivo paraIamfcropropagaclen de apices de Xanthosoma(tiquisque):

El medio de Inlctaclon de tiquisque consiste de las sales mlnerales y

vttamlnas MS. 30 gil de sacarosa y 0.1 mgll de BAP. Para el periodo de

multlpllcaclon se prepara el mismo medio pero con 3 mgll de BAPy en la etapa

de desarrollo se ellmina la hormona. En todos los casos el pH se ajusta a 5.8

y se agrega 7 gil de agar. Los explantes siempre premanecen en presencia de

luz,

Medio para Ia micropropagacion de apices de Ipomoea batata (camote):

Para la Inlciaclon y multlpllcackin de camote se prepara un medio de

cultlvo con 30 gil de sacarosa, sales minerales y vitaminas MS. 0.1 mgll de

ANAy 0.1 mg/I de BAP. El pH se ajusta a 5.8 y se agrega 7 gil de agar. Para

la etapa de desarrollo se ellminan las hormonas del medio de cultlvo. Los

explantes permanecen en conclctones de luz.




Medios de cultivo para Ia mlcroprcpegacfen de orquideas (iniciando con

semillas):

Para la Inlctaclon 0germtnacton de las semlllas se prepara un medio

con 30 gil de sacarosa y las sales minerales y vitaminas MS. Se ajusta el pH

a 5.8 y se agrega 7 gil de agar. Para la multtpllcaclon y desarrollo de lasplantulas se prepara el medlo anterior pero se adicionan 200 mg/l de caseina

hidrolizada y 400 mg/l de extracto de malta. Se puede adicionar 1mg/l de BAP

a este medio si se desea acelerar la multtpllcacion.

METODOS DE DESINFECCION

El cultivo in vitro consiste en cultivar un explante con potencialidad de

dlferenclaclon bajo condiciones aseptlcas en presencia de una dieta balancea-

da de nutrientes y hormonas. Estas a la vez son condiciones ideales para el

crecimiento y prollferaclon de microorganlsmos contaminantes, de am que

podemos Imaglnar la importancia de losmetodos que usemos para desinfectar

superflcialmente los explantes, esterillzar los medios de cultlvo, desinfectar

los instrumentos. la camara de transferencia de flujo laminar y limpiar los

cuartos de trabajo,

- Material vegetal:

El procedimiento de destnfecclon superficial del explante debe ellmlnar

los microorganismos pero a la vez debe causar el menor dana posible al

explante. Varios compuestos se han recomendado y entre los mas usados

estan el hipoclorito de sodio (cloro comercial del2% aI5%) y de calcio (del 6%

aI12%) que se recomienda como menos toxlco y el etanol (70%). Tarnbien se

ha recomendado la adiclon de un detergente (2 a 4 gotas de Tween-20) pararomper la tension superficial y permitir que el explante este en mejor contacto

con el quimlco, Por ejernplo, para desinfectar ramas ortotroplcas de cafe que

se colectan en el campo. primero se enjuagan con agua corrtente, se incuban

en hipoclorito de calcio all 0% por 30 minutos y luego en hipoclorito de calcio

al 8% por 20 mlnutos, en la camara de transferencia de flu]o laminar se

enjuagan con agua destllada esterll al menos 3 veces antes de inlciar su cultlvo

in vitro. El uso de anttblottcos se recomienda como ultima alternativa para

limpiar los explantes. estos pueden Influlr negativamente en otros procesos

del cultlvo.




No se puede generallzar sobre el tlpo de desinfectante 0la concentraclon

de este a utlllzar ya que cada especie y tipo de explante es un caso particular

10 que resalta la importancia de experimentar con diferentes metod os utlllzan-

do un numero reducido de explantes. Sin embargo. se puede decir que la

concentraclon mas liviana de desinfectante que sea efectiva contra la conta-

mlnacton de determinado explante es la mas adecuada. si es mas dUuida que

esta no se ellmlnaran los microorganismos y si es mas concentrada se

quernara el explante. Para facilitar la limpieza del explante es importante

considerar que los brotes nuevos son mas limpios que los viejos. materiales

que crecen en el invernadero son mas limpios que los que se mantienen en el

campo yentre mas pequefio sea el explante a introd ucir a cultivo in vitro menor

sera la contammacion a ellmlnar, sin embargo. el tamafio debe ser tal que

facilite el establecimiento del tejido. Otra recornendaclon que se ha formulado

es el uso de antioxidantes si se observa coloracion cafe en el explante durante

el proceso de destnfecclon. Por ejemplo, 100 mg de acido ascorblco y 150 mgde acldo citrico en un litro de agua destilada. Esta solucton de antioxidantes

se esterUiza yen ella se sumergen los explantes antes de iniciar el proceso de

reducclon de su tamafio para iniciar el cultivo.

- El medio de cultivo:

Por 10 general el medio de cultlvo se esterillza en el autoclave a una

presion de 115 lb. (l212C) durante 20 mlnutos, sin embargo. el tiempo deestertllzaclon dependera del volumen de medio. Otro metodo muy utilizado

es la estertllzaclon en frio utUizando para esto filtros miliporosos que pueden

retener hongos y bacterias. Para esta operaclon es necesario esterUlzar

primero tanto los recipientes como los flltros que se usaran, Para facilitar este

tipo de esterlllzacton una operon podria ser la utlllzaclon de aparatos de

flltracton previamente esterUizados y desechables que se encuentran en el

mercado.

- La cristaleria:

La cristaleria debe lavarse con detergentes que se eliminen factlmente

con agua, Es recomendable que la crtstaleria que haya estado en contacto con

altas concentraciones de hormonas se enjuague con etanol al 70% antes de

lavarla con agua y detergente para asegurarnos de eliminar los residuos. Una

vez finalizado el proceso de lavado es recomendable dar un ultimo enjuague

con agua destllada.




- La camara de transferencia deflujo laminar:

La camara de transferencia de flujo laminar esta provtsta de un flltro

HEPA(elcual no debe ser tocado debido a su fragilidad) que permite que el aire

que suavemente circula a traves de la camara sea estertl. Esto permite al

tecnlco abrir libremente los tubos y realizar las transferencias de manerarazonablemente segura. Sin embargo. antes de iniciar las labores debe limpiar

las superflcies de la camara (mesa y paredes interiores). para esto se utiUza

alcohol de 702• Otra recomendacton que ayudara a mejorar la tecnlca de

traba]o en la camara es nunca colocar beakers. frascos de cultivo u otros, al

frente del area de trabajo ya que esto interrumpe el flujo de aire estertl. UtUice

las 3/4 partes mas internas de la camara para trabajar y coloque cerca de

donde se abren los frascos de cultivo el mechero 0quemador. de manera que

no tengan que permanecer abiertos por mucho tiempo. Estas practtcas Ie

ayudaran a reducir la contammacion en los cultivos.

- Los instrumentos de trabajo:

La tecnlca cornunmente utilizada para esterilizar los instrumentos

metalicos, plnzas, btsturies. tijeras. etc. es el flarneo previa Inmerston en

alcohol de 952• Si se usa vidrio como base para las operaciones de transferen-

cia este puede asperjarse con alcohol de 952 y flamearse. Cuando se utilizan

platos petri 0papel, estos deberan esterilizarse antes haciendo uso delautoclave. Otra recomendaclon uttl es la de asperjar el exterior de los frascos

de cultivo, agua estertl, etc. con etanol para asi reducir las posibles fuentes de

contarnlnacion.

- El cuarto de transferencia:

La limpieza del cuarto de transferencia es un factor importante para

lograr el exlto. Este debe Ilmpiarse con desinfectantes y a fondo. Esrecomendable hacer la limpieza al final del dia de manera que a la manana

slgutente el cuarto este libre de olores y se pueda iniciar el trabajo temprano.

Nodebe permitirse el ingreso de alimentos a esta habltacion.

- El tecnicot

EItecnlco debe ser cuidadoso en las operaciones que realiza, estar atento

a no hacer movimientos bruscos dentro de la camara de transferencia para nointerrumpir el flujo de aire. Antes de iniciar labores de transferencia de




cultivos es recomendable que limpie sus manos y brazos con alcohol. usar una

bata de laboratorio limpla y trabajar a brazos extendidos de manera que pueda

hacer las manlpulaclones en la parte mas interna posible de la carnara y a la

vez que el allento de su resplraclon no llegue a los explantes evitando con esto

contamtnaclon.

EMBRIOGENESIS SOMATICA Y SUSPENSIONESDE CELULAS

Estas tecnlcas tuvieron su ortgen en el concepto de Totlpotencia enun-

ciado por Haberland en 1902. Totipotencla stgnlflca que todas las celulas

vegetales tienen la capacidad de formar plantas completas.

La totlpotenclalldad de la celula vegetal se debe a la particularidad que

tlene cualquler celula vegetal de perder su dfferenctaclon (desdlferenctactonl.

Los primeros resultados a favor de esta teoria fueron los obtenldos por

Reinert en 1958 y Steward et al. en 1958. Estos Investtgadores lograron

Induclr la forrnacton de embriones sornatlcos a partlr de raices de zanahorla.

A la fecha se han reallzado clentos de estudios con dlferentes plantas

conflrrnadose los resultados anteriores. Algunas revisiones sobre la

ernbrtogenests somatica se pueden encontrar en: Tisserat et al. 1979:

Ammlrato 1983: Evans et at. 1981: Vasil 1982.

EMBRIOGENESIS SOMATICA

La embrtogenests se refiere a la forrnaclon de un ernbrton somatico a

partir de celulas somatlcas que no son el producto de la fusion de gametos.

Esta termlnologia fue utllizada por Tokin en 1963 para describir la forrnaclon

de un individuo a partir de una 0varlas celulas somattcas, Sin embargo. este

fenomeno no debe confundirse con la organogenesis.

Caracteristicas de un embri6n somatfcos

Son estructuras bipolares con un eje radical-apical, y no poseen conexlo-

nes vasculares con el tejido materno (generalmente alslados por una epider-

mls). Esta estructura es capaz de crecer y formar una planta completa. En

muchos aspectos de su desarrollo los embriones sornatlcos mantienen una




slmilitud con los embriones ctgotlcos. Sin embargo. pueden ocurrir anorma-

lldades en el desarrollo como por ejemplo la fusion de los cotUedones.

Embriogenesis directa 0indirecta:

Aunque a veces esta distinel6ri no es admttida es importante resaltar quela embrtogenesls somatlca puede acornpanarse de un fen6meno llamado

callogenesis 0formaclon de un cal!,p(un calla puede ser definidos como un

conjunto desorganizado de celulasvcapaces de dlvldlrse, pudiendo ser

mertstemattcas 0embriogenicas).' Es :~l~~lltado de la totipotenelalidad.

Factores que afectan Ia embriogenesis somatica:

Ala fecha existen muchas teorias sobre la embrtogenesla somatlca y los

factores que favorecen este proceso. sin embargo. no parecen existir reglas nirecetas universales.

El Explante:

En base a la definicion de totipotencia, vlrtualmente todos los tejldos

vegetales tienen capaeldad para formar embriones sornancos in vitro. Sin

embargo. dependlendo de las especies y de las condiciones de cultlvo. pocos

explantes son capaces de inielar la embrtogenests somatlca, En general. los

explantes util1zados con mas exlto en varias especies de la mayoria de lasfamjltas. de plantas son 10$ eotlledones, los hlpocotllos y los embriones. Sin

emhB:rgo. tamblen se umi~l?n los apices. segmentos de hoja, raices e

Inflorescenclas. Por ejernplo, los embriones clgottcos inmaduros han resul-

tado el explante m a s favorable para Inducir la embrtogenests somatlca en la

mayoria de los cereales. Tamblen se han util1zado las hojas en sorgo. cafe y

palmaceas y las nucelas en citrtcos y mango. En general se puede admitir que

entre mas joven sea el tejido util1zado Iestadio juvenil poco diferenciado) mas

facll sera desviarlo de su programa genettco y asi obtener la desdtferenclacton

hacla la formaclon de ernbrtogenesls somatlca.

Segun Lttz, 1984 YDhed'a et al, 1991, un factor a considerar es que

muchas veces dentro de una misma especle, las reacciones de las diferentes

variedades pueden ser muy diferentes. Asi. un metodo establecido para un

cultivar 0varied ad podra no aplicarse a otro indlviduo de la misma especle.

La semilla y sus tejidos juegan un papel muy Importante en el desarrollo

del ernbrton ctgotlco. Los tejidos en .muchas especles crean barreras que

permiten regular el lntercarnblo gase'oS6 asi, el oxigeno disponible para el

ctgoto es limitado. Anivel de nutrtcton, los teiidos de la semilla como la nucela




y el endospermo proveen al clgoto los elementos necesarios para su desarrollo:

carbohldratos. Iipldos y proteinas. Los tegumentos juegan tarnblen un papel

lmportante en la regulacton de la luz.

Factores Extemos:

En contraste con los esfuerzos que se han dedicado al estudio de los

medios de cultivo y las sustancias de crectmlento. pocos Investtgadores se han

dedicado a estudiar el efecto de los factores ambientales.

Eloxigeno:

EI nivel del oxigeno en cultivo de tejidos depende de los gases presentes

alrededor y dentro del recipiente de cultivo y de su proporclon. EI nivel de

oxigeno dependera entonces de la manera en que se clerre el frasco de cultlvo,

de Ia frecuencia de los subcultivos y del metabollsmo de los tejldos que rodean

al tejido embrtogenlco (callos). En trtgo, Carman (1989) demostro que bajas

dosls de oxigeno favorecian la embrlogenests somatlca. Por otro lade

Engelmann (1990). trabajando con palma africana encontro que la conserva-

cion de cultivos embrtogenlcos se favoreclo en presencia de una atmosfera al

1% de 02 + 99% de N2•ya que el nttrogeno des plaza rapldarnente el oxigeno.

El medio:

Los medios sernf-solldoa son los mas empleados. Sin embargo. existen

vartos estudios que demuestran la importancia del agente gellflcante : agar.

gelrtte, agarosa.

Aunque en la fase de tntctaclon de Ia embrlogenests somatlca se utUiza

preferencialmente el medio solido. el medio liquldo es muy utillzado en la

multlpllcaclon a gran escala.

'EI cultivo en medio liqutdo presenta varias ventajas:

- Indtvtduallzacton de todos los embriones somatlcos.

- Aumento del potencial embrtogenlco.

- Aumento en la expreston de los pro-embrlones y por ende, un aumento

del nurnero de embriones sornatlcos

- Mejoramiento de la maduraclon de los embriones y como consecuencia

mejorarnlento de la gerrnlnaclon de los mismos.




EIproceso conslste en transferir el cultivo embrlogeruco a un erlenmeyer

con medio llquldo con agttacton 0en bioreactores. Tarnblen se puede utiUzar

el"Slstema de Inmerston Temporal". el cual ha sido desarrollado reclentemen-

teo Este sistema consiste en sumergtr el cultlvo en el medio a intervalos

regulares, por ejemplo, 4 veces al dia por un periodo de 1 minuto.

EI medio de cultivo:

Por 10general. se utUiza elmedio de Murashlge y Skoog 0modificaciones

de este.

Sacarosa:

La sacarosa se utillza en nlveles de 2 a 3% (20 a 30 gIl). Sin embargo.

exlsten varios estudios que demuestran que aItas dosls de sacarosa pueden

favorecer la embrlogenesls sornatlca. As], Wetherell (1984) reporto el uso de

sacarosa a 120 gIl en zanahoria. Por otro lado, Escalant y Teisson (1989)

demostraron que en Musa fue necesario utilizar 60 gIl de sacarosa. Segun

Finer (1987). otra ventaja que conlleva el utillzar altas concentraciones de

sacarosa (120 gil) es poder disminuir la dosls de auxina.

Nitrogeno:

EI nltrogeno es ~in duda un elemento esencial en el cultivo de tejidos.Existen varias formas de sumlntstrarlo siendo las mas comunes el NH.

(amonio) y el N03(nitrato). Tamblen se puede complementar la dosls con el

nttrogeno organlco provisto por amino acldos tales como glutamina y alanma,

la caseina hidrollzada 0por el agua de coco.

Carbon Activado:

EI carbon activado se utlllza principalmente para llmitar los problemas

de oxldaclon asociados al cultivo de teJidos (ltberaclon de compuestosfenollcos que provocan la oxldaclon y muerte del tejido). EI carbon activado

adsorbe las sustancias quirnlcas en general. limitando asi su Intervenclon con

el tejido cultivado. Con respecto a las auxinas y citocininas. se cree que el

carbon activado las retiene Ilberandolas progresivamente en el medio favore-

ciendo asi la embrtogenests somatlca. Las dosts cornunmente utUizadas van

de O.1 gl I a Igl 1 .




Reguladores del Crecimiento:

- Las auxinas

De acuerdo con Evans et al. 1981, en la mayoria de los sistemas de

embrtogenesls somatlca la ind ucclon requiere una concentraclon alta auxinao equivalente: AlA; ANA; 2.4-0; 2.4.5-T; picloram (4-amino-3.5.6-

trichloropicolinic acid); dicamba. EI 2.4-D slendo el mas utiUzado. Las

concentraciones utiUzadas son muyvariables (0.5 - 27.6pM hasta 450 pM en

presencia de carbon activado).

- Las citocininas:

Las citocininas como el SAP.la kinetinay la zeatina son a veces utiUzadas

en el medio de Inducclon de la embrlogenests somatlca, Sin embrago sonmucho mas utiUzadas en la fase de dlferenclaclon y maduraclon del embrton

sornatlco.

- Otras sustancias:

- En el caso de las especies lenosas, se ha recomendado incorporar el acldo

giberellco (G~) con el fin de ayudar a la maduraclon y gerrnlnaclon de

los embriones somaticos.

- El ABA0acldo abscislco puede favorecer la embrtogenesis somatlca. En

trigo, se observe que en ausencia de ABAel embrlon ctgottco utiUzado

como explante primario germinaba (Javed. 1989). La adlclon de ABA(0.5

- I mg/I) al medio de cultivo permite inhibir la germlnacton y aumentar

los porcentajes de callos ernbrtogentcos. Otro punta importante reside

en el control que tiene el ABAsobre el desarrollo del embrlon somatlco

reduclendo la producclon de embriones anormales.




SUSPENSIONES CELULARES

Los primeros ensayos de cultivo de celulas vegetales alsladas fueronreallzados por Haberlandt. Para 1937. en un estudio con celulas aisladas de

la cofia de raices, Gautheret resalto la importancia de condicionar previamen-

te el medio de cultivo (nodriza) antes de inocular las celulas aisladas.

Las suspensiones celulares consisten en celulas libres y agregados

celulares puestos en un medio Hquldo en movimiento. Tales suspensiones

pueden ser permanentes mediante el suministro continuo de nutrientes.

Inleiaeion de las suspensiones

Expiante: EI material comunrnente utilizado consiste en trozos de

tejidos friables de tipo "callo". A veces es necesarto, utllizar enzimas

(pectinasas y celulasas) para liberar las eelulas. La calldad del explante iniciaI

es muy tmportante, el mejor Inoculo consiste de un cultivo friable con un alto

ritmo de division celular, por ejemplo, un cultivo embrlogentco el cual es un

tejido friable constituido por celulas embrtogenlcas y proembriones somatlcos.

Recipiente: Por 1 0 general el lnoculo se siembra en erlenmeyers. Sin

embargo. debido a la gran importancia de la relaclon volumen de medio y

volumen del Inoculo es aconsejable algunas veces utilizar recipientes de tipo

"Multi-Well Tissue Culture Plates" 0 sea. cajas de petri con varias celditas.

Para la produccion mas iva de celulas 0 metabolitos secundarios a nivel

industrial se utiliza los "bloreactores".

Muchos de los trabajos publlcados sobre suspensiones celulares resal-

tan la importancla de la densidad del Inoculo en el exlto de las suspensiones.

En general se recomienda empezar con volumenes pequefios de medio (10 a

50 ml)Yun Inoculo de 2 a 5 g (peso materia fresca).

Caraeteristieas de las suspensiones eelulares:

En su fase de Inlciacton las suspenslones celulares cons tan de varios

tipos de celulas:

- Celulas diferenciadas sin capacidad de division: son celulas aIargadas y

grandes con una vacuola enorrne y un citoplasma reducido con un

nucleo pequefio.




- Celulas mertstemattcas: mas pequefias, con un citoplasma mas denso

ocupando todo el espacio intracelular.

- Celulas embrtogenlcas: con un citoplasma ocupando todo el espacio

Intracelular, sustancias de reservas como almldon, proteinas y Iipidos.

En resumen. durante el periodo de Inlclaclon Iasuspensiones celulares

constan de varios tlpos de celulas asi como de agregados de diferentestamanos y en ciertos casos de proembriones y embriones somatlcos.

Desarrollo de la suspension de celulas

EI desarrollo de Ia suspension celular, por 10 general. comprende tres

fases: una fase inicial de latencia durante la cualla densidad de celulas no

aumenta: una fase de alto crecimiento durante Ia cual el volumen celular

aumenta y una ultima fase llamada "estacionaria" durante la cual el erect-

miento se manteniene constante y el volumen celular no aumenta. Elcrecimiento de una suspension de celulas es por 10 tanto de tipo exponencial.

EI desarrollo de Ia suspension celular esta relacionado con varios

factores:

- Tipo de explante inicial.

- Calldad del medio de cultivo: reguladores del crecimiento. compuestos

organlcos y minerales.

- Condiciones ambientales: relaclon oxigeno/C02. luz/oscuridad.

- Velocidad de agttaclon (60 - 100 rpm).

- Densidad en materia celular: relacton volumen de celulas I volumen demedio.

Es dificUestablecer reglas en 10 que concierne a estos parametres. sinembargo. en la gran mayoria de los casos, se recomienda un cambio de medlo

cada semana (en ciertos casos cada 3 dias). Varios estudios han demostrado

que durante la fase de crecimiento la suspension celular puede acabar

rapldamente con varios de los nu trientes. Por ejemplo, Browny Beevers (1987)

demostraron que en suspensiones de arroz. el fosfato y el azucar del medio

fueron limitantes despues de 7dias de cultivo. Existe tambien gran evidencia

de que la division celular se favorece en presencia de reguladores tipo auxina

como el 2.4-D: el picloram. etc. Por el contrarlo, la forrnaclon de embriones

somatlcos requiere de una dtsmtnuclon en la concentraclon en auxina y la

Introducclon de citocininas al medio de cultivo.




Tarnblen es muy importante conslderar el cultlvo de celulas en presencia

de "nodrizas". En efecto, en Ia mayoria de los casos, cuando se trata de

suspensiones de celulas aisladas (es decir obtenidas a traves de un flltro de

50 j4 ) la division celular y el crecimiento de estas celulas dependen de la

presencia cercana de un tejido "nodrlza" que proporcione a las celulas los

metabolitos necesarios.

Existe varlos tipos de nodriza como por ejemplo: los callos embrtogenlcoe

o mertstematlcos, EI cultivo con nodriza puede realizarse en varias formas.

Una es el cultlvo de las celulas aisladas en presencia de nodrtzas (callo)en su

alrededor 0tam bien se puede precondicionar un sustrato dejando la nodriza

un cierto tiempo y removlendola al momento de inocular las celulas aisladas.

Se plensa as! que las sustancias necesarias al buen desarrollo de las eelulas

aisladas son proporcionadas a traves del medio de cultivo.

Una vez que las condiciones de cultivo son establecldas. se puede

multiplicar una suspension. Para esto se realizan divisiones sucesivas de la

masa celular colocandose estas en otros recipientes.

Evaluaci6n del crecimiento:

Existen diferentes metodos para Ia evaluaclon del crecimiento de una

suspension de celulas.

•Conteo de celulas:

Es necesario en este caso tener una suspension sin agregados grandee,

de 10 contra rio se haria necesario un tratamiento con enzimas tipo pectinasa

(0.1% durante 16 h a 262C). EI conteo se realiza usando un microscopio.

•Determinaci6n del volumen celulari

Se toma una fracclon deIasuspension celular y se transflere a un tubo

graduado de centrifugacton. Despues de centrifugarla durante 3 minutos a

2500 rpm. el material celular sedimenta y se puede apreciar el volumen

celular, Se expresa en mi de celulas por ml de medio. Este metodo de

evaluaclon es facll y rapldo. Ademas, puede realizarse en condiciones

estertles, 10 que permite conservar la totalidad de Ia suspension.

•Pesofresco

• Peso seco

• Turbidez:




Usando un fotocolorimetro con filtro azul (400-465 nm).

• Indice miiotico:

Consiste en la evaluaclon del numero de celulas en estado de mitosis.

Este Indlce se calcula de la slgutente manera:

1M= Celulas en mitosis x

total de celulas

1 0 0

Regeneracion de plantas a partir de suspenstones celulares:

La regeneracton de plantas completas a partir de suspensiones celulares

puede ocurrir mediante varios procesos tales como: calla + organogenesis;

calla + embrtogenests sornatlca0

embrtogenests somatlca "directa". Por10

general. la regeneraclon a partir de callos ocurre despues de "platear" una

aUquota de la suspension sobre un medio semi-solido adecuado. La formaclon

de plantas a traves de la embrtogenesls somatlca puede ocurrir directamente

en el medio liquido 0despues del "plateo" sobre el medio seml-soltdo.

En general. el desarrollo de plantas a partir de suspensiones celulares

requiere una dlsmlnuclon de las auxinas y la Introduccion de citocininas.

Tamblen puede ser muy uttl la presencia del acldo abscisico (ABA)como

regulador de las divisiones celulares. EI ABA favorece la obtenclon deembriones sornattcos bien formados (evita los problemas de embriones plurt-

cotUedonarios) y tamblen lagermtnacton y la obtenclon de plantas completas.




METODOS DE CONSERVACION

DE LOS RECURSOS FITOGENETICOS

Durante los ultlmos anos el germoplasma vegetal. al Igual que otros

recursos naturales. se esta perdiendo en forma alarmante, en muchos casos

antes de percatarnos de su exlstencla, su potencial y su valor real. La

destruccton de los habitat. la selecclon natural. los agentes btotlcos y

paradojtcamente, el abandono de las variedades tradicionales en favor de las

nuevas variedades mejoradas, han sldo los factores involucrados en esta

erosion genetlca. Recordemos que el germoplasma vegetal es un recurso

irrenovable y que es vital para la seguridad allmentaria de la humanidad y por

ende para un desarrollo sostenible. Debido a esta erosion genenca aceleradade las especies vegetales se ha despertado gran Interes por desarrollar

metodos eficientes para conservar el germoplasma, esto es, preservar con la

mayor integridad posible toda la variabilidad dlsponlble en una especie dada.

I. CONSERVACION IN SITU

Idealmente ladiversidad vegetal deberia conservarse in situ coexistiendo

con otros organismos vivos en su ambiente natural. .Sin embargo. diferentes

experlenctas sefialan que a fin de garantizar la exlstencla del recurso, se

requlere de otros metodos de preservaclon. Como resultado. se han desarro-

llado sistemas de conservaclon ex situ.

II. CONSERVACION EX SITU

Estos metodos dependeran del tipo de propagaclon de la especie en

particular y /0el tipo de semilla que presentan.

Los bancos de semillas:

En general los bancos de semillas son adecuados para la conservaclon

a largo plazode especies con semillas ortodoxas, es declr, semillas que resisten

alto grado de desecaclon y almacenamiento a bajas temperaturas (entre 50C

y -20OC).Sin embargo. este tlpo de almacenamiento es inadecuado 0imposible

para un alto numero de cultivos debido a que poseen semUlas recalcitrantes

(no resisten la desecaclon y el almacenamiento por largos periodos sin perder

rapldamente la vlabllidad),0son propagados vegetativamente. Este es el caso

del cacao. coco. mango. hule, banano, aguacate, yuca, ptna, cafe. pimienta y

muchos otros cultivos. Para la conservaclon de especies con semillas




recalcitrantes 0 propagadas vegetativamente las colecciones en el campo y

mas reclentemente, las colecctones in vltro representan altematlvas a cons i-

derar.

Las coiecciones de campo:

Las colecciones de campo son dificiles de implementar presentandose

problemas como la decision del tamafio adecuado de la muestra para

conservar la diversidad genetlca. Dependiendo de la especle, esta podria

variar desde unos pocos individuos hasta miles de plantas para poder

mantener la heterocigocidad. Esto impllca que el espacio requerido para la

conservaclon sera considerable. mas aun cuando se piensa en conservaclon

de especies forestales. Por otra parte. cuando se piensa en conservaclon a largo

plazo este no serfa el metodo mas adecuado. Las plantas estan expuestas a

desastres naturales. agentes blotlcos, errores humanos y camblos en laspolittcas instltucionales 0gubemamentales. Ademas.Jos costos de manteni-

miento y labor son muy altos.

Conservaci6n in vitro:

Con el desarrollo de las tecnlcas de cultlvo de tejidos es posible la

conservaclon y el intercambio de germoplasma vegetal in vltro. La conserva-

cion in vltro ha estado sujeta a dtscuslones, principalmente debido a que el

germoplasma debe mantenerse bajo estrictos controles de asepsia. Sinembargo. esto es precisamente 10 que permite el intercambio de material

vegetal entre paises sin pasar por el periodo de cuarentena. Esta tecnlca ofrece

muchas otras ventajas. por ejernplo, permite el almacenamiento de gran

numero de especies en un espacio reducldo, se elimina el riesgo de ataques

de plagas y enfermedades. Para aquellos materiales de ciclos cortos se puede

alargar los perfodos de transferencta, ademas, es posible producir y mantener

plantas libres de virus con altas tasas de multtplicacton y todo esto indepen-

diente de las condiciones cllmatlcas.

Bajo esta modalidad la conservaclon puede realizarse:

1. a mediano plazo. modificando la tasa de crecimiento del cultivo para

alargar los periodos entre transferencias y por ende, disminuir los riegos de

vartaclon.

2. a largo plazo 0crioconservaci6n que consiste en suprimir totalmente el

crecimiento y metabolismo del material almacenandolo a~ltra bajas tempe-

raturas (rutrogeno liquldo, -196°C)por tiempo indefinido.




Oonservacton in vitro a mediano plazo:

EI metodo consiste en mantener los cultivos (yemas. plantulas 0

meristemos) en condiciones flslca (factores ambientales) y quimlcas (compo-

stolon del medio de cultlvo) que permltan extender al maximo el lntervalo de

transferencia a los medios de cultivo frescos. sin afectar su vlabilldad y

reduciendo la posibilldad de perdlda por manlpulaclon y contamlnaclon. La

reducclon en la tasa de crecimlento generalmente se logra dismlnuyendo en

unos grados la temperatura del ambiente y /0 Ia intensldad de la luz,

dependlendo la temperatura de almacenamlento de la sensibUidad de la

especie. Por ejemplo, IaRed Internacional para el Mejoramiento del Banano

y el Platano (INlBAP. en Ingles) conserva la colecclon mundial in vitro de

bananos y platanos bajo esta modalldad de crecimiento reducido almacenan-

do los merlstemos apicales a una temperatura de 152C y una Intensidad

Iuminlca de 2000 lux. Por otro lado, el Centro Intemacional de Agrtcultura

Tropical (CIAT)conserva la colecclon in vitro de yuca a 222C. ya que tempera-

turas inferiores a los 182Cson perjudiciales para estos materiales a menos que

la Intensidad lurninlca se reduzca por debajo de 500 lux. Sin embargo.

modificaciones en la concentraclon de nutrientes. reguladores de crectmlento,

presencia de osmottcos, oxigenaclon y el fotoperiodo son factores que tamblen

afectan el crecimiento.

Crtoconservacien 0Conservacton in vitro a largo plazo:

La crtoconservaclon consiste en lIevar material blologlco desde su

temperatura flslologtcarnente normal hasta ultra bajas temperaturas y de

nuevo a su temperatura normal sin causar dano. Esta tecnlca tiene sus raices

htstortcas en estudios realizados sobre Ia sobrevivencia de especies vegetales

en condiciones de temperaturas bajo cero grados centfgrados, en zonas

templadas y en la busqueda de resistencia a las heladas. sin embargo. no fue

sino hasta 1973 cuando se logro una verdadera crtoconservaclon en nttrogeno

Iiqutdo de celulas de zanahoria.

AIpresente, la crtoconservaclon se ha considerado como el unlco metodo

viable para el almacenamiento de germoplasma vegetal a largo plaza bajo

condiciones de alta estabilldad genetlca y con un minimo de mantenimiento.

Una vez que el material ha sido congelado a -196OC.las funciones metab611cas

cesan, por 10 tanto. no ocurre division celular, deterioro 0 mutaciones. Mas

aun, elmaterial puede permanecer en este estado por tiempo Indeflnldo, Otras

ventajas que presenta este metodo de almacenamiento son los bajos costos de

labor y mantenimiento y el reducido espacio requerido. Ademas, permite la

conservacton no solo de meristemos. sino tambten de embriones ctgottcos,somatlcos. callos embrtogentcos. polen y suspensiones celulares, es declr,

material generado en ellaboratorio y por ingenieria genetlca.




Requisitos para la crioconservaci6n de especies vegetales:

- Habilidad de cultivar el material in vitro.

- HabUidad de multlpllcarlo in vitro.

- Los materiales deben reststlr los pretratamientos y crioprotectores.

- El tejldo debe regenerarse despues del congelamiento.

Etapas en el proceso de crioconservaci6n:

a) La seleccion y aislamiento del material a conservar. En esta etapa se debe

de considerar la establlidad genettca tntrinseca del sistema. por 10tanto.

los meristemos y embriones son los materiales prloritarios en programas

de conservaclon de germoplasma.

b) Pretratamiento y crtoproteccton, se induce cierto grado de deshldrataclon

en las celulas y tejidos para evitar dafios causados por la formaclon de

cristales de hielo durante los procesos de congelamiento y

descongelamiento. El material puede cultivarse desde unos pocos

minutos hasta varios dias en presencia de sustancias crloprotectoras

como la sacarosa, gltcerol, sulfoxldo de dimetilo y otras. Ademas de

inducir una deshldrataclon protectora, estas sustancias disminuyen la

temperatura a la cual el agua intracelular se congela e intervienen en la

establllzaclon de membranas y en la protecclon de sitios de enlace de

enzimas durante el proceso de congelamiento.

c) Congelamtento, este puede ser ultra rapldo por Inmerston directa en

nltrogeno liquido 0lento siendo necesario un congelador prograrnable

para obtener resultados precisos y reproducibles. El almacenamiento en

nttrogeno liquido es recomendable ya que las fases liquida y vapor se

estabillzan a -150Q

C. 10que evita el deterioro progresivo del material.

d) Descongelamlento, ella mayoria de los cas os se realiza por Inmerston de

los viales que contienen las muestras en banos de agua a 40QC. sin

embargo. se han reportado algunas excepciones donde el

descongelamiento lento ha sido necesario.

e) Recuperaclon. es el tratamiento a que se somete el material despues del

descongelamiento. Consiste en ellavado 0dlluclon de loscrioprotectores

y el cultlvo de las muestras en condiciones opttmas para asegurar sucrecimiento.




Durante los ulttmos 20 afios las investigaciones en esta area han

generado gran numero de reportes sobre tecntcas desarrolladas para la

crtoconservaclon no solo de especies vegetales de clima templado sino

tamblen de especies tropicales comoMusa spp.•Manlhot esculenia, Theobroma

cacao. Elaels gulneensls. Coffea spp.• Rubus. Cocos nucifera, Saccharum

offtctnarum y muchas otras. Actualmente son pocos los laboratorios queutllizan lacrtoconservacton, sin embargo. el interes par conocer e implementar

este nuevo metodo de preservacion de germoplasma va en aumento.




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