19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 338 97721© Número de solicitud: 20080327551© Int. Cl.:

C12Q 1/08 (2006.01)

B01D 59/30 (2006.01)

12© SOLICITUD DE PATENTE A1

22© Fecha de presentación: 12.11.2008

43© Fecha de publicación de la solicitud: 13.05.2010

43© Fecha de publicación del folleto de la solicitud:13.05.2010

71© Solicitante/s: FUNDACIÓ PRIVADA INSTITUTCATALÀ DE NANOTECNOLOGÍACampus UAB, Edifici CM708193 Bellaterra, Barcelona, ESUniversidade de Vigo

72© Inventor/es: Merkoçi Hyka, Arben;Escosura Muñiz, Alfredo de la;González Fernández, África;Díaz Freitas, Belén ySánchez Espinel, Christian

74© Agente: Zea Checa, Bernabé

54© Título: Método de identificación de células con nanopartículas de oro por reducción de iones hidrógeno.

57© Resumen:Método de identificación de células con nanopartículas deoro por reducción de iones hidrógeno.El método de identificación de células comprende la uniónde proteínas específicas de superficie de las células in-movilizadas en la superficie del transductor electroquími-co con anticuerpos específicos conjugados con nanopar-tículas de oro, y la posterior detección y cuantificación dela nanopartícula mediante la generación de hidrógeno ca-talizada por dicha nanopartícula a un potencial apropiado.También comprende su aplicación en un método de diag-nóstico y/o pronóstico de una enfermedad que implique laexpresión de proteínas de superficie de las células y loskits correspondientes.

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Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

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DESCRIPCIÓN

Método de identificación de células con nanopartículas de oro por reducción de iones hidrógeno.

La presente invención se refiere a un método de identificación de células, basado en el uso de nanopartículas deoro conjugadas a anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células y en la utilización de un métodoelectrocatalítico para la detección de estas nanopartículas, así como su aplicación en el diagnóstico y/o pronóstico deuna enfermedad.

Estado de la técnica

La detección de células, en particular células tumorales, ha sido un campo de gran interés en los últimos años. Esteinterés es debido al hecho de que la presencia de estas células en sangre periférica es indicativa de una enfermedad,así como de una baja efectividad en tratamientos terapéuticos.

Los métodos actuales utilizados para el diagnóstico, como por ejemplo citometría de flujo e histoquímica son pocoprecisos, caros, con tiempos de análisis largos y requieren de instrumentación muy avanzada. En los últimos años sehan desarrollado nuevos métodos basados en la detección de células utilizando anticuerpos específicos.

Por otro lado, el uso de biosensores para la identificación de células se ha desarrollado para el seguimiento delos cambios morfológicos y fotoquímicos de células adheridas a estos sensores, usando un sistema de detección deimpedancia eléctrica y el estudio de la respuesta celular a sustancias químicas, como por ejemplo la monitorizaciónde la acidificación del medio en cultivos de células vivas.

En alguno de los métodos mencionados anteriormente, se requiere la inmovilización de las células en una su-perficie, como la superficie de un transductor electroquímico. Esta inmovilización se realiza mediante técnicas deadsorción, sándwich, de atrapado o uniones covalentes entre otras. Estas técnicas presentan el inconveniente que difi-cultan la fijación de las células en la superficie del transductor y su posterior análisis. Asimismo, la limitación básicade las técnicas de adsorción y atrapado pasivo es la inestabilidad de las células durante el uso continuado de éstas.

Se ha demostrado que un aumento en la porosidad de la superficie favorece esta inmovilización celular. Las nano-partículas pueden utilizarse para inducir este aumento de la porosidad, formando interfases o matrices biomiméticasno tóxicas entre la célula y la superficie del transductor electroquímico. La débil interacción entre las nanopartículas yla superficie de las células aporta un ambiente similar a un sistema nativo y permite una mayor libertad de orientaciónde las biomoléculas. Estas matrices poliméricas están formadas por las nanopartículas y productos con una buenabiocompatibilidad y alta capacidad gelificante como puede ser el chitosan. En estos casos concretos que existe unrecubrimiento de la superficie del transductor, la detección de la presencia de las células se realiza mediante la corre-lación mostrada entre el incremento de la resistencia de transferencia de electrones y la concentración de las célulasen la superficie del transductor.

En el caso de las nanopartículas de oro (AuNPs), éstas presentan propiedades electroactivas que hacen que ladetección electroquímica esté especialmente indicada, aprovechando así las ventajas intrínsecas de las técnicas elec-troquímicas (tales como polarografía Diferencial de Pulso, voltamperometría de pulso diferencial, voltamperometríade onda cuadrada y potenciometría) como son su rapidez, sencillez y bajo coste. Habitualmente, esta detección se lle-va a cabo indirectamente, disolviéndolas en una mezcla de ácido bromhídrico/bromo y detectando posteriormente lasolución de Au3+ resultante. Últimamente se han desarrollado métodos de detección directa, basados en una oxidaciónelectroquímica de las AuNPs a Au3+ (cf. Pumera et al., “Direct voltammetric determination of gold nanoparticles usinggraphite-epoxy composite electrode”, Electrochimica Acta 2005, vol. 50, pp 3702-3707) sobre la superficie del trans-ductor electroquímico y posterior detección in-situ. Asimismo, existen otros métodos indirectos basados en el efectocatalítico que ejercen las AuNPs sobre la reducción de ciertos iones. En la mayoría de estos casos, la sensibilidad dela detección se aumenta por deposición química o electroquímica de plata en la superficie de la nanopartícula.

Aunque estos métodos catalíticos presentan una mayor sensibilidad que los métodos directos, todavía existenciertos inconvenientes, como por ejemplo, tiempos de análisis prolongados debido a la complejidad de los procesosimplicados en la detección, o el estricto control de las condiciones de reacción, como es el caso de las condiciones dedeposición de la plata sobre la superficie de la AuNPs.

Así, de lo que se conoce en el estado de la técnica se desprende que todavía existe la necesidad de proporcionarmétodos que aporten una mayor sensibilidad, exactitud y rapidez, y que al mismo tiempo, requieran instrumentaciónmás sencilla y manejable, para mejorar la identificación de células y establecer más rápidamente el diagnóstico y/o elpronóstico de una enfermedad.

Explicación de la invención

Los investigadores han encontrado un método de identificación de células, basado en el uso de nanopartículas deoro conjugadas a anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células a identificar y en la utilizaciónde un método electrocatalítico que mide la corriente catódica generada en la evolución de hidrógeno por reducción delos iones de hidrógeno del medio, siendo la reducción catalizada por las nanopartículas de oro.

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Este método es ventajoso porque permite la identificación de células mediante un método rápido y sensible, asícomo llevar a cabo el diagnóstico y/o de pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un paciente susceptiblede presentar la enfermedad y sus correspondientes kits de identificación, de diagnóstico y/o de pronóstico de manerarápida y precisa.

Así, un aspecto de la presente invención es proporcionar un método de identificación de células que comprende:(a) Poner en contacto un transductor electroquímico y las células a identificar en un medio de cultivo apropiado a unatemperatura determinada y durante el tiempo necesario, para inmovilizar y hacer crecer las células en la superficiedel transductor electroquímico; (b) Poner en contacto una suspensión de nanopartículas de oro con un anticuerpo ocombinación de anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células a identificar; (c) Poner en contactolas células inmovilizadas en la superficie del transductor electroquímico con las nanopartículas de oro (8) resultantesde la etapa (b), a una temperatura apropiada; (d) Aplicar un potencial reductor durante un tiempo apropiado en unmedio ácido, con lo cual se produce la reducción catalizada por las nanopartículas de oro (8), de los iones hidrógenodel medio a hidrógeno; (e) Medir la corriente catódica generada en la reducción de los iones hidrógeno; (f) Restarel valor neto de la corriente generada por el transductor electroquímico sin células inmovilizadas, del valor obtenidoen el apartado (e) y correlacionar la diferencia de intensidad de corriente observada con la presencia o ausencia denanopartículas de oro (8) unidas a las proteínas de superficie de las células a identificar.

Este método de identificación de células está basado en las propiedades catalíticas de las nanopartículas de oropara la generación de hidrógeno a partir de los iones hidrógeno. Las nanopartículas de oro en un medio ácido aun potencial adecuado, reducen catalíticamente los iones hidrógeno, generando hidrógeno y una corriente catalí-tica asociada. Esta corriente se mide cronoamperométricamente. La cronoamperometría consiste en someter a unpotencial fijo al electrodo de trabajo y registrar la corriente generada a lo largo del tiempo. Para ello, se puede uti-lizar cualquier potenciostato-galvanostato que integre un sistema de medida y registro de corrientes. Posteriormen-te se correlaciona la diferencia de intensidad de corriente generada con la presencia o ausencia de las células deinterés.

Un sistema potenciostato-galvanostato permite realizar pruebas electroquímicas, suministrando una diferencia depotencial controlada y registrando la corriente que circula a través de una celda electroquímica (modo Potenciostato)o suministrando una corriente controlada registrando la diferencia de potencial en las terminales de la celda (modoGalvanostato).

El método catalítico de generación de hidrógeno catalizado por partículas metálicas ha sido descrito anteriormentepara la cuantificación de iones metálicos tales como complejos de platino (II) y oro (I). Así, por ejemplo, los com-plejos de oro se han utilizado en la detección de secuencias específicas de ADN (cf. M. Díaz-González et al., “DNAhybridization biosensors using polylysine modified SPCEs”, Biosensors and bioelectronics 2008. vol. 23, pp. 1340-1346). Por otro lado, también se han utilizado nanopartículas de oro formando parte de inmunocomplejos de partículasmagnéticas con anticuerpos específicos conjugados y se han cuantificado mediante detección electroquímica directa,aplicando la técnica de voltamperometría diferencial de pulso (cf. A. Ambrosi et al., “double-codified gold nanolabelsfor enhanced immunoanalysis”. Analytical Chemistry 2007, vol. 79, pp. 5232-5240). Sin embargo, aunque el métodocatalítico de generación de hidrógeno para la identificación de complejos de oro es conocido, nunca se ha sugeridopara la identificación y cuantificación de AuNPs ni su aplicación en la identificación de células.

Otra ventaja del método de identificación de células de la invención es que permite reducir el tiempo de análisisconsiderablemente, incluso hasta llegar a valores de 30 segundos. De este modo, se pueden llevar a cabo los métodos dediagnóstico y/o de pronóstico de la invención de manera más rápida y eficiente. Se ha observado que la corriente neta(diferencia entre la señal y el blanco) de catálisis es mucho más estable a tiempos cortos al utilizar las nanopartículasde oro conjugadas a anticuerpos específicos de la invención con respecto a los complejos de oro descritos en el estadode la técnica para el propósito de generar corriente.

Por otro lado, este método permite la inmovilización y crecimiento de células en la superficie del transductorelectroquímico, lo que también aumenta la sensibilidad y favorece la disminución del tiempo de análisis. La detecciónen el mismo medio donde se inmovilizan y/o se proliferan las células a identificar, facilita la disminución de etapas ycomo consecuencia la simplificación del método.

Como se ha mencionado anteriormente, el método de la invención utiliza un transductor electroquímico. Un trans-ductores un dispositivo capaz de transformar o convertir un determinado tipo de energía, en otra diferente de salida.Concretamente un transductor electroquímico es el dispositivo que mide propiedades químicas de las sustancias talescomo pH y potenciales de oxidación por medios electroquímicos. En una realización preferida, el transductor elec-troquímico utilizado para la identificación de células es un electrodo de carbono serigrafiado (“screen-printed carbónelectrode”, SPCE) (cf. Fig. 1).

En una realización particular, la inmovilización de las células en la superficie del transductor electroquímico selleva a cabo a una temperatura adecuada, preferentemente a 37ºC.

En otra realización particular, la etapa (a) del método de identificación de células de la presente invención se llevaa cabo en una atmósfera que comprende un contenido de dióxido de carbono del 5%.

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Generalmente, la incubación de la nanopartícula de oro con el anticuerpo específico o combinación de anticuerposde las proteínas de superficie que corresponde a la etapa (b) del método de identificación de la invención, se realiza a25ºC, preferentemente durante aproximadamente 20 minutos.

Por otro lado, otra manera de aumentar la sensibilidad y selectividad del método es mediante el bloqueo o satura-ción de la superficie de la nanopartícula que se encuentra libre de anticuerpo. Para alcanzar esta saturación, se puedenutilizar diferentes técnicas, como por ejemplo aumentar la concentración de los mismos anticuerpos específicos ofragmentos de éstos en la etapa (b) o adicionar proteínas capaces de unirse inespecíficamente a la superficie libre delas nanopartículas.

En una realización preferida, las nanopartículas de oro (8) resultantes de la etapa (b), se ponen en contacto con unasustancia capaz de saturar la superficie de la nanopartícula libre de anticuerpo, como por ejemplo albúmina de suerobovino (BSA) o caseína. En una realización particular, se utiliza BSA a una temperatura de 25ºC durante 20 minutos.

En otra realización particular, la incubación de las células inmovilizadas en la superficie del transductor electro-químico con el anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos conjugados con la nanopartícula de oro 8 y conel BSA se realiza a 37ºC durante 30 minutos.

Generalmente, el pH del medio ácido de la etapa (d) del método de identificación de células es igual o inferior a 5.Preferentemente, el pH es igual o inferior a 3. En una realización preferida, el medio ácido se alcanza por adición deun ácido seleccionado entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y ácido acético. En una realización máspreferida, el ácido es ácido clorhídrico. En otra realización preferida, la muestra a identificarse somete a un potencialreductor comprendido entre -0.6 v y -1.4 v. Preferentemente, se aplica un potencial de pretratamiento de +1.35 vdurante 1 minuto después de la etapa (c). En una realización particular, el potencial de reducción aplicado es de -1 v yel tiempo de aplicación 30 segundos.

En otra realización particular, la corriente catódica generada en la etapa (d) se mide cronoamperométricamente.

El método comprende en una etapa posterior comparar esta corriente generada por células que presentan las pro-teínas de superficie conjugadas con la nanopartícula, como por ejemplo, las células HMY (DR+) 6 como se ilustraen el ejemplo 7, con la corriente generada por la adición de una solución de ácido clorhídrico 1 M a un blanco sincélulas inmovilizadas o a un blanco de células inmovilizadas que no expresen la proteína de superficie conjugada conla nanopartícula de oro tal como células PC3 7. Éstas últimas son células de la línea tumoral de cáncer de próstataque no expresan la proteína de superficie DR. Así, en este caso concreto, se puede correlacionar de manera rápida ladiferencia de intensidad observada con la presencia o ausencia de nanopartículas de oro 8 conjugadas con anti-DRmAb y BSA unidas con la proteína de superficie de las células a identificar HMY (DR+) 6 (cf. Fig. 2).

En otra realización preferida, las células se seleccionan entre células tumorales y células inflamatorias que expresenproteínas específicas en la superficie de la célula. Preferentemente células tumorales. Y en otra realización particular,las células tumorales son de la línea tumoral HMY 6 que expresa en superficie moléculas de HLA-DR.

Otro aspecto de la presente invención es un método de diagnóstico y/o de pronóstico de una enfermedad en mues-tras aisladas de un paciente susceptible de presentar la enfermedad, que comprende llevar a cabo el método de identi-ficación de células definido anteriormente en la presente invención sobre dicha muestra aislada, donde el anticuerpo ocombinación de anticuerpos específicos de la etapa (b) son marcadores específicos de la enfermedad a identificar.

Los marcadores específicos son sustancias producidas por las células a identificar o inducidas por el huéspedante la presencia de una enfermedad que permiten establecer el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad, realizarsu seguimiento o comprobar la eficacia de un tratamiento. En este caso concreto, los marcadores utilizados debenexpresarse en la superficie de la célula.

En una realización preferida, las células a identificar se seleccionan entre células tumorales y células inflamatoriasque expresen los marcadores específicos de la enfermedad en la superficie de célula. Preferentemente, son célulastumorales.

Otro aspecto de la presente invención es un kit de identificación de células, diagnóstico y/o de pronóstico de unaenfermedad en muestras aisladas de un paciente, que comprende los medios necesarios para llevar a cabo cualquierade los métodos de identificación de células, diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad definidos anteriormente enla presente invención.

En una realización preferida, los medios necesarios para la identificación de células comprenden las nanopartículasde oro conjugadas con el anticuerpo o combinación de anticuerpos 8.

En una realización más preferida, el kit además comprende un transductor electroquímico. En una realizaciónparticular, el transductor electroquímico es un SPCE.

Tal y como se ha comentado durante la presente invención, las nanopartículas de oro están conjugadas con unanticuerpo o combinación de anticuerpos específicos de la proteína de superficie de la célula a identificar.

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Por el término “anticuerpo” se entiende un anticuerpo entero, incluyendo sin límite un anticuerpo quimérico, huma-nizado, recombinante, transgénico, injertado y de única cadena, y similares, o cualquier proteína de fusión, conjugada,fragmento, o derivados de éstos que contengan uno o más dominios que se unan selectivamente a proteínas especí-ficas de superficie. El término anticuerpo incluye también una molécula de inmunoglobulina entera, un anticuerpomonoclonal, o un fragmento inmunológicamente efectivo de alguno de éstos.

Por un fragmento de anticuerpo se entiende un Fv, un disulfuro unido a fragmentos de Fv, scFv, Fab, F(ab’), o F(ab’)2, que son bien conocidos en el estado de la técnica. Un fragmento de un anticuerpo representa cualquier partedel mismo con un tamaño adecuado y una conformación para unirse a las proteínas de superficie.

Por el término “Fv” se entiende un fragmento variable de un anticuerpo. Por el término “scFv” se entiende unfragmento variable de cadena sencilla que corresponde a la mitad de un Fab donde únicamente está presente la parteque aporta la especificidad. El scFv se obtiene por la unión de la parte variable de las cadenas pesadas y ligeras de unanticuerpo.

Por el término “Fab” se entiende un fragmento de un anticuerpo y de unión a un antígeno. Por el término “F(ab’)”se entiende el fragmento de anticuerpo obtenido por la digestión de un anticuerpo entero con el enzima pepsina y porel término “F(ab’)2” se entiende el fragmento de anticuerpo obtenido por la digestión de un anticuerpo entero con elenzima papaína.

También se considera parte de la invención el método de identificación y cuantificación de nanopartículas de oroque comprende: (a) Poner en contacto una mezcla de nanopartículas de oro en un medio ácido, con la superficie deun transductor electroquímico; (b) Aplicar un potencial reductor durante un tiempo apropiado, con lo cual se producela reducción catalizada por las nanopartículas de oro, de los iones hidrógeno del medio a hidrógeno; (c) Medir lacorriente catódica generada en la reducción de los iones hidrógeno; (d) Restar el valor neto de la corriente generadapor el transductor electroquímico en un medio ácido, del valor obtenido en el apartado (c) y correlacionar la diferenciade intensidad de corriente observada con la presencia o ausencia de nanopartículas de oro presentes en el medio y/ocon la concentración de nanopartículas de oro presentes en el medio.

Una ventaja de este procedimiento de identificación y cuantificación de nanopartículas de oro es que el efectocatalítico del oro en las nanopartículas se observa a potenciales menos negativos y se presenta de una manera másconstante y reproducible, que cuando se utilizan complejos de oro. Ello conlleva un menor tiempo de análisis paraconseguir una estabilización de la señal y por otro lado, evita el daño del electrodo.

En una realización preferida el transductor electroquímico utilizado en la etapa (a) del método de identificación ycuantificación de nanopartículas de oro es un electrodo de carbono serigrafiado.

En una realización preferida, el potencial de reducción aplicado está comprendido entre -0.6 v y -1.4 v y en unarealización particular, este potencial es de -1 v y el tiempo de aplicación 30 segundos.

Generalmente, el pH del medio ácido de la etapa (d) del método de identificación de células es igual o inferior a 5.Preferentemente, el pH es igual o inferior a 3. En una realización preferida, el medio ácido se alcanza por adición deun ácido seleccionado entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y ácido acético. En una realización máspreferida, el ácido es ácido clorhídrico.

En otra realización preferida, el método de identificación y cuantificación de nanopartículas de oro además com-prende aplicar un potencial de pretratamiento después de llevar a cabo la etapa (a). En una realización particular, estepotencial es +1.35 v y se aplica durante 1 minuto.

En otra realización preferida, la corriente catódica generada en la etapa (c) se mide cronoamperométricamente.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluirotras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajasy características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de lapresente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa un SPCE, utilizado como transductor electroquímico que comprende tres electrodos: 1 elelectrodo de referencia de plata, 2 el electrodo de trabajo de carbono de 4 mm de diámetro para un volumen de muestramáximo de 50 µl y 3 el electrodo auxiliar. También se representa la capa aislante 4 y los contactos eléctricos 5.

La Figura 2 representa en el apartado A un ejemplo del método de identificación de células HMY 6 utilizandocélulas PC3 7 como blanco y las nanopartículas 8 conjugadas con el anticuerpo monoclonal anti-humano de ratón (anti-DR mAb) y BSA. En el apartado B se representa los cronoamperogramas obtenidos por aplicación de un potencial de-1.40 v durante 5 minutos por adición de 50 µl de una solución de HCl 1 M, donde 9 representa un blanco del SPCE

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con ácido clorhídrico. Las unidades del cronoamperograma se representan a continuación: t es tiempo, s son segundos,i es intensidad de corriente y µA son microamperios.

La Figura 3 representa un ejemplo de un voltamperograma cíclico registrado desde +1.35 v hasta -1.40 v a unavelocidad de barrido de 50 mv/s, después de adicionar 50 µl de una solución de HCl 1 M directamente en la superficiedel SPCE (curva blanco 10) o sobre la muestra de nanopartícula 8 conjugada con anti-DR mAb (curva 11) y BSA. Lasunidades del voltamperograma se representan a continuación: E es potencial, v son voltios, i es intensidad de corrientey µA son microamperios.

La Figura 4 representa imágenes de microscopio de líneas celulares de tumor humano B HMY 6 y de líneascelulares de tumor humano de próstata PC3 7 creciendo en cámara (parte superior) o en placa de petri (parte inferior).

La Figura 5 representa fotografías del sistema de incubación utilizando placa de 8 pocillos en cámara (A, B y C) oplaca de Petri (D).

Ejemplos

Consideraciones generales

Trihidrato de Tetracloroaurato (III) de hidrógeno (HAuCl4·3H2O, 99.9%) y citrato trisódico se compraron a Sig-ma-Aldrich. Todos los reactivos tampones y otros productos químicos inorgánicos fueron suministrados por Sigma,Aldrich o Fluka, salvo que se indique lo contrario. Todos los productos químicos se utilizaron tal y como se recibierony todas las soluciones acuosas se prepararon con agua doblemente destilada. El tampón de solución fosfato (PBS)consiste en 0.01 M fosfato salino tamponado, 0.137 M NaCl y 0.003 M KCl (pH 7.4). El ácido clorhídrico (HCl) escalidad de análisis. Sus soluciones se prepararon con agua ultra-pura.

Las líneas de células tumorales utilizadas en este estudio fueron HMY 6 (HLA-DR+) y PC3 7 (HLA-DR-). Todaslas células se cultivaron en el medio RPMI 1640 (Gibco, Life technologies, Grand Island, Escocia) suplementado con10% de suero fetal bovino (FCS) (PAA, Linz, Austria), penicilina (100 U/ml) y glutamina (2 mM) (Gibco) a 37ºC enuna atmósfera humidificada con un contenido de CO2 del 5%.

Las mediciones de la expresión de HLA-DR se llevaron a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal HLA-DRantihumano de ratón (mAb) (Immunotech, Marsella, Francia).

Las células se visualizaron con microscopios invertidos y directos (Olympus IX50 y BX51 respectivamente, Olym-pus Optical. Tokyo, Japón) y las fotografías se tomaron con una cámara Olympus DP71.

El transductor electroquímico utilizado para el crecimiento in-situ de las células se construyó por los investigadoresy era un SPCE. El sustrato utilizado es una hoja de poliéster transparente (Austostat HT5 de la empresa McDermidAutotype) y el tamaño total del sensor era 29 mm x 6.7 mm (cf. Fig. 1).

La corriente generada se registró mediante cronoamperometría, utilizando un potenciostato-galvanostato IviumCompactstat (Ivium Technologies, Holanda).

Ejemplo 1

Voltamperograma cíclico en HCl 1 M

Se añadieron 50 µl de HCl 1 M en la superficie del SPCE y se registró un voltamperograma cíclico desde +1.35 vhasta -1.40 v, a una velocidad de barrido de 50 mv/s, obteniendo una curva del blanco 10.

Por otro lado, se mezcló 25 µl de una solución de HCl 2 M con 25 µl de una solución de las AuNPs 8 conjugadascon anti-DR mAb y BSA. La mezcla resultante se depositó en la superficie de otro SPCE. De nuevo se registró unvoltamperograma cíclico desde +1.35 v hasta -1.40 v, a una velocidad de barrido de 50 mv/s, obteniendo una curva11, en donde se observa un desplazamiento de potencial respecto a la curva 10, que corresponde al efecto catalítico delas nanopartículas 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSA (cf. Fig. 3).

Ejemplo 2

Incubación de células en frasco

Las líneas celulares HMY 6 y PC3 7 se cultivaron en un medio de cultivo a 37ºC en una atmósfera humidificadacon un contenido de CO2 del 5% durante 48 h en un frasco de cultivo de tejidos (Falcon, Belcton Dickinson andCompany Franklin Lakes, NJ, USA).

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Ejemplo 3

Incubación de células en la superficie del SPCE en cámara

El electrodo de trabajo 2 se introdujo dentro de una Lab-TekTM con placas de 8 pocillos (Nunc, Thermo Fisherscientific), después de eliminar la junta, se fijó con el medio de cultivo mounting. A continuación, se añadieron encada pocillo 200.000 células en 700 µl del medio de cultivo y se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada conun contenido de CO2 del 5% durante 48 h. (cf. Fig. 4 y 5 (A, B y C)).

Ejemplo 4

Incubación de células en la superficie del SPCE en placa de Petri

Se introdujeron los SPCE en las placas de petri Corning®, DxH35 mm x 10 mm, sin tratar (SIGMA-ALDRICH).A continuación se añadieron 200.000 células en 3 ml de medio de cultivo y se incubaron a 37ºC en una atmósferahumidificada con un contenido de CO2 del 5% durante 48 h (cf. FIG 4 y 5D).

Ejemplo 5

Síntesis de las nanopartículas de oro y su conjugación con anti-DR mAb y BSA

Las nanopartículas se prepararon por reducción del tetracloroaurato (III) de hidrógeno con citrato trisódico, segúnmétodo descrito por Turkevich (cf J. Turkevich et al., Faraday Discussion of the Chemical Society. 1951, vol. 11, pp.55-75). A una solución de 200 ml de HAuCl4 0.01% en ebullición con agitación vigorosa, se adicionaron rápidamente5 ml de una solución de citrato trisódico. Cuando la mezcla de reacción se volvió de color rojo intenso, indicando laformación de las nanopartículas de oro, la solución se enfrió manteniendo la agitación.

Se mezclaron 2 ml de la suspensión de nanopartículas de oro con 100 µl (de 100 µg/ml) de anti-DR mAb yse incubaron a 25ºC durante 20 minutos. A continuación se realizó una etapa de bloqueo con 150 µl (de 1 mg/ml)de albúmina de suero bovino (BSA) manteniendo la temperatura a 25ºC durante 20 minutos. Finalmente, la mezclaresultante se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 minutos y las nanopartículas 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSAse reconstituyeron con PBS.

Ejemplo 6

Incubación de células con las nanopartículas 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSA

Una vez las células habían crecido en la superficie del SPCE, se lavaron con PBS. A continuación se adicionaron50 µl de una solución de nanopartículas 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSA sobre el electrodo de trabajo 2 y semantuvieron durante 30 minutos a 37ºC.

Ejemplo 7

Señal analítica basada en la generación de hidrógeno catalizada por la nanopartícula 8 conjugadas con anti-DR mAby BSA y, registro de la corriente generada

Las células se lavaron con PBS y a continuación se adicionaron 50 µl de una solución de HCl 1 M sobre lasuperficie de los 3 electrodos 1 2 y 3. Después, el electrodo de trabajo 2 se sometió a un primer potencial de +1.35v durante 1 minuto y luego se aplicó un segundo potencial de -1 v durante 300 segundos, registrándose la corrientecatódica generada.

Esta corriente generada se registra por cronoamperometría. Para ello, se puede utilizar cualquier potenciostato-galvanostato que integre un sistema de medida y registro de corrientes. En este caso, se utiliza un Ivium Compactstat.

Aunque en este ejemplo el potencial de reducción se aplica durante 300 segundos, el tiempo de aplicación podríareducirse hasta 30 segundos, ya que a partir de 30 segundos la corriente catódica generada por la reducción de losiones hidrógeno se encuentra estabilizada en el tiempo, tal y como se observa en la figura 2B.

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REIVINDICACIONES

1. Método de identificación de células que comprende:

(a) Poner en contacto un transductor electroquímico y las células a identificar en un medio de cultivo apropiadoa una temperatura determinada y durante el tiempo necesario, para inmovilizar y hacer crecer las células enla superficie del transductor electroquímico;

(b) Poner en contacto una suspensión de nanopartículas de oro con un anticuerpo o combinación de anticuerposespecíficos de las proteínas de superficie de las células a identificar;

(c) Poner en contacto las células inmovilizadas en la superficie del transductor electroquímico con las nano-partículas de oro (8) resultantes de la etapa (b), a una temperatura apropiada;

(d) Aplicar un potencial reductor durante un tiempo apropiado en un medio ácido, con lo cual se produce lareducción catalizada por las nanopartículas de oro (8), de los iones hidrógeno del medio a hidrógeno;

(e) Medir la corriente catódica generada en la reducción de los iones hidrógeno;

(f) Restar el valor neto de la corriente generada por el transductor electroquímico sin células inmovilizadas,del valor obtenido en el apartado (e) y correlacionar la diferencia de intensidad de corriente observada conla presencia o ausencia de nanopartículas de oro (8) unidas a las proteínas de superficie de las células aidentificar.

2. Método de identificación según la reivindicación 1, donde el transductor electroquímico es un electrodo decarbono serigrafiado.

3. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el potencial de reducción estácomprendido entre -0.6 v y -1.4 v.

4. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el medio ácido se alcanza poradición de un ácido seleccionado entre el grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico yácido acético.

5. Método de identificación según reivindicación 4, donde el ácido es ácido clorhídrico.

6. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además comprende poner en contactolas nanopartículas resultantes de la etapa (b) con una sustancia capaz de saturar la superficie de la nanopartícula.

7. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que además comprende aplicar un poten-cial de pretratamiento después de llevar a cabo la etapa (c).

8. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la corriente catódica de la etapa(d) se mide cronoamperométricamente.

9. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde las células se seleccionan entrecélulas tumorales y células inflamatorias.

10. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde las células son células tumorales.

11. Uso del método de identificación de células según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para diagnósticoy/o pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un paciente susceptible de presentar la enfermedad, dondeel anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos de la etapa (b) son marcadores específicos de la enfermedad aidentificar.

12. Uso del método de identificación de células según la reivindicación 11, para diagnóstico y/o pronóstico de unaenfermedad, donde las células a identificar se seleccionan entre células tumorales y células inflamatorias.

13. Kit de identificación de células, diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un pa-ciente, donde los medios necesarios para la identificación de células comprenden las nanopartículas de oro conjugadascon el anticuerpo o combinación de anticuerpos (8).

14. Kit según la reivindicación 13, que además comprende un transductor electroquímico.

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15. Método de identificación y cuantificación de nanopartículas de oro que comprende:

(a) Poner en contacto una mezcla de nanopartículas de oro en un medio ácido, con la superficie de un trans-ductor electroquímico;

(b) Aplicar un potencial reductor durante un tiempo apropiado, con lo cual se produce la reducción catalizadapor las nanopartículas de oro, de los iones hidrógeno del medio a hidrógeno;

(c) Medir la corriente catódica generada en la reducción de los iones hidrógeno;

(d) Restar el valor neto de la corriente generada por el transductor electroquímico en un medio ácido, del valorobtenido en el apartado (c) y correlacionar la diferencia de intensidad de corriente observada con la presen-cia o ausencia de nanopartículas de oro presentes en el medio y/o con la concentración de nanopartículasde oro presentes en el medio.

16. Método de identificación según la reivindicación 15, donde el transductor electroquímico es un electrodo decarbono serigrafiado.

17. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, donde el potencial de reducción estácomprendido entre -0.6 v y -1.4 v.

18. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde el medio ácido se alcanza poradición de un ácido seleccionado entre el grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico yácido acético.

19. Método de identificación según reivindicación 18, donde el ácido es ácido clorhídrico.

20. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 15-19, que además comprende aplicar unpotencial de pretratamiento después de llevar a cabo la etapa (a).

21. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 15-20, donde la corriente catódica de laetapa (c) se mide cronoamperométricamente.

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OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© ES 2 338 977

21© Nº de solicitud: 20080327522© Fecha de presentación de la solicitud: 12.11.2008

32© Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA

51© Int. Cl.: C12Q 1/08 (2006.01)B01D 59/30 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría 56© Documentos citados Reivindicacionesafectadas

Categoría de los documentos citadosX: de particular relevanciaY: de particular relevancia combinado con otro/s de la

misma categoríaA: refleja el estado de la técnica

O: referido a divulgación no escritaP: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación

de la solicitudE: documento anterior, pero publicado después de la fecha

de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado

�5 para todas las reivindicaciones � para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe Examinador Página

16.02.2010 Mª D. García Grávalos 1/5

X US 20080050769 A1 (HUANG et al). 28.02.2008, página 1, 13párrafos 0010-0013; página 2, párrafos 0024-0026; página 3,párrafo 0049 - página 4, párrafo 0054; reivindicaciones 1-5.

A 1-12,14-21

X US 20070031337 A1 (HUANG et al). 02.02.2007, página 1, 13párrafo 0010 - página 2, párrafo 0011; página 3,párrafo 0026 - página 4, párrafo 0036; página 5, párrafo 0040.

A 1-12,14-21

X PISSUWAN D et al. Gold Nanosphere-Antibody Conjugates for 13Hyperthermal Therapeutic Applications. Gold Bulletin. 2007,Vol 40(2), páginas 121-129, todo el documento.

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X EL SAYED IH et al. Surface Plasmon Resonance Scattering and 13Absorpcion of anti-EGFR Antibody Conjugate Gold Nanoparticles inCancer Diagnostics: Applications in Oral Cancer. Nano Letters.2005, Vol 5(5), páginas 829-834, todo el documento.

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INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: 200803275

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C12Q, B01D

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos debúsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE

Informe sobre el Estado de la Técnica (hoja adicional) Página 2/5

OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 200803275

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 16.02.2010

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-12, 14-21 SÍReivindicaciones 13 NO

Actividad inventiva Reivindicaciones 1-12, 14-21 SÍ(Art. 8.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 13 NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase deexamen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión:

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como ha sido publicada.

Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 200803275

1. Documentos considerados:

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la reali-zación de esta opinión.

Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 4/5

Documento Número Publicación o Identificación Fecha PublicaciónD01 US 20080050769 A1 28-02-2008

D02 US 20070031337 A1 08-02-2007

D03 PISSUWAN D et al. Gold Bulletin. 2007, Vol 40(2), páginas 121-129.

2007

D04 EL SAYED IH et al. Nano Letters. 2005, Vol 5(5), páginas 829-834. 2005

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo,de patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud divulga un método catalítico de generación de hidrógeno para identificación de células, empleando untransductor electroquímico sobre cuya superficie se inmovilizan las células unidas a anticuerpos específicos, conjugados connanopartículas de oro. Aplicando un potencial reductor se determina la diferencia de corriente generada que indica la presenciao ausencia de las células unidas a las nanopartículas de oro (reivindicaciones 1-10). Se reivindica también su uso para diag-nóstico y/o pronóstico de una enfermedad, especialmente cáncer (reivindicaciones 11-12); así como un kit de identificación(reivindicaciones 13-14). También se refiere a un método para identificar y cuantificar nanopartículas de oro (reivindicaciones15-21)

El documento D01 divulga un método de detección de biopartículas (virus, bacterias, células) en muestras biológicas, pordielectroforesis, empleando un sustrato de electrodos entrelazados en forma de peine sobre el que se deposita la muestra,mezclada con anticuerpos conjugados a nanopartículas de oro. Una vez realizada la implementación, las biopartículas, re-tenidas en los electrodos, pueden ser identificadas y cuantificadas, aplicando señales alternativas de bandas de frecuenciaespecífica y comparando la impedancia que muestran las biopartículas retenidas en los bordes de los electrodos con la obteni-da en un modelo de referencia con electrodos vacíos (ver página 1, párrafos 0010-0013; página 2, párrafos 0024-0026; página3, párrafo 0049 - página 4, párrafo 0054; reivindicaciones 1-5)

El documento D02 divulga el uso de nanopartículas de oro unidas a anticuerpos específicos de células cancerígenas, paradetectar y caracterizar tumores, mediante un sistema de tomografía computada y terapia de protones, aumentando la precisiónde este sistema e incrementado el efecto de la radiación (ver página 1, párrafo 0010 - página 2, párrafo 0011; página 3, párrafo0026 - página 4, párrafo 0036; página 5, párrafo 0040)

El documento D03 divulga la preparación y caracterización de nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos que se unenselectivamente a células macrófagas; así como su uso en terapia fototermal "in vivo" (ver todo el documento)

El documento D04 se refiere al uso de nanopartículas de oro, conjugadas a anticuerpos monoclonales que reconocen losfactores de crecimiento epidérmico, para diagnóstico y estudio "in vivo" e "in vitro" de células de cáncer oral epitelial (ver todoel documento)

OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 200803275

Hoja adicional

Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita hoja adicional) Página 5/5

1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)

El objeto técnico de la presente solicitud es un método catalítico de generación de hidrógeno para identificación de células,empleando transductor electroquímico y nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos para las células. Serefiere también a su uso para diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad y a un método para identificar y cuantificar lasnanopartículas de oro.

1.1. REIVINDICACIONES 1-21

El documento D01 se considera el más cercano al Estado de la Técnica, ya que anticipa un método de detección de bio-partículas y diagnostico de una enfermedad, empleando nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos. Losdocumentos D02-D04 también anticipan la obtención nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos y su usopara diagnóstico y/o terapia de cáncer. Sin embargo el método reivindicado en la presente solicitud, difiere de los descritos enestos documentos en que ninguno de ellos hace referencia a un método catalítico, ni al uso de un transductor electroquímico.

En consecuencia, las reivindicaciones 1-12 y 14-21 cumplen el requisito de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1LP11/1986).

Sin embargo, según lo expuesto en los documentos D01-D04, la invención tal y como se recoge en la reivindicación 13, carecede novedad y de actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP11/1986)