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Memorias del Curso Importancia de la muestra clínica para el diagnóstico de laboratorio

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Comité Organizador

HISTORIA CLÍNICA

Díaz Zarco Soledad* Zamora Espinosa José Luis*

Gutiérrez Castillo Adriana del Carmen**

*Integrante del Cuerpo Académico en Salud Animal

**Integrante del Cuerpo Académico en Patogénesis Microbiana

INTRODUCCIÓN

Entre los elementos imprescindibles para la integración de un buen diagnóstico se encuentra la historia clínica o anamnesis, pilar fundamental en la toma de decisiones para la solicitud del análisis clínico pertinente y el establecimiento del diagnóstico definitivo.

La historia clínica es un instrumento de investigación clínica; se puede definir como un documento donde se recoge la información que procede de la práctica clínica relativa a un enfermo. Es el conjunto de datos obtenidos a través de un interrogatorio para conocer los antecedentes de la enfermedad desde su inicio hasta su posible pronóstico, con la finalidad de identificar las motivaciones (causas) de la alteración morfológica o funcional y los sentimientos (síntomas), la posible causa de muerte y la conexión entre ambas. Así tenemos una idea clara de que órganos y sistemas se deben estudiar con mayor detalle y las técnicas diagnósticas específicas. Estos datos se vierten en un formulario, instrumento básico para establecer un orden en la obtención de información.

La historia clínica es el elemento clave para el ejercicio clínico profesional, pues actúa como recordatorio para el manejo clínico del paciente, permitiendo el análisis retrospectivo del quehacer médico. En toda institución médica, de salud o de diagnóstico, la historia clínica es el archivo más importante, contiene información vital para la gestión médica, administrativa y legal. A la información básica se pueden integrar módulos de diferentes especialidades como el de laboratorio y estudios complementarios de diferentes especialidades o específicos según las necesidades de cada usuario. Es importante considerar todos los datos del propietario, por ejemplo: domicilio, teléfono, correo electrónico, referencias del predio en caso de que se requiera llevar a cabo actividades de vigilancia epidemiológica, etc. El valor de la historia clínica radica en saber obtener, ordenar, analizar y relacionar la información de manera lógica, pues de esta forma orienta las investigaciones a una dirección determinada para llegar al diagnóstico.

CONSIDERACIONES PARA LA OBTENCIÓN DE LA INFORMACIÓN

La persona encargada de elaborar la historia clínica debe evitar en lo posible las preguntas capciosas, saber conducir el interrogatorio para evitar datos confusos y de poca importancia, infundir confianza al cliente, también contará con habilidad para el interrogatorio y obtener de manera metódica y completa la información sin omitir datos importantes y evitando la necesidad de repetir la investigación, cobrando mayor relevancia en aquellos casos en donde el diagnóstico corresponde con una enfermedad zoonótica, exótica o de alto impacto a la salud animal.

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Es conveniente permitir al dueño que narre la historia con sus propias palabras y completarla con preguntas especialmente orientadas. Las anotaciones de lo que se refierea, deben ser descriptivas y no interpretativas. Es conveniente que se compruebe la validez de los datos ya que puede ser que nos enfrentemos ante un caso de negligencia por parte de alguno de los posibles responsables. Debe advertirse si la información es tendenciosa debido a posibles contradicciones cuando lo sugerido no concuerda con los resultados de los exámenes clínicos y posmortem. Recordar que en algunos casos como peritaje, reclamaciones, determinación de incapacidad total o permanente, etc., este documento podrá tener valor legal. La exactitud de los datos muestra no solo la preparación técnica del médico y su acuciosidad para obtenerlos, sino también su capacidad de relación, su inteligencia para entender al individuo que sufre y su habilidad para conseguir la información necesaria. La información puede obtenerse por diferentes vías como:

Anamnesis, es la información surgida de la entrevista clínica proporcionada por el propio encargado/dueño.

Exploración física o clínica.

Pruebas o exámenes complementarios realizados por el médico.

Juicios de valor que el propio médico extrae o de documentos que él elabora para fundar un diagnóstico, prescribir el tratamiento y, finalmente, dejar constancia del curso de la enfermedad.

FUNCIONES DE LA HISTORIA CLÍNICA

Permite conocer los antecedentes de la enfermedad.

Orienta hacia la selección de muestras para el estudio de laboratorio.

Conduce a resultados confiables y exactos.

Indica cómo manejar al animal en casos de riesgo a la salud pública, reforzando las medidas de bioseguridad.

Permite valorar el impacto ambiental.

Permite seleccionar la técnica de eutanasia (NOM-033-ZOO-1995, Sacrificio Humanitario de los animales domésticos y silvestres).

Permite realizar la disposición zoosanitaria adecuada de los residuos peligrosos biológicos infecciosos relacionados con cadáveres o muestras biológicas (Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995).

Realizar una serie de estudios estadísticos de áreas seleccionadas para tal fin.

Permite realizar listados de clientes, enfermedades, especies afectadas, etc., dependiendo del campo de interés, indicando la característica de los mismos.

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La historia clínica es una fuente de información que debe estar relacionada con los elementos que integran el proceso epizoótico, es decir, agente, hospedero y ambiente relacionado con el animal o con las poblaciones animales. Esta información debe ser ordenada cronológicamente y registrarse en los formatos que para tal efecto se elaboran Para ello se sugiere que la información recopilada en la historia clínica, satisfaga aspectos importantes como: Administrativos y de gestión. Son datos utilizados para el control interno, es el elemento fundamental para el control y gestión Médico-legal. De vigilancia epizootiológica. La información recopilada en la historia clínica, debe responder en un momento dado a las necesidades requeridas por el formato del Sistema de Información y Vigilancia Epidemiológica (SIVE), publicado en el Diario Oficial de la Federación el 6 de diciembre de 1995; así como en aquellos padecimientos normados a través de campañas nacionales y en cuyo caso se debe emplear el formato específico y en aquellas enfermedades con características exóticas o en problemas en donde está involucrada la salud pública. Los datos así recopilados, deben poder ser procesados en paquetes de cómputo con fines de análisis del proceso salud-enfermedad, caracterizando la problemática de la salud animal o de la salud pública para la implementación de programas control y de medicina preventiva. Docencia e investigación. A partir de las historias clínicas pueden realizarse estudios e investigaciones sobre determinadas patologías. Mejora continua de la calidad. La historia clínica es un fiel reflejo de la relación médico-paciente así como un registro de la actuación médica prestada al paciente De diagnóstico. La información deberá ser obtenida de acuerdo a los períodos que integran la historia natural de la enfermedad; el prepatogénico y el patogénico con la finalidad de relacionarla cronológicamente. En el período prepatogénico (antes de que inicie la enfermedad) es cuando interactúan los tres elementos de la triada epizootiológica del proceso epizoótico (hospedero, agente y ambiente). A través del interrogatorio, se busca identificar el momento en que tal interacción rompe con el equilibrio y predomine el agente etiológico sobre el hospedero, bajo condiciones adversas del medio ambiente o la susceptibilidad del hospedero. Agente. Es todo elemento biótico o abiótico que al estar en contacto con el hospedero y que bajo condiciones ambientales adversas para el hospedero, tiene la capacidad de producir desequilibrio entre la homeostasis del hospedero y el ambiente. La Norma Oficial Mexicana NOM-056-SSA-1-1993 lo define como toda substancia química, microorganismos, tipo de energía, actividad o relación social que puede alterar la salud. Hospedero. Es todo ser vivo que puede albergar un agente o bien, sufrir los efectos de este. El hospedero puede caracterizarse desde el punto de vista individual y poblacional, bajo diferentes factores de riesgo como edad, raza, sexo, función zootécnica, inmunizaciones, alimentación, tipo de explotación, densidad de población, posibles agentes etiológicos, micro y macroclima. Eventos individuales. Son los datos en detalle del hospedero afectado de manera individual que incluyen desde la identificación hasta la evolución de la enfermedad. Eventos poblacionales. Comprende la historia sanitaria del rebaño o parvada en lo que se refiere a su perfil epizootiológico, estudios diagnósticos retrospectivos. Total de la población, número de

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animales enfermos (morbilidad), número de animales muertos del total de la población (mortalidad), número de animales muertos de los que enfermaron (letalidad), con estos indicadores nos damos idea de la patogenicidad, virulencia, forma de transmisión del agente en la población o la susceptibilidad del hospedero, número de especies animales existentes, edades, movilización de animales y visitas, lugar de procedencia, tratamientos indicados y evolución, inicio y duración de la enfermedad. Ambiente. El examen del hospedero debe estar acompañado por el estudio de su ambiente considerado como todo aquello que lo rodea. Se puede abarcar desde dos puntos de vista: 1. Macroambiente. El cual se refiere a condiciones ambientales generales tomando en cuenta

ubicación geográfica, topografía, hidrología, precipitación pluvial, altitud, humedad relativa, orografía, clima, temperatura, etc.

2. Microambiente. Es el medio ambiente más cercano al hospedero y puede abarcar desde un

local hasta la unidad de producción en su totalidad. El período patogénico se compone de dos etapas; la preclínica que manifiesta el efecto predominante del agente sobre el hospedero, iniciando con alteraciones morfológicas en diferentes niveles que para fines de diagnóstico son: celular, tisular, orgánico, individuo o población y como consecuencia alteraciones funcionales en el correspondiente nivel, a partir de este momento termina esta etapa e inicia la etapa clínica en donde rebasa la línea imaginaria conocido como horizonte clínico, en donde se identifican a través de la manifestación de los signos e interpretación de los mismos, los síntomas por parte de la persona encargada o del clínico, los indicadores de enfermedad. Este período termina de acuerdo con la interrelación de los elementos de la triada, en particular la patogenicidad y virulencia del agente, la resistencia o susceptibilidad del hospedero y las condiciones medioambientales existentes, con la recuperación del hospedero en diferente grado, quedar incapacitado o llegar a la muerte. De la caracterización de éste período depende en gran medida la orientación diagnóstica que se elabore y por lo tanto las medidas contraepizoóticas que se implementen.

BIBLIOGRAFÍA

Blood DC, Studdert VP. (1988): Diccionario de veterinaria Vol. I. Interamericana Mc Graw-Hill, México. Doxey DL. (1978): Patología Clínica y Procedimientos de Diagnóstico en Veterinaria. El Manual Moderno, México. http://www.biocom.com/sistema/historias_clinicas/historia_clinica_informatica.html (2010) McCurnin DVM. (1987): Técnicas Veterinarias. El Manual Moderno, México. Perusquia JMT, Paasch ML. (1985): Necropsia en Aves. Radostits OM, Mayhew IG, Houston DM. (2002): Examen y diagnóstico clínico en veterinaria. Saunders, España.

http://www.biocom.com/sistema/historias_clinicas/historia_clinica_informatica.html

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MUESTRA

Diaz Zarco Soledad* Velázquez Ordóñez Valente*

Alonso Fresán Ma. Uxúa*


INTRODUCCIÓN

El mantener la salud de los animales domésticos en forma óptima es un requisito indispensable para el proceso de producción de la economía planificada. Las enfermedades infecciosas y no infecciosas adquieren en este contexto una importancia especial, la cual debe tomarse en consideración por medio de un diagnóstico rápido y eficiente, así como una valoración epizootiológica y respectivas medidas contraepizoóticas. El conocimiento de las enfermedades que afectan a los animales domésticos ha aumentado considerablemente en los últimos años. Para reconocer verdaderamente a las enfermedades debe tenerse conocimiento especial sobre su etiología, epizootiología, patogenia, diagnóstico, inmunología y medidas profilácticas para su utilización racional en el trabajo práctico. Las enfermedades de los animales domésticos representan un papel importante desde el punto de vista económico y de salud pública. Mientras la amenaza de algunas enfermedades ha sido totalmente eliminada o en parte reducida en los países desarrollados, en algunos países en desarrollo todavía se sufre un incremento en la incidencia de diversas enfermedades o el desconocimiento de la existencia de algunas otras, debido principalmente a la falta de una base sólida para el diagnóstico. Esto, aunado a la escasa información sobre la presencia de enfermedades y a la poca comunicación entre los profesionistas expertos en el área, repercute en pérdidas económicas a corto y largo plazo, lo cual debe tomarse en consideración y establecer sistemas de diagnóstico rápido y eficiente para determinar la presencia y distribución de enfermedades así como investigación continua para identificar brotes de enfermedades nuevas y una valoración epizootiológica y respectivas medidas de prevención y control, que garanticen la salud animal.

MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO

La consulta de laboratorios privados u oficiales para el control de enfermedades, a través del envío de muestras es una herramienta auxiliar para el Médico Veterinario en la solución de problemas. Con frecuencia este esfuerzo es inútil por un manejo inadecuado o por la recolección de la muestra no representativa. Para lograr los mejores beneficios en cuanto al apoyo de los laboratorios de diagnóstico, es necesario tener en cuenta los principios básicos sobre la correcta selección, empaquetado y envío de la muestra. Criterios de selección: Es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad de los individuos objeto de estudio, este procedimiento dependerá del tipo de producto y de la finalidad del examen.

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Muestra: Es todo aquel material biológico obtenido del individuo vivo o muerto, de la población susceptible o de su ambiente y representativa del problema de estudio. En procesos morbosos, la selección de la muestra debe recaer en el animal que se encuentre en etapa temprana de la fase aguda de la enfermedad y acorde a los datos de la historia clínica. Es preferible remitir varios especímenes de la población, sobre todo en brotes epizoóticos y en animales cuyo costo por unidad no sea tan elevado, deben elegirse animales recientemente muertos y varios en diversos estadíos de la enfermedad. Es conveniente señalar que el envío de los especímenes para el laboratorio deberá realizarse tan rápido como sea posible, ya que se corre el riesgo de su inutilización por descomposición, tenemos entre las causas más frecuentes, las siguientes:

Hemólisis, en las muestras de sangre impide los exámenes serológicos o hematológicos y puede ser causada por:

– Empleo de jeringa o aguja húmeda. – Vaciado brusco a través de la aguja. – Agitación indebida. – Calentamiento o enfriamiento excesivo. – Descomposición bacteriana. – Contaminantes químicos.

Llenado excesivo (que hace que se pierda la proporción sangre: anticoagulante o bien no se forme coágulo).

Descomposición o desarrollo bacteriano, las principales causas son:

– Contaminación ambiental, con material fecal o intestinal. – Temperaturas elevadas durante el transporte. – Transporte de larga duración.

Autolisis, se debe a la digestión de tejidos por sus propias enzimas y se presenta en tejidos que han sido empacados en conservadores de acción leve, volumen inadecuado o por temperaturas elevadas.

Desecación, puede presentarse sobre todo por:

– Muestra escasa. – Cerrado no hermético que permita la evaporación.

Fragmentación, da por resultado un examen histopatológico inadecuado, puede ser causada por:

– Emplear tijeras o cuchillos sin filo para el corte de los tejidos. – Forzar la muestra en envases de poca capacidad. – Utilizar fijadores o conservadores en cantidad insuficiente o inadecuada. – Congelar la muestra o tejido.

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Conservación de la muestra Existen numerosas sustancias conservadoras, cada una tiene sus propias ventajas o limitaciones, sin embargo el criterio de selección deberá basarse en el tipo de análisis que se requiera, tipo de muestra y tiempo desde la obtención de la muestra hasta su procesamiento.

La refrigeración, es útil en las muestras donde se requieren procesos bacteriológicos, serológicos y anatomopatológicos. Para la refrigeración es recomendable el uso de recipientes que contengan el material refrigerante, como bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua del deshielo o el refrigerante alcance directamente a la muestra, para la refrigeración puede usarse:

– Hielo natural. – Hielo seco. – Líquido refrigerante.

Conservadores químicos, se clasifican según sus efectos como deshidratantes y fijadores y son utilizados en muestras para estudios histopatológicos, entre los que destacan:

CONSERVADOR CONCENTRACIÓN – Formaldehído 4 al 10 %. – Acido acético 0.3 a 0.5 %. – Acido pícrico 100 % (solución saturada). – Acido crómico 0.5 al 2 %. – Dicromato de potasio 1 a 2 %. – Tetraóxido de osmio 1 a 2 %. – Acetona 73 al 100 %.

Soluciones bactericidas, serán utilizadas cuando sea necesario mantener el desarrollo bacteriano en un nivel mínimo y tomando en cuenta el tipo de proceso requerido.

– Formalina al 10 %. – Fenol al 0.5 %. – Tolueno.

ENVÍO

El manejo y transporte de la muestra debe efectuarse de tal manera que se evite la ruptura y filtración de los empaques y que esto altere o contamine la misma. Durante el envío, las muestras no deberán exponerse a la luz solar directa. Los especímenes deben ser empacados en materiales impermeables, éstos a su vez introducidos en recipientes de mayores dimensiones a prueba de fugas de agua donde se llena el espacio vacío con la unidad de refrigeración y empacados nuevamente en cajas que contengan material absorbente como papel o aserrín. Las muestras deben ser enviadas debidamente cerradas, etiquetadas y acompañadas por la historia clínica que contenga los datos de: Tipo y número de muestras, tipo de conservador, fecha y hora de obtención de la muestra, tratamiento indicado, dosis, frecuencia, evolución y diagnóstico presuntivo.

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CONSIDERACIONES PARA DETERMINAR EL TAMAÑO DE MUESTRA

Cuando el proceso patológico está afectando a varios individuos de la población, es necesario obtener indicadores epidemiológicos a través de un diagnóstico de situación que den a conocer con mayor precisión el comportamiento de la enfermedad, la información se obtiene a partir de encuestas y estudios. Por lo general, una encuesta supone realizar el recuento de los miembros de un conjunto agregado de unidades y valorar sus características tales como peso, producción, presencia de una enfermedad, niveles de anticuerpos, etc. Un estudio sin embargo, supone realizar la comparación de grupos y por lo general se efectúa para poner de manifiesto la causa de la enfermedad. Si la encuesta se planifica correctamente, puede hacerse una estimación razonablemente precisa de una variable mediante el examen de algunos de los individuos de la población principal, es decir de una muestra, para tal efecto puede recurrirse a la selección intencionada que consiste en la elección de una muestra cuyas medias de sus características cuantitativas o cuya distribución de sus características cualitativas sean similares a las de la población. Su objetivo consiste en seleccionar una muestra en las que las características estén equilibradas con las de la población. Para determinar el tamaño de la muestra en necesario considerar los objetivos del estudio, las circunstancias de la investigación, la precisión deseada de la estimación de la prevalencia y la frecuencia esperada de la enfermedad. El diseño de la muestra es un componente esencial de las encuestas y estudios analíticos. Por ejemplo, los datos de investigaciones de brotes o datos recogidos rutinariamente de registros de hospitales o de clientes, pueden ser considerados como procedentes de una muestra de la población, aunque no se ha empleado un muestreo metódico; hay menos problemas en la extrapolación de los datos obtenidos de un muestreo planificado que de los datos, cuya obtención no fue planeada previamente. Los datos de una muestra planificada procedentes de la población describen los caracteres (es decir frecuencia o distribución de la enfermedad o de niveles de producción) de una población y permite comprobar asociaciones específicas entre sucesos y factores de la población. Si el estudio es una encuesta o un estudio analítico, la forma en que los individuos de estudio se obtengan de la población, es decir, el método de muestreo, determinará la precisión y la naturaleza de las extrapolaciones que vayan de la muestra a la población. Aunque la muestra en sí es solamente una parte del diseño del estudio analítico, su importancia radica en que los tipos de estudios que se realicen se basan en la estrategia de la selección de las muestras, considerando los siguientes puntos: - Establecer objetivos claros y concisos que incluyan los parámetros que van a estimarse y la unidad de interés. - Es importante que la muestra sea representativa de la población diana. - Antes de seleccionar la muestra, la población a muestrear debe dividirse en unidades de muestreo. El tamaño puede variar desde un individuo a un conjunto de individuos, como camadas, piaras o rebaños.

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- Finalmente, es importante los métodos que se van a utilizar. Las determinaciones exactas del tamaño de la muestra requerida para una encuesta pueden ser muy pormenorizadas y la mayoría de las encuestas complejas pueden requerir la ayuda de un estadístico.

BIBLIOGRAFÍA

Coffin DL. (1986): Laboratorio Clínico en Medicina Veterinaria. 3ªed., La Prensa Médica Mexicana, México. Aluja SA, Casas FC. (2002): Técnicas de necropsias en animales domésticos. El Manual Moderno, México. FMVZ. (SF): Técnica de Necropsia. Manual de Referencia Técnica del Diagnóstico No. 17. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UAEM. Salinas MJA. (1994): Las enfermedades Infecciosas del Ganado en México. Enfermedades Infecciosas del Ganado y el TLC, Simposium Internacional, Monterrey, N.L. Secretaría de Salud (1994). Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM -109-SSA1-1994, bienes y servicios. Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Diario Oficial de la Federación, 4 de noviembre, 68-72. Thrusfield M. (1990): Veterinary Epidemiology. Butterworths, London.

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BIOSEGURIDAD

M. en C. Ada Elia Díaz González Borja, Dra. Adriana del Carmen Castillo Gutiérrez,

M. en C. Valente Velázquez Ordoñez, M. en C. Raúl C. Fajardo Muñoz.

La formación es la clave de la eficacia de la bioseguridad, y debe ser facilitada a todas las personas que están expuestas a los riesgos de tipo biológico y no biológico tanto en el laboratorio como en el campo. Estas deben responsabilizarse de su propia seguridad y de la de sus compañeros una vez que las normas de seguridad han sido establecidas, aprobadas, escritas y asumidas. Bioseguridad

Es el manejo técnico adecuado, en laboratorio y campo, por el personal expuesto a riesgos peligrosos biológico infecciosos principalmente y cuya eficiencia refleja el entrenamiento del personal y se traduce en la protección del mismo, de las instalaciones y del medio ambiente.

Objetivo:

Proteger, proveer seguridad laboral, adopción de prácticas seguras que eviten accidentes y disminuyan riesgos de exposición (biológicos, químicos y físicos), tener conocimiento de la conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos elementos y crear conciencia sobre la cultura de riesgos biológicos infecciosos.

La bioseguridad está estructurada en tres barreras de protección, las cuales se dividen exclusivamente para fines académicos ya que en la práctica se consideran como un todo que debe abordarse de manera simultánea: Barrera de protección al agente: Esta barrera se refiere a la integridad de la muestra contra la degradación o contaminación que pudiese poner en peligro la validez de esta, para ello es necesario considerar los siguientes puntos: • Información pertinente. • Protección. • Aislamiento. • Identificación • Manejo. Estos puntos ayudan a determinar la patogenicidad relativa, forma de transmisión, establecer el nivel de seguridad para un manejo adecuado e integridad del mismo. Así como establecer la protección de la persona que lo está manejando y la protección al medio ambiente.

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Barrera de protección al personal que labora en el laboratorio. Consiste en proteger al personal del laboratorio contra exposiciones innecesarias e injustificadas a agentes infecciosos, y para ello debe seguir lineamientos como son: • Conocer el manual de normas y procedimientos del área de trabajo, porque todo

profesional tiene el derecho y el deber de conocer a profundidad los riesgos de su profesión.

• Establecer buenas prácticas de trabajo y disciplina. • Implementar medidas de seguridad en técnicas y procedimientos a medida que se

desarrollan. • Dotación de ropa y equipo de protección persona (REPP). Su uso reduce la

probabilidad de lesiones y exposición a agentes infecciosos y disminuye el riesgo de adquisición de enfermedades ocupacionales, lo cual no significa que la REPP sea un substituto de una buena práctica de trabajo. La utilización de un equipo equivocado creará un riesgo adicional al operario al inspirar en éste un falso sentido de seguridad.

• La REPP debe ser seleccionado en función de la actividad a desarrollar y del máximo nivel de riesgo que se espera encontrar.

• Implementar un botiquín de primeros auxilios, con el material necesario para actuar inmediatamente ante un accidente de laboratorio de tipo biológico. Este debe estar a la vista y de fácil acceso.

• Supervisión. • Capacitación. • Señalamientos. • Avisos. Barrera de protección al medio ambiente: La función básica de esta barrera es mantener a los agentes infecciosos confinados para evitar su diseminación y se conviertan en un problema de salud pública o animal. • Control y manejo adecuado de residuos peligrosos biológico infecciosos. • Tratamiento y disposición adecuada de residuos peligrosos biológicos infecciosos. • Control de visitas y del personal. • Control de vectores. • Control de vehículos. • Saneamiento ambiental. Para lograr el equilibrio de estas barreras, es necesario conocer los niveles de riesgo, grado de desarrollo técnico del laboratorio y necesidades de personal de laboratorio para el desarrollo de los procesos técnicos.

CLASIFICACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS EN GRUPOS DE RIESGO BIOLÓGICO

Los agentes infecciosos han sido clasificados en cuatro grupos de riesgo (Comité de Expertos OMS 1978), para facilitar el manejo adecuado de los agentes patógenos, así como la implementación de prácticas seguras, tipo de contención, uso de equipo de protección personal, considerando los siguientes puntos: la capacidad patógena del

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agente, su forma de transmisión, gama de hospederos, disponibilidad de medidas de prevención eficaces, profilaxis (vacunas, antisueros, medidas de sanidad, control de vectores y reservorios etc.) y disponibilidad de un tratamiento eficaz. CLASIFICACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS EN GRUPOS DE RIESGO BIOLÓGICO GRUPO DE

RIESGO CARACTERÍSTICAS EJEMPLO

I

Escaso riesgo individual y comunitario Son microorganismos que tienen pocas posibilidades de provocar enfermedades humanas o enfermedades de importancia veterinaria.

E. coli. Salmonella enteritidis.

Salmonella dublin. Trichosporum cutaneum

II

Riesgo individual moderado y riesgo bajo de transmisión

Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o enfermedades en los animales, pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal que labora en la comunidad, el ganado o medio ambiente, pero se dispone de medidas eficaces de tratamiento y prevención, por tanto el riesgo de propagación es controlado.

S. pyogenes. S. aureus.

Coxiella burnetti Microsporum canis

Aspergillus fumigatus Blastomyces dermatitidis

III

Riesgo individual elevado, riesgo comunitario bajo. Agente patógeno que suele provocar enfermedades serias en las personas o en los animales pero no se trasmite fácilmente de un individuo a otro, para las cuales existen tratamiento y medidas preventivas.

Salmonella typhymurium Salmonella paratyphi

Brucella abortus Mycobacterium avium

P.aeruginosa Actinobacillus mallei

Histoplasma capsulatum

IV

Elevado riesgo individual y comunitario Agente patógeno que provoca enfermedades graves en las personas o en los animales y puede propagarse fácilmente, de un individuo a otro, directa o indirectamente. Y para las cuales no existe tratamiento ni medidas preventivas eficaces.

Bacillus anthracis

Es importante conocer el riesgo que representan los microorganismos infectantes, así como su correlación que existe entre el grupo de riesgo y el tipo de laboratorio. GRUPOS DE RIESGO CON RELACIÓN AL LABORATORIO

Grupo de riesgo

Clasificación del laboratorio

Ejemplo de laboratorio

Ejemplo de microorganismo

I

Básico De enseñanza básica

E. coli. Bacillus subtilis

II

Básico

De servicios primarios de salud De diagnóstico.

De enseñanza universitaria

Salmonella tiphy V. de la hepatitis B

M. tuberculosis

De diagnóstico Brucella sp.

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III Contención especializado. V. de la Fiebre de Lassa

IV

Contención máxima Que trabajan con patógenos peligrosos o de alta

seguridad (CPA)

V. de la Fiebre Aftosa V. Marburg

Las infecciones profesionales están relacionadas con el trabajo y son el resultado de exposiciones a microorganismos como bacterias, virus, hongos y parásitos. Las infecciones se presentan en profesionales al cuidado de la salud, después de un contacto con hospederos infectados, sus secreciones, excreciones, tejidos infectados y hospederos sintomáticos. Es por ello que personas al cuidado de la salud (veterinarios, médicos etc.) se encuentran en elevado riesgo de infección frente a microorganismos cuyos hospederos naturales pueden ser los animales y el hombre, un ejemplo de estas enfermedades son la brucelosis, dermatitis, tétanos, tuberculosis, candidiasis, histoplasmosis, dermatomicosis, enfermedades causadas por protozoarios y helmintos, toxoplasmosis, rabia, anquilostomiasis entre otras. anquilostomiasis entre otras.

FORMACIÓN DE AEROSOLES Y GOTAS El riesgo de exposición del personal al momento de tomar la muestra en campo o laboratorio es la formación de aerosoles y gotas, ya que estos se difunden rápidamente en el área de trabajo, este riesgo se minimiza evitando la manipulación de materiales infectados y buenas prácticas de bioseguridad.

Aerosol Infeccioso

Es una suspensión de partículas muy finas secas y con frecuencia húmedas en un gas (neblina) menores a 5 μ de diámetro, que son producidas durante el curso de muchos procesos.

Estos aerosoles no se asientan rápidamente y son dispersados por fuertes corrientes de aire a largas distancias en campo o en el laboratorio por los sistemas de ventilación, que al ser inhalados son transportados a los alvéolos pulmonares. Gotas Son partículas mayores a 5 μ de diámetro, por su tamaño

permanecen en el aire por períodos cortos de tiempo y no son respirables.

Estas partículas se asientan rápidamente en superficies inanimadas, en piel o membranas mucosas, representando un riesgo de infección, asociado a la contaminación directa de membranas mucosas, piel, ropa y equipo de protección personal.

Los procedimientos que generan aerosoles y gotas son: al manipular muestras líquidas, sólidas o polvos secos como: órganos y tejidos, mezclado, obtención de orina, sangre y leche, eliminar tapones de rosca, apertura de envases con material infecciosos cuya presión interna es diferente a la del ambiente, inoculación intranasal en animales.

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Ejemplo: la manipulación de órganos, esta actividad favorece la formación de aerosoles y gotas y contribuye a que se presente el riesgo de ingestión. Control Lavarse las manos con frecuencia.

No tocarse los ojos o la boca.

No consumir alimentos y bebidas.

Usar el equipo de protección personal.

PREVENCIÓN DE LA EXPOSICIÓN A AEROSOLES

El manejo seguro del agente infeccioso involucra utilizar una combinación de estrategias como: Control del material peligroso y su fuente para prevenir la liberación en el área de trabajo, minimizar la posibilidad de presentación de accidentes de material peligroso, protección de la persona que toma la muestra, como objetivo evitar el contacto de esta con la muestra (material infeccioso), conducta segura de trabajo, aunado a:

BUENAS PRÁCTICAS DE TRABAJO

La actitud y el modo de proceder de las personas que trabajan en el laboratorio o en el campo determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y la de las personas en general. Es por eso que la aplicación de las siguientes buenas prácticas de trabajo favorece su seguridad. 1. Manipular cuidadosamente fluidos infecciosos (orina, sangre, etc.), para evitar la

formación de aerosoles, goteo y la presentación de derrames. 2. Restringir el uso de agujas y jeringas y solamente usarlos en aquellos procesos donde

no hay alternativa. Esto es para evitar auto inoculación, se recomienda contar con un contenedor resistente a pinchazos para disponer en él agujas, jeringas y otros artículos agudos.

3. Usar equipo de protección personal, que consiste de botas de hule, overol o bata, anteojos de seguridad (goggles) mascarilla y careta parcial.

4. Lavarse las manos después de manipular animales enfermos, material infeccioso con jabón y abundante agua y para finalizar utilizar un desinfectante, como alcohol al 70%, solución de yodo o cloruro de benzalconio.

5. Desinfección de superficies de trabajo, antes y después de su uso e inmediatamente después de un derrame. Se puede utilizar alcohol al 70%, solución de hipoclorito de sodio (1 g/litro) para derrames de sangre y de 50 g/litro en presencia de materia orgánica

6. No comer, fumar, o almacenar comida en el área de trabajo.

Estas prácticas de trabajo son simples y efectivas, son a un mínimo costo y reducen grandemente el riesgo de exposición y dan como resultado mayor eficiencia y seguridad.

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VÍAS DE ENTRADA DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS Para que se produzca una infección debe estar presente cuatro elementos: un hospedero susceptible, un agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una vía de entrada apropiada. De todos estos factores, el que mejor se puede controlar es la vía de entrada. Las vías de entrada de los agentes biológicos al cuerpo son contacto, la oral, ocular, la inoculación directa, la vía la oral y la respiratoria. Las vías de entrada indican el tejido por el cual el agente patógeno penetra al organismo. La exposición a microorganismos dispersos o diseminados en forma de aerosoles o gotas infecciosas, es una importante fuente para adquirir una infección laboral. Mientras existan focos respirables, como primera fuente de infección, es esencial que las vías de entrada o acceso sean consideradas. A. Contacto B. Oral C. Ocular

D. Inoculación

E. Respiratoria

A. Contacto. Existen microorganismos capaces de invadir el cuerpo a través de la piel, ésta actúa como una barrera de defensa contra la infección microbiana. La piel al ser lesionada por: heridas, quemaduras, mordeduras de animales o cirugías, son una vía de acceso por la cual pueden penetrar microorganismos patógenos, que pueden multiplicarse en la piel, ingresar al sistema circulatorio y a tejidos internos. Agentes patógenos que penetran al organismo por contacto y causan enfermedad.

Enfermedad Agente patógeno Nivel de Riesgo

Ántrax B. anthracis (endoesporas). III

Tularemia Franciella tularensis II

Brucelosis Brucella abortus III

Leptospirosis Leptospira interrogans II

Pioderma Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes

II

Micosis Microsporum canis. Trichophyton sp

II

Tétanos Clostridium tetani II

EVITAR EL

RIESGO PROCEDIMIENTOS

Exposición

• Procedimientos que eviten la contaminación del cuerpo, material y superficies de trabajo.

• Complementado con el uso de equipo de protección personal, como guantes, ropa protectora de trabajo,

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por contacto

materiales absorbentes. • Usar guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que

contengan posibles patógenos. • Estos deben ser desechados antes de salir del área de

trabajo, nunca tocar con ellos el teléfono, equipo, etc. • Desinfección de superficies de trabajo.

Procesos que favorecen la exposición por contacto Goteo • Manipulación de órganos y tejidos.

• Obtención de sangre, orina etc. • Decantación de líquidos. • Remoción de tapas de recipientes de rosca • Mezclar en recipientes sin sello • Inoculación de animales.

Contaminación de superficies

• Se presenta a través de guantes contaminados y envío inadecuado de material o desechos contaminado

B. Oral. Los microorganismos que penetran al tracto gastrointestinal (TGI) están relacionados con la ingestión de alimentos y agua. Para que una infección se presente se requiere de una dosis infecciosa que sobrepase sus mecanismos de defensa. Numerosos procedimientos que se llevan a cabo, ofrecen exposición potencial indirecta por vía oral. Indirecta Se elimina con prácticas de higiene personal, como el lavado de

manos y no llevar cualquier objeto incluyendo los dedos a la boca.


Gastroenteritis Rotavirus RNA II

Hepatitis V. de la hepatitis tipo A II

Salmonelosis Salmonella typhi II

EVITAR EL

RIESGO

PROCEDIMIENTOS

Exposición Oral

El uso de mascarilla o careta facial, que protege contra salpicaduras de material infeccioso al interior de la boca.

C. Ocular. El ojo es una vía de acceso de patógenos, estos son capaces de provocar una infección cuando sobrepasan las barreras de defensa de este órgano, como son el arrastre de las lágrimas y al inactivar la lisozima y anticuerpos. Causas: Traumatismos del tejido ocular, penetración de aerosoles y contaminación con cuerpos extraños favorecen la presencia de infecciones oculares. Agentes patógenos que penetran al organismo por vía ocular y causan Enfermedad

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Conjuntivitis

Moraxella Staphylococcus aureus

Streptoccoccus pyogenes Pseudomona aeruginosa

I II II III

Algunas de estas infecciones son autolimitantes, en 8 días desaparecen, pero otras causadas por la Pseudomona aeruginosa, ocasiona daño corneal, ulceración y llega a perforarla.

EVITAR EL RIESGO

PROCEDIMIENTOS

Exposición

ocular

Se recomienda el uso de lentes de seguridad o goggles, éstos protegen contra aerosoles de sustancias biológicas. Salpicaduras de material infeccioso dentro de los ojos. El uso de careta facial proporciona protección a los ojos, contra impacto moderado y partículas en vuelo.

D. Inoculación. Un procedimiento simple que representa un riesgo de exposición, es el empleo de agujas y jeringas, usadas principalmente para la transferencia de material infeccioso a recipientes o bien para inocular animales de experimentación, procesos inadecuados dan como resultado la contaminación de la superficie corporal. La manipulación inadecuada de animales de experimentación inoculados con material biológico infeccioso, da como resultado la inoculación por picaduras, rasguños y mordidas.

EVITAR EL RIESGO

PROCEDIMIENTOS

Exposición

por inoculación

• El peligro inminente es la misma inoculación debido al uso de

agujas y jeringas, es por ello que se recomienda que su uso sea limitado y que se realice con cuidado.

• Nunca se debe volver a poner la capucha a las agujas y éstas no deben ser torcidas ni separadas de la jeringa.

• Las agujas y jeringas usadas, así como los bisturíes, deben ser desechados sólo en contenedores especiales diseñados para este propósito.

E. Respiratoria. Diariamente inhalamos de 10 000 a 20 000 litros de aire, lo que la hace ser una vía de acceso para muchos patógenos, permitiendo que muchos de ellos se queden en el sistema respiratorio provocando enfermedades infecciosas de tipo local o sistémica al ingresar al sistema circulatorio y diseminarse a otros sitios del organismo. Es importante mencionar que para que se establezca una infección, primero el agente patógeno debe sobrepasar las barreras de defensa inespecífica del tracto respiratorio

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inferior (macrófagos alveolares) y tracto respiratorio superior (cilios y secreción mucosa que en conjunto forman la carpeta mucociliar) encargada de restringir el paso de las partículas incluyendo los microorganismos. El tracto respiratorio superior está en contacto con el aire que contiene muchos microorganismos, aunado a que el tracto respiratorio inferior tiene un área bastante amplia que facilita el intercambio gaseoso además del intercontacto entre el sistema respiratorio y el circulatorio que permite la oxigenación de la sangre, es por ello que la posibilidad de infección es bastante alta. La transmisión por el aire ocurre con frecuencia cuando los aerosoles que contienen microorganismos patógenos se transfieren de un individuo a otro susceptible. Procedimientos que tienen el potencial para generar aerosoles respirables • Estornudo* • Tos * • Apertura de preparaciones liofilizadas. * Son la causa principal de la diseminación de agentes patógenos Agentes patógenos que penetran al organismo por vía respiratoria oral y causan Enfermedad.


Neumonía Staphylococcus aureus Klebsiella pneumonie

II

Neumonía atípica Mycoplasma pneumonie II

Psittacosis Chlamydia psittaci II

Tuberculosis Mycobacterium tuberculosis III

Meningitis bacteriana Neisseria meningiditis E. coli

II I

Fiebre Q Coxiella burnetti II

Histoplasmosis Histoplasma capsulatum* II

Coccidioimicosis Coccidioides inmitis* II

Blastomicosis Blastomyces dermatitidis* II

*inhalación de esporas.

TOMA DE MUESTRAS El primer riesgo de infección, es la toma incorrecta, su transporte y la recepción de la misma. Para obtener resultados significativos y confiables de una muestra, se requiere que esta sea tomada en forma correcta para evitar alteraciones. • Debe ser tomada la más fresca posible. • Ser representativa del padecimiento. • Identificada con el número o nombre del animal.

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• Acompañada de la historia clínica. Se recomienda que la historia clínica se coloque dentro de una bolsa plástica resistente, para evitar se contamine con la muestra, o bien atada firmemente en el exterior del paquete (paquete postal).

o Nombre y domicilio del propietario. o Identificación del animal, sexo, edad. o Signos clínicos del paciente. o Número de animales en riesgo. o Diagnóstico presuntivo ( sí es posible) o Hallazgos anatomopatológicos. o Indicar tipo de examen que requiere.

TRANSPORTE Y ENVÍO DE MUESTRAS El manejo, embalaje y envío de productos biológicos y muestras para diagnóstico, es muy importante, un embalaje adecuado, reduce grandemente el riesgo de exposición accidental para personal que no trabaja en el laboratorio (encargados de hacer el envío) y además asegura la validez de la muestra. La muestras biológicas, deben ser embaladas apropiadamente y rotuladas (ver imagen), siguiendo siempre los lineamientos que marca el Gobierno Federal y Estatal. De una manera general, un sistema básico de embalaje se compone de: Contenedor primario estanco, a prueba de filtraciones, etiquetado, que contiene la muestra. El recipiente debe envolverse en material absorbente. Contenedor secundario estanco, a prueba de filtraciones, que encierra y protege el recipiente primario. Se pueden colocar varios recipientes primarios envueltos en un recipiente secundario. Se debe usar suficiente material absorbente para proteger a todos los recipientes primarios y evitar choques entre ellos. Contenedor externo de envío. El recipiente secundario se coloca en un paquete de envío que protege al recipiente secundario y su contenido de los elementos externos, tales como daño físico y agua. Los formularios con datos, cartas y otras informaciones de identificación de la muestra deben colocarse pegados con cinta adhesiva en el exterior del recipiente secundario. Otras posibilidades de transporte de material biológico incluyen: El traslado de muestras dentro de un hospital o centro, de un laboratorio a otro, de un hospital a otro de la misma ciudad o a otra ciudad. Los principios en los que se basa un transporte seguro son los mismos en todos los casos y su finalidad es que la muestra no tenga ninguna posibilidad de derrame en circunstancias normales de transporte. El transporte de material biológico requiere una buena colaboración entre el remitente, la compañía de transporte y el destinatario, y cada uno debe asumir sus responsabilidades

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para garantizar que el producto llega a su destino oportunamente y en buenas condiciones. Transporte de la muestra al laboratorio Contenedor 1. Una muestra que no está marcada, ni identificada con el agente etiológico está

prohibida. 2. La muestra debe introducirse en un contenedor de cierre hermético (tubo, vial etc.). 3. Cuidar que no queden residuos del material de la muestra en el exterior del

contenedor. • Para evitar derrames deben usarse recipientes secundarios tales como charolas o

cajas, plásticas o metálicas, con gradillas para mantener las muestras en posición vertical.

• Estos recipientes deben poderse esterilizar ya sea por autoclave o por desinfectantes

químicos y deben ser descontaminados regularmente.

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Recepción de muestras Los laboratorios deben designar un área específica para tal fin. • Debe ser recibida por personal capacitado. • Nunca debe ser abierto en oficinas o áreas que no sean el laboratorio. • En el laboratorio se debe asignar el nivel de seguridad con el cual se va a manejar. • Indicar que seguimiento se le va a dar (procesos bacteriológicos, toxicológicos etc.). • Equipo de protección personal y equipo de contención a utilizar. • Disponer de una campana de seguridad biológica para abrir el empaque. • Muestras que muestren cualquier indicio de daño o derrame deben ser abiertos en una

campana de seguridad biológica, el personal que realice esta actividad deberá portar equipo de protección.

• El laboratorio debe dar una clave de identificación, para posteriormente asentar adecuadamente los resultados.

Apertura de paquetes

El personal de recepción debe conocer los posibles riesgos del trabajo que desarrollan y consultar cuando se encuentren con algún recipiente roto o derramado. Debe haber disponibilidad de desinfectantes.

Si se trata de muestras marcadas con la etiqueta del símbolo universal de peligro biológico infeccioso o fueron recibidas por correo aéreo, deben abrirse en una campana de seguridad biológica.

NECROPSIA Y MUESTRAS PATOLÓGICAS La necropsia y muestras biológicas representan un riesgo a la salud, para el personal encargado de manejar este tipo de material. Las personas deben cuidar su salud contra los agentes infecciosos que puedan estar contenidos en fluidos corporales, tejidos, órganos y cadáveres. Bacterias, virus, hongos, rickettsias y parásitos representan un riesgo potencial de infección. Durante la necropsia, el riesgo de adquirir una infección es:

• Cortes en la piel, causados por agujas, cortaduras o piquetes. • Dermatitis severa por contaminación de heridas. • Contaminación por inhalación. Disminución del riesgo

• Prevenir lesiones en piel y evitar exposición cuando existan lesiones de pérdida de continuidad.

• Evitar la formación de aerosoles y gotas que podrían ser inhaladas y contaminar la piel, heridas y membranas mucosas.

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• Utilizar equipo de protección personal (guantes, goggles, mascarilla bacteriológica, careta facial, botas y mandil). El equipo es una barrera de protección, que aísla a la persona del peligro de exposición.

• Inmunización de personas que manejan tejidos frescos los cuales pueden estar infectados con agentes como Salmonella, M. tuberculosis y C. tetani (manejo de artículos de necropsia).

Rutina de necropsia

Cuando no se cuenta con información, se recomienda que todos los casos sean considerados potencialmente peligrosos e infecciosos y la necropsia realizarla con cuidado, pasos a seguir:

1. Disminuir el uso de agujas, hojas y navajas, con el fin de evitar posibles cortaduras, piquetes por agujas y abrasiones.

2. Utilizar equipo de protección personal para evitar posibles riesgos de contaminación de membranas mucosas.

Necropsia de organismos, que se conoce están infectados

1. Deben ser rotulados adecuadamente:

• Símbolo universal de peligro biológico. • Agente etiológico de que se trate. • Diagnóstico presuntivo.

2. Los ayudantes y asistentes de necropsia, deben ser informados del diagnóstico clínico. 3. Saber que desinfectante usar, el cual debe ser preparado antes de iniciar el proceso. 4. Ropa de protección que debe usarse:

• Overol, mandil, botas, guantes. • Protector de ojos: goggles (para proteger la conjuntiva). • Mascarilla facial y careta facial, (proteger la vía oral y respiratoria de posibles

aerosoles y gotas. • Guantes resistentes o dobles para proteger la contaminación de piel de las manos.

5. La disección debe ser hecha por el prosector a un solo tiempo. 6. Disminuir la producción de aerosoles y gotas. 7. El uso de tijeras debe ser disminuido para reducir el riesgo de cortaduras. 8. La toma de muestras para cultivo u otros exámenes debe hacerse en un área de toma

de muestras o en su caso lo más estéril posible y cuidando de no contaminar el exterior del recipiente.

9. Al finalizar la necropsia el cadáver debe ser envuelto en papel absorbente para prevenir el escape de líquidos y rociarlo con el desinfectante previamente preparado, colocarlo en una bolsa plástica con un rotulo que indique: Precaución “Residuo peligroso biológico infeccioso” para su disposición.

10. Al finalizar el proceso el ayudante circulante será el encargado de desinfectar el área para prevenir posibles contaminaciones.

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11. Los artículos usados durante la necropsia deberán ser confinados en una mesa del área para su desinfección.

12. Desinfección del área. 13. Tanto prosector como ayudantes deberán quitarse la ropa en el cuarto de necropsia y

colocarla en un contenedor para su tratamiento apropiado, desinfección, lavado o bien si es necesaria la incineración.

RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO INFECCIOSOS (RBI) Es aquel material de desecho que contiene microorganismos patógenos (virus, bacterias, hongos) con capacidad y cantidad suficiente para causar infección e impacto adverso sobre la salud de los seres vivos y el ambiente. Los residuos biológico infecciosos representan la presencia de microorganismos patógenos viables en concentraciones suficientes, capaces de causar infección a un hospedero susceptible y se consideran los tejidos o desechos médicos generados del cuidado del hospedero quienes tienen una enfermedad infecciosa, desechos sólidos que incluyen artículos como manchas en el suelo, camas de animales enfermos, canales, alimentos contaminados. El responsable de manejar un desecho biológico infeccioso debe anticipar su eliminación y considerar los problemas que pueden ocasionar al público en general cuando se lleve a cabo esta. No olvidar que el riesgo está asociado solamente a formas indirectas de transmisión (a través de reservorios y vectores), para que se produzca la infección es necesario tener en cuenta aspectos epidemiológicos como la vía de transmisión, la puerta de entrada, la virulencia del patógeno, la susceptibilidad del hospedero, que el agente sea capaz de sobrevivir en el reservorio por un período prolongado de tiempo, de esta forma existe la probabilidad para que el hospedero susceptible pudiese exponerse al agente. El riesgo de tipo ocupacional es para las personas, que generan, manipulan, tratan y procesan los RBI y estos son precisamente los que están en riesgo potencial de exposición directa a un agente infeccioso, las exposiciones más frecuentes son la inoculación (jeringas y agujas contaminadas) y la inhalación (por procesos que generan la formación de aerosoles infecciosos). Manejo de RBI. • El empaquetado de RBI, debe estar identificado claramente de su peligro potencial, de

forma que sea comprendido y entendido por todos con el símbolo universal de peligro biológico.

• El empaquetado debe hacerse, para proteger de una exposición al personal responsable del manejo y de la disposición final.

• Las propiedades físicas del contenedor para RBI deben ir acorde al proceso de tratamiento.

• Los RBI deben separarse de los desechos generales.

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• Hasta donde sea posible deben ser tratados en el mismo sitio de generación, para reducir la concentración de agentes patógenos a un nivel aceptable.

• La persona encargada del manejo de RBI, debe utilizar equipo de protección personal y aplicar prácticas de higiene personal (lavarse las manos después de trabajar con RBI, está prohibido fumar y comer mientras maneja RBI etc.).

Clasificación de RBI y tipo de contenedor que debe usarse

Métodos de tratamiento de RBI son.

RPBI

Características

Tipo de contenedor

Sólido

Tejidos y órganos

Empaquetar en bolsas de plástico

resistente

Material

punzocortante

Agujas hipódermicas,

pipetas Pasteur, porta y

cubreobjetos

Contenedores a prueba de

pinchazos

Pesado

Muestras anatómicas y

camas de animales

Contenedor rígido, y que el peso de

los RPBI no exceda su capacidad

para evitar su ruptura.

Líquidos

Leche, sangre y orina

Contenedor de plástico para

inactivación química, y contenedor

metálico para esterilización en

autoclave.

Método

Forma de actuar

Tipo de residuos biológicos

Autoclave

Esterilización con vapor a

presión

Jeringas, agujas y material de cristal

Incineración

Reduce significativamente

el volumen a cenizas y

produce un producto final

libre de patógenos.

Cadáveres material de lechos, camas

de animales infectados, tejidos y

órganos.

Químico

Eliminación de

microorganismos patógenos

Artículos usados para la realización de

necropsias, instalaciones, heces, sangre,

etc.

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La esterilización, incineración e inactivación de los RBI elimina el riesgo de infección y facilita su transporte al sitio de disposición final por el personal encargado de esta actividad.

SERVICIO MÉDICO PREVENTIVO. La forma correcta de tomar una muestra biológica, las medidas y estrategias de seguridad y el equipo de protección a utilizar, todos estos son pasos para evitar que se presente un accidente y disminuir el riesgo que representa la muestra. La inmunización se considera como un nivel adicional de protección, es difícil establecer un programa de vacunación a menos que se trabaje con agentes específicos (laboratorio de investigación), de lo contrario este programa se vuelve amplio y complicado. Por tanto en medicina veterinaria lo que se recomienda es la aplicación del esquema profiláctico antirrábico, del toxoide de difteria, tétanos, y aplicación de la vacuna de tuberculosis. Las personas que estén expuestos a compuestos peligrosos deben formar parte de programas apropiados de un Servicio médico preventivo o reconocimiento médico. El cual debe incluir:

• Historia clínica y ocupacional previa. • Exámenes físicos general • Pruebas fundamentadas. • Plan de seguimiento y reconocimiento.

Además se recomienda la realización de otras pruebas como, prueba cutánea de tuberculosis, radiografía completa de tórax, recuento sanguíneo, análisis de orina, electrocardiograma y una muestra de suero seriada, todas estas pruebas son el antecedente médico, que permitirá hacer comparaciones a futuro, en caso de que personas al cuidado de la salud adquieran una infección o enfermedad y saber si fue consecuencia de su actividad profesional o fue por otra causa. Es recomendable que personal al cuidado de la salud tenga siempre a la mano un botiquín de primeros auxilios (actividades de campo), debido a que está expuesto a sufrir un accidente (cortaduras, piquetes, mordidas etc.). Este debe incluir: 1 frasco de alcohol de 100 mL. 1 frasco de merthiolate de 100 mL. 5 sobres de gasas de 10x10 cm. 4 sobres de algodón. 1 tijeras. 1 carrete de tela adhesiva de 2.5 cm. 2 vendas elásticas de 5 y 10 cm. 1 caja de tabletas de analgésicos y antipiréticos. 1 bolsa de detergente.

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La toma inadecuada de muestras, los errores humanos y las prácticas de trabajo incorrectas contrarrestan la eficacia de las medidas de seguridad y las del equipo de protección personal. Favoreciendo la presentación de accidentes y la exposición agentes patógenos que tiene como resultado la adquisición de enfermedades de tipo profesional. Es por ello que un profesional preocupado por su salud y seguridad debe identificar los riesgos potenciales a los que está expuesto y son inherentes a su trabajo, así como adquirir el conocimiento de cómo combatirlos para prevenir infecciones profesionales e incluso la muerte.

BIBLIOGRAFIA

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Microbiology, Washington D.C. • Phillips G. B.; Baily S. P. 1966: Hazards the mouth pippeting. American Journal of

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• Guía de gestión intracentro de residuos sanitarios. Departamento de Sanidad y Seguridad Social, Generalitat de Cataluña. Barcelona, 1994.

• Residuos sanitarios. Departamento de Urbanismo, Vivienda y Medio Ambiente. Gobierno Vasco. Vitoria, 1994. 22. Guía de gestión de residuos químicos en centros sanitarios. Departamento de Sanidad y Seguridad Social, Generalitat de Cataluña. Barcelona, 1998.

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PARASITOLOGÍA

M. en C. Jorge Estrada Botello

INTRODUCCIÓN

Las parasitosis son importantes por su alta incidencia en el trópico, subtrópico y áreas templadas, es sin duda, el problema número uno de los sistemas de producción de leche y carne. Debido a los daños que ocasionan y el impacto económico que se produce por estas. Quiroz R. H. (1992) citado por Carrillo, Barreto y Rodríguez, menciona que en México se tiene estimado que se pierden anualmente 48 millones de kilogramos de carne y 44 millones de litros de leche debido al parasitismo gastrointestinal. La fasciolasis, producida por Fasciola hepática, es de las enfermedades que mayores pérdidas ocasiona a la ganadería nacional. Los hospedadores más frecuentes de éste parásito dentro de los animales domésticos son los rumiantes y de éstos los bovinos presentan mayores frecuencias y los ovinos son los que se ven mayormente afectados, al menos por la forma aguda de presentación clínica. Borchet (1969), citado por Gaxiola, Camacho, Rubio, Borbolla, reportó que la conversión alimenticia en bovinos infectados con 1000 metacercarias de Fasciola hepática es 36% más baja y el aumento de peso es 40% menor. Yáñez, (1989) citado por Lepe, Michel, Villa, Rodríguez y Blanco, encontró que los becerros se infestan de parásitos gastrointestinales a partir de los 20 días de vida, antes de ello no es común encontrar becerros infestados de parásitos que ingresan por la vía oral. La solución de una enfermedad es satisfactoria solamente cuando va precedida de un diagnóstico preciso. La alteración de resultados es significativa en cualquier procedimiento de laboratorio, por lo que se requiere que la muestra sea extraída en la forma correcta, representativa y que sea preservada de la mejor manera posible para evitar su deterioro. El usuario del laboratorio clínico se enfrenta a una completa variedad de exámenes que se pueden practicar en la sangre, plasma, orina, heces, órganos, exudados, trasudados y piel.

CRITERIOS IMPORTANTES A TENER EN CUENTA INDEPENDIENTEMENTE DEL TIPO DE MUESTRA

1. Deben ser obtenidas lo más frescas posibles y preservadas correctamente. 2. Cada muestra debe ser identificada y rotulada. 3. Junto con la muestra se debe incluir la historia clínica. 4. Determinar con claridad el tipo de estudio que se requiere. 5. Mencionar si existe programa de desparasitación.

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ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO

Las muestras a enviar al laboratorio deben ser colocadas en un recipiente hermético de vidrio o plástico. El recipiente debe estar correctamente empaquetado para evitar que se rompa durante el transporte, por ejemplo, con aserrín, papel o algodón. En los casos en que se requiera refrigeración ésta se puede realizar de diferentes formas, como serían: − Con hielo natural de un refrigerador en un recipiente hermético y el frasco de la muestra colocarlo dentro del mismo (la conserva de 8 a 24 horas). − El uso de refrigerante es de gran utilidad para la conservación de cualquier tipo de muestra. − Otro método de refrigeración más prolongado consiste en el empleo de hielo seco (bióxido de carbono sólido). En este caso se coloca el recipiente que contiene la muestra en una bolsa de plástico, la que se rodea con hielo seco envuelto en papel. Nunca colocar el hielo seco en una caja hermética pues la volatización del bióxido de carbono puede causar una explosión. El recipiente ideal cuando se utiliza hielo seco es una caja de cartón.

COLECTA, CONSERVACIÓN Y ENVÍO DE HECES

MEDIDAS HIGIÉNICAS. − Aplicación de medidas de protección personal e higiénica para el personal que interviene en el proceso. − Norma de cuidados y manejo para cada especie animal. − Uso de recipientes limpios o estériles MATERIAL. − Guantes de plástico. − Bolsas de polietileno. − Espátulas de madera. − Recipientes de plástico con boca ancha, con tapa a rosca o tapa a presión. − Tubo de ensaye con tapón. − Formol al 10%. − Marcadores o lápiz. − Cinta adhesiva. − Varilla de vidrio punta roma. − Refrigerante o hielo. − Dicromato de potasio al 2%. MÉTODO Obtención de heces. En los bovinos y equinos es práctico e higiénico obtener la muestra del recto con un guante de plástico, cuando se obtiene la cantidad de heces suficiente el guante es volteado hacia adentro, sirviendo de esta manera como recipiente de recolección, se cierra cuidadosamente tratando de eliminar todo el aire y se identifica con los datos necesarios para su posterior envío al laboratorio.

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Es posible obtener las muestras del piso siempre que sean limpias y frescas, tomando la muestra de la parte superior. Cantidad apropiada por especie. Ovino 30 g. Bovino 80-100 g. Equino 80-100 g. Cerdo 30-50 g. En equinos para ver si se tiene infestación por Oxyuris se pueden considerar los siguientes pasos: Material necesario: cinta adhesiva transparente (celofán) de 2.5 cm de ancho por 15 cm de largo. Lavar el área vecina a l ano para eliminar el exceso de cebo y suciedad el día anterior a tomar la muestra. Tomar fuertemente la cinta entre el pulgar y el índice derechos, pararse al lado de la nalga izquierda del caballo y levantar la cola con la mano izquierda y que el codo del mismo lado apoye sobre la nalga, al mismo tiempo con el pulgar derecho adherir fuertemente la cinta adhesiva en los pliegues anales. A continuación despegar la cinta y pegarla sobre un porta objetos. Para observar la preparación se debe colocar una gota de agua debajo de la cinta, luego esta se adhiere fuertemente y se observa al microscopio. En ovinos, caprinos y porcinos se toma la muestra directamente del recto, previo masaje en la región perianal o bien, introduciendo los dedos índice y medio por vía rectal. En caninos y felinos, se puede realizar la toma de la muestra introduciendo los dedos índice y medio o bien una varilla de vidrio por vía rectal, de no ser posible lo anterior colocar al animal en un local o superficie limpia y colectar las heces inmediatamente después de la defecación o bien de la parte superior de estas. La cantidad de heces requerida es de 30-60 gr aproximadamente. En aves es posible obtener una muestra representativa colocando un papel marrón debajo de las perchas (8 hojas de 1 m x 0.5 m) por cada 1000 animales seleccionados al azar. Por la mañana las muestras cecales y heces intestinales son recolectadas separadamente. Para 500 aves al menos deben tomarse 20 muestras y por cada 500 animales más otras 10 muestras y así sucesivamente. Otras opciones para la toma de muestras en aves y conejos serían. − Con la introducción de una varilla de vidrio en cloaca o recto. − Empleo de jaulas metabólicas previa colección de algunos animales sintomáticos − Sacrificio de los animales más afectados para el análisis del contenido del tracto digestivo CONSERVACIÓN − Si las muestras se trabajan inmediatamente después de su colecta, no se requiere conservador, pero se recomienda mantenerlos en refrigeración o en un lugar fresco, evitando los rayos solares. − Sí las muestras van a ser transportadas durante varias horas, es necesario su refrigeración o bien puede utilizarse formol al 10%.

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− Si se desea el diagnóstico de verminosis pulmonar, no utilizar ningún tipo de conservador, en refrigeración.

− Si son muestras de heces de aves o de sus tractos digestivos, se recomienda una solución de dicromato de potasio al 2% como conservador. ENVÍO Deberán enviarse en días y horas hábiles utilizando el medio de transporte más rápido y de preferencia, en cajas de poliuretano con la siguiente información: historia clínica indicando el tipo de conservador que se utilizó, el diagnóstico presuntivo, tipo de muestra y estudio solicitado.

COLECTA CONSERVACIÓN Y ENVÍO DE SANGRE

Aparte de la observación de los animales, en muchas ocasiones será necesario enviar muestras sanguíneas al laboratorio para completar o verificar el diagnóstico de hemoparásitos. Es por ello fundamental para el MVZ, conocer las técnicas y vías más recomendables del sangrado. El método ideal de sangrado debe ser: − Rápido. − Fácil de efectuar. − Seguro para el animal y el operador. − Minimizar el manejo físico. − Y lo más importante, preservar las características biológicas de la sangre. MATERIAL. − Tubos vacutainer con y sin anticoagulante. − Jeringas y agujas hipodérmicas de varios calibres. − Alcohol metílico y del 96% − Anticoagulante (EDTA) − Caja de poliuretano − Hielo o refrigerantes − Aserrín − Etiquetas auto adheribles y lápiz marcador. MÉTODO. En todos los casos el sitio de punción debe ser recortado y frotado con alcohol para eliminar el riesgo de contaminación de la muestra. Las agujas y jeringas deben ser estériles del tipo desechable o bien se puede utilizar tubos de auto llenado (vacutainer). Las jeringas y agujas a utilizar deben estar perfectamente secas. En caballos la sangre se extrae de las venas yugulares utilizando agujas finas (calibre 21) de 3.5 cm y una jeringa o por medio de vacutainer. La vena se eleva por presión aplicada con la mano izquierda en la mitad inferior del surco yugular, insertando la aguja en el centro de la vena en dirección ascendente.

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Una suave tracción sobre la jeringa resulta suficiente para facilitar la extracción. En bovinos, ovinos y caprinos también se utiliza la vena yugular, que se eleva por presión digital y se inserta una aguja de 5 cm, calibre 16, (o con el uso del vacutainer). Cuando se cuenta con manga de manejo, el sitio más conveniente para muestrear es la vena coccígea en la base de la cola. Se procede a elevar ésta última y se inserta la aguja de dos a tres cm directamente en la línea media, a la altura del segundo o tercer espacio intervertebral coccígeo. La profundidad de la penetración varía dependiendo de la cantidad de grasa. Obtención de muestras en el cerdo. El material básico, además de las agujas y jeringas, incluye: − Laza trompas o cuerda para sujeción − Agua, jabón y cepillo para lavar la zona de elección de sangrado − Torundas y antiséptico − Frascos o tubos para depositar sangre − Cinta adhesiva y marcador para identificar muestras − Papel y lápiz El calibre y largo de las agujas varía según la vía elegida, el tamaño del cerdo y la preferencia del operador. Las vías más comunes para extraer sangre en cerdos de diferentes tamaños, son las siguientes: − Vena yugular − Vena coccígea − Vena auricular marginal − Vena cava anterior La extracción de sangre en perros y gatos puede hacerse utilizando aguja y jeringa de la vena cefálica o tarsal recurrente que son elevadas utilizando una ligadura o bien por un asistente haciendo presión digital. Se puede aplicar una suave tracción sobre la jeringa ya que un aspirado excesivo provoca hemólisis en estas especies. No es muy recomendable el uso de vacutainer. En gatos y perros pequeños o debilitados un buen sitio de muestreo es la vena yugular. CONSERVACIÓN: La muestra de sangre debe conservarse en frascos o tubos estériles conteniendo anticoagulante, se debe agitar con movimientos suaves para lograr su homogeneización. Conservar las muestras en refrigeración. Para evitar la hemólisis de la muestra se deben tomar las siguientes precauciones: − Evitar que agujas y jeringas estén húmedas. − Retirar la aguja antes de vaciar la muestra. − Evitar el vaciado brusco de la muestra y realizarlo a través de las paredes del tubo. − Evitar el calentamiento de la muestra. Se recomienda, después de la toma de la muestra realizar el frotis“al pie del animal’’ secar “al aire’’ y fijar inmediatamente con alcohol metílico, si fuese el caso. Si se desea la muestra para serología, entonces no se debe emplear anticoagulante, debiendo dejar los tubos con la muestra con una inclinación de 45º, a temperatura ambiente o en

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refrigeración durante 12-24 horas hasta la formación del coágulo. Para posteriormente separar el suero, de no ser utilizado inmediatamente se debe meter al refrigerador.

DIAGNÓSTICO DE LA Trichomona foetus

La Tricomoniasis es una enfermedad altamente contagiosa, insidiosa y venérea, caracterizada por infertilidad, piometra y abortos.

El microorganismo que produce la Tricomoniasis es un protozoario flagelado. Vive en el tracto reproductivo de las vacas y se localiza en las criptas (dobleces) de la superficie mucosa del pene de los toros. Los hallazgos más comunes ante la infección de Trichomona son muertes embrionarias tempranas, que suceden entre los 30 y 60 días de gestación. Comúnmente cuando esto ocurre, la vaca absorberá el embrión y entrará en celo nuevamente alrededor de los 90 a 100 días posteriores sin mostrar ningún otro signo. Si el feto está más desarrollado, cuando la vaca adquiere la enfermedad, este morirá por la infección de Trichomona y será abortado. Los abortos tempranos suelen ocurrir entre los 90 y 130 días de la gestación. La Tricomoniasis puede representar hasta un 50% de reducción en la obtención de becerras, por lo que las pérdidas causadas por esta son asombrosas. Diagnóstico El diagnóstico positivo de la enfermedad depende de la observación del protozoario vivo móvil en muestras de exudado genital, así como en tejidos y líquidos de los fetos abortados. Para obtener las muestras se emplean diversos métodos de lavado, hisopos y pipetas. La identificación precisa del organismo al examen microscópico directo, requiere de cierto adiestramiento técnico. Diagnóstico en el toro. El toro hace menos oposición de la que se espera, aunque debe tenerse la seguridad de que esta sujeto con firmeza. Es necesario recomendar al ganadero que mantenga al toro en reposo sexual por lo menos 4 días antes de la colecta del moco, a fin de evitar acarreamiento de tricomonas de genitales femeninos, no es conveniente iniciar el muestreo en toros a los que se les efectuaron lavados prepuciales 7 días antes de la toma de la primera muestra. En el toro los métodos más prácticos para la toma de muestras son la colecta del moco y el lavado prepucial en orden de importancia. PROCEDIMIENTO PARA LA COLECTA DEL MOCO Material: Pipetas de inseminación. Espejuelos de vidrio estériles. Jeringa desechable estéril. Tubo látex Medios de cultivo: Medio de Diamond Tioglicolato líquido

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Guantes de plástico para palpación Método: 1) Antes de iniciar el muestreo se deben cortar los pelos de la región genital externa y lavar con agua corriente, evitando el empleo de detergentes ya que inmovilizan a las tricomonas (utilizar guantes de plástico). 2) Introducir al saco prepucial una pipeta de plástico de las usadas en inseminación artificial (cubierta con un especulo de vidrio estéril) mediante un trozo de manguera látex a una jeringa desechable. 3) La pipeta se introduce hasta el fondo del saco prepucial y se dirige hacia adelante y atrás, entre el pene y la mucosa del prepucio. Al mismo tiempo se hace succión con la jeringa, ya que al ejercer una presión negativa, se obtendrán las muestras de moco, en volumen y consistencia variables. 4) La orientación de la pipeta se controla a través de la pared del prepucio con una mano moviendo la pipeta, y manipulando la jeringa con la otra. 5) Inocular la muestra obtenida en los medios de cultivo. IMPORTANTE Un toro se reporta como negativo a la infección, después de seis exámenes negativos practicados uno por semana o bien si resultan negativos a la prueba de la vaquilla virgen, es decir si monta a dos vaquillas y estas resultan negativas a los exámenes realizados a las muestras de exudado vaginal o moco cervical colectando 10 a 19 días después de la monta. Diagnóstico en la vaca Es necesario recomendar al ganadero que las hembras no sean montadas por lo menos 4 días antes de la colección de las muestras, ni llevar a cabo lavados vaginales o toma de muestras de moco cervical 7 días antes del primer muestreo. Procedimiento para la colecta del moco cervical a) material (el mismo del procedimiento anterior). b) Método 1) Se debe limpiar la vulva con agua corriente, eliminando las heces, no utilizar jabón ni antisépticos (usar guantes). 2) Introducir en la vagina por la parte superior de la comisura vulvar una pipeta de inseminación cubierta por un espéculo de vidrio estéril. Evitar que se introduzca por uretra, llevándola hacia adelante hasta el nivel del cuello uterino. La muestra será tomada de la parte inferior del cérvix, moviendo la pipeta hacia delante y atrás succionando la jeringa. 3) Observar en frotis directo o proceder inmediatamente a su cultivo. 4) El mejor momento para tomar muestras de moco uterino es durante la semana anterior al celo (el moco es fluido y claro) aunque puede contener copos de pus y tricomonas móviles si está infectada la vaca. No se debe tomar muestras de vacas en celo (donde el moco es claro y abundante) ya que normalmente no contiene tricomonádidos. El moco vaginal cuando es denso, escaso y uniforme turbio, rara vez contiene tricomonas móviles, en los casos de piometra casi siempre se hallan los flagelados. En otros casos los parásitos se encuentran en las secreciones vaginales inmediatamente después del aborto o poco antes del celo.

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IMPORTANTE En vacas, las tricomonas son más numerosas en vagina 12 a 19 días después de ser servidas por un toro infectado. Un simple examen directo no es suficiente para dar un diagnóstico negativo. Se considera que una vaca no está infectada después de tres exámenes negativos practicados uno por semana.

PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO EN EL FETO ABORTADO

Material Pipetas Pasteur estériles. Bulbo de goma. Medios de cultivo: Medio de Diamond Medio de triglicolato líquido Solución salina fisiológica al 0.85% estéril. Centrífuga Porta y cubreobjetos. Guantes Método De ser posible se envía el feto abortado, el cual deberá mantenerse frío, colocando hielo, pero no debe congelarse, así mismo se incluirá una parte de placenta. 1) Se toman muestras de líquido amniótico y alantoideo así como contenido abomasal con pipetas Pasteur estériles. 2) De estas muestras se coloca por un lado aproximadamente 1ml de la muestra en 5 a 10 ml de solución salina fisiológica estéril para centrifugarlo y hacer la primera observación. Por otro lado también se colocará 1 mL. en un tubo que contenga 5 mL del medio de cultivo.

ECTOPARÁSITOS

Los artrópodos forman el grupo más numeroso de especies animales que habitan la tierra, incluyen más del 85% de ellas, con más de un millón de especies. Algunas especies son benéficas como los crustáceos, las abejas, el gusano de seda, entre otras y un pequeño número es perjudicial al hombre y a los animales domésticos, ejerciendo un parasitismo temporal o permanente y otras más que inyectan veneno con sus picaduras. Algunas de las especies de parásitos tienen gran importancia económica debido al gran daño que causan en la salud de animales domésticos. El efecto patógeno puede deberse a lesiones traumáticas al picar la piel para sustraer sangre, a bien acción traumática al penetrar en la piel. La garrapata figura como uno de los ectoparásitos de mayor importancia económica a escala mundial, por las mermas que ocasiona en la producción de ganado bovino, caprino lanar y caballar. Al lesionar la piel para chupar sangre, muchas especies de garrapatas pueden transmitir los más diversos agentes patógenos; como virus, bacterias, riquetsias y protozoos, lo que puede conducir a enfermedades agudas, crónicas e incluso la muerte.

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La pérdida de peso de un bovino parasitado por garrapatas Boophilus spp. Se calcula en 0.26 Kg/garrapata/año, y por Amblyomma spp. 1.09 Kg/garrapata/año. Esto ocasiona pérdidas de varios miles de millones de dólares en la economía pecuaria mundial.

COLECTA DE ARTRÓPODOS

En los casos en que se sospeche de infestación por ácaros, deberá recortarse el pelo de la zona a muestrear. La zona elegida debe ser la parte más húmeda del borde de la lesión, debido a que la mayoría de los ácaros prefieren la zona periférica de las lesiones activas. En la sarna sarcóptica es preferible recoger el raspado del borde del área depilada y en otro punto de la piel sana donde se presenten pequeños granos. Es de gran utilidad humedecer la piel con glicerina para que los ácaros se adhieran al bisturí y no se pierdan. Si se sospecha de sarna corióptica o psoróptica, debe utilizarse un bisturí afilado, raspando la parte externa de la epidermis, junto con las raíces de los pelos, la profundidad del raspado se realiza hasta que inicie a brotar la sangre. La muestra puede ser recogida directamente en un pequeño tubo que pueda cerrarse herméticamente. En los animales en los que se sospecha de sarna sarcóptica o notoédrica, se deberá recortar el pelo y realizar el raspado más profundo con un trocito de algodón sujetado por medio de unas pinzas. La sarna demodécica se presenta en forma escamosa o pustular. Las lesiones escamosas determinan el engrosamiento de la piel por la acumulación de células epiteliales muertas por lo que se requiere de raspados profundos para llegar a los ácaros. En la sarna demodécica pustular los ácaros son por lo general abundantes pudiendo ser observados en el examen del contenido caseoso de una pústula presionada o incidida.

RECOLECCIÓN DE ÁCAROS DE LA PIEL

Los ácaros del género Demodex forman nódulos como consecuencia de la dilatación de los folículos pilosos, para la obtención de estos ácaros se puede presionar y sacar el contenido de los nódulos. Cuando se sospeche de sarna coreóptica o psoróptica se deberá realizar un raspado de piel con un bisturí impregnado de aceite o glicerina, hasta que brote la sangre. Se deberá buscar en las descamaciones epidérmicas localizadas en el nacimiento de las plumas si es el caso. RECOLECCIÓN DE GARRAPATAS Estas deberán ser recolectadas procurando que al desprenderlas, las piezas bucales no se queden adheridas a la piel. Después de desprendidas, deben ser depositadas en un recipiente que contenga un papel impregnado de solución salina al 10 % para conservar la humedad. RECOLECCIÓN DE INSECTOS Preparar una solución de alcohol-éter (97 ml de alcohol al 70% y 3 ml de éter), mojar una espátula o hisopo con esta solución y pasarla sobre el pelo o las plumas en el sentido de estas, así un buen número de ártropodos quedarán adheridos al hisopo, posteriormente introducir la muestra en un frasco con cerrado hermético.

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RECOLECCIÓN DE LARVAS Las larvas productoras de miasis se recogen directamente de las heridas y se colocan en solución salina al 1%, en caso de querer conservarlas se depositan en solución de etanol al 70% adicionando 5% de glicerol, de esta forma se previene la deshidratación. Los nematodos deben ser recogidos y lavados por agitación en solución salina al 0.9%, pasándolos de inmediato a una mezcla de alcohol al 70% en caliente o formol al 5% en solución salina, lo que permite su estiramiento y fijación.

VARROASIS

La Varroasis es una parasitosis que deteriora la salud de las abejas y afecta la producción de miel; cada apicultor debe controlarla, para lo cual necesita ser capaz de identificarla en sus apiarios. La Varroasis es una parasitosis externa de las abejas del género Apis, causada por el ácaro Varroa jacobsoni Oudemaus. La parasitosis se inicia cuando las hembras preñadas de varroa se introducen en las celdillas de la cría de abejas que están a punto de ser operculadas. Una vez entro, empiezan a ovopositar, primero un huevo del que se desarrollará un macho y posteriormente da origen únicamente a hembras. Las Varroas alcanzan su madurez sexual y se aparean dentro de la celda; de ésta salen las hembras preñadas para continuar el ciclo. El hospedador original de Varroa jacobsoni es la abeja oriental Apis cerana, a la que provoca trastornos menores, debido a: 1.- Las obreras se acicalan unas a otras para librarse de los ácaros. 2.-Son capaces de eliminar gran parte de los ácaros que se encuentran en su colonia. 3.-La hembra preñada de Varroa, entra tanto en las celdillas de obreras como de zángano, favoreciéndose más su reproducción en estas últimas. Las pérdidas más grandes se han reportado entre tres a cinco años después de su introducción en un país, es decir, el año de su detección y los dos siguientes. Es de distribución mundial a excepción de Nueva Zelanda y de las Islas Hawaii. En México se detectó por primera vez el 8 de mayo de 1992 en Veracruz.

La Varroasis ocasiona dos tipos de daño a la apicultura, que son: a).- El ejercido por el ácaro sobre las abejas en forma directa e indirecta. b).- Por erogación económica. DETECCIÓN La Varroa se puede detectar mediante el examen de las abejas adultas, de la cría, de los desechos de la colonia o del polen colectado en las trampas de polen. MUESTREO DE ABEJAS ADULTAS Colectar de 200 a 300 abejas de un bastidor del centro de la colmena en un frasco, es importante verificar que no se encuentre la reina entre estas. Se pueden utilizar tres métodos para determinar si las abejas colectadas tienen ácaros: Por observación directa, por lavado o utilizando éter (éter en aerosol, de forma comercial el arrancador de motores diesel).

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Observación directa. Las abejas se examinan mientras se encuentran anestesiadas. Las abejas adultas se examinan individualmente con una lupa o con un microscopio estereoscópico (10x). La efectividad de este método, en comparación con el de “lavado”, es poco mayor de 85% debido en parte a que las Varroas son difíciles de encontrar cuando están adheridas entre los segmentos del cuerpo de la abeja. Lavado. Los ácaros se desprenden del cuerpo de las abejas si estas se agitan dentro de líquidos como agua caliente, alcohol al 70%, detergente, gasolina o hexano. Con agitación de 20 minutos, se desprende el 100% de los ácaros, si el agitado es durante 1 minuto, se desprenderá aproximadamente el 90%. La muestra se pasa por una malla de 8 a 10 cuadros por pulgadas, para que las abejas se detengan en esta, pero que pasen los ácaros y el líquido; después el líquido se filtra a través de una tela blanca y limpia de algodón, que retendrá a los ácaros si se encuentran presentes. Uso de éter. Las abejas se anestesian exponiéndolas durante uno o dos segundos al éter y luego se rotan dentro del recipiente que las contiene durante 10 segundos. Las abejas anestesiadas regurgitan el néctar contenido en su estómago, el cual se pega a las paredes del recipiente y los ácaros, que en su mayoría se habrán desprendido del cuerpo de las abejas, también se adhieren a las paredes del recipiente. Las abejas se colocan sobre un trapo blanco, por si se desprenden más Varroas. Las observaciones se efectúan inmediatamente después de aplicar el éter. Examen de la cría. Las Varroas se pueden observar fácilmente sobre el cuerpo blanco de las pupas de las abejas, se sugiere que se examinen por lo menos 100 pupas por colonia, de preferencia de zánganos. O bien se cortan trozos de panal de 3 por 15 cm con cría (preferentemente de zángano) operculada y se envía al laboratorio envuelto en tela color blanco o en papel periódico y esta a su vez en bolsa de plástico para su posterior observación con auxilio del microscopio estereoscópico. Inspección de los desechos de la colonia. Los desechos de la colonia: La cera, polen, abejas y crías muertas, así como los ácaros muertos en forma natural o por la aplicación ex profeso de productos químicos, caen continuamente en el piso de la colmena y las abejas limpiadoras los remueven. Esos desechos pueden examinarse en busca de Varroa. Si se decide aplicar tratamiento químico se recomienda hacerlo inmediatamente después de la cosecha, cuando hay menor cría. Para colectar el desecho de la colonia, se coloca un papel (cartulina), un cartón o una lámina de color blanco impregnada con aceite vegetal, aceite comestible o con vaselina y se coloca en el interior de una trampa de recolección con las siguientes características: Charolas de triplay de 33X45 cm y 3 mm de espesor, las cuales tienen un marco de 3 lados; el cual mide 1 cm de ancho por 1 cm de alto, cubierto con una malla de alambre cuadriculada, con abertura de 2 a 3 mm, dejando una abertura para la introducción de la cartulina, el cartón o la lámina de 28X42 cm. La trampa se coloca sobre el fondo de la colmena a tratar y se deja al menos durante una semana, al término de la cual se retira la cartulina con el detritus teniendo cuidado de que no se tire nada, para posteriormente ser enviada al laboratorio con todos los datos del apiario y del apicultor. Para su envío al laboratorio se empaqueta en bolsa de plástico o de papel, lo más pronto posible.

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HEMATOLOGÍA Y QUÍMICA SANGUÍNEA

Dr. Martín Talavera Rojas*

M. en C. Israel Alejandro Quijano Hernández**

*Integrante del Cuerpo Académico de Patogénesis Microbiana **Integrante del Cuerpo Académico de Medicina y Cirugía de perros y gatos

CONSIDERACIONES GENERALES

La hematología es una de las ramas de la patología clínica que mas estudios de laboratorio abarca, entre estos incluimos al hemograma, tiempos de coagulación y pruebas específicas de antígenos por ejemplo: el factor de Von Willebrand; la búsqueda específica de hemoparásitos y morfología celular. Para un hemograma se requiere de sangre completa con EDTA como anticoagulante, la cual debe ser obtenida de un animal vivo que sea representativo de las condiciones propias de la enfermedad. La cantidad varía de acuerdo a la especie, pero se requiere un mínimo de 3 mL para efectuar el análisis, ya que la proporción anticoagulante sangre siempre debe mantenerse. El análisis debe efectuarse con la sangre lo más fresca posible, no exceder más de 12 a 24 horas después del muestreo. Es recomendable realizar el frotis sanguíneo al momento de la toma de la muestra para que no sufran alteraciones morfológicas principalmente los leucocitos. También los eritrocitos sufren alteraciones al permanecer durante más tiempo en contacto con el anticoagulante y sufrir los efectos del enfriamiento y deshidratación, por mínimas que estas sean. Los exámenes bioquímicos permiten cuantificar o establecer diferencias con relación a los rangos de referencia de diferentes analitos, a través de los cuales podemos establecer enfermedades de órganos específicos. Existe una gran variedad de análisis y es conveniente ponerse en contacto con los laboratorios para recibir instrucciones acerca del tipo de muestra, volumen, duración, aditivos e interferencias que puedan afectar la interpretación de los análisis realizados.

COLECCIÓN DE LA MUESTRA

La selección del tubo o frasco (contenedor) apropiado así como el tipo de anticoagulante a emplear son determinantes para la colección de la muestra. El frasco debe identificarse con un número o clave y anotarla también en la historia clínica y datos generales del paciente, como especie, sexo, edad, raza y hasta variedad. Los tubos que se fabrican comercialmente contienen la cantidad apropiada del anticoagulante para el examen hematológico o bioquímico. Estos tubos tienen el vacío necesario para la cantidad de sangre requerida y usando la aguja adecuada la sangre se recolecta directamente en el tubo, este es el método preferido de recolección. Algunos veterinarios prefieren colectar la muestra en jeringas y pasar la muestra posteriormente al tubo con anticoagulante. Este método debe tener ciertas consideraciones para evitar alteraciones que interfieran en los resultados del laboratorio.

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Cuando la sangre se utiliza para análisis hematológicos, debe retirarse la aguja de la jeringa antes de vaciarla en el tubo con anticoagulante, para evitar hemólisis y posteriormente se homogeniza en una forma suave para evitar la coagulación de la misma. Para la obtención de suero para análisis bioquímicos se puede realizar de la misma manera, quitando la aguja y vaciando en un tubo sin anticoagulante o bien dejar la sangre en la jeringa para que se separe el suero y ya en el laboratorio se sella con calor y puede ser centrifugado en la misma jeringa, para este procedimiento se recomiendan las jeringas de 5 y 10 mL.

MANEJO DE LA MUESTRA

La mayoría de los componentes químicos son determinados en la porción extracelular de la sangre (plasma o suero) por lo que cualquier entrada de una fuente intracelular puede influir en los resultados, algunas sustancias presentes en plasma o suero se encuentran dentro de los eritrocitos en una alta concentración, por lo que la hemólisis puede influir en los resultados de laboratorio. Una vez obtenida la muestra de sangre para análisis bioquímico o hematológico, debe de trasladarse inmediatamente al laboratorio para su análisis. La forma más efectiva, es transportarla en refrigeración, ya que es un método sumamente efectivo y proporciona una temperatura aproximada de 4-8ºC. Para mayor seguridad la muestra debe colocarse en un recipiente a pruebas de fugas de agua y éste a su vez se encierra en otro recipiente también a prueba de fugas de agua y de dimensiones mayores. Se llena el espacio entre ambos recipientes con hielo o bien pueden utilizarse refrigerantes. Las cajas de unicel son adecuadas y pueden conservar la temperatura por mayor tiempo. Se debe evitar el contacto directo del hielo con la muestra, ya que pudiera ocasionar congelación y a su vez producir hemólisis de la muestra. Para las mediciones de tiempos de coagulación es importantísimo que la colección de sangre sea en forma precisa, evitando puncionar en repetidas ocasiones al paciente para obtener la sangre, ya que esto activará las vías de coagulación, alterando los resultados in vitro. También debe considerarse que el citrato de sodio al 3.8% se mezcle en una proporción de 1:9 con sangre, ya que los reactivos se encuentran preparados para una cantidad conocida de anticoagulante. En el caso de el amoniaco, debe utilizarse heparina sódica, procurando separar inmediatamente el plasma del resto de las células para evitar la mayor formación in vitro de amoniaco por los eritrocitos, al tiempo que debe ser refrigerada. Cuando se trata de medir gases sanguíneos, el anticoagulante a utilizar es heparina de litio, ya que normalmente se analizan al mismo tiempo los electrolitos, la muestra después de ser obtenida de la arteria de elección (Tarsal, femoral o carpal), se debe sumergir en hielo para evitar cambios de pH y CO2.

En el caso de los frotis de sangre que se han realizado al momento del muestreo deben secarse al aire y enviarlos con su identificación (se puede realizar sobre el mismo frotis

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con un lápiz) envueltos en papel tratando de no colocarlos frente a frente, ya que pueden borrarse por el roce entre éstos. Para el caso de la obtención del suero es recomendable si es que se va a tardar en llegar al laboratorio, separar el suero en otro tubo y enviarlo con su identificación.

ARTEFACTOS QUE ALTERAN LOS RESULTADOS DE LABORATORIO

La hemólisis in vitro ocurre cuando: la sangre se deposita en el tubo rápidamente, se agita vigorosamente, se congela o se queda a temperatura ambiente durante un largo período. El curso de hemólisis in vivo es un signo crítico de una enfermedad. Cuando la hemólisis es observada, una segunda muestra debe obtenerse cuidadosamente y el plasma examinarse después de la centrifugación (microhematocrito). La importancia de este artefacto radica, en que ocasionalmente las lecturas espectrofotométricas se ven alteradas, ya sea disminuyendo o aumentando los resultados de otros analitos; a la vez que puede variar las mediciones de hematocrito. La lipemia ocurre frecuentemente en muestras que no son tomadas en ayuno (animales monogástricos). La lipemia causa un aparente incremento en la concentración de sustancias que son medidas por absorbancia (espectrofotometría). La lipemia postpandrial puede ser evitada en animales obesos realizando el muestreo con un mínimo de 6 a 12 horas de ayuno. Aunque la persistencia de lipemia sugiere un desorden metabólico o endocrino. La lipemia predispone a hemólisis in vitro.

FUENTES DE VARIACIÓN

La calidad de los resultados de laboratorio depende de la preparación del paciente, de la colección y el manejo de la muestra y finalmente del reporte analítico. El ejercicio puede influir dramáticamente en los resultados hematológicos particularmente en animales como el caballo que tienen una respuesta marcada de esplenocontracción. Las muestras tomadas inmediatamente después del ejercicio tienen un incremento en el volumen del paquete celular así como en el conteo de leucocitos. Estos cambios usualmente desaparecen horas después del ejercicio. Si el ejercicio es prolongado se incrementa la actividad de enzimas musculares (creatin quinasa (CK), aspartato-amino-transferasa (AST), lactato-deshidrogenasa (LDH) en el suero. El estrés emocional es común que se presente en animales y puede favorecer la liberación de epinefrina, que causa incremento en la glucosa y linfocitos en la sangre (principalmente en el gato) o bien presentarse la fórmula del estrés caracterizada por neutrofilia, linfopenia, eosinofilia y monocitosis especialmente en perros; este último efecto sólo se observará después de 4 a 6 horas de que el paciente fue sometido a estrés, ya que el efecto es netamente esferoidal, y ese es el tiempo que tardan en hacer su efecto el cortisol y los demás esteroides, (endógenos o exógenos). La dieta influye en los resultados del laboratorio principalmente en los animales monogástricos, los alimentos concentrados ricos en proteínas elevan la urea nitrogenada en sangre, al igual que las hemorragias gastrointestinales producen l mismo efecto.

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Los agentes terapéuticos pueden alterar la actividad fisiológica del paciente resultando cambios en la concentración de sustancias medidas. Por ejemplo la administración de glucocorticoides altera el conteo diferencial y total de leucocitos, incrementa la fosfatasa alcalina (ALP) y la alanin-amino-transferasa (ALT).

SITIOS DE OBTENCIÓN DE SANGRE

En la práctica veterinaria, los exámenes hematológicos se realizan satisfactoriamente con sangre venosa. La punción venosa mediante aguja y jeringa o con el sistema vacutainer se ejecuta en cualquiera de las venas superficiales prominentes. Si se requieren muestras en repetidas ocasiones en caso de conejos, es conveniente rasurar el área del margen externo de la oreja y cortar la vena marginal con un bisturí y tomar la muestra con una pipeta en el caso de otras especies como el visón y hurón, se recomienda cortar una vena de la membrana interdigital previa asepsia. En caso de lechones se sujeta al animal echado sobre el dorso y se introduce la aguja en el vértice del cartílago cariniforme dirigiendo la aguja hacia adentro, abajo y atrás penetrando la aguja en la vena cava, debe utilizarse una aguja de 3.5 –5 cm. de largo. a. Vena yugular, (grandes especies). b. Vena cefálica, (perros y gatos). c. Arteria femoral d. Arteria carpal o tarsal e. Vena auricular (conejos, cerdos). f. Dedo de pie o uña (aves). g. Vena coccígea (bovinos). h. Corazón (animales jóvenes o de talla pequeña). i. Vena safena (perros y gatos) j. Vena mamaria (vacas). k. Vena cava anterior (cerdos). l. Vena alar humeral (aves). m. Plexo venoso retroorbitario (ratones y ratas)

BIBLIOGRAFIA

1. Meyer, D.J.; Embert H.C.; Lon J.R. (1992): Veterinary Laboratory Medicine. W.B. 2. Saunders Company. Philadelphia. 3. Busch. B.M. (1991): Interpretation of Laboratory Results for Small Animal Clinicians. 4. Blackwell Scientific Publications, Oxford. 5. Benjamin M.M. (1991): Manual de Patología Clínica en Veterinaria. Limusa, México. 6. Paredes H.E.; Cubillos G.V. (1995): Manual de necropsia en animales domésticos. 7. Universidad Austral de Chile, Chile. 8. Coffin. L. D. (1981): Laboratorio Clínico en Medicina Veterinaria, La Prensa

Mexicana, México

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UROANÁLISIS

Talavera Rojas, Martín.

INTRODUCCIÓN

El análisis de orina es uno de los procedimientos de laboratorio más comunes aplicados a la

práctica veterinaria y es un método utilizado frecuentemente como medio diagnóstico de las

enfermedades de las vías urinarias del tracto urinario alto o bajo. Para poder hacer un análisis e

interpretación adecuada del Uroanálisis, es necesario conocer la función renal, regulación del

equilibrio ácido-básico, electrolitos y líquidos, la presión osmótica y eliminar los desperdicios del

metabolismo y sustancias tóxicas.

El análisis de orina con frecuencia revela alteraciones y características de enfermedades del riñón

y proporciona información de otros trastornos funcionales del organismo. La orina debe

examinarse lo más pronto posible y deben tomarse las muestras en las primeras horas de la

mañana.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

Para la recolección de las muestras, es necesario emplear recipientes químicamente

limpios. Las muestras pueden tomarse de diferentes maneras, entre las principales se encuentran:

1.- Emisión natural: En casi todas las especies se puede recoger la muestra de orina

mientras que el animal efectúa la micción. Es necesario a veces vigilar al animal para que

en el momento de la micción se recolecte la muestra.

Se utilizan también cajas con pisos herméticos o con otros dispositivos que permitan

recoger la orina tales como las cajas con drenaje en el piso.

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En caso de animales como el bovino, ovino o equino se utiliza una bolsa “hembra” de hule que es

atada al animal en tal forma que su abertura está colocada al orificio prepucial.

2.- Mediante comprensión manual de la vejiga: Para inducir a la micción

3.- Cateterización transuretral: En lo posible debe evitarse esta técnica en pacientes con

susceptibilidad a padecer infecciones del tracto urinario, esto incluye pacientes con enfermedad

urinaria del tracto urinario bajo y falla renal, hiperadrenocorticismo, diabetes mellitus y poliuria.

4.- Cistocentesis: Es una forma de paracentesis, consiste en punzar la vejiga acoplada a una

jeringa. Es recomendada en los siguientes casos: Prevención de contaminación de la orina con

bacterias, células o restos del tracto genital bajo. Ayuda a evaluar problemas como: hematuria,

piuria y bacteriuria. Minimiza problemas iatrogénicos causados por cateterización.

5.- Cateterización. Las muestras obtenidas por cateterización son preferibles para estudios tales como bacteriológicos ya que están libres de detritus celulares. Cateterizar a un perro por más de una o dos veces al día no se recomienda, ya que la reacción tisular al traumatismo ocasiona una inflamación y disminución en el lumen uretral.

Hay que impedir la contaminación de la muestra con sustancias tales como vaselina, que

interfieran en los resultados, también se debe tener en cuenta que debemos evitar la

contaminación del catéter para no introducir un agente infeccioso en vías urinarias, se recolecta la

orina dejando fluir libremente o haciendo una presión ligera para evitar traumatismos a la mucosa

de la vejiga.

En la mayoría de exámenes realizados de rutina (examen físico, químico y microscópico)

es suficiente conservar la orina mediante refrigeración utilizando el mismo método de los

recipientes que fue descrito para muestras de sangre.

Otras maneras de obtener la orina son a).- Jeringa hipodérmica directamente en vejiga, se utiliza sobre

todo en gatos. b).- Caja de recolección para perros y gatos y c).- Presión sobre la vejiga urinaria hasta

lograr que fluya esta última, en gatos y perros.

CONSERVACIÓN DE LA ORINA

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El análisis de la orina se efectúa lo más rápido posible o se puede almacenar en refrigeración, pero se

debe mantener a temperatura ambiente antes de realizar el análisis. En la mayoría de exámenes

realizados de rutina (examen físico, químico y microscópico), es suficiente conservar la orina mediante

refrigeración utilizando el mismo método de los recipientes que fue descrito para muestras de sangre.

Cuando no es posible refrigerar se agrega 1 gota de formol al 40% en 30 mL de orina añadiendo antes de

realizar el examen químico y el urocultivo, también se le puede agregar tolueno en cantidad suficiente

que forme una capa en la superficie de la orina.

PRESERVACIÓN IN VITRO DE LA ORINA

El objetivo de todo proceso de preservación es prevenir alteraciones que puedan ocurrir en las propiedades físicas y químicas. Los métodos de preservación son los siguientes:

Refrigeración

Se usa para preservar las muestras cuando estas

no pueden ser enviadas inmediatamente al

laboratorio. Se puede refrigerar máximo 2 horas

después de la recolección.

Congelación

Se usa para preservar las propiedades químicas de

la orina, inhibiendo y retardando el crecimiento

bacteriano y de la mayoría de metabolitos.

Conserva el calcio, sodio, potasio, cloro, magnesio y

fósforo por lo menos 10 semanas.

Acidificación

Algunos elementos como células, cilindros y

algunos químicos se preservan por acidificación de

la orina por medio del ácido hidroclorhídrico (5-10

ml) o ácido acético glacial.

Formaldehído Previene crecimiento microbiológico. Una gota al

40% por 30 ml de orina es la adecuada.

Cloroformo Es un agente antimicrobiano, usando 5 ml son

suficientes para preservar una orina por 24 horas.

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BIBLIOGRAFIA

1. Meyer, D.J.; Embert H.C.; Lon J.R. (1992): Veterinary Laboratory Medicine. W.B. Saunders Company, Philadelphia.

2. Busch. B.M. (1991): Interpretation of Laboratory Results for Small Animal Clinicians. Blackwell Scientific Publications, Oxford.

3. Benjamín M.M. (1991): Manual de Patología Clínica en Veterinaria. Limusa, México. 4. Paredes H.E.; Cubillos G.V. (1995): Manual de necropsia en animales domésticos.

Universidad Austral de Chile, Chile.

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TOXICOLOGÍA

Valladares Carranza, Benjamín*. Zamora Espinosa, José Luis*. Velázquez Ordóñez Valente*.

Gutiérrez Castillo Adriana**. * Integrantes del Cuerpo Académico en Salud Animal. ** Integrante del Cuerpo Académico Patogénesis Microbiana

El diagnóstico exacto de una toxicosis, al igual que el de otras enfermedades se realiza

utilizando la información obtenida mediante criterios básicos, los cuales incluyen: Historia clínica, Evaluación clínica, Hallazgos posmortem (necropsia), Análisis de laboratorio y Pruebas biológicas.

El diagnóstico clínico se basa en el conocimiento de criterios pertinentes con el problema, valoración calificada en el laboratorio de muestras apropiadas e interpretación de los resultados obtenidos; según la asociación de circunstancias con el problema. Es importante evitar que el diagnóstico se base en la información obtenida de un solo criterio, rehusando obtener o considerar la información de otros criterios esenciales para establecer un diagnóstico correcto. El diagnóstico exacto es el factor individual más importante al intervenir en intoxicaciones de los animales, y una vez conocida la causa del problema puede iniciarse su prevención, control o tratamiento específico. A. HISTORIA CLÍNICA

El conocimiento de las circunstancias asociadas con el envenenamiento resulta de gran utilidad y es clave para el diagnóstico correcto. Debe investigarse la presencia de venenos y otros compuestos químicos en la explotación, pradera, establo o determinar si han sido utilizados, y la reciente exposición a los mismos animales, esto con el fin de calcular el grado de exposición, siendo examinados cuidadosamente los piensos y el agua de consumo por la presencia de plantas tóxicas, mohos, algas, hongos u otros tóxicos presentes en estos.

En especies de mamíferos domésticos o aves habrá que considerar el número de animales en el hato o granja, animales afectados, curso de las alteraciones (descritos en horas o días), número de muertes, tipo de manejo, programa de alimentación y datos de enfermedades anteriores.

Otros datos que ayudan a orientar el diagnóstico son: procedencia del alimento, fecha de preparación, tiempo de consumo, permanencia de los animales en pradera así como la existencia o contacto con maquinaria agrícola.

Descripción detallada de signos clínicos, lesiones post mortem, tiempo transcurrido desde que el animal fue observado por última vez antes de su muerte y su estado en el momento de la observación, tratamiento administrado antes de la muerte y en caso afirmativo cual fue la respuesta, datos relativos al tratamiento o pulverizaciones de otra naturaleza contra parásitos internos y externos.

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En pequeñas especies deben incluirse datos como: zona donde vive el animal, si permaneció suelto o atado, historia del empleo de rodenticidas u otros pesticidas en su alojamiento, tratamiento contra parásitos e inmunizaciones. B. EVALUACIÓN CLÍNICA.

Incluye las manifestaciones externas del desarrollo de la patogenia del tóxico en el hospedero. Debe realizarse con especial atención en los detalles ya que el más ligero signo visto por un observador atento puede constituir una clave para la identificación de un tóxico, por ejemplo: la existencia de agentes tóxicos que influyen sobre sistema nervioso pueden dar como resultado muchas y variadas respuestas. Debe cuidarse con exactitud la actitud del animal, ya que por efecto de cientos de agentes tóxicos el animal reflejará diferentes reacciones en los distintos aparatos y sistemas, los cuales son patognómonicos de toxicosis, por lo cual la secuencia de los hechos y la gravedad de los síntomas son de relevancia para el diagnóstico. C. HALLAZGOS POST MORTEM

Los exámenes anatomopatológicos e histopatológicos aportarán pruebas valiosas en caso de sospecha de intoxicación, y deben realizarse antes de emprender cualquier acción de tipo legal.

Algunos venenos provocan lesiones extensas, otros ligeras alteraciones e incluso otros no producen cambios morfológicos apreciables. En este punto es importante considerar la cinética de las sustancias toxicas, considerando que durante el estudio anatomopatológico se deben colectar las muestras suficientes y precisas para su determinación analítica en el laboratorio. D. ANÁLISIS DE LABORATORIO

La evidencia química suele ser una ayuda indispensable en los casos del diagnóstico toxicológico. Utilizados correctamente y con la perspectiva adecuada, los análisis químicos pueden proporcionar el criterio independiente más importante para el diagnóstico. La colección de la muestra está condicionada por la fisiopatogenia del compuesto y por el tiempo transcurrido desde el momento de la exposición hasta la muerte, por lo cual, es necesario cumplir con tres puntos importantes. 1). Practicar el análisis de la muestra adecuada. 2). Elegir el método analítico y específico. 3). Encontrar cantidades significativas del tóxico.

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MUESTRAS PRECISAS PARA ANÁLISIS TOXICOLÓGICOS ESPECÍFICOS

PROCESO TÉCNICO

MUESTRA CANTIDAD MÍNIMA

RECIPIENTE CONSERVADOR

Clorhidrato de clenbuterol (CCL)*

Suero sanguíneo, orina

3-5 mL Tubo Vacutainer Refrigeración o congelación

Aflatoxinas

Alimento Leche Hígado

1000 gr 500 mL 500 gr

Bolsa de papel Frasco estéril

Congelación o Refrigeración

Alcaloides Contenido gástrico o ruminal Alimento Planta Suero

300 gr 1000 gr 1000 gr 20 mL

Frasco estéril Frasco estéril Bolsa de papel Tubo estéril


Microminerales (Se, Zn, Cu, Fe)

Forraje Contenido gástrico o ruminal Hígado Riñón Orina

1000 gr 500 gr 50 gr 50 gr 50 mL



Metales pesados (Cu, Pb, Cr, Ag, As).

Forraje Alimento Hígado Ríñón

1000 gr 1000 gr 50 gr 50 gr


Refrigeración o Congelación

Organoclorados y Organofosforados

Encéfalo Contenido gástrico Suero Sangre Hígado Riñón Grasa corporal Faneras

1000 gr 500 gr 20 mL 30 mL 50 gr 50 gr 100 gr 5 gr

Bolsa de papel Frasco estéril Tubo estéril Frasco estéril Bolsa de papel

Congelación

Oxalatos Forraje fresco Orina Riñón

1000 gr 1000 gr 50 mL 1 Riñón

Frasco estéril Bolsa de papel Frasco estéril

Congelación, Refrigeración Formol al 10% (cuando se determina valorar y correlacionar por HT lesiones en tejidos)

Nitratos, Nitritos

Ensilado Forraje Agua Orina Suero

1000 gr 1000 gr 50 mL 50 mL 20 mL

Frasco estéril Bolsa de plástico Frasco estéril Tubo estéril

Congelación Refrigeración

Cianidinas Forraje Ensilado Contenido gástrico o ruminal

1000 gr. 1000 gr 500 gr

Frasco estéril Refrigeración o Congelación

Fluoracetato de Sodio

Contenido gastrointestinal E hígado

Todo el disponible Frasco estéril Congelación

Urea Contenido ruminal Hígado Alimento

200 gr. Frasco estéril Solución saturada de HgCl3

* CCL también se puede determinar en tejidos (hígado, riñón, músculo y ojo) y otras muestras como: alimento, orina, suero sanguíneo y pelo.

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La elección de la muestra es importante en la ejecución del análisis químico. Las muestras deberán obtenerse exentas de contaminación y residuos químicos, no ser lavas para evitar la posibilidad de arrastrar residuos del agente químico o de contaminación con el agua. Debe considerarse que frecuentemente se trabajara con cantidades vestigiales de un determinado producto químico y que incluso la contaminación más ligera puede originar resultados erróneos. D. PRUEBAS BIOLÓGICAS

Otro apartado importante y necesario e indispensable para el diagnóstico, en el que se administra el material tóxico sospechoso a un animal susceptible, para observar los efectos en detalle, y en el que en la mayoría de los casos se utilizan animales de laboratorio (ratones, ratas, conejos, cuyos, etc.).

Los resultados positivos pueden avalar directamente el diagnóstico, sin embargo un resultado negativo no indica que el tóxico administrado no produjo reacción (envenenamiento), ya que pueden intervenir múltiples factores en el caso natural que se desconocen o solo pueden reproducirse experimentalmente, además de las variaciones entre animales de la misma especie, de la susceptibilidad del individuo o bien estar determinado por características propias del tóxico.

LITERATURA REVISADA Blood, D.C.: (1996) Manual de Medicina Veterinaira. Mc. Graw-Hill- Interamericana, S.A. de C.V., México, D.F. Buck, W.B.; Osweller, G.D. y Van Gelaer, G.A.: (1973) Clinical and Diagnostic Veterinary Toxicology. Kendall Hunt Publishing and Company, Iowa, U.S.A. Dreisbach, R.H. y Fraga, E.E.: (1987) Manual de toxicología clínica; Prevención, diagnóstico tratamiento. El Manual Moderno. México, D.F. Garner, R.J. y Papworth, D.S.: (1988) Garner, Toxicología Veterinaria. 3ª ed. Acribia. Zaragoza, España. Jurado, C.R.: (1989) Toxicología Veterinaria. 2ª ed. Salvat. Barcelona, España. Lorgue, G.; Lechet, J. y Riviere, A.: (1997) Toxicología Clínica Veterinaria. Acribia. Zaragoza. España. Plumlee, K.H.: (2004) Clinical Veterinary Toxicology. Mosby. Elsevier. U.S.A. Radeleff, R.D.: (1967) Toxicología Veterinaria. Academia. León, España.

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MUESTREO DE ALIMENTOS PARA ANIMALES

M. en C. Susana Goñi Cedeño

OBJETIVO

Explicar el procedimiento general de muestreo (Normas oficiales) aplicable a alimentos terminados e ingredientes mayores para animales considerando su presentación como unidades de producto, así como su importancia.

INTRODUCCIÓN

Los laboratorios de servicios analíticos dedicados a cuantificar materias primas, premezclas y alimentos terminados, deben garantizar su trabajo mediante la adopción de programas de aseguramiento de calidad, tal como la Norma ISO 17025, que especifica los requisitos generales para la competencia de laboratorios de ensayo, que se utiliza en nuestro país para otorgar la certificación ante la Entidad Mexicana de Acreditación (EMA). En México se cuenta con la norma NMX-Y-111-SCFI-2001 que marca los procedimientos generales de muestreo que se aplican a alimentos terminados e ingredientes mayores para animales. La selección de la muestra es un paso muy importante para el análisis en laboratorio; tanto que puede mencionarse que por más cuidado que se tenga en el proceso y uso de equipo de vanguardia, el análisis no tiene valor si se utiliza una muestra no representativa de todo el material en observación. No es fácil obtener una muestra representativa como se ejemplifica en seguida. Cuando se va a estimar el contenido de proteína de un pasto, con el método de Microkjeldalh, la muestra debe ser de 0.1 g. Esta cantidad tan pequeña debe representar una pradera que en ocasiones puede tener una extensión de muchas hectáreas productoras de varias toneladas del material; y aún después de recibir muestras en el laboratorio el problema de muestreo continúa siendo enorme. En 200 g de pasto verde hay un promedio de 40 ó 50 g de materia seca, unas 500 veces la muestra de 0.1 g requerida para determinar proteína. De la misma pradera se pueden obtener varias muestras, tomadas en diferentes zonas y es necesario decidir si se hace el análisis en conjunto o de cada muestra por separado. Cuando se reciben las gramíneas del campo, se pueden picar o dejar en un tamaño de tres metros, aunque con materiales de gran tamaño no es posible homogenizar la muestra. Al hacer el análisis químico, es necesario picar la gramínea para facilitar el secado. Una vez seca la muestra se debe moler pasándola por una criba de 1 mm. Así se evita el problema de las diferencias en tamaño físico que se presentaría en el caso del pasto con tallos de 2.5 a 5.0 cm y hojas cortadas del mismo tamaño. Aún cuando las longitudes son iguales, los volúmenes relativos son muy diferentes.

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Es muy difícil mezclar materiales de diferentes tamaños físicos debido a que tienden a separarse. Es más fácil obtener una muestra objetiva después de reducir el material al tamaño de 1 mm y de mezclarlo totalmente. En el muestreo de forrajes se trata de medir la producción y su valor nutritivo, protegiendo una porción de la zona de pastoreo para propósitos de muestreo y análisis. Las plantas se cortan a la misma altura que la porción del campo en el cual el ganado ha pastoreado, luego se pesan y se analizan, para obtener el rendimiento.

TOMA DE MUESTRAS, CONSERVACIÓN Y ENVÍO AL LABORATORIO.

Antes de iniciar el análisis de muestras es necesario considerar que para que los resultados sean útiles, las muestras deberán ser homogéneas y representativas del lote donde fueron tomadas, independientemente del tamaño del lote, el tipo de muestreadores, y de la forma del empaque; debe tomarse suficiente número de muestras que representan a la totalidad de la masa del alimento del que fue tomado. Cuando el muestreo es para control de calidad en la producción, existen métodos basados en distribuciones específicas (Estadística), para los cuales el número de muestras que se tomarán, se basa en ecuaciones que correlacionan ciertos parámetros tales como:

La tolerancia permitida en la calidad del producto.

El tamaño del universo muestreado (productividad/unidad de tiempo).

Desviación estándar deseada, etc. Para fines de investigación como es el caso de los análisis en Nutrición Animal, es más práctico y útil un “muestreo al azar”. La selección al azar es un procedimiento definido y riguroso que asegura que cada parte o unidad de un universo particular tiene igual probabilidad de ser seleccionada. Los términos que se utilizan en los muestreos según la norma NMX-Y-111-SCFI-2001 son los siguientes:

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Defecto • Cualquier discrepancia o no conformidad con relación a requisitos especificados.

Granel • Material consistente en unidades irregulares en su proporción y distribución.

Inspección • Proceso de medición, examen, comprobación u otra forma de comparación de la muestra con las especificaciones establecidas.

Nivel de calidad aceptable (NCA)

• Corresponde al máximo % defectivo que se puede considerar como satisfactorio para una calidad promedio.

Producción unitaria (lote)

• Unidades de producto de composición similar cuyas características se van a inspeccionar.

Tamaño del lote • Número de unidades de producto dentro de una producción unitaria

Unidad defectiva • Toda unidad de producto que contiene uno o más defectos.

ALIMENTOS BALANCEADOS, SUPLEMENTOS E INGREDIENTES ALIMENTICIOS SÓLIDOS.

Para muestrear éste tipo de productos es necesario utilizar instrumentos diseñados especialmente (ver figura 1), los cuales deben estar limpios y libres de contaminación tanto interna como externamente. Sin embargo, si no se dispone de ellos se puede ingeniar una forma de obtener las muestras, y si se hace con cuidado se obtendrán resultados similares aunque se requiera más tiempo para realizar el muestreo.

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Fig. 1 INSTRUMENTOS UTILES PARA REALIZAR EL MUESTREO

Una muestra que contenga “vivos” insectos o que se sospeche que los contiene debe ser fumigada para matarlos e impedir que aumente su número entre el momento de tomar la muestra y el de sus análisis en el laboratorio. La muestra no debe ser expuesta a temperaturas extremas que puedan alterar el producto y por lo tanto afectar el resultado del análisis previsto. Si el producto está envasado en bolsas o sacos cerrados, se tomará de cada bulto a muestrear, 500 a 1000 g de material, el cual se extraerá colocando horizontalmente el bulto y se inserta de extremo a extremo el muestreador, el cual puede ser la lanza abierta o la boquilla vertedora. El número de sacos o núcleos dependerá del tamaño del lote; para lotes menores de 10 unidades deberán muestrearse todos los sacos. Si hay más de 11 unidades, se toman 10 sacos al azar y se obtiene una muestra núcleo de cada uno. Se debe muestrear no menos del 20% de los sacos cuando se trata de lotes grandes. Si el producto a muestrear está a granel, ya sea en camiones, vagones de ferrocarril o en bodega, se utilizará un muestreador cilíndrico siendo las muestras del mismo tamaño que las obtenidas de

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los sacos. Basándose en la capacidad del vagón transportador, se tomarán muestras a tres niveles de profundidad en cada punto, cuyo número y distribución será el siguiente:

Vagones o bodegas rectangulares de hasta 15 toneladas: 5 puntos de muestreo, uno al centro, aproximadamente a 50 cm de las paredes laterales.

Vagones o bodegas rectangulares de 15 a 30 toneladas: 8 puntos de muestreo, dos al centro, y seis aproximadamente a 50 cm de las paredes laterales.

Vagones o bodegas rectangulares de 30 a 50 toneladas: 11 puntos de muestreo, tres al centro y ocho aproximadamente a 50 cm de las paredes laterales.

Otra forma de muestrear los ingredientes a granel es en el momento de cargar o descargar un lote: sólo basta introducir un recipiente adecuado bajo la tolva de descarga a intervalos de tiempo que serán proporcionales al volumen cargado o descargado. Las muestras primarias deben ser mezcladas y divididas al tamaño de la muestra contractual. Una vez obtenidos los núcleos que constituyen la muestra, ésta debe ser homogenizada, ya sea en recipiente o sobre papel extendido; después, por medio de cuarteo, se reducirá hasta tener el tamaño adecuado para ser enviada al laboratorio. La manipulación de la muestra debe ser lo más rápido posible para evitar que pierda o absorba humedad, sobre todo en lugares con condiciones atmosféricas extremosas. Las muestras deben ser guardadas en recipientes herméticos y etiquetados debidamente.

MUESTREO DE FORRAJES

Para muestrear correctamente un forraje deben considerarse las variables que influyen en su calidad: origen, estado fenológico, tipo de suelo, condiciones atmosféricas, condiciones de manejo (fertilización, regadío, pastoreo); dependiendo del parámetro a medir será la forma de muestrear. Al muestrear un forraje se deberá proporcionar la siguiente información:

Material de que se trata.

Nombre común regional.

Nombre científico: género, especie y variedad.

Estado fenológico.

Lugar y fecha de colección.

FORRAJES FRESCOS

El muestreo de un forraje fresco dependerá de la extensión de la pradera. Se deben colectar pequeñas cantidades de diferentes zonas del terreno tratando de que éstas no queden alineadas, ya que muchas veces la formación geológica o la morfológica de un terreno sigue patrones de bandas y la composición del suelo o de su declive influyen para que haya diferencias en el desarrollo del forraje. La manera ideal de muestrear es en forma radial, partiendo del centro del potrero, el cual se puede marcar con un poste o mojonera, y de allí, a distancias proporcionales y radialmente hacer las colecciones. Existen sin embargo definición de puntos de muestreo alternativas como son en zig-zag, sinuosa, etc.

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Al colectar las plantas del pasto en cada punto hay que tomar uno o varios manojos de plantas, evitando seleccionarlas por tamaño u otra característica. Las plantas seleccionadas al azar deben de cortarse de preferencia a la altura que son arrancadas por los animales al pastorear. Cuando se desea hacer un muestreo a diferentes edades de la planta o diferentes estados fenológicos, cuidar de no volver a cortar la misma planta del muestreo anterior pues ya no será representativa. Cuando se obtuvieran varios kilos, conviene cuartear y homogenizar previamente. Cuando la muestra se ha subdividido hasta tener un kilo de materia fresca, se guarda en una bolsa de papel para su traslado al laboratorio. Cuando la muestra está contaminada por la tierra o basura, hay que tratar de eliminar los contaminantes sacudiéndola o limpiando las partes sucias.

MUESTREO DE HIERBAS Y ARBUSTOS

El muestreo de hierbas y arbustos es similar al de pastos en cuanto a selección de los puntos de recolección pero difiere en el corte de la muestra y preparación de la misma. En el caso de una herbácea (leguminosas como alfalfa y otras similares) ésta se cortará a la misma altura que un pasto y de una arbustiva se deben cortar únicamente las partes suculentas del tallo, que son las que consume el ganado. Cuando se desea hacer un estudio detallado de ciertas plantas es necesario analizar la proporción de tallos y hojas, a su vez que el contenido nutricional de cada uno de ellos. Para ello, una vez recolectada la muestra, se procede a deshojarla manualmente teniendo cuidado de separar las hojas junto al peciolo dejando únicamente el tallo desnudo. Se deberá anotar la proporción tallo: hoja de cada especie considerada.

FORRAJES ENSILADOS

La obtención de una muestra representativa del contenido total de un silo es sumamente difícil, ya que durante el llenado del silo hay parte que se compacta más debido a mayor presión o mejor acomodo del material picado, lo que provoca que la fermentación sea diferente de una zona a otra y por lo tanto su composición. Si se desea muestrear el contenido total de un silo habrá que tomar las muestras utilizando sondas cilíndricas. Estas sondas son cilindros provistos de una broca o taladro, el cual al mismo tiempo que horada, arroja la muestra al exterior. Este método tiene el inconveniente que al perforar el centro del silo entra aire que altera la fermentación, lo que puede dañar el ensilaje alrededor de las perforaciones. Una vez tomada y homogenizada la muestra debe colocarse rápidamente en un recipiente cerrado ya que los ensilados contienen sustancias volátiles como alcoholes y ácidos grasos. La muestra debe compactarse lo máximo posible para conservar las condiciones de anaerobiosis y evitar cambios en el patrón de fermentación y por lo tanto en su composición. Una vez empacadas las muestras de ensilados, se trasladan al laboratorio para su análisis; si no serán analizadas de inmediato, deberán ser congeladas.

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FORRAJES HENIFICADOS.

El muestreo de forrajes henificados presenta el inconveniente del volumen y la poca densidad del material, pero tiene la ventaja de que las muestras no necesitan ningún tratamiento para su conservación.

TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN DE MUESTRAS

El envío de la muestra debe realizarse de modo que llegue en perfecta condición al laboratorio; este envío puede hacerse en diferentes medios de transporte, por lo que el método de conservación y envase deberán ser congruentes entre sí. La conservación adecuada es, después del muestreo, uno de los factores más importantes para el análisis.

Deshidratación Es el mejor método de conservación. El agua contenida en el alimento no contribuye a su valor nutritivo, y si lo hace susceptible a fenómenos de descomposición por bacterias, hongos y enzimas tisulares. No es posible deshidratar sin que la muestra sufra alteraciones. Se usa el término “deshidratación” cuando se elimina la humedad por medios artificiales y “secado” cuando se realiza al sol o a temperatura ambiente. La temperatura elevada durante la deshidratación altera la proteína del alimento disminuyendo su digestibilidad y la disponibilidad de aminoácidos debido a la formación de compuestos insolubles entre los aminoácidos y azúcares por reacción de Maillard, se conservan cambios de color y olor, registrándose oscurecimientos. En forrajes se ha observado que la temperatura altera el nitrógeno insoluble en ácido detergente por formación de compuestos semejantes a la lignina. Una modalidad de deshidratación es efectuarla a bajas presiones y temperaturas (utilización de vacío) con lo que se logra fácil la sublimación del agua, pero el método es costoso. Se aplica para deshidratación de carnes y quesos o sus subproductos.

Refrigeración o congelación La refrigeración a temperatura 1 - 5ºC, puede no ser lo suficientemente baja para prevenir deterioro por enzimas, bacterias y hongos, por lo tanto su almacenaje deberá ser por períodos de tiempo cortos. La congelación, que generalmente se realiza a -10ºC, sí permite la conservación de las muestras por períodos de tiempo más largos, aunque no todas las muestras la resisten sin alterarse. La congelación deberá realizarse rápidamente para que no haya cambios en la composición de nutrimentos. Si la congelación se realiza lentamente se observan fenómenos de proteólisis y enranciamiento de grasas; así mismo hay pérdida de vitaminas. Cuando la muestra va a ser conservada por congelación durante tiempo largo, la temperatura deberá estar entre -20 y -30ºC. Identificación de muestras

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La identificación apropiada de las muestras es muy importante para los resultados de los análisis. La identificación debe ser clara y precisa y contener todos los datos que ayuden a su clasificación. Debe estar en un lugar visible, escrita de manera legible sobre material que resista la humedad y adherido al envase; debe ser escrito con tintas indelebles para que no se borren durante el manejo y almacenaje.

TAMAÑO DE LA MUESTRA, TIPO DE ENVASES Y MÉTODOS DE CONSERVACIÓN PARA EL ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE NUTRICIÓN ANIMAL.

Tipo de alimento Tamaño de muestra

Tipo de envase de conservación

Método general

Alimentos balanceados, suplementos e ingredientes alimenticios sólidos

100 - 250 g Frascos vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca, bolsas de polietileno, cerradas herméticamente.

Menos de 10% de humedad, a temperatura ambiente. Secar al sol o estufa a 50 ºC por 10-12 H.

Alimentos e ingredientes líquidos

250-500 ml

Frasco vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca. Bolsas de papel grueso.

Refrigeración (1-5 ºC)

Forrajes frescos, pastos, herbáceas y arbustivos.

150-250 g en base seca ó 500-1000 g

Cuando se deshidrata úsese bolsa de polietileno o frasco de vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca.

Adicionar preservador. Deshidratación en estufa de aire forzado (50ºC durante 24 Hs).

Forrajes henificados 150-250 g Frasco de vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca. Bolsa de polietileno.

Menos de 10% de humedad, temperatura ambiente. Secado al sol, o en estufa a 50ºC durante 8 H.

Forrajes ensilados 500-1000 g en base de humedad

Frasco de vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca. Bolsa doble de polietileno grueso.

Inmediatamente tomada la muestra, congelarla (-10 a -15ºC)

Líquido ruminal (LR) 50-75 ml Frasco de vidrio con tapa de rosca o tapa de hule bien asegurada.

Seguir cualquiera de los siguientes métodos: 1.- Centrifugación a 3000 rpm/30 min; congelar sobrenadante (-10 a -15ºC). 2. Solución sobresaturada de HgCl2 1 ml/100 ml LR; refrigérese. 3.- 5 ml de ácido metafosfórico al 25% y 25 ml de LR en baño de hielo 30 min. Centrifugar 12000 rpm/min. Agregar al sobrenadante alcohol amílico al 1 %, 0.6 ml/10 ml LR. Refrigérese.

Orinas 50-75 ml Frasco de vidrio con tapa de rosca

Agregar cualquiera de los preservadores; 5 ml/l: 1.- H2SO4 , 50%

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2.- HCl , 50% 3.- Sol. de K2Cr2O7 , 17.6 gr más HgCl2, 6.25 g y agua destilada cbp 100 ml. Refrigérese.

Sangre, plasma o suero

Depende de la determinación

Frasco de vidrio con tapa de rosca o hule bien asegurado

Refrigeración (1-5ºC) Congelación (-20 a -15ºC)

Heces de bovino, ovino, cerdo o ave.

150-200 g en base seca

Frasco de vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca; bolsas de polietileno.

Con 10% de humedad: refrigeración o congelación (-10ºC) Más de 10% de humedad, secar al sol ; secado posterior en estufa a 50ºC por 8-10 H.

Notas:

Cuando se van a determinar minerales es preferible usar nalgeno.

Cuando se va a determinar vitaminas, grado de enranciamiento, peróxido o digestibilidad de la proteína, preguntar al laboratorio antes de deshidratar o secar.

No olvide el dato de humedad cuando se deshidrata o seca para referirlo al laboratorio.

Pregunte al laboratorio antes de adicionar el preservador y no olvide indicar la cantidad empleada del mismo en la etiqueta.

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BIBLIOGRAFÍA

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VIROLOGÍA

Mendoza Vilchis Roberto, Gutiérrez Castillo, Adriana del Carmen

INTRODUCCIÓN

En el contexto del comercio internacional y nacional las exigencias para los alimentos de origen animal es que cuenten con un status sanitario favorable (ausencia de enfermedades de la Lista OIE que restringe el comercio). Por lo que la problemática en Salud Animal debe resolverse a través de un enfoque integral, identificando los riesgos derivados de las enfermedades limitantes de la producción, previniendo aquellas que puedan ser transmitidas a la población humana, asegurando la calidad sanitaria de los alimentos y disminuyendo el impacto al ambiente por las actividades de producción y transformación de los productos de origen animal, para bienestar del hombre. Lo que implica que los MVZ responsables de las unidades de producción deben establecer programas de bioseguridad que impidan la entrada de enfermedades que afecten el status sanitario del ganado, garantizando su ausencia a través de el monitoreo continuo. El diagnóstico virológico es una herramienta importante a utilizar tanto para garantizar el estado de salud de una unidad de producción, así como para detectar o descartar agentes virales en caso de presentarse un problema de salud. Por tanto el conocer los métodos y técnicas adecuadas para la selección y envió de muestras para el seguimiento virológico es de suma importancia, para que con la ayuda del laboratorio se pueda certificar el estado de salud de los animales o bien determinar el agente etiológico involucrado con un problema de salud animal, con la finalidad de tomar las medidas pertinentes que eviten su difusión y propagación en las poblaciones susceptibles. El área de virología cuenta con una gama de recursos para ser aplicados en el diagnóstico los cuales son utilizados de acuerdo con el objetivo que se persigue con la muestra:

1. Aislamiento e identificación del agente viral. 2. Demostración de incrementos significativos de los títulos de anticuerpos. 3. Detección de ácido nucleico viral: RT-PCR. 4. Citología, histopatología, microscopía electrónica: estás técnicas son utilizadas para

examinar tejidos sospechosos infectados, con la finalidad de identificar lesiones resultado de la presencia viral o bien son utilizados para detectar virus presente en los tejidos.

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Cualquier muestra deberá ser remitida con:

Historia clínica.

Debe colocarse en el exterior de la caja en sobre cerrado. Se deben incluir los siguientes datos:

Nombre, teléfono y dirección del propietario. Enfermedad sospechosa. Pruebas solicitadas. Especies animales en la explotación y tiempo que llevan en la misma. Es

muy importante señalar si ha habido alguna nueva incorporación. Fecha de los primeros síntomas. Distribución de la enfermedad por la explotación. Número de bajas y de animales con sintomatología. Tipo de alojamiento y sistema productivo. Medicación y vacunaciones administradas en los últimos días. Listado de las muestras remitidas.

Una vez recogidas y rotuladas las muestras, estas deben ser mantenidas a 4º C, siempre que el análisis de laboratorio se efectúe en menos de 72 horas, en el caso que análisis se realice después de las 72 horas, es mejor congelarlas a - 40º C y transportarlas en congelación. Se debe utilizar un frasco distinto para cada animal y con cierre hermético, tubos al vacío para la sangre o jeringas desechables de 20 ml y aguja apropiada para la edad del animal.

1. DETECCIÓN VIRAL:

Existen diferentes técnicas disponibles para la detección del virus o de sus antígenos virales (Aislamiento viral, inmunoflorescencia directa, inmunoperoxidasa directa, ELISA de captura de antígeno).

Aislamiento viral El aislamiento en cultivos celulares está considerado en la actualidad como la técnica de referencia obligada en zonas exentas de la enfermedad o como técnica confirmatoria en caso de dudas. Este método está basado en la capacidad de multiplicarse de algunos virus en una la línea celular conocida. Sobre esta línea, se coloca un macerado extraído de los órganos sospechosos, lo que permitirá ver si la muestra es positiva, ya que al replicarse el virus en las células se puede observar que el crecimiento este y el efecto que produce. Su presencia debe ponerse de manifiesto mediante un método de marcado inmunológico como la inmunoperoxidasa o fluoresceína. Es una técnica muy sensible, ya que aunque exista una pequeña cantidad de partículas virales infecciosas podrá multiplicarse en la línea celular, y muy específica gracias a los anticuerpos monoclonales. Presenta como único problema que es muy laboriosa y lenta, pudiendo llevar entre 3 a 10 días.

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Especímenes para aislamiento virológico Los especímenes se colectan preferentemente entre el tercero y séptimo día después de iniciada la enfermedad. Los especímenes colectados de animales muertos se toman lo más asépticamente posible y de ser posible después de que ocurra la muerte. El aislamiento viral a partir de músculo, hígado y riñón es poco común pero se puede intentar. Los especímenes deben ser enviados a 4º C (hielo) si el traslado de la muestra es corto, es decir que tarden en llegar al laboratorio de 6 a 12 hrs., los especímenes que tarden en llegar más tiempo se conservan a -70º C. La posibilidad de aislamiento viral depende críticamente del conocimiento, cuidado y atención del MVZ para colectar la muestra, la posibilidad de éxito de identificar el virus depende en gran medida de los signos clínicos y el conocimiento de la patogénesis del agente involucrado. Recolección de sangre para aislamiento virológico. La sangre es utilizada comúnmente para pruebas serológicas y para el aislamiento virológico a partir del suero o de los componentes celulares de la sangre, cuando la recolección se hace en la fase aguda de la enfermedad en los 3 primeros días y no más de 7. Material: Sistema vacutainer o jeringa, tubos de ensaye con tapón, con alcohol y algodón. Técnica: Colectar 10 ml de sangre, conservarse a una temperatura de 4ºC. Recomendaciones:

- No congelar suero junto con sangre, pues ocasiona hemólisis.

Muestras para aislamiento virológico a partir de hisopados. Los hisopados son obtenidos de mucosas oculares, nasales, vaginales y rectales. Material: hisopos estériles en tubos de ensayo con capuchón amarrado con hilo. Tubo con medio de Hank´s o solución fisiológica. Técnica: se frota el hisopo en la superficie a muestrear, luego se diluye el material colectado en tubo con el medio de Hank´s o solución fisiológica y remitido a 4ºC. El hisopo debe sumergirse en una solución desinfectante para luego ser incinerado inmediatamente después. Muestras para aislamiento virológico a partir de contenido intestinal. En animales vivos: Material: bolsa de polietileno. Técnica: Colocar la mano dentro de la bolsa y así, dentro del recto, tomar la muestra fecal, cerrando la mano para retirarla del recto, invertir la bolsa, se anuda y se identifica. En animales muertos: Material: hilo, frasco estéril con tapa hermética. Técnica: ligar el intestino en dos sectores separados a una distancia de 10 cm y cortar por fuera de la ligadura, colocarlo dentro del frasco y enviarse a 4ºC. Muestras para aislamiento virológico a partir de líquido cefalorraquídeo. Material: jeringa, aguja de 60x20 y tapa protectora de la aguja en condiciones de esterilidad. Técnica: Desinfectar y depilar la zona atlanto-occipital introducir la aguja en un ángulo de 45º, extraer líquido de la cisterna magna. Enviar el líquido en tubo estéril a -70º C ya que los virus en este medio son extremadamente lábiles.

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Muestras para aislamiento viral de líquido de vesículas. Material: jeringa y tubo de ensayo con tapón estéril. Técnica: extraer líquido de las vesículas y colocarlo en el tubo. Observaciones: Se envían trozos de epitelio de las vesículas en glicerina al 5% en agua destilada. Muestras para aislamiento virológico de orina. En animal vivo. Material: sonda plástica rígida; para machos de 5 mm de diámetro y en hembras de 1 cm de diámetro, vaselina y tubo estéril. Técnica: lubricar la sonda en su parte exterior con vaselina, introducir la sonda por orificio uretral, colectar la orina en tubo. En animal muerto. Material: jeringa nueva estéril. Técnica: extraer la orina directamente del cuerpo de la vejiga y enviar las muestras a 4ºC. Muestras para aislamiento virológico de lavado prepucial y uterino. Material: sonda, jeringa, recipiente estéril con tapa hermética medio Erle o Hank´s con antibiótico: 500 UI/ml de penicilina, 500 mg/ml de estreptomicina y 200 UI/ml de nistatina, con la finalidad de incrementar la tasa de aislamiento viral de las muestras. Técnica: Lavado prepucial: introducir la sonda en el prepucio, aplicando la mano en el orificio prepucial para cerrarlo y colocar 250 mL del medio en la cavidad prepucial y finalmente extraer el líquido y colocándolo en el frasco. Lavado uterino: introducir la sonda por el orificio uterino externo a través de ella colocar 500 cc de medio en la cavidad uterina, extraer por succión y colocarlo en el frasco.

Inmunofluorescencia (FD) e Inmunoperoxidasa Directa (IPD). Consisten en la detección de antígenos virales en cortes histológicos de órganos sospechosos mediante la tinción con un conjugado policlonal (contra todas las proteínas del virus, no permite la diferenciación) o monoclonal (frente a una proteína, permite la diferenciación) marcado con isotiocianato de fluoresceína (IFD) o peroxidasa (IPD). La ventaja de esta técnica es su gran rapidez (dos a tres horas); el inconveniente es que no se puede realizar en un gran número de muestras. Su utilización está recomendada para diagnóstico rápido en zonas ya infectadas o con altas sospechas de estar infectadas, o cuando el número de muestras no sea muy elevado. Elisa de captura: ELISA de captura para la detección de los antígenos virales a partir de órganos, leucocitos sanguíneos y suero de animales sospechosos se ha utilizado recientemente con aceptable éxito, dado el nivel de correlación con el aislamiento viral sobre todo a partir de los 5 a 6 días post infección. La técnica está basada en un sistema ELISA sandwich en el que se emplean anticuerpos monoclonales (AcM) específicos para capturar y revelar la captación de los antígenos virales. Esta técnica a diferencia de la anterior, la ventaja de ser utilizada para gran número de muestras, pues las diferentes etapas de la técnica ELISA, incluyendo la lectura, están automatizadas. El tiempo total de realización de este método es de 4 a 18 horas, mayor que en la IFD e IPD, pero mucho menor que en el aislamiento vírico. La técnica es recomendable utilizarla en zonas ya afectadas o con alta probabilidad de ser infectada así como cuando el número de muestras sea muy elevado.

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2. SEROLOGÍA:

Sirve para monitorear títulos de anticuerpos de los programas de vacunación, pero también sirve para mostrar o no el contacto con algún agente viral por la ausencia o por el incremento de títulos de anticuerpos específicos. En este caso las técnicas más utilizadas son la seroneutralización, la técnica de ELISA e inhibición de la hemoaglutinación. El uso de estas técnicas se recomienda para comprobar la presencia o no de zonas libres y no vacunadas, pero no cuando se sospecha de una infección reciente. En este caso se deben emplear además técnicas de detección viral. Para la interpretación serológica de las enfermedades virales es importante disponer de un antecedente de los títulos de anticuerpos. Ya que el diagnóstico se basa en demostrar anticuerpos específicos contra un virus en dos muestras de suero (muestras "pareadas") de un animal, de una misma población obtenidas a determinado intervalo. La primera debería tomarse cuando se detecta la enfermedad (fase sintomática), antes de que se formen anticuerpos, y la segunda debería obtenerse a las 3 semanas posteriores (fase convaleciente). Sólo en la muestra en la que el título de anticuerpos aumenta significativamente entre muestreos (más tres diluciones del suero), la seroconversión tiene valor diagnóstico. Frecuentemente se remite al laboratorio una muestra de suero, provocando que el resultado tenga un valor parcial en resultado diagnóstico. Material y Método: Material: jeringa, tubo de ensayo, tapón de goma, torundas de algodón con alcohol. Técnica: desinfectar el área de la vena a puncionar, extraer la sangre, colocar la sangre en el tubo de ensayo dejar reposar 2 hrs. a 22 ó 23º C hasta coagular y luego a 4º C hasta que el coágulo se retraiga, separar el suero vertiéndolo en otro tubo, el suero es clarificado por centrifugación durante 20 minutos y se congela a -20ºC hasta su utilización. Para el examen serológico es necesario enviar dos muestras del mismo animal la primera es extraída al principio de la enfermedad y la segunda dos o tres semanas después. ELISA

Los métodos más utilizados son los ELISAs de bloqueo, de competición o indirectos, debiendo detectar anticuerpos del virus en estudio pero a su vez evitar reacciones cruzadas con otros. Como antígeno emplean proteínas virales recombinantes o bien cepas de virus recomendadas por los Laboratorios de Referencia. ELISA de Competición. Se trata de un ELISA de captura-competición que emplea dos anticuerpos monoclonales (AcM) específicos frente a dos epítopos diferentes de la proteína estructural E2, uno de ellos tapizando las placas (anticuerpo de captura) y el otro conjugado con peroxidasa (anticuerpo detector). Como antígeno utiliza una proteína recombinante. ELISA de Bloqueo. Este tipo de ELISA emplea placas tapizadas con antígeno; los anticuerpos presentes en la muestra bloquearían la posibilidad de unión de un AcM conjugado con peroxidasa específico frente a la proteína que se añade en un paso posterior. En caso de que la muestra sea negativa el antígeno permanecerá libre, por lo que podrá unirse a él el AcM conjugado con peroxidasa, unión que se detectará mediante el color producido debido a la reacción de la peroxidasa con el substrato añadido a continuación. Otros ELISAs de bloqueo no emplean ni AcM ni proteínas recombinantes. Las placas se encuentran sensibilizadas con antígeno del virus purificado e inactivado, y como antisuero utilizan un suero hiperinmune anti-virus producido en conejo o cerdo y conjugado con peroxidasa.

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ELISA Indirecto. Las placas de se encuentran tapizadas con antígeno viral, y tras la incubación con el suero a testar, la reacción se pone de manifiesto utilizando como conjugado proteína A-peroxidasa. El gran inconveniente de los tres métodos descritos es que algunos Kits comerciales no permiten diferenciar los anticuerpos de enfermedad de los anticuerpos vacunales, de las vacunas actualmente comercializadas en la actualidad. SERONEUTRALIZACIÓN: El método de seroneutralización (SN) consiste en determinar la capacidad que tiene el suero objeto de estudio de neutralizar el efecto de un virus sobre la línea celular sensible (ejemplo PK 15). Para ello se utilizan diferentes diluciones del suero problema y se comparan sus resultados frente a un suero control. Las técnicas de enzimoinmunoensayo ELISA, para la detección de anticuerpos específicos, que se utilizan hoy en día, son técnicas rápidas, sensibles, específicas, de fácil ejecución y permiten analizar un gran número de muestras a la vez, por lo que son las utilizadas habitualmente en los rastreos epidemiológicos, sirviéndonos de las técnicas de SN para la confirmación de aquellos sueros que han resultado positivos o dudosos en la técnica de ELISA.

3. DETECCIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO VIRAL:

La técnica PCR para la detección de ácidos nucleicos virales resulta tremendamente práctica, rápida y eficaz en el diagnóstico de gran número de enfermedades infecciosas. Consiste en la detección de un pequeño fragmento específico ácido ribonucleico viral mediante la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa. De manera que se puede hacer un diagnóstico diferencial de gran sensibilidad y especificidad. Además, es una técnica relativamente rápida (6 horas) y económica. Sin embargo tiene el inconveniente de la dificultad en el manejo de un número elevado de muestras, si bien es posible trabajar con "pools" de muestras en lugar de muestras individuales, sin pérdida significativa de sensibilidad.

4. HISTOLOGÍA Y CITOLOGÍA:

Se utiliza para examinar tejidos sospechosos infectados, con la finalidad de identificar lesiones y demostrar la presencia de agentes virales: . RECOLECCIÓN DE MUESTRAS Diagnóstico virológico por citología e histopatología e inmunofluorescencia microcopia electrónica: Estás técnicas son utilizadas para efectuar el diagnóstico el mismo día o al siguiente, el inconveniente es que no siempre se observan las lesiones, o bien la cantidad de virus en la muestra no es suficiente para demostrar la presencia del agente en los tejidos por la técnica de inmunofluorescencia. Frotis. Está técnica es utilizada para el diagnóstico de distemper canino después de raspar la cornea, mucosa bronquial o vesical, se fija y se tiñe con hematoxilina y eosina. Material: portaobjetos y alcohol. Técnica: colocar una gota del material sospechoso en un extremo de un portaobjeto, apoyarlo sobre otro portaobjeto en un ángulo de 45º y deslizarlo hacia atrás, secar al aire, fijar con alcohol por 10 minutos, secar y envolver en papel para ser remitido al laboratorio.

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Improntas de órganos. Esta técnica es utilizada para hacer el diagnóstico a partir de biopsias o muestras de necropsias. Material: bisturí, portaobjetos, alcohol, papel absorbente. Técnica: después de cortar un trozo de órgano, se apoya una de las caras el número de veces necesario hasta retirar la sangre y otros líquidos en papel absorbente y posterior a esto sobre el portaobjetos, se fija por 10 minutos en alcohol y se seca. Histopatología de biopsias o muestras de necropsias: MATERIAL Y MÉTODOS Material: instrumental estéril. Frascos estériles con tapa. Frasco con formol bufferado. Técnica para la tinción de inmunoperoxidasa. Se colectan tejidos frescos de 1 cm. cúbico, utilizando instrumental estéril. En el caso de sistema nervioso deberá enviarse médula cervical y lumbar, corteza cerebral temporal y cerebelo. En casos de enfermedades respiratorias incluir pulmón y tráquea. Las muestras se enviarán en refrigeración. Para la técnica de histopatología los tejidos serán enviados en frascos con formol bufferado en una proporción de 1 en 30 volúmenes. Para el caso del estudio por microscopía electrónica igual se envía tejido de 1 cm3 en glutaraldehído al 3% en una proporción de 1 en 30 volúmenes.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MÉTODOS DIAGNÓSTICO VIROLÓGICOS

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO

VENTAJAS DESVENTAJAS

Aislamiento viral Permite estudios futuros del agente Disponible

Consume tiempo, no siempre se logra el aislamiento Seleccionar el tipo celular Observación directa.

Microscopio electrónico Microscopio inmunoeléctrico

Rápido detecta virus que son Difíciles de aislar o que no son viables

Se requiere equipamiento limitado a pocas infecciones virales.

Elisa (identificación serológica)

Rápida y sensitiva Kits diagnósticos

- No es aplicable a todos los virus. - La interpretación puede dificultarse. - Pruebas de tratamiento médico.

PCR Rápida sensitiva Potencialmente aplicada a todos los virus Puede no estar fácilmente disponible

Histopatología Rápido, fácil, disponible Limitado a algunas infecciones virales

Conversión de anticuerpos Es cuando en enfermedades que se comportan como brote

Interpretación puede dificultarse (suero en fase aguda y convaleciente)

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México.

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ESTUDIO PATOLOGICO: HISTOPATOLOGÍA

Velázquez Ordóñez Valente Gutiérrez del Castillo Adriana del Carmen

Zamora Espinosa, José Luis Díaz Zarco Soledad

CUERPO ACADEMICO EN SALUD ANIMAL CUERPO ACADEMICO EN PATOGENESIS MICROBIANA

FMVZ-UAEM. INTRODUCCIÒN La histopatología es una técnica empleada en el estudio patológico, la cual permite identificar microscópicamente las alteraciones presentes en los tejidos derivadas de algún proceso patológico detectado en el individuo. Las muestras para realizar el estudio histopatológico, se obtienen de los diferentes órganos y tejidos obtenidos al efectuar el estudio posmortem en el cadáver de un animal. También se pueden obtener muestras de un animal vivo a partir de una biopsia, que es una pequeña porciones de tejido, a partir de un sitio lesión. Este procedimiento se efectúa mediante un método quirúrgico que al incidir permite obtener el tejido por un corte o bien a partir de una punción exploratoria realizada mediante una aguja de centésis con un diámetro entre 3 a 8 mm dependiendo del tipo de estudio requerido. El procesamiento de tejidos para elaborar las preparaciones histológicas, que permitan el examen microscópico del tejido, se realizan mediante dos procedimientos; el de inclusión en parafina con la que se obtienen laminillas de tejidos con cortes fijos de mayor duración, aunque su proceso requiere de más tiempo. Los cortes por congelación tienen entre otras ventajas el permitir un diagnostico transquirúrgico rápido, además de la posible aplicación de otras técnicas de estudio; histoquímicas, inmunológicas y moleculares, sin embargo la vida media útil de estas laminillas es menor. La interpretación de la histología patológica la realiza el patólogo, el cual emite el diagnostico histopatológico de las lesiones microscópicas observadas sobre los tejidos estudiados. Confirmando o rectificando los hallazgos microscópicos, enunciados en el diagnostico anatomopatológico emitido después de efectuar el estudio posmortem, apoyado de la los antecedentes referidos en la historia clínica. MANEJO Y DISPOSICIÓN SANITARIA DEL CADAVER El cadáver de los animales, constituye una fuente valiosa de información patológica, que se obtiene al efectuar el realizar el estudio posmortem y el estudio histopatológico. Por lo tanto es indispensable manejar de manera adecuada el cadáver de los animales. No solamente por razones de bioseguridad con las cuales se disminuye el riesgo de diseminación de las enfermedades ò la contaminación del entorno ambiental por una deposición inadecuada de los cadáveres. Si no también por el procurar una conservación del animal muerto, para evitar los cambios posmortem, relacionados con la autolisis y putrefacción de los tejidos cambiando su integridad, este motivo impide concluir favorablemente el estudio de caso debido a las modificaciones de la apariencia histológica. Para efectuar el estudio posmortem se procura remitir preferentemente el animal, bajo condiciones de refrigeración generalmente inmediatamente después de haber ocurrido la muerte, y en un lapso de tiempo no mayor no mayor de 12 hrs. en mamíferos, y de no más de 3 hrs. en las aves.

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Considerado este tiempo transcurrido entre el deceso del animal y su entrega a la sala de necropsias, con esto contribuimos a asegurar una selección adecuada de tejidos para el diagnostico patológico. Lo anterior denota la importancia que tiene el manejo adecuado del cadáver cuando este se destina para estudio de caso como muestra para el laboratorio de diagnóstico en patología animal, razón por la que se deben de reconocer los estadios de la rigidez cadavérica (rigor mortis) y los posibles cambios posmortem observados en el animal. Debemos señalar que algunas condiciones clínicas predominantes antes de haber ocurrido la muerte del animal (bacteriemia, procesos febriles, stress, deshidratación y toxemia), contribuyen a acentuar la autolisis del cadáver. De igual forma el incremento en la temperatura ambiental y la posible exposición del animal muerto a los rayos solares aceleran los cambios posmortem y su invasión bacteriana por microorganismos saprofitos, propiciando la putrefacción y posteriormente la licuefacción del cadáver, esta última fase se incrementa por la presencia de larvas de insectos necrófagos desarrolladas a partir de los huevecillos depositados en orificios corporales y lesiones superficiales de la piel. Los anteriores cambios no permiten realizar el estudio patológico, salvo en algunas ocasiones bajo proceso legal y de bioconservación de la fauna, se requiere una aproximación mediante métodos de patología forense, complementados con técnicas moleculares, toxicológicas, bioquímicas y de microscopía especiales. Las cuales permiten identificar la especie animal, su morfometría y las posibles causas etológicas de la muerte. En el caso de animales con avanzados cambios posmortem no se emplearan para el estudio patológico y será destinado, a una disposición sanitaria mediante la incineración con el equipo aprobado por las normas ecológicas y sanitarias para tal efecto. También es posible disponer del cadáver y sus restos con otros procedimientos técnicos sanitarios a proceder bajo condiciones de campo. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS PARA HISTOPATOLOGÌA Durante la necropsia se observan las cavidades, la situación de los órganos y su relación anatómica. Posteriormente estos son extraídos y aprecian posibles cambios externos en; tamaño, forma, color, consistencia, volumen, peso y eventualmente alteraciones en su olor. Se inspecciona su apariencia superficial, e identifican las áreas afectadas, las cuales son expresadas en porcentaje, la presencia de cavidades, masas y artefactos en el órgano dañado. Para revisar la apariencia interna de los órganos, estos se palpan con suavidad y se seccionan longitudinalmente en pequeños trozos para apreciar lesiones profundas, cambios en apariencia y consistencia. Al efectuar las incisiones se emplean; cuchillos limpios y afilados, pinzas sin dientes, tijeras y bisturí según sea el caso. Al obtener las muestras de los tejidos destinados para el estudio histopatológico, se procuran porciones de tejido afectados y otras sin cambios patológicos aparentes, de aspecto aparentemente normal. En los casos en los que no es posible apreciar posibles cambios macroscópicos se envían muestras de los diferentes tejidos. La descripción sistemática, cuidadosa y objetiva las alteraciones en los órganos y tejidos, sin omitir ningún detalle significativo en el protocolo de necropsia, permite establecer una relación macroscópica y microscópica entre las áreas afectadas, en su caso determinar su relación con la nosología del caso, descrita en el resumen de la historia clínica.

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De pasar por alto las lesiones macroscópicas o seleccionar muestras inadecuadas para estudio, las lesiones, pueden no corresponder con el diagnóstico emitido en función de que el diagnostico histopatológico se basa en los hallazgos histológicos será exclusivamente de las lesiones que se identifiquen en el corte y que no necesariamente tienen relación con el problema poblacional o de la causa de muerte, por carecer de elementos apropiados para emitir un diagnóstico integral. MANEJO Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA El envío de muestras para el estudio histopatológico se efectúa a partir de la remisión del animal completo, órganos conservados en una solución de formalina amortiguada y biopsias de tejidos. En la obtención y transporte de muestras se debe evitar colocar los tejidos en solución salina antes del proceso de fijación, debido a que se propicia la autolisis. De la misma manera se evitara la inclusión de tejidos en recipientes conteniendo alcohol etílico y otras soluciones no aptas para el proceso de fijación de tejidos, las muestras para histopatología no deben mantenerse en congelación. PROCESO DE FIJACIÓN DE TEJIDOS La fijación además de preservar los tejidos detiene la autolisis y conserva la integridad tisular, al endurecerse ligeramente de tal forma que las estructuras titulares no se encogen y fragmentan permaneciendo en un estado cercano al in vivo. Además de permitir que el tejido permanezca sin cambios luego de subsecuentes tratamientos durante el procesamiento histológico de los tejidos. La fijación puede lograrse por inmersión o por perfusión, misma que se realiza en forma rápida, ya que cualquier demora favorece que el tejido, se seque y acelere la autolisis del mismo. A tal efecto las muestras se colectan en un frasco de boca ancha, con agente fijador. Se recomienda colocar primero el fijador en el frasco y después los tejidos para evitar que éstos se adhieran a las paredes del recipiente, de lo contrario se puede interferir en la acción del fijador sobre el tejido. Las muestras se depositan inmediatamente en el agente fijador y deben permanecer por 24 hrs., si se emplea la solución de formalina amortiguada, para lograr una correcta fijación, cuyo objetivo es preservar la morfología celular. Además de facilitar el corte e inclusión de los tejidos en la rutina del procesamiento histológico, así como el conservar los tejidos para estudios posteriores de referencia en patología por tiempo indefinido, excepto si se requieren para el empleo de técnicas de inmunohistoquímica. Se hace necesario destacar que la penetración del fijador en el tejido es lenta (se sabe que la penetración del fijador en el tejido es de aproximadamente 1 mm por hora) razón por la cual los cortes no deben sobrepasar mas de los 3 a 6 mm de grosor preferentemente. Es recomendable que cuando se remitan tejidos para histopatología estos tengan una superficie no mayor de 1 cm. x 1 cm. x 5 cm. En el caso de muestras de vísceras no deben exceder más de 2 cm. cuadrados de superficie y de 3 a 4 mm de grosor, efectuando un corte en sentido perpendicular a la cápsula del órgano. Cuando se obtiene una muestra de encéfalo este se prefiere que de las áreas predeterminadas de interés en el caso, se cortan en fresco transversalmente en delgadas rodajas de aproximadamente 0.6 a 1 cm. de espesor; utilizando un cuchillo largo y bien afilado para que el corte sea rápido y limpio, evitando su maceración. Bajo este procedimiento después de una hora el tejido estará lo suficientemente endurecido para resistir la manipulación posterior. Cuando se toman muestras demasiado gruesas se fijarán exclusivamente las partes periféricas mientras que en el centro, donde no puede penetrar el fijador, los procesos autolíticos avanzarán sobre el tejido.

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Si se cortan pedazos de tejido, pasados 20 a 30 min. Después de concluir el proceso de necropsia, la muestra se puede cortase nuevamente después de que los tejidos se han endurecido ligeramente, estos se cortan en trozos más pequeños, para ser colocados nuevamente en frascos para su fijación ulterior, sin el peligro de que se deformen. Los cortes frescos muy delgados tienden a retraerse, cuando se introducen en el fijador lo que dificulta su corte fino cuando se incluyen en los bloques de parafina; el excesivo encogimiento o abultado puede alterar las relaciones biplanares de los componentes tisulares. Los tejidos que flotan en la superficie, como el tejido adiposo y el pulmón, se procura envolver estos en gasa o algodón; una inclusión incompleta con frecuencia producirá pérdida del área de un tejido durante el proceso de corte. El tejido nervioso se altera rápidamente después de la muerte, lo que puede dificultar el distinguir estos cambios de lesiones degenerativas anteriores. Su precoz fijación es aún más importante que para otros tejidos; es esencial que tejidos como cerebro o médula ósea sean muestreados antes de transcurrida una hora de la muerte, de lo contrario se dificulta la interpretación histopatológica. Para el caso de intestino se recomienda ligar en los extremos antes de cortar el segmento que se envíe y con una jeringa se perfunde el fijador, evitando distender demasiado la víscera, posteriormente, se coloca en el frasco. AGENTES FIJADORES DE L TEJIDO La formalina neutra al 10% pH 7.2 (formol 37-40 %, 100 ml; agua destilada 900 ml; fosfato monobásico, 4g; y fosfato difásico anhidro de sodio, 6.5 g), en tanto que en algunos laboratorios prefieren la solución a un pH 7.4 para fijar los tejidos, se deben llenar completamente los frascos y no sobrepasar en unas 9 veces el volumen de la pieza (proporción 1:9, tejido: formol). Los recipientes para las muestras deben ser de boca ancha para que puedan salir íntegros y fácilmente una vez fijados. Los tejidos fijados en formalina pueden ser tratados de nuevo con otro fijador permitiendo así la posibilidad de hacer microscopía electrónica. Muchas reacciones inmunohistoquímicas pueden tener efecto en tejidos previamente fijados en formalina. El glutaraldehído penetra más lentamente que el formaldehído y es más recomendable en microscopía electrónica y en histoquímica enzimática. Pequeños bloques de tejido 1 - 2 mm en tamaño, se fijan bien a temperatura bajas, 1º a 4º C, y muestras de tejidos fijados pueden almacenarse en una solución estabilizadora por muchos meses. La penetración lenta, la baja temperatura requerida y la necesidad de un medio de almacenamiento impiden el uso de este fijador en la histotecnología diagnóstica de rutina. El ácido acético nunca se usa solo, sino en combinación con otros fijadores que causen contracción tisular. En ácido acético penetra rápida y completamente pero lisa los eritrocitos. La acetona fría se prefiere en estudios histoquímicos para enzimas, especialmente lipasas y fosfatasas. La acetona no se usa como un fijador de rutina por causar distorsión nuclear y compresión del citoplasma; además no preserva el glucógeno.

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Cuando se usan fijadores de Zenker o Bouin, una vez que han permanecido los tejidos 24 hrs. para su fijación, deben permanecer en alcohol por 3 hrs. en cada uno de los alcoholes al 50, 60 y 70%, para retirar la coloración amarilla, se prefiere agitar para favorecer esto, lavarse con agua y luego colocarse en alcohol al 80 %. No se debe utilizar ácido fénico, antisépticos o soluciones alcohólicas de uso quirúrgico como preservantes. MANEJO DEL TEJIDO NERVIOSO Para el diagnóstico de rabia se requiere el encéfalo y en determinadas circunstancias las glándulas salivales, la obtención de la muestra la debe realizar personal especializado cuyos títulos de anticuerpos antirrábicos garanticen que no existe riesgo de adquirir la enfermedad bajo la exposición. En caso contrario se debe enviar el cadáver dentro de un costal de plástico y cubierto con hielo, si esto no es posible se decapita el animal y la cabeza se envuelve en hojas de periódico para ser depositado en una bolsa doble de plástico y esta a su vez en un recipiente hermético que contenga hielo suficiente. El envío de las muestras debe ser lo más rápido posible en condiciones de refrigeración, congelación o conservadas en una solución de glicerina al 50% en solución salina fisiológica. Cuando se envían las muestras, en la parte externa del paquete se coloca una etiqueta con el SIMBOLO DE RIESGO BIOLOGICO y se anota una leyenda que diga “MATERIAL BIOLÓGICO DE FÁCIL DESCOMPOSICIÓN”, “MUESTRA SOSPECHOSA A RABIA” y “entrega inmediata al laboratorio para su procesamiento”. Es importante anexar los datos completos y exactos del propietario, nombre completo, dirección con algún punto de referencia (evitar el domicilio conocido), su teléfono, código postal, personas agredidas, personas en contacto. Datos del animal; sintomatología, si fue vacunado, cuando, tipo de vacuna, si existen más casos en la región, etc. Para enfermedades en programas de campañas nacionales como: la fiebre porcina clásica las muestras de histopatología sólo podrán utilizarse como apoyo y no como prueba definitiva para emitir un diagnóstico final. Las muestras recomendadas son: mitad de encéfalo, tonsila, ganglios linfáticos, riñón, hígado y bazo (Mínimo 1 cm. de ancho por 2 cm. de largo y 1 cm. de espesor). Y parte distal del íleon no más de 4 horas postmortem refrigerada o en congelación. En la Enfermedad de Aujeszky se enviarán muestras de tonsila, encéfalo, pulmón, bazo y ganglio de Gaser (ubicación). Para el programa de vigilancia de Neuropatías en bovinos en México en el que se efectúa el diagnostico diferencial entre los diferentes padecimientos neurológicos en la especie animal y dentro de ellos el de la Encefalopatía Espongiforme Bovina considerada como exótica en nuestro país. Para ello se recomiendan pedúnculos cerebrales, puente y médula oblonga. Así mismo estas porciones de tejido nervioso son remitidas para efectuar el diagnostico de Listeriosis y Scrapie en los ovinos. En el caso de un diagnóstico presuntivo de Distemper canino, se envía el cerebro completo.

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BIBLIOGRAFÍA

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CONSERVACIÓN Y ENVIÓ DE MUESTRAS PARA PRUEBAS MOLECULARES

Dr. Simón Martínez Castañeda.

INTRODUCCIÓN

La finalidad de este trabajo es presentar que los ácidos nucleicos (DNA y RNA) pueden

ser usados para el diagnóstico en diversas áreas como la Virología bacteriología

micología, genética, oncología medicina forense entre otras. Y que el éxito de la utilización

de estas moléculas en el diagnóstico depende en gran medida de la forma en la que se

puede obtener y preservar muestras de DNA o RNA. El DNA es usado más comúnmente

para propósitos de diagnóstico que el RNA, debido a que la primera es una molécula más

estable.

El diagnóstico basado en DNA toma ventaja de que dicha molécula es específica de cada

organismo y microorganismo, de esta manera por ejemplo en el campo de la

microbiología nosotros podemos identificar si la infección en un animal ha sido producida

por un virus o por una bacteria e incluso se puede establecer la cepa o especie que ha

producido dicha infección. En genética se pueden establecer registros genealógicos de

individuos ya que el genoma de cada uno es similar a una huella dactilar, esto quiere decir

que el DNA es especifico para cada persona y en medicina genómica donde las

enfermedades son producidas principalmente por mutaciones en los genes que codifican

para una proteína con una función específica, se puede identificar aquellos genes que

poseen las mutaciones y diferenciarlos de los genes normales.

Otra ventaja de la utilización del DNA en el diagnóstico de enfermedades es el hecho de

que los distintos métodos y tecnologías para el análisis de esta molécula es prácticamente

el mismo para cualquier especie de donde se haya obtenido el DNA.

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Tipos de DNA:

Para nuestros propósitos aquí, hay dos tipos de ADN por el que estar preocupado. El primero es el DNA nuclear de las células. El segundo tipo de DNA es el DNA mitocondrial (mtDNA) que está en las mitocondrias de las células. La prueba de mtDNA sigue a la línea maternal debido a que este tipo de DNA solo puede ser heredado por las madres. Sin embargo, usted también debe saber que los vástagos machos y de sexo femenino reciben su mtDNA de su madre. Eso quiere decir que mujeres también como los machos pueden tener su mtDNA y se pueden hacer pruebas para seguir los antepasados de su madre, la madre de su madre.

Métodos de colección

Desde un punto de vista científico, el orden de preferencia por probar las muestras de ADN sería 1) sangre, 2) el raspado bucal, 3) el pelo y 4) fluidos corporales. Hablaré un poco sobre cada tipo de muestra en los párrafos siguientes.

Sangre:

La sangre proporciona DNA en alta concentración y alta calidad. Distintas pruebas de laboratorio pueden realizarse a partir de una solo muestra, por ejemplo una muestra de sangre que es tomada en un animal que es sospechoso de estar infectado con el virus del distemper canino, mientras en el laboratorio clínico se realiza un hemograma para identificar si el animal presenta leucopenia, con parte de la misma muestra en el laboratorio de biología molecular se puede buscar la presencia de partículas virales mediante la técnica de RT-PCR.

Sin embargo la obtención de sangre es un método invasivo y muchos clientes prefieren otros métodos como el raspado de la mejilla o la obtención de pelo, pero en estos casos difícilmente se pueden realizar pruebas para enfermedades infecciosas siendo estas más preferidas para análisis genéticos.

Raspados bucales (mejilla):

Están usándose raspados bucales cada vez más en identificación y en pruebas de paternidad. Las células obtenidas de estas muestras proporcionan DNA en suficiente cantidad y calidad. Su colección es un procedimiento menos invasivo que los que se utilizan para obtener sangre. Las personas podrían tomar la muestra en sus casas y enviar las muestras al laboratorio.

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Pelo:

El pelo puede utilizarse para analizar DNA nuclear y mtDNA. Para el análisis del mtDNA, puede usar simplemente el propio pelo. Sin embargo, para DNA nuclear debe conseguir la "raíz" o "bombilla" del pelo. La raíz contiene el ADN nuclear que incluye. Obtener DNA del pelo es difícil y consume tiempo, por lo que esto podría aumentar los costos de cualquier prueba.

Conservación del DNA:

Primero se debe saber para quiere guardar DNA. ¿Para análisis de relaciones genealógica? ¿Para el diagnóstico o estudio de enfermedades médicas genéticas?, ¿para el diagnóstico de agentes infecciosos?

Comercialmente se puede utilizar el químico de FTA que fija el DNA para su almacenamiento este químico se inventó en 1988 por Profesor Leigh Burgoyne Asociado de la Universidad de Flinders en Australia (Tecnologías de Flinders PTY S.A.). Los Flinders lo lleva a otro sitio: (Whatman BioScience-quienes distribuyen los productos de FTA). Whatman tiene una licencia para distribuir los productos con el preservativo de FTA (desarrollado en Universidad de Flinders). Nota: Con respecto al químico FTA se ha comprobado que puede preservar el DNA durante 11 años en excelentes condiciones.

En el laboratorio DNA puede ser preservado en congelación a -20°C suspendido en etanol, isopropanol o acetona; incluso se ha reportado que la utilización de acetona podría conservar el DNA por varios años a temperatura ambiente.

También se ha estudiado el uso de DMSO (dimethyl sulfoxide)- para la preservación del DNA; esta sal provee la mejor protección para evitar la degradación de DNA.

BIBLIOGRAFÍA:

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2. Kilpatrick CW. (2002) Noncryogenic preservation of mammalian tissues for DNA extraction: an assessment of storage methods. Biochem Genet. Volumen 40; números 1-2; páginas 53-62.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Kilpatrick+CW%22%5BAuthor%5D

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ONCOLOGÍA

Fajardo Muñoz Raúl

Introducción

Las neoplasias son causadas por una proliferación continua no controlada de las células, debido a que éstas no son capaces de responder apropiadamente a las señales que rigen el comportamiento normal celular, crecen y se dividen de manera incontrolada, invadiendo los tejidos y órganos sanos, y finalmente se diseminan por todo el cuerpo. Uno de los puntos más importantes en la patología del cáncer es distinguir los elementos histológicos que caracterizan a los tumores malignos, así como su comportamiento, ya que estos tumores son capaces de invadir el tejido normal adyacente y de propagarse por el cuerpo mediante los sistemas circulatorio o linfático (producción de metástasis). Existen diversos factores a los que estamos expuestos día con día que favorecen y predisponen el desarrollo de procesos neoplásicos, entre los cuales se pueden mencionar la edad, la raza, factores genéticos y ambientales. En la clínica veterinaria ya no es raro encontrar procesos neoplásicos en caninos, inclusive se han encontrado en pacientes de corta edad. Estas neoplasias rara vez son remitidas a laboratorios especializados para realizar el estudio histopatológico, y esto representa una gran barrera para conocer y establecer un diagnostico preciso. Una de las dificultades con las que nos enfrentamos la mayoría de las veces es el no conocer como se deben tomar y enviar las muestras neoplásicas, además es indispensable actualizarnos, ya que se implementan nuevas técnicas diagnósticas que brindan la posibilidad de un diagnostico confiable y que den información pronóstica.

Puesto que las neoplasias se originan por disturbios del comportamiento y crecimiento celular y subcelular, su etiología debe diagnosticarse a nivel celular y subcelular, pero los estudios en epidemiología oncológica nos pueden brindar varias pistas sobre la causa de su aparición, a establecer prevalencias e incidencias, en gran medida a establecer la terapia adecuada para cada tipo de tumor y además de poder realizar estudios epidemiológicos comparativos con los estudios que se han realizado en humanos, ya que los perros podrían servir como centinelas de algunos factores ambientales predisponentes para los seres humanos. Actualmente el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal de la FMVZ-UAEM, con cooperación del Hospital Veterinario de Pequeñas Especies de la FMVZ- UAEM, Clínicas privadas y de estudiantes de licenciatura y de postgrado, está realizando investigación oncológica, con la finalidad de brindar estudios sobre el comportamiento epidemiológico, patológico, patología molecular y epidemiología molecular de las neoplasias en caninos de la ciudad de Toluca, ya que en esta ciudad se carece de esta información y a nivel nacional es muy escasa. Además se pretende establecer un banco de tejidos neoplásicos congelados para la extracción de ADN y ARN para contar con una base de datos que permita continuar con estudios posteriores en patología y epidemiología oncológica moleculares en veterinaria. Por tanto aprovechamos este curso para informarles sobre la toma y envió de las muestras para oncología y para invitarlos a participar en este proyecto.

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Objetivos

Presentar la toma y envío de la muestra oncológica. Realizar un estudio descriptivo de los tumores en pequeñas especies. Crear un banco de tejidos. Estudiar algunas mutaciones en el ADN o en el ARN de los tumores.

Material y Métodos

Generación de un banco de tejidos Colección de tejidos formolados (0.5-10 cm3). Colectar los bordes laterales e

inferiores de la neoplasia (Fig.1). En Masas tumorales voluminosas colectar varias biopsias de la misma

masa (Fig. 2). Colección de tejidos tumorales congelados (1-2 cm3). Colección de 2x2mm de tejidos en 500µl de trizol. Colección de sangre con EDTA congelada (2-5 ml). Creación de una base informática de datos.

Los tumores serán sometidos a Histopatología con técnicas convencionales y especiales

de oncología. Serán clasificados de acuerdo a la Clasificación Histológica Internacional de la OMS y del

Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de Norteamérica. Algunos tumores se podrán someter a pruebas inmunohistoquímicas para una mejor

clasificación. A la sangre y a los tejidos congelados se les hará la extracción de ADN y se comparará el

ADN de sangre con el ADN del tumor, para identificar las mutaciones. A los tejidos en trizol se les extraerá el ARN para identificar las mutaciones.

Como empezar

Debe haber una buena colaboración entre el Clínico y el Patólogo, ya que trabajan en conjunto para resolver el problema del paciente.

Papel del Médico Veterinario ° Identificar que se trata de un tumor ° Tomar biopsia ° Realizar cirugía ° Enviar tejido al laboratorio ° Dar tratamiento ° Tratar de determinar la epidemiología, etiología Papel del Patólogo en la Oncología Veterinaria ° Determinar la naturaleza del tipo de tumor ° Asegurar si la cirugía fue exitosa ° Indicar el pronóstico ° Dar información de evolución del tumor post tratamiento ° Tratar de determinar la epidemiología, etiología y la citomorfometría

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Figura 1. Se corta unos milímetros más de lo que abarca la neoplasia. Se debe enviar los bordes laterales e inferiores de la masa tumoral, ya que nos ayuda a ver si la masa tumoral está infiltrando el tejido normal y para ver si la cirugía retiró completamente el tejido tumoral.

Figura 2. En neoplasias voluminosas, se debe hacer un muestreo múltiple como se muestra en la figura, debido a que muchas veces el centro o los lados de la masa tumoral pueden presentar necrosis, impidiendo con el examen histopatológico. El muestreo múltiple da más posibilidad de llegar a un buen diagnóstico.

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Bibliografía

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3. Withrow S.J. (2001) Biopsy principles in Small animal clinical oncology. 3ra Ed. Saunders

Company pp.63-69.

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PECES

Celene Salgado-Miranda

Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México. Campus San Cayetano. Carretera Toluca-Atlacomulco, Km. 15.5, Toluca 50200, México, México. Tel/Fax: (722) 2-96-55-55, 2-96-89-90. Email: [email protected], [email protected] INTRODUCCIÓN En la acuacultura al igual que en toda actividad pecuaria se debe proporcionar a los organismos las condiciones adecuadas para un crecimiento y desarrollo óptimo, así como la implementación de medidas de bioseguridad para la prevención y control de enfermedades. Sin embargo, esto no siempre es posible y pueden presentarse brotes de enfermedades en las poblaciones animales, siendo necesario realizar un diagnóstico oportuno y correcto. Por lo anterior, es necesario conocer la forma correcta de muestreo, selección, conservación y envío de la muestra clínica al laboratorio. Debemos tener en cuenta que existen dos tipos de muestreo: el muestreo al azar y el muestreo dirigido. El muestreo dirigido se realiza cuando se presenta una enfermedad en los organismos y deseamos conocer la causa de esta. El muestreo al azar se realiza para establecer el estatus sanitario de la población. A continuación se listan algunas situaciones en las que se debe realizar el muestreo: organismos importados, organismos localizados en unidades de cuarentena, organismos que serán movilizados, organismos cultivados que no dispongan de certificado de salud, organismos naturales capturados y en organismos enfermos. Independientemente del tipo de muestra que sea enviada al laboratorio, existen algunas indicaciones importantes que deben ser consideradas: Muestra recién tomada con estrictas reglas de asepsia, muestra rotulada y acompañada de la historia clínica. SELECCIÓN DE LA MUESTRA Para seleccionar los organismos que conformarán la muestra, debemos observar su comportamiento dentro del agua así como su aspecto externo para identificar los cambios o alteraciones conductuales y físicas. La muestra debe integrarse a partir de organismos enfermos o moribundos y deberá completarse con organismos aparentemente sanos. Los organismos muestreados no deberán haber recibido tratamiento. Cuando se trate de un muestreo dirigido, la muestra debe conformarse con un mínimo de 10 organismos que presenten signos de enfermedad. En el muestreo al azar, deberá de considerarse el tamaño del lote, la prevalencia del patógeno, el porcentaje de sensibilidad y especificidad de la prueba diagnóstica. En ambos casos la toma de los organismos debe realizarse de forma aséptica con la ayuda de una red y cuchara del estanque muestreado. CONSERVACIÓN Y ENVÍO DE LA MUESTRA OBTENIDA Los organismos acuáticos que conforman la muestra clínica pueden ser transportados al laboratorio de la siguiente forma: tanques abiertos o cerrados, bolsas de plástico, en hielo o congelados o con preservativos químicos. A continuación se mencionan algunas recomendaciones para cada uno.

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

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Tanques abiertos o cerrados: Colocar agua suficiente, no sobrecargar el tanque con peces, colocar uno o varios difusores de oxígeno. Bolsas de plástico: Colocar 1/3 de agua y 2/3 de oxígeno o aire, no sobrecargar la bolsa con peces (Figura 1). Su efectividad aumenta si se coloca hielo afuera de la bolsa. En hielo o refrigerantes: Utilizar recipientes limpios, colocar los peces en bolsas de plástico, colocando hielo sobre estas. Preservativos químicos: En el caso de formaldehido utilizarlo a una concentración del 10%, realizar cortes de órganos de 0.5 cm. de grosor, la proporción muestra-formol debe ser 1:10. TÉCNICA DE SACRIFICIO Y NECROPSIA EN PECES Los peces pueden sacrificarse por medio de: Corte atrás de la cabeza, corriente eléctrica y anestésicos. Para realizar la necropsia de un pez, este debe colocarse en decúbito lateral, con la región cefálica a mano izquierda del operador y la región caudal a la derecha. Antes de iniciar la necropsia, se rocía la superficie del organismo con alcohol etílico al 70 %. El primer corte se realiza en el opérculo, dejando visibles las branquias las cuales se separan del arco branquial (Figura 2 y 3). El segundo corte se realiza en línea recta, en dirección craneal introduciendo las tijeras por la abertura anal. El tercer corte se hace en forma de semicírculo partiendo del ano, pasando a través de la superficie lateral del cuerpo llegando a la altura del opérculo, para finalmente penetrar en la cavidad (Figura 4), posteriormente el vértice de la piel debe ser cortado (Figura 5). El cuarto corte se realiza en el cráneo del pez, de adelante hacia atrás con una hoja de bisturí, dejando visible el cerebro (Figura 6). El quinto corte se hace con el bisturí en la musculatura. Concluida la necropsia, es necesario que los peces examinados sean incinerados y el material y equipo utilizado esterilizado.

Figura 1. Transporte de pez en bolsa de plástico (de Kinkelin, 1991)

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TÉCNICA PARA OBTENCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE La toma de sangre puede realizarse por varias vías: punción cardiaca, punción del vaso dorsal y corte del pedúnculo caudal (Figura 7).

Figura 5. Corte del vértice de la piel (Aluja, 1985)

Figura 2. Corte del opérculo (Aluja, 1985) Figura 3. Corte de las branquias (Aluja, 1985)

Figura 4. Segundo y tercer corte (Aluja, 1985)

Figura 6. Cuarto corte (Aluja, 1985)

Figura 7. Puntos para la toma de sangre

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BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA Amilácea, E. (1984): Manual de enfermedades de los peces. Acribia, Zaragoza, España. Barnabé, G. (1991): Acuicultura. Omega, Barcelona, España. Bruno, D. W.; Poppe, T. T. (1996): A colour atlas of salmonid diseases. Academic Press, USA. Collins, R. (2000): Principios de diagnóstico de enfermedades. Acuicultura para veterinarios. Producción y clínica de peces. Editorial Acribia, S. A. Zaragoza España. de Kinkelin, P.; Michel, C.; Ghittino, P. (1991): Tratado de las enfermedades de los peces. Acribia, Zaragoza, España. Noga, J. E. (2000): Fish Disease. Diagnosis and Treatment. First Edition. Iowa State Press. Iowa. USA. OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) (2008): Manual de Pruebas de Diagnóstico para los Animales Acuáticos. 5ª ed. Organisation Mondiale de la Santé Animale. France. OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) (2011): Código Sanitario para los Animales Acuáticos. 14ª ed. Organisation Mondiale de la Santé Animale. France. Plumb, J. A. (1999): Health maintenance and principal microbial diseases of cultured fishes. Iowa State University Press, USA. Roberts, R. J. (1981): Patología de los peces. Ediciones Mundi-Prensa, España. Roberts, R. J.; Shepherd, C. J. (1997): Handbook of trout and salmon diseases. Third edition. Fishing News Books, U.K. Shepherd, C. J. (1999): Piscicultura intensiva. Acribia, España. Zarzuela, P. E. (1981): Principales enfermedades infecciosas de los Peces. Biblioteca Técnica AEDOS, Barcelona, España.

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BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA

Dra. Adriana del Carmen Gutiérrez Castillo*,

Dr. Martín Talavera Rojas*, M. en C. Ada Elia Díaz González Borja,

M. en C. Roberto Mendoza Vilchis.

*Integrantes del Cuerpo Académico de Patogénesis Microbiana

INTRODUCCIÓN

La selección de la muestra, la conservación y el envío en forma correcta es de primordial importancia para llegar a un diagnóstico específico. El diagnóstico de enfermedades bacterianas y micóticas depende del aislamiento e identificación del agente etiológico. En algunos casos se hace un diagnóstico de presunción por el aspecto de un síndrome clínico y de las lesiones, sin embargo es impropio y peligroso fiarse de tal información como único criterio. Los aspectos más importantes de la bacteriología y micología diagnósticas son la obtención de una cantidad adecuada de la muestra precisa y la comunicación entre el médico de campo y el laboratorista para delinear el diagnóstico clínico y sugerir cualquier microorganismo poco común que pudiera causar la enfermedad en cuestión. Consideraciones generales respecto a la toma de la muestra: 1. Toda muestra para examen bacteriológico o micológico deberá ser tomada en condiciones de

asepsia y los recipientes para su envío deberán estar estériles. Debe evitarse la contaminación al momento de tomarla.

2. Seleccionar al animal para obtener la mejor muestra, de preferencia en una fase adelantada de su enfermedad. Si el mal representa un problema general del hato o parvada, las muestras se obtendrán de más de un animal enfermo. De cada grupo deben enviarse muestras de uno o dos animales que hayan muerto recientemente así como muestras de animales en varias fases de desarrollo de la enfermedad.

3. Asegurarse de que las muestras preparadas para el envío sean características de la enfermedad en estudio.

4. Considerar el horario de atención y días hábiles del laboratorio al que será remitida la muestra, con la finalidad de optimizar el recurso.

La obtención de una muestra adecuada carece de utilidad si el tiempo que media entre la toma y el cultivo permite que muera el microorganismo patógeno, o que sea superado en número por la flora normal que a veces contamina la muestra. Es de suma importancia transportar rápidamente las muestras al laboratorio de diagnóstico para procesarlas sin tardanza y así tener mayores probabilidades de proliferación, aislamiento e identificación del microorganismo patógeno. En algunas ocasiones se recomienda inocular inmediatamente la muestra en medio de cultivo, una vez obtenida del enfermo y después llevar el medio inoculado al laboratorio para incubarlo e identificar las bacterias. En otros casos puede protegerse el material en un caldo nutritivo o en un

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medio amortiguado para transporte y después llevarlo al laboratorio para que ahí prolifere. En todos los casos, el procesamiento rápido de todas las muestras y piezas permite la identificación más rápida y fidedigna del microorganismo. Es requisito indispensable anexar a la muestra una carta que explique toda la historia del caso y de ser posible incluir el diagnóstico presuntivo.

CONSERVACIÓN DE MUESTRAS

La mejor forma de preservar las muestras para bacteriología es en refrigeración: Hielo natural.- Este método de refrigeración sólo sirve si el envase está muy bien preparado y la distancia al laboratorio no es muy grande. El hielo conservará la muestra durante 8-12 horas. Las muestras acomodadas en hielo deberán colocarse en un recipiente hermético rodeado de un bloque de hielo o dentro de un recipiente, a su vez incluido en otro mayor, entre los cuales está el hielo. Hielo seco.- Se preferirá este método de refrigeración si la muestra puede congelarse sin perturbación con los necesarios procedimientos de laboratorio. La muestra deberá encerrarse en una bolsa de plástico u otro envoltorio impermeable, con el hielo seco envuelto en papel y colocado dentro de una caja. No deberá colocarse el hielo seco en contacto directo con la muestra, a no ser que la congelación no la modifique en absoluto. No debe enviarse hielo seco en un recipiente hermético de metal o vidrio, pues el hielo, al evaporarse se acumula con presión tan alta que provoca la explosión. Otro conservador es la glicerina al 50% combinada con una solución buffer de fosfatos, solución salina fisiológica, agua destilada, solución Hank o bien agua hervida, Inhibe el crecimiento bacteriano y mantiene la forma y tonicidad de los tejidos. Cuando el material no pueda ser enviado rápidamente al laboratorio, es aconsejable tomar las muestras con un hisopo y enviarlas en medio de transporte, en lugar de enviar los órganos completos. El medio de Stuart o de transporte está compuesto de agar, preparado con agua, glicerina y azul de metileno. Es utilizado para introducir hisopados de exudados y conserva la muestra lo más parecida a la hora en que fue tomada, impide la contaminación y multiplicación de las bacterias presentes.

DIMENSIONES ADECUADAS

En general entre 20 y 50 ml de líquido o entre 30 y 100 gr de órganos. En caso de que sea enviada una porción de intestino se recomienda que sea ligado en ambos extremos y se indique a que porción corresponde (duodeno, colon, etc.).

TIPO DE MUESTRA

El tipo de muestra es diferente dependiendo si el animal está muerto o no. Por ejemplo en casos de rinitis, faringitis, heridas infectadas, etc. el material generalmente será enviado en hisopos y medios de transporte; si se ha realizado la necropsia son los órganos los que serán enviados.

MUESTRAS DE ÓRGANOS Y TEJIDOS

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Todos los órganos y tejidos destinados a exámenes bacteriológicos, deben recolectarse en las mejores condiciones de asepsia y más tardar una hora después de la muerte del animal. Los órganos esenciales para dichos exámenes son: corazón, bazo, hígado, pulmón, riñones y ganglios linfáticos. Cuando se realiza la necropsia en campo y no se cuente con material previamente esterilizado puede hacerse uso de un mechero de alcohol para flamear el instrumental antes de tomar las muestras. Así mismo se recomienda obtener las muestras antes de la extracción de los órganos, cuando aún se encuentran dentro de la cavidad para evitar la manipulación innecesaria y posible contaminación. Debe procurarse el empleo de instrumental (pinzas, tijeras, cuchillos, etc.) previamente esterilizados en autoclave, por ebullición en agua durante 15 minutos o empleando antisépticos como el benzal o el alcohol (70%). Así mismo se usarán guantes que se lavarán en soluciones antisépticas cuantas veces sea necesario en el transcurso de la necropsia. Los órganos o parte de éstos se depositarán en frascos estériles de cristal o plástico de boca ancha con tapa de rosca o bien en bolsas de plástico. Cuando se carezca de los medios necesarios para la refrigeración, los tejidos podrán recolectarse en glicerina neutra y agua a partes iguales, mezcla que evita la proliferación bacteriana retardando la descomposición. Cuando se trate de recolectar exudados, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo o material purulento, se tomarán con agujas y jeringas estériles o con hisopos de algodón, depositándose en tubos de ensaye estériles con tapón de hule. Para evitar la desecación lenta de la muestra, los hisopos se humedecerán en solución salina estéril o en medios de cultivo apropiados (caldo infusión cerebro corazón, caldo tioglicolato), con lo cual se favorecerá la supervivencia de los microorganismos. Las muestras provenientes de distintos sistemas no deben colocarse en el mismo recipiente. Por ejemplo, no se debe mezclar un trozo de intestino con uno de pulmón.

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Selección de muestras idóneas para el aislamiento bacteriano y micótico de algunos agentes específicos de importancia en medicina veterinaria.

AGENTE ETIOLÓGICO

SELECCIÓN

TIEMPO PROMEDIO DE AISLAMIENTO E

IDENTIFICACIÓN EN EL LABORATORIO

Lysteria monocitogenes Médula oblonga y base del encéfalo, sangre, líquido cerebroespinal

2 semanas

Salmonella spp. Íleon, ciegos, hígado, médula ósea, heces fecales.

4 días

Campylobacter spp Heces, intestino delgado y grueso (en aves además tonsilas cecales)

5-7 días

Escherichia coli Íleon, ganglios regionales, médula ósea, heces fecales

4 días

Mycoplasma spp. Hisopado nasal, pulmón, ganglios regionales

5-7 días

Corynebacterium renale Orina fresca, vejiga o riñón. 4 días

Actinobacillus pleuropneumoniae

Pulmón 4-7 días

Haemophilus somnus Meninges, encéfalo, líquido cefalorraquídeo

5-7 días

Streptococcus suis Hisopado de meninges, meninges, encéfalo

5 días

Clostridium chavoei, Clostridium novyi y

Clostridium septicum

Músculo y tejidos necróticos 4-7 días

Bacillus anthracis Sangre 4-7 días

Haemophilus parasuis Pulmón 4-7 días

Agentes productores de mastitis: Streptococcus,

Staphylococcus, E. coli, etc.

Leche 4-7 días

Micosis cutáneas: Epidermophyton floccosum,

Microsporum canis, Keratinomyces ajelloi,

Trichophyton equinum, etc.

Raspados de piel 1-2 semanas

Micosis subcutáneas: Trichosporon cutaneum

Raspado profundo de piel, biopsia. 1-2 semanas

Micosis sistémicas: Blastomyces dermatitidis,

Coccidioides immitis

Pulmón, ganglios regionales 1-2 semanas

MUESTRAS DE SANGRE

Si el examen bacteriológico se practica a partir de sangre, esta se extraerá con toda asepsia, directamente del corazón o de una vena accesible antes de la muerte del animal y se depositará en tubo de ensaye estéril que contenga anticoagulante (citrato de sodio, heparina, E.D.T.A.). En muchos casos de bacteremia los microorganismos se encuentran

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en número relativamente pequeño. La cantidad de sangre que se extrae para cultivo no debe ser escasa, por lo general no inferior a 10 ml. Es esencial la estricta asepsia en la extracción de sangre y en el paso de esta a los tubos esterilizados que la van a contener. El lugar elegido para la punción debe ser rasurado y lavado con jabón detergente. Después se limpia con un algodón empapado en éter o alcohol y finalmente se aplica yodo o merthiolato. La jeringa y la aguja deben estar secas y libres de residuos químicos. Es preferible usar una aguja desechable estéril. Aunque la muestra de sangre puede recogerse en un tubo estéril conteniendo anticoagulante que, que se remite al laboratorio, es mejor ponerla directamente en el recipiente que contiene un medio de cultivo. La ventaja de la inoculación inmediata es que se evita que los pocos microorganismos presentes en la muestra de sangre mueran durante el transporte al laboratorio. La mayoría de las bacterias pueden aislarse en medios que contengan como base caldo de triptosa u otra fórmula de las que se usan para el cultivo de sangre. Algunas bacterias que se encuentran en la sangre requieren condiciones anaeróbicas o microanaerófilas para su multiplicación y hay que ajustar de modo conveniente las condiciones de incubación del medio inoculado. La identificación de patógenos específicos requiere subcultivos en otros medios y los procedimientos usuales de aislamiento y tipificación. La presencia de bacterias en la sangre (bacteriemia) a menudo se acompaña con escalofríos y fiebre, taquicardia e hipotensión. Incluso en infecciones en que dicho signo constituye el aspecto principal de la enfermedad, no siempre están los microorganismos en la corriente sanguínea en números suficientes para identificarlos en una sola muestra de sangre. A veces se necesita extraer varias muestras de sangre en los animales enfermos antes de aislar el agente causal. Cuando se sospecha de bacteriemia intermitente, es costumbre obtener tres muestras de sangre de 10 ml en un lapso de 24 horas, para maximizar las posibilidades de poder aislar el microorganismo.

MUESTRAS FECALES

Para el examen bacteriológico no es necesario el uso de preservativos. Un método para enviar muestras de heces consiste en suspender 5 gramos de material en solución salina fisiológica adicionada con 30% de glicerol. Es conveniente que todas las muestras de excremento para estudios bacteriológicos viajen refrigeradas. Los organismos patógenos pueden no hallarse en el excremento durante todo el curso clínico de la enfermedad, lo cual sucede en individuos que han recibido quimioterapia contra bacterias. El mejor tiempo para obtener muestras en estos casos es en la etapa inicial de la fase aguda.

LÍQUIDOS CORPORALES, EXUDADOS Y HERIDAS

Los líquidos cefalorraquídeo, peritoneal, articular, contenido de abscesos, etc. pueden enviarse en jeringas estériles.

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Los signos comunes de meningitis son cefalalgia, fiebre, vómito y rigidez del cuello. El líquido cefalorraquídeo se obtiene por una punción en la región occipital o lumbar. Es de máxima importancia descontaminar el sitio de punción y así asegurar que no se inyecte mecánicamente en el líquido algunos microorganismos o material contaminante. La muestra debe colocarse en un tubo estéril con tapa de rosca y enviarse inmediatamente al laboratorio para diagnóstico. Es posible prever que el pus y el exudado de una herida infectada o un absceso abierto contengan el agente etiológico de la infección. Sin embargo, en heridas abiertas casi siempre se detectan contaminantes de piel y suelo, que en circunstancias apropiadas de cultivo superan en número al microorganismo infectante real y con ello, se tiene un resultado erróneo. En la medida de lo posible hay que utilizar una jeringa y una aguja estériles para obtener muestras de heridas y abscesos. El empleo de un hisopo no siempre es satisfactorio, por el poco material reunido con él y porque muchos de los microorganismos mueren al secarse el algodón, con lo cual es difícil o imposible aislar el o los agentes etiológicos. Es importante recordar también que las heridas y los abscesos suelen estar infectados con bacterias anaerobias obligadas, que rápidamente mueren en el hisopo que queda expuesto a la atmósfera. Por las razones aducidas, todos los materiales aspirados deben transportarse al laboratorio en frascos especiales que tengan gas pero no oxígeno. Tales recipientes, que se expenden comercialmente, pueden contener unas cuantas gotas de resazurina al 0.0003%, un indicador de oxidorreducción, que adquiere color rosa si se contamina el interior del recipiente con aire. Un método sencillo consiste en sumergir la muestra en un medio semisólido para favorecer la microanaerobiosis necesaria para la conservación de las bacterias como Haemophilus, Campylobacter, Helicobacter, etc. Las quemaduras son infectadas a menudo por oportunistas, como Pseudomona aeruginosa, gérmenes entéricos, Staphylococcus y levaduras, y es muy difícil el aislamiento del agente definitivo. Es necesario enviar en estos casos muestras de tejido quemado y cualquier material de drenaje.

MUESTRAS DE ORINA

La orina utilizada para el cultivo bacteriológico debe ser recogida en un recipiente estéril, de la porción media y de la porción ultima de la emisión. Si esto no es factible, es adecuada la muestra obtenida por cateterización, ésta por lo general se recomienda en las hembras. A este tipo de muestras no debe añadirse preservativos. La aspiración de orina por paracentesis entraña el peligro de peritonitis. Proteus, organismo que por lo general se encuentra en la orina de los cánidos causa peritonitis rápida y mortal después de la parecentesis.

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Si se sospecha de Leptospirosis se debe añadir formol al 10% como conservador en proporción de 1:9 (formol: orina) para preservar la integridad de las Leptospiras.

LECHE

La muestra debe ser tomada antes del ordeño o al menos 6 horas después. Si se lava el pezón es indispensable secar muy bien. Eliminar los primeros chorros y colocar la leche en tubos estériles. Una vez que se cuenta con la muestra y se ha hecho la evaluación clínica de la enfermedad, es tarea del laboratorista aislar el agente etiológico, identificarlo y dar un perfil de la susceptibilidad a los antibióticos. Sin embargo, incluso después del aislamiento y la identificación de microorganismos en una muestra de laboratorio, no siempre es posible definir que sean la causa de la enfermedad o síntomas, pero que bajo circunstancias especiales ocasionan infecciones graves. No siempre se sabe por qué un microorganismo causa enfermedad y en ocasiones no la causa. Los géneros Fusobacterium y Bacteroides rara vez causan enfermedad si están en su hábitat normal en el intestino grueso, pero producen graves abscesos si se introducen en heridas. Staphylococcus aureus causa los cuadros más graves como invasor secundario después de una infección viral o cuando algún antibiótico ha destruido el resto de la flora normal. El éxito o el fracaso de un análisis de muestras en laboratorio depende en gran medida de la forma en que la muestra sea recolectada, conservada y enviada, puesto que alguna incorrección en cualquiera de ellas arruina la correcta identificación de los agentes que causan la enfermedad o infección que afecta a los animales en estudio.

RASPADOS CUTÁNEOS

En caso de piodermias (bacterianas) o infecciones micóticas se procede a raspar la lesión con el filo de una navaja o bisturí estéril de forma perpendicular, pasándola varias veces por la lesión. El primer material obtenido se desecha y se procede a realizar otro raspado que será conservado en medio de transporte (bacteriología) o bien en un sobre de papel (micología).

MICOSIS SUPERFICIALES

Para la adecuada toma de muestra de las micosis superficiales se recomienda seguir las siguientes recomendaciones: examen con luz de Wood, limpieza del área afectada y recogida de la muestra.

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Examen con luz de Wood. Antes de realizar la toma de muestras de una micosis superficial es aconsejable examinar las lesiones de la piel (dermatofitosis) en una habitación completamente oscura bajo la luz de Wood (luz ultravioleta de 365 nm de longitud de onda, que pasa a través de un filtro de cristal que contiene óxido de níquel). En Tinea capitis debidas a Microsporum spp. o Trichophyton schoenleinii, las lesiones muestran una fluorescencia característica. El descubrimiento de Margarot y Deveze, en 1925, de que pelos infectados por ciertos dermatofitos producían una fluorescencia característica bajo la luz ultravioleta de la lámpara de Wood fue un importante avance en la Micología. La naturaleza y fuente de las sustancias fluorescentes en los pelos infectados no son del todo conocidas y la sugerencia de que era una pteridina ha sido cuestionada. El pelo permanece fluorescente después de que el hongo deje de ser viable, y el material fluorescente puede ser extraído del pelo en agua caliente o solución fría de bromuro de sodio. Debido a que el crecimiento del hongo, en el medio de cultivo o de forma in vitro en el pelo, no origina fluorescencia, esta se atribuye a alguna sustancia producida por la interacción entre el crecimiento del hongo y del pelo. Solamente algunos dermatofitos capaces de invadir el pelo producen fluorescencia: M. canis y M. audouinii, siempre producen fluorescencia verde; sin embargo, M. gypseum y M. nanum, lo hacen ocasionalmente. T. shoenleinii, causa una fluorescencia verde pálida. La fuente más común de errores en el examen con luz de Wood es una habitación insuficientemente oscura o la existencia de sustancias químicas capaces de emitir fluorescencia (cosméticos, productos terapéuticos, etc.). Limpieza del área afectada. Antes de realizar la recogida de la muestra, la piel, pelos o uñas afectados deben limpiarse con etanol (70%) para eliminar la flora bacteriana, exudación o restos de excipientes de tratamientos previos que dificultan el examen directo y el cultivo. Recolección del material. Escamas. En las lesiones descamativas, deben recogerse las escamas de las zonas afectas con fluorescencia positiva (pitiriasis versicolor o eritrasma) o con fluorescencia negativa (candidiasis y dermatofitosis), raspando su borde activo con un bisturí desechable, ya que dicho borde es el que más probablemente contenga elementos fúngicos viables. Cuando existen lesiones satélites (candidiasis), el raspado se realiza de dichas lesiones por ser las más jóvenes. El material obtenido se recoge en un sobre o placa de Petri (debidamente precintada), con el fin de mantenerlo seco y libre de contaminación. El uso de contenedores de plástico puede tener el inconveniente de que las escamas se adhieran a sus paredes dificultando su recuperación; mientras que el uso de portaobjetos de cristal, tiene el riesgo de pérdida de material por ruptura del vidrio en el transporte. Los dermatofitos en los raspados de la piel pueden permanecer viables durante meses.

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En la pitiriasis versicolor parcialmente tratada, la descamación es escasa, por lo que se recomienda hacer la toma con la técnica del papel de sello, para ello se aplica la zona adherente de la cinta sobre la piel a estudiar, presionando enérgicamente, se despega y se coloca sobre un portaobjetos. En intertrigos candidiásicos, las lesiones no suelen ser descamativas sino exudativas, en cuyo caso no se debe raspar porque resultaría una técnica cruenta, sino que el material se recoge con torunda estéril con/sin humedad. Si el espécimen no va a ser procesado inmediatamente, se prefiere el empleo de torunda con un medio de transporte (como el de Stuart) ya que las levaduras pierden rápidamente la viabilidad en los hisopos secos. Pero hay que tener presente que el retraso en el procesamiento de estas torundas permite la multiplicación de las bacterias en la muestra y que, además, el medio de transporte la diluye, dificultando la observación directa. Existe una técnica complementaria o alternativa para la recogida de las escamas en las micosis cutáneas (candidiasis y dermatofitosis): el método del cuadrado de moqueta de Mariat y Adán- Campos. Consiste en frotar 5 veces con un cuadrado de alfombra de lana estéril la totalidad de la superficie a examinar (piel glabra o cuero cabelludo); posteriormente, la moqueta se guarda en un sobre de papel o en una caja de Petri y se envía al laboratorio de Micología para su procesamiento. Este procedimiento tiene varias ventajas: i) no es cruento para el paciente, ii) es útil para realizar tomas de Tinea capitis con fluorescencia negativa, iii) permite estudiar a portadores asintomáticos de dermatofitos o pacientes ya tratados, cuando la lesión clínica ha desaparecido, iv) facilita los estudios epidemiológicos de tiña y v) permite estudiar animales (gatos, perros, etc.) que pueden ser reservorio de dermatofitos. Sin embargo, tiene el inconveniente de que con esta técnica no se puede realizar la observación directa, solamente el cultivo. Pelos. Dependiendo del tipo de lesión observada, los pelos deben recogerse mediante diversas técnicas: • En la Piedra blanca o la Piedra negra, ambas confinadas a la vaina del pelo, se debe cortar la porción supra folicular de los pelos enfermos. • En las tiñas es importante recoger los pelos parasitados arrancándolos con la raíz intacta, ya que cortar los pelos es menos eficaz. En muchas ocasiones, los pelos parasitados se reconocen porque tienen una fluorescencia positiva con luz de Wood, están deslustrados, rotos, friables o se desprenden fácilmente con el raspado. Las tiñas microspóricas (M. canis y M. audouinii) se reconocen por presentar una placa escamosa blanquecina con escasa o nula inflamación, que puede alcanzar varios centímetros de diámetro, y en la cual se observan pelos rotos a 5-10 mm de la superficie cutánea, estos pelos parasitados son friables y se arrancan con facilidad al raspar con el bisturí. Las tiñas tricofíticas antropofílicas (Trichophyton tonsurans y T. violaceum), forman pequeñas placas escamosas con pelos de poca longitud, en forma de W o Z, situados en el espesor de la escama o bien rotos al nivel de la superficie dando un aspecto de “puntos

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negros”, casi siempre en ausencia de inflamación. Estos “puntos negros” son los que deben extraerse con la punta del bisturí o mediante pinzas. La tiña favosa (T. schoenleinii) presenta costras amarillentas, cóncavas y centradas por un pelo, denominadas escútulas o cazoletas fávicas. Están formadas por un conglomerado de hifas que originan una foliculitis y, con el tiempo, alopecia cicatricial por destrucción de la matriz. La muestra de estas lesiones debe ser tomada con asa (el pus folicular) y cucharilla (las cazoletas). Algunos autores recomiendan que en lesiones de tiña tricofítica, en las cuales se encuentran mezclados pelos sanos y enfermos, es útil cortar 20 a 30 pelos a una altura de 1 cm (en un área de 4-5 cm de diámetro) y, posteriormente, depositarlos en un portaobjetos, previamente calentado o en una placa de Petri, destinando una parte del mismo al examen directo y otra al cultivo. En la Tinea capitis, además, se pueden realizar tomas con la moqueta de Mariat y Adán-Campos y con un cepillo de plástico estéril de diámetro inferior a la placa de Petri donde se va a sembrar. Este método de cultivo es extremadamente sensible y de gran valor para estudios epidemiológicos de animales domésticos sospechosos. Consiste en cepillar enérgicamente 10 veces el cuero cabelludo y posteriormente implantar las púas del cepillo sobre la superficie del agar (técnica descrita por MacKenzie y usada por Clayton y Midgley. Antes de reutilizar estos cepillos deben esterilizarse con óxido de etileno. En lesiones dolorosas e inflamatorias, como el Kerion, o en individuos sensibles, puede ser difícil la toma de muestras. En estos casos, el uso de una torunda humedecida sobre la zona afectada puede ser el único medio incruento de realizar la toma. Con esta técnica es posible obtener cultivos positivos, pero resultados negativos no excluyen la infección. Uñas. En las onicomicosis, la toma de muestras varía en función del tipo de lesión clínica: Onicomicosis distal y lateral subungueal o uña en “médula de junco”: la lesión comienza en el borde libre de la uña y va extendiéndose hacia la matriz, la sustancia de la uña se sustituye por un material amarillento y friable, mientras que la lámina exterior puede estar infectada o destruida. Esta lesión es debida a dermatofitos, Scopulariopsis spp. o Scytalidium dimidiatum. En estos casos, se recoge el material ungular más cercano a la cutícula, raspando con el bisturí en la profundidad del surco periungueal. Con una torunda o asa estéril, se obtiene el pus de la paroniquia acompañante tras incisión con lanceta o compresión de la porción lateral del dedo. Onicomicosis distrófica total: corresponde al estadio final de cualquier onicomicosis. En estos casos, se debe raspar preferentemente el material subungueal. Transporte de la muestra superficial. Las muestras superficiales de pitiriasis versicolor y dermatofitosis deben ser transportadas en un contenedor seco; sin embargo, si se sospecha la presencia de Candida spp. y se demorase su procesamiento, se debe emplear un medio de transporte como el de Stuart, para preservar su viabilidad. Las distintas opciones de transporte, como ya se comentó para bacteriología, están en función

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de la lesión clínica, agente etiológico y posibilidades de recolección. El almacenaje de muestras dermatológicas se debe realizar a temperatura ambiente. Los nuevos métodos de detección e identificación de patógenos microbianos, basados en el ADN, ofrecen ventajas tanto para los productores como para los consumidores. La seguridad microbiológica de los alimentos continúa suscitando gran preocupación entre todos los componentes de la cadena alimenticia, del campo a la mesa. Productores, transformadores y encargados de la elaboración de alimentos toman todas las precauciones posibles para evitar que la comida que ofrecen pueda provocar una intoxicación. Entre los sistemas para la gestión de la seguridad alimenticia que han demostrado ya resultados satisfactorios cabe mencionar el sistema de Buenas Prácticas de Fabricación y el denominado Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos. Un aspecto importante de estos sistemas preventivos que garantizan la seguridad, es que determinan si los patógenos en potencia se encuentran en los productos en crudo o en el entorno de la cadena alimenticia en cuestión. Las pruebas de detección de agentes patógenos siempre han requerido largos análisis a cargo de personal muy calificado. En la última década, esos análisis tradicionales se han sustituido por métodos que se sirven del ADN, mucho más rápidos. Un técnico puede realizarlos en cuestión de pocas horas, mientras que las técnicas antiguas podían llevarle varios días a un microbiólogo altamente preparado. Estos nuevos métodos, al utilizar información genética para detectar las bacterias, proporcionan resultados más precisos que los tradicionales, basados en las características bioquímicas e inmunológicas, que estaban sujetos a las condiciones del entorno. Muchos de los nuevos métodos dependen de la ampliación enzimática o reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR), que ha evolucionado en los últimos años gran parte de la biología molecular, ya que permite obtener cantidades considerables de ADN a partir de muestras ínfimas. Otros se basan en una técnica denominada hibridación del ADN. Los primeros resultan de gran utilidad para confirmar la presencia o ausencia de agentes patógenos determinados en los alimentos. Para comprobar la existencia de un germen en particular, como la bacteria de la salmonera, se toma una muestra del alimento en cuestión y se favorece el desarrollo de cualquier bacteria en él. Se extrae luego el ADN de las bacterias y, mediante la técnica de PCR, se amplifican las pequeñas cantidades de ADN extraídas hasta obtener cantidades fáciles de identificar. La PCR sólo amplificará el ADN del organismo elegido (en este caso, la salmonera) y, de estar presente, resultará fácil de detectar. Diversos métodos de producción comercial para toda serie de bacterias patógenas ya están disponibles. Cuando se trata de identificar de forma precisa ciertos patógenos en materias primas, a lo largo de la cadena de producción o en los productos finales, se aplican técnicas basadas en la hibridación del ADN, que proporcionan las “huellas” del ADN de los microbios. Existe una versión automatizada de este sistema, que compara la huella del ADN de cualquier muestra con otras almacenadas en una base de datos y archiva luego el prototipo, así como las referencias relativas a su origen.

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Al cotejar esas huellas características a través de todo el proceso de producción alimentaria, se puede establecer el origen del agente patógeno. A modo de ejemplo, una empresa del sector productor de alimentos detectó recientemente Staphylococcus epidermidis en sus productos mediante los procedimientos de garantía de calidad habituales. La tecnología reciente permitió descubrir que, de entre las diversas fuentes posibles de dicho espécimen patógeno en la planta de producción, el origen de la contaminación eras las manos de un empleado, con lo que pudieron tomarse medidas correctivas inmediatas y de bajo costo, en lugar de verse forzados a suspender la actividad para realizar una costosísima descontaminación general. Gracias a estos nuevos métodos novedosos basados en el ADN, se puede identificar rápidamente el origen de patógenos y retirar de la venta los alimentos afectados. Es indudable que tanto los productores como los consumidores se benefician de estas técnicas, que permiten llevarles la delantera a los agentes patógenos. ¿Cuándo usamos biología molecular en bacteriología y micología?:

En diagnósticos difíciles. En susceptibilidad y resistencia antimicrobiana. En la tipificación de cepas.

¿Cuándo usar PCR? Si el microorganismo no crece in vitro. Si el cultivo es poco sensible Si los medios de cultivo que se requieren son complejos, por ejemplo cultivo celular. Si el tiempo de incubación es demasiado prolongado.

La naturaleza de las muestras varía dependiendo del tipo de agente bacteriano o micótico. Las más comunes son: Sangre.- Se recomienda en lo posible la extracción de tres muestras de sangre (3 a 10 mL según la especie animal) obtenidas en días consecutivos. La sangre se colecta en tubos que contengan polianetol sulfonato de sodio (SPS) como anticoagulante (Vacutainer, BBL, Cokeysville, Maryland, EUA), y se remite de inmediato para su procesamiento. Hisopo rectal.- La muestra se toma introduciendo la punta de un hisopo de algodón humedecido en solución salina o medio de transporte en el recto y haciéndolo rotar ligeramente. Estará bien tomada si observamos un ligero color café en el hisopo. Una vez tomada la muestra se introduce en hisopo hasta el fondo en un tubo con medio de transporte de Cary Blair que debe ser bien tapado posterior a la toma de muestra (tapón de rosca preferentemente). Para estudios bacteriológicos se envía inmediatamente después de haberse tomado. Se envía a temperatura ambiente. Materia fecal.- Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con tapa hermética que permitan su fácil transporte, de preferencia que no sean de vidrio. Las heces obtenidas del suelo no son satisfactorias, debido a que pueden

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contaminarse con material ajeno. La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio. El transporte se realiza en frío.

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Cuadro de referencia para la selección de las muestras en relación con los probables agentes bacterianos y micóticos involucrados.

TIPO DE MUESTRA

MICROORGANISMOS PROBABLES PRESENTES

TIPO DE MUESTRA


TIPO DE MUESTRA


Torunda nasal

Staphylococcus Streptococcus

Pasteurella Haemophilus Actinomyces Mycoplasma

Corynebacterium Escherichia coli

Klebsiella Bordetella

Pseudomona Aspergillus

Cryptococcus

Pus y líquidos

pleurales y peritoneales


Corynebacterium Pasteurella

Actinomyces Actinobacillus

Escherichia coli Haemophilus

Pseudomonas Bacteroides Clostridium Nocardia

Coccidioides

Orina Escherichia coli Proteus

Pseudomona Staphylococcus Steptococcus

Klebsiella Organismos entéricos misceláneos

Corynebacterium renale Leptospira

Lavado traqueal

Los mismos que el anterior más:

Mycobacterium Nocardia

Coccidioides

Líquido cerebroespin

al


Corynebacterium Haemophilus

Listeria Escherichia coli Cryptococcus Mycoplasma

Exudado ocular

Staphylococcus Streptococcus Pseudomona

Neisseria Mycoplasma

Moraxella Haemophilus

Aspergillus y otros hongos

Chlamydia

Torunda de oído

Staphylococcus Streptococcus Pseudomonas

Proteus Klebsiella

Escherichia coli Corynebacterium

Aspergillus

Órganos parenquimato

sos

La mayoría de los órganos ya mencionados

más: Salmonella (intestino,

hígado)) Mycoplasma, hongos

(pulmón) Clostridium (hígado)

Bacteroides, Spherophorus y Clostridium (tej.

Necrótico) Haemophilus (cerebro

bovino) Leptospira (riñón)

Fetos abortados

Brucella Vibrio

Streptococcus Escherichia coli

Klebsiella Salmonella Chlamydia Leptospira

Torundas y líquido sinovial


Escherichia coli Erysipelotrix

Actinobacillus Haemophilus Mycoplasma Salmonella Chlamydia

Sangre Streptococcus Escherichia coli

Klebsiella Erysipelotrix

Staphylococcus Bacillus

Leche Streptococcus Staphylococcus Pseudomona Mycoplasma

Corynebacterium Mycobacterium

Raspado de piel

Dermatofitos: Microsporum Trichophyton

Exudados de fístulas

Actinomyces Staphylococcus

Bacteroides Corynebacterium

Coccidioides Nocardia

Pústulas y costras de

piel

Staphylococcus Dermatophilus Streptococcus

Material fecal E.coli Salmonella Klebsiella

Pseudomona Proteus

Enterococcus Mycobacterium

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http://www.svamc.org/

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CITOPATOLOGÍA

Dra. Adriana del Carmen Gutiérrez Castillo*,

Dr. en C. Valente Velázquez Ordoñez** M. en C. Soledad Díaz Zarco**

Dr. en C. María Uxúa Alonso Fresán**

*Integrante del Cuerpo Académico de Patogénesis Microbiana *Integrante del Cuerpo Académico de Salud Animal

INTRODUCCIÒN

El examen citológico es reconocido como una herramienta útil para los veterinarios prácticos. En la mayoría de las situaciones, las muestras citológicas pueden ser colectadas rápido, fácilmente y de forma económica. Generalmente las muestras pueden ser preparadas, teñidas e interpretadas mientras el cliente espera. La interpretación diagnóstica con frecuencia es valiosa en el establecimiento de un diagnóstico, identificación de una enfermedad (neoplasia contra inflamación), orientación de terapia, formulación de un pronóstico o bien determinar que procedimiento diagnóstico debe continuar después. Como resultado de ello el paciente recibe mayor y mejor atención y el cliente está más satisfecho. La citología diagnóstica veterinaria es relativamente reciente pero a la vez su progresión ha sido muy rápida. La aplicabilidad de ésta técnica se adoptó sobre todo en lo que se refiere a ciertas facetas de campo que la hacen de utilidad rápida. La operatividad que representa la citología junto con otros métodos clínicos ambulantes similares como podría ser la realización de hematocrito sirve al clínico para enfocar un diagnóstico y un tratamiento adecuado, en un tiempo breve. Las técnicas diagnósticas que ejecuta el clínico en su consulta las podemos extrapolar con la mayor y total inmediación al veterinario que realiza la inspección de carnes y que como especialista debe desarrollar y complementar sus conocimientos en su máxima amplitud cumpliendo los preceptos normativos actuales. Por todo ello, la inspección sanitaria de carnes en mataderos debería conocer y utilizar este procedimiento diagnóstico para los dictámenes que confieran una decisión grave. En esencia, la citología se basa en la investigación celular estudiando sus alteraciones de forma. Esta técnica resulta una forma válida y económica, a veces de gran exactitud y otras, al menos, de valor orientativo en los procedimientos a seguir. Entre los diagnósticos de interés que la citología puede facilitar a nivel facultativo y con repercusión en los dictámenes rápidos en la industria productora de carne, destacan las hiperplasias, las inflamaciones tanto agudas como crónicas y las tumoraciones, tanto benignas como malignas. También, y sin necesidad de una gran infraestructura ni de técnicas complejas, la citología permite comprobar la presencia de procesos causados por agentes micóticos y parasitarios. Por último, la técnica facilita la investigación de los cambios estructurales de tejidos alterados por residuos derivados de la adición ilegal de sustancias para engorde de animales de abasto, actual caballo de batalla en los mataderos europeos. Los procesos neoplásicos, las hiperplasias y los tumores en general son afecciones corrientes en nuestros animales de abasto. Es por ello que el diagnóstico debe ser un aspecto imprescindible para ofrecer un dictamen adecuado a cada tipo de lesión. La actual normativa refleja la necesidad

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de diferenciar entre la benignidad o malignidad de un proceso tumoral para efectuar un decomiso parcial o total de la carne del animal. La inspección sanitaria de carnes en mataderos comienza por la denominada inspección ante-mortem o en vivo que se efectúa de manera obligatoria antes del sacrificio del animal. Esta inspección resulta básica e imprescindible para completar un buen diagnóstico y dictamen final sobre las carnes. En este contexto, la citología diagnóstica ofrece la posibilidad de investigar la presencia de residuos. Sustancias como los costicosteroides son diagnosticadas citológicamente por cambios histológicos en glándulas como el timo o las suprarrenales. La realización de citologías sanguíneas junto con hemogramas completos, en concreto el recuento de leucocitos (linfocitos especialmente) en ganado bovino de abasto nos relaciona sus porcentajes con la administración de corticosteroides. Las sustancias hormonales exógenas, por otra parte, pueden detectarse en la observación de cambios celulares de la hipófisis. El clembuterol y otros anabolizantes B-agonistas se detecta en cambios del tejido que forma la tráquea, aparato reproductor y en músculos específicos, así como en la observación del líquido sinovial. El manejo de la citología junto con los datos macroscópicos sobre el estado del animal ayuda a diferenciar y solventar muchas dudas. Una de las principales es correlacionar los cambios observados en diferentes tejidos y órganos con el uso de sustancias ilegales. Este sería el caso de otro de los anabolizantes empleados en el engorde ilegal del ganado de abasto como el B-estradiol, que provoca en el tejido óseo y cartilaginoso una inmadurez que se observa mediante técnicas citológicas sencillas.

COLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE IMPRONTAS

Las muestras citológicas pueden ser colectadas mediante un hisopo, raspado o aspiración de la lesión. Las técnicas usadas para colectar muestras citológicas y preparación de laminillas varían, dependiendo de la localización anatómica, las características del tejido a muestrear y del paciente. De ser posible varias improntas deben prepararse, dejando algunas sin teñir, estas últimas estarán disponibles para tinciones especiales si es necesario.

IMPRONTAS

Las improntas para la evaluación citológicas pueden prepararse de lesiones externas en el animal vivo o de tejidos retirados durante la cirugía o la necropsia. Son fáciles de obtener e implican mínima resistencia, pero se colectan menos células que en los raspados y contienen mayor cantidad de contaminantes (bacterianos y celulares) que las punciones con aguja delgada (PAD). Como resultado, las improntas de lesiones superficiales solo reflejan una infección secundaria bacteriana o una inflamación inducida por displasia (término médico que se refiere a cambios celulares atípicos, proliferativos, irregulares, reversibles en respuesta a la irritación o inflamación) en el tejido. Las improntas de úlceras deben realizarse antes de que estas últimas sean limpiadas. La lesión debe limpiarse entonces con una esponja quirúrgica humedecida en solución salina y realizarse otra impronta o raspado. Puede también realizarse una punción con aguja delgada (PAD) del tejido debajo de la superficie de la lesión.

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En algunos casos, tales como en la infección por Dermatophilus congolensis (streptothricosis) e infección por Coccidioides immitis, las improntas de la lesión sucia contienen mucho menos organismos que las impresiones de lesiones limpias y que las muestras colectadas por PAD. Las improntas a partir de raspados en las lesiones producidas por Dermatophilus congolensis son las más recomendadas. En otras condiciones puede obtenerse mayor información en las lesiones limpias que de las lesiones sin limpiar. Para colectar improntas de lesiones en piel limpias o tejidos colectados durante la cirugía o necropsia, la sangre y los tejidos fluidos deben primero retirarse de la superficie de la lesión con un material absorbente. La sangre en cantidad excesiva y los tejidos fluidos inhiben que las células se adhieran a la laminilla, produciendo una preparación celular pobre. Así mismo, el exceso de fluido inhibe que las células se distribuyan y asuman el tamaño y forma que generalmente tienen en las improntas secadas al aire. La parte media de la laminilla de vidrio debe presionarse contra el tejido a muestrear. Aunque pueden realizarse múltiples impresiones, generalmente una sola impresión por laminilla es suficiente. De ser posible deben prepararse varias improntas para tenerlas disponibles para tinciones especiales si es necesario. La obtención de improntas convencionales de cerviz se ha conservado por 5 décadas. El muestreo inapropiado y la transferencia de la muestra son las principales causas de resultados fasos negativos. Cuando se preparan las improntas sin cuidado, no todo el material obtenido del cerviz es enviado al laboratorio en laminillas, sino que la mayoría de las células de la muestra permanecen en los implementos con que se colectan. En contraste, los métodos de colección con líquidos virtualmente obtienen todas las células de la muestra.

RASPADOS

Las improntas de raspados pueden ser preparadas a partir de tejidos colectados durante la necropsia o cirugía o de lesiones externas en el animal vivo. El raspado tiene la ventaja de colectar gran cantidad de células del tejido, sin embargo es desventajosa cuando la lesión es firme y se descaman pocas células. La mayor desventaja es que es más difícil de colectar y solo se obtienen muestras superficiales. Como resultado, los raspados de lesiones superficiales con frecuencia solo reflejan una infección secundaria o bien inflamación inducida por displasia del tejido. Esto limita su uso en el diagnóstico de neoplasias. Los raspados se obtienen frotando la lesión con el filo de una navaja de bisturí de forma perpendicular, pasándola varias veces por la lesión. El primer material obtenido se desecha y se procede a realizar otro raspado. El segundo raspado se deposita en una laminilla y se realiza el frotis colocando otra laminilla sobre la que contiene la muestra y se desliza cada una de ellas hacia lados opuestos, procurando mantener el material en un área pequeña del portaobjetos. El uso combinado del raspado y la técnica de impronta es superior que el método convencional de impronta únicamente, ya que se obtienen fragmentos de tejidos intactos, policromasia, detalles nucleares y citoplasmáticos, las preparaciones delgadas permiten aplicar de mejor manera los criterios citológicos y además se obtiene un fondo libre de eritrocitos y eosina.

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HISOPOS O COTONETES

Generalmente las improntas de hisopos son colectadas en caso de que las improntas, raspados o aspirados no se pueden hacer, tales como en tractos fistulosos y en colecciones vaginales. La lesión es limpiada primeramente con un hisopo estéril humedecido. Para humedecer el hisopo debe utilizarse una solución isotónica tal como el NaCl al 0.9%. Esto ayuda a minimizar el daño de las células durante la colecta y preparación de las células. Si la lesión es muy húmeda, el hisopo no necesita humedecerse. Después el hisopo se rueda gentilmente sobre la superficie limpia de una laminilla. No debe comprimirse el hisopo a través de la superficie de la laminilla, porque esto causa un daño excesivo a las células.

ASPIRACIÓN DE MASAS

La PAD de biopsias puede ser colectada de masas (incluyendo nódulos linfáticos, lesiones nodulares y órganos internos). Para lesiones cutáneas, mediante la PAD se disminuye la contaminación superficial (bacteriana y celular), pero se colectan menos células que en el raspado. Selección de la jeringa y la aguja: Las biopsias con PAD son colectadas con aguja del 21 al 25 y jeringas de 3 a 20 mL. Mientras más suave sea el tejido a aspirar menor será el diámetro de la aguja y la jeringa usadas. Se recomienda cuando mucho el calibre 21 para la aspiración, aun tratándose de tejidos firmes tales como fibromas. Cuando se usa una jeringa mayor, tiende a aspirarse el centro del tejido y esto resulta en una preparación citológica pobre. Así mismo las agujas más grandes tienden a causar mayor contaminación de sangre. El tamaño de la jeringa usada está influenciado por la consistencia del tejido a ser aspirado. Los tejidos suaves, tales como nódulos linfáticos, con frecuencia pueden ser aspirados exitosamente con jeringas de 3 mL. Los tejidos firmes, tales como fibromas y carcinomas de células escamosas, requieren de jeringas más grandes para mantener una adecuada succión y que haya una suficiente colección de células del tejido. Ya que el tamaño ideal de jeringa no se conoce antes de la aspiración, la jeringa de 10 mL es de un tamaño aceptable. La preparación del sitio de aspiración: Cuando pruebas microbiológicas deban realizarse de la porción colectada, o la muestra corresponde a una cavidad (peritoneal, y torácica, articulaciones, etc.), el área de aspiración debe prepararse de manera quirúrgica. En otras situaciones, la preparación de la piel es esencialmente la que se requiere para la vacunación o la venopunción. Un hisopo con alcohol puede usarse para limpiar el área. Procedimiento de aspiración: La masa a ser aspirada es sujetada firmemente para permitir la penetración de la piel y la masa y controlar la dirección de la aguja. La aguja, con la jeringa integrada, es introducida en el centro de la masa y se aplica presión negativa llevando el émbolo hasta ¾ del volumen de la jeringa (Fig. 1). Varias áreas de la masa pueden ser muestreadas, pero debe evitarse la aspiración de la muestra dentro del cilindro de la jeringa para evitar la contaminación del tejido aspirado. Para lograr esto, cuando la masa es lo suficientemente grande se permite que la aguja sea redirigida y movida hacia varias áreas de la masa, manteniendo la presión negativa durante la reorientación y movimiento de la aguja.

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Sin embargo, cuando la masa no es lo suficientemente grande para ser reorientada y movida sin dañar la masa, la presión negativa es aligerada durante la reorientación y movimiento de la aguja. En esta situación, la presión negativa es aplicada solo cuando la aguja está estática. Con frecuencia colectas de alta calidad en el aspirado no se observan en la jeringa y algunas veces ni en el cubo de la aguja.

Fig. 1 Cowell y Tyler, 1989

Después de que varias áreas son muestreadas, la presión negativa es retirada de la jeringa y la aguja es removida de la masa y de la piel. Enseguida, la aguja es retirada de la jeringa y se extrae la muestra cargando con aire nuevamente la jeringa y expeliendo el contenido sobre la parte media de la laminilla y se realiza la impronta rápidamente. La lesmaniasis cutánea es una enfermedad parasitaria y su diagnóstico es importante para el éxito de su tratamiento. La técnica convencional de raspado es empleada para detectar al parásito y la PAD es usada rara vez. El valor de estas dos técnicas para confirmar el diagnóstico clínico fue comparado en 46 casos por Al-Jitawi y colaboradores en 1995. El estudio indicó que ambos métodos son iguales de eficientes para detectar la enfermedad, sin embargo la PAD es más fácil, replicable y toma menos tiempo demostrar el organismo, por lo que la PAD se recomienda como método de elección para confirmar la sospecha clínica de lesmaniasis cutánea en áreas endémicas.

PREPARACIÓN DE IMPRONTAS DE ASPIRADOS DE MASAS SÓLIDAS

Varios métodos pueden usarse para preparar improntas para la evaluación citológica de masas sólidas, incluyendo linfonodos. La experiencia de la persona preparando las improntas y características de la muestra influyen en la selección de la técnica de preparación de improntas. Se sugiere una combinación de técnicas.

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Técnica combinada. Un procedimiento combinado incluye depositar el aspirado sobre la mitad de la laminilla. Colocar la laminilla con el preparado en una superficie sólida y horizontal, colocar otra laminilla a un ángulo de 45 grados con la primera laminilla y ponerla en contacto con el aspirado (Fig. 2). Entonces desplazar suave y rápidamente la segunda laminilla como en las improntas de sangre. Enseguida colocar la primera laminilla horizontalmente en un frasco con alcohol de 96 grados de pureza.

Fig. 2. Cowell y Tyler 1989.

Preparación en squash. En manos expertas esta puede proporcionar improntas excelentes. Sin embargo en manos inexpertas, es frecuente que las improntas obtenidas sean ilegibles debido a que muchas células son rotas o la muestra no está suficientemente distribuida. Una preparación en squash es hecha expeliendo el aspirado en la parte media de la laminilla y luego colocando una segunda laminilla sobre el aspirado de forma horizontal (Fig. 3). La segunda laminilla es entonces rápida y suavemente deslizada a través de la primera laminilla.

Fig. 3 Cowell y Tyler 1989.

Técnica de squash modificada. Una modificación de la técnica de squash con menor tendencia hacia la ruptura de las células consiste en colocar la segunda laminilla sobre el aspirado, luego rotar la segunda laminilla 45 grados y levantar (Fig. 4).

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Fig. 4

Cowell y Tyler 1989. Otra técnica de distribución de la muestra consiste en depositar el aspirado periféricamente en varias direcciones con la punta de la aguja produciendo una forma de estrella de mar (Fig. 5). Esta técnica no daña las células frágiles pero permite que el tejido fluido permanezca alrededor de las células. Algunas veces el fluido impide que las células se diseminen bien e interfiere con la evaluación del detalle celular. Generalmente, sin embargo algunas áreas aceptables están presentes.

Fig. 5 Cowell y Tyler 1989.

PREPARACIÓN DE IMPRONTAS DE FLUÍDOS

Las improntas citológicas deben prepararse inmediatamente después de colectar el fluido. Cuando es posible, y sobre todo tratándose de células sanguíneas, las muestras de fluidos para el examen citológico deben colectarse en tubos con EDTA (ácido etilendiaminotetracético), para garantizar la mejor conservación del material obtenido. Las improntas pueden prepararse directamente de forma fresca, o bien mezclar el fluido o el sedimento de una muestra centrifugada con la técnica de impronta de sangre (Fig. 6), en línea (Fig. 7) o en squash (Fig. 3). La celularidad, viscosidad y homogeneidad del fluido influye en la selección de la técnica de impronta.

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Fig. 6 Fig. 7

Cowell y Tyler 1989. La técnica de preparación de improntas en squash en muestras viscosas y muestras con hilos de material es mejor que la técnica de sangre. La técnica de improntas de sangre generalmente produce improntas bien distribuidas de fluidos homogéneos con suficiente celularidad, de 5000 células/microlitro o más, pero con frecuencia produce improntas de insuficiente celularidad en fluidos que contienen menos de 5000 células /microlitro. La técnica de impronta en línea puede usarse en fluidos concentrados de baja celularidad, pero con frecuencia no se distribuyen suficientemente las células de los fluidos altamente celulares. En general, los fluidos traslúcidos son de baja a moderada celularidad, mientras que los fluidos opacos son generalmente de alta celularidad. Por ellos, los fluidos traslúcidos con frecuencia requieren concentración, ya sea por centrifugación o por la técnica de impronta en línea. Cuando es posible, la concentración por centrifugación se prefiere. Para concentrar fluidos por centrifugación, el fluido es centrifugado 5 minutos a 165-360 G (gravedades). Esto equivale a operar una centrífuga con un brazo radial de 14.6 cm. de longitud (el más común en centrífugas para orina) a 1000-1500 rpm. Después de la centrifugación el sobrenadante es separado del sedimento y analizado para la concentración de proteína total. El sedimento es resuspendido en unas cuantas gotas del sobrenadante. Una gota del sedimento resuspendido es colocado en una laminilla y se hace una impronta mediante las técnicas de squash o de impronta de sangre. Cuando el fluido no puede ser concentrado por centrifugación o la muestra centrifugada es baja en celularidad, puede usarse la técnica de impronta en línea para concentrar las células en la impronta. Una gota de fluido es colocada sobre una laminilla limpia y la técnica de impronta de sangre es usada, excepto en que la distribución del material se hace permitiendo la formación de una línea conteniendo una concentración más alta de células que el resto de la laminilla. Desafortunadamente, una cantidad excesiva de fluido puede también permanecer en la línea y evitar la buena distribución de las células. Las improntas son fijadas en alcohol de 96 grados durante 10 minutos y pueden ser mantenidas en el alcohol o ser secadas al aire y enviadas al laboratorio para su análisis.

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En caso de que no se tengan posibilidades de realizar las improntas los líquidos deben ser conservados con una cantidad de alcohol de 96 grados de pureza, en una proporción 1:1 (muestra: alcohol), para posteriormente ser transportados al laboratorio para su estudio.

MÉTODOS DE FIJACIÒN

La fijación de los especimenes citológicos depositados en una laminilla es vital para evitar cambios en la morfología celular que indiscutiblemente van a alterar e incluso nulificar la interpretación de los hallazgos microscópicos. Actualmente se utilizan dos métodos de fijación basados en el nivel de hidratación de la célula al momento de la fijación. Cada uno conlleva ventajas y desventajas sobre el otro; sin embargo, no se contraponen, más aún son complementarios. Aunque dependiendo la formación del citopatólogo, este preferirá alguno de los dos, ya que las tinciones y la interpretación de los hallazgos microscópicos son un tanto diferentes entre uno y otro.

1.- Fijación en seco: También denominada fijación al aire, o mal llamada muestras sin fijar. En esta una vez que se ha realizado el frotis se debe secar lo más rápido que sea posible, incluso puede recurrirse a realizar movimientos en abanico. Ya que el frotis se ha secado; es decir, que las células presentes en ese frotis están totalmente secas se procede a aplicar el fijador sobre la laminilla por un periodo no menor a tres minutos. El fijador de elección para estos casos es el metanol. Este tipo de fijación se utiliza primordialmente para tinciones tipo Romanowsky (Wright, Giemsa, Diff-Quik, etc.).

2.- Fijación en Húmedo: También denominada por algunos autores como fijación en alcohol. En este caso, al terminar de realizar el frotis este debe contactar con el fijador en un periodo no mayor a tres segundos, sin permitir que la laminilla se seque. Es decir la célula debe estar perfectamente hidratada al momento que se fija, de ahí el nombre de fijación en húmedo. Si se utiliza alcohol etílico 96º como fijador, la laminilla debe sumergirse en este por un periodo mínimo de quince minutos. Transcurrido este tiempo, la laminilla se saca del fijador y se seca al aire, para ser remitida al laboratorio. El uso de alcohol, es una manera sencilla y económica para fijar los especímenes citológicos, pero no es la única; ya que pueden emplearse fijadores en aerosol, los cuales crean una capa protectora sobre las células, lo que las preserva en óptimas condiciones, sobre todo si las laminillas tardaran varios días en llegar al laboratorio, como es el caso de las muestras remitidas a través del correo o de la mensajería. En este caso, una vez realizado el frotis y antes de que se seque el material, se debe aplicar una capa del aerosol sobre la laminilla a una distancia no menor a 20 cm y dejar secar al aire. En el mercado, existen muy diversas marcas de fijadores citológicos en aerosol, conocidos coloquialmente como "cito-spray", los cuales tienen un costo muy accesible. Las muestras fijadas en húmedo son las óptimas para realizar la tinción de Papanicolau, que es la tinción citológica por excelencia. Además de Hematoxilina-Eosina y toda la gama de histoquímicas.

Todo lo anterior debe dejar muy claro que es de vital importancia comunicar al laboratorio el método de fijación que se ha empleado en cada caso, para que el laboratorio seleccione el tren de tinción más conveniente en cada caso.

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FACTORES QUE AFECTAN LA COLECCIÒN DE MUESTRAS

Clínicos. Los clínicos deben recibir entrenamiento apropiado en la toma de muestras, en la preparación y fijación de los frotis. El laboratorio, por supuesto, no puede controlar la colección de la muestra, por lo tanto es responsabilidad de la persona que toma la muestra minimizar los artefactos que se producen como resultado de una mala recolección o fijación de la misma. Instrumento para la recolección. Los instrumentos para la colecta de muestras juegan un rol importante en la obtención de una muestra adecuada. La forma, superficie, textura y material del implemento puede determinar qué tanto del tejido raspado es depositado en las laminillas y está disponible para su análisis. En el caso de muestras vaginales el uso combinado de una espátula y un cepillo endocervical permite obtener mejor material. Número de laminillas. Algunos estudios han demostrado que dos laminillas detectan más anormalidades que una. El número de laminillas influye en la sensibilidad del estudio, esto también puede reflejar el uso de dos tipos de implementos en el muestreo, la cantidad de material y la mejor conservación de la muestra. Fijación. La fijación inicial en una preparación citológica es crítica para la posterior interpretación de la muestra. El fijador ideal es aquel que causa menor distorsión en la morfología celular y nuclear. La mayoría de los fijadores comerciales contienen alcohol (etanol) como base con propilenglicol como aditivo para preservar el material celular. Desafortunadamente no contienen aditivos para evitar la lisis de las células sanguíneas, líquidos extracelulares y moco, por lo que esto se dispersa en toda la extensión impidiendo que las células sean observadas adecuadamente. Métodos alternativos han sido desarrollados mediante el empleo de Cytorich Red System (Roche Image Analysis Systems, Inc., Eaton Collage, North Carolina, U.S.A.), el cual evita el acumulo de sangre y líquidos extracelulares en el fondo de las preparaciones, que pueden interferir en la preparación e interpretación de la muestra. Conservación de la muestra posterior a su colecta. La muestra debe permanecer refrigerada todo el tiempo posterior a la toma. El tiempo entre la toma y el procesamiento no debe superar las 24 hrs. En el caso de las efusiones. Si el tiempo de envió supera las 24 hrs. La muestra debe prefijarse realizando una dilución 1:10 con alcohol etílico 96º y mantenerse en refrigeración.

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INMUNOHISTOQUÍMICA

Dra. María Uxúa Alonso Fresán*

Dr. Valente Velázquez Ordoñez*

M. en C. Soledad Díaz Zarco*

Dra. Adriana del Carmen Gutiérrez Castillo**

*Integrante del Cuerpo Académico en Salud Animal **Integrante del Cuerpo Académico en Patogénesis Microbiana

INTRODUCCIÓN

La inmunohistoquímica es la técnica que se utiliza para localizar antígenos en secciones de tejido utilizando anticuerpos marcados, a través de interacciones antígeno-anticuerpo específicos visualizadas por un marcador conjugado como son la fluorescencia, enzimas, un elemento radioactivo u oro coloidal. Coons y colaboradores (Coons y col. 1941, 1955 de Albert H.; Los Coons y Kaplan 1950) fueron los primeros en marcar anticuerpos con fluorescencia, y lo utilizaron para identificar antígenos en secciones de tejido. Con el uso y desarrollo de la técnica, se han utilizado marcadores enzimáticos como la peroxidasa (Nakane y Pierce 1966; Avrameas y Uriel 1966) y la fosfatasa alcalina (Masón y Sammons 1978). El oro coloidal como marcador (Faulk y Taylor 1971) también se ha utilizado para identificar reacciones inmunohistoquímicas en microscopía de luz y electrónica. Otros marcadores incluyen elementos radioactivos, pudiéndose visualizar la inmunoreacción mediante radiografías. Puesto que la técnica implica la reacción específica antígeno-anticuerpo, tiene ventajas evidentes sobre las técnicas tradicionales de coloración especial y enzimáticas que solamente identifican un número limitado de proteínas, de enzimas y de estructuras tisulares, por lo que ha llegado a ser una técnica importante y ampliamente utilizada en muchos laboratorios de investigación médica así como de diagnóstico clínico. Existen numerosos métodos inmunohistoquímicos que se pueden utilizar para localizar antígenos. La selección de un método debe basarse en parámetros tales como el tipo de espécimen bajo investigación y del grado de sensibilidad requerido.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA INMUNOMARCACIÓN

Existen dos factores que influyen sobre la calidad de la inmunorreacción. En primer lugar se encuentran las características del tejido y su preservación antigénica. La conservación adecuada de las características antigénicas del tejido depende del tipo de fijador empleado, de una fijación adecuada y del tiempo de fijación. En segundo lugar se encuentran los elementos externos al tejido que pueden controlarse como: el tipo de anticuerpo utilizado, la sensibilidad y la dilución, el sistema de detección, los cromógenos empleados, el método de recuperación utilizado y la interpretación de la reacción por el patólogo.

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS

Fijación: La preparación del tejido es la base de la técnica. Para asegurar la conservación de la arquitectura del tejido y de la morfología celular, se requiere de una fijación rápida y adecuada. Una fijación inadecuada o prolongada puede disminuir perceptiblemente la capacidad de unión del anticuerpo.

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No existe un fijador universal ideal para la demostración de todos los antígenos. Sin embargo, muchos antígenos pueden demostrarse en cortes de tejidos fijados con formaldehido y embebidos en parafina. Para obtener mejores resultados, los tejidos procedentes de vertebrados (especialmente tejidos neuronales) requieren generalmente de fijación mediante perfusión para la conservación óptima del tejido. Las soluciones fijadoras más comúnmente utilizadas son las siguientes: a) paraformaldehido al 4% en amortiguador de fosfato 0.1 M b) paraformaldehido al 2% adicionado con 0.2% de ácido pícrico en amortiguador de fosfato 0.1 M c) Fijador PLP: para formaldehido al 4%, 0.2% de peryodato y lisina al 1.2% en amortiguador de fosfato 0.1M d) paraformaldehídol 4% adicionado con 0.05% de glutaraldehído Algunos antígenos no resisten la fijación con aldehídos, por lo que los tejidos frescos deben congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y cortarse utilizando un criostato. Las secciones deben mantenerse congeladas a -20° C o menos hasta su fijación utilizando acetona o alcohol frío. Después de la fijación, las secciones pueden procesarse con protocolos inmunohistoquímicos estándar. Corte: Desde su introducción, la parafina ha sido el medio de inclusión más ampliamente utilizado para el diagnóstico histopatológico, por lo que la mayor parte del material se ha procesado utilizando como fijador el formaldehído en cortes incluidos en parafina. Los cortes de parafina producen resultados satisfactorios para la demostración de la mayoría de antígenos mediante el uso de técnicas de recuperación del antígeno. Ciertos antígenos celulares se degradan al utilizar la fijación e inclusión de rutina, por lo que el uso de cortes congelados es esencial para su demostración. Entre las desventajas en el uso de cortes congelados están: pérdida de la morfología, pérdida de la resolución en aumentos microscópicos mayores, se requiere de almacenaje especial, limitación para realizar estudios retrospectivos y dificultad en el corte para algunos tejidos. Preparación de montaje completo: Pueden procesarse pequeños bloques de tejido (de menos de 5 milímetros de grueso) como montajes enteros. La ventaja de éste tipo de preparaciones es que proporcionan información tridimensional sobre la localización de antígenos sin la necesidad de la reconstrucción de secciones. Su limitación principal es la penetración incompleta del anticuerpo en el tejido, dando por resultado una coloración desigual o falsa negativa. El tratamiento con Tritón X-100 o con saponina se utiliza para ayudar con la penetración del anticuerpo.

RECUPERACIÓN DE ANTÍGENOS

La demostración de muchos antígenos puede mejorarse mediante el tratamiento previo con reactivos de recuperación del antígeno que rompen los enlaces proteicos cruzados formados por la fijación con formaldehido, dejando al descubierto sitios antigénicos ocultos. Éstos implican el uso de calor en diferentes períodos de tiempo en los cortes incluidos en parafina utilizando una solución acuosa (designada comúnmente solución de recuperación). Esto se llama recuperación del epítope provocada por calor (HIER). Otro método utiliza digestión enzimática y se llama recuperación del epítope inducida por proteólisis (PIER). Entre los aparatos de mayor uso para el método de calentamiento se tiene al horno de microondas, la olla de presión y las vaporeras. Otros equipos utilizados incluyen a la autoclave y baño maría. El tiempo de calefacción durante 20 minutos parece ser el más satisfactorio y el enfriamiento tarda generalmente cerca de 20 minutos. La solución más comúnmente usada para la recuperación de antígenos es el amortiguador de citrato pH 6.0, adecuada para la mayor parte de los anticuerpos. El TRIS-EDTA pH 9.0 y el EDTA pH 8.0 son otras soluciones que también se

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utilizan para la recuperación. La proteinasa K es un reactivo eficaz para la digestión de antígenos de membrana tales como integrinas, CD3 ó vWF. El método proteolítico a través enzimas (tales como proteinasa k, tripsina, quimiotripsina, pepsina y otras proteasas) también se ha utilizado para restaurar la inmunoreactividad de los antígenos del tejido. Sin embargo, el uso del método de digestión enzimática puede destruir ciertos epítopes y la morfología del tejido. Por lo tanto, debe probarse el tiempo óptimo de incubación así como la concentración de la enzima. La combinación de los métodos enzimáticos y proteolíticos mediante calor son procedimientos alternativos para desenmascarar antígenos si no funcionan otros métodos. Son especialmente útiles cuando se requieren localizar dos o tres antígenos al mismo tiempo. Es importante mejorar la penetración del anticuerpo para lograr una buena coloración inmunohistoquímica de las secciones congeladas. El Tritón X-100 es el detergente de elección para mejorar la penetración del anticuerpo. Sin embargo, no es apropiado para el uso de antígenos de membrana puesto que las destruye. Algunos investigadores prefieren el método de congelado y descongelado para mejorar la penetración del anticuerpo. El tratamiento con borohidruro de sodio (al 1% en amortiguador de fosfato) también se utiliza para desenmascarar antígenos, particularmente en tejido fijado con glutaraldehído para reducir los enlaces que se pudieran formar debido al tratamiento con glutaraldehído.

MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS

Bloqueo: La coloración de fondo puede ser específica o inespecífica. La fijación inadecuada o retrasada puede dar lugar a resultados falsos positivos debido a la absorción pasiva de la proteína del suero y a la difusión del antígeno. Estos falsos positivos son comunes en el centro de bloques grandes de tejido o en tejidos en los cuales la fijación se retrasó. Los anticuerpos, en especial los policlonales, se contaminan a veces con otros anticuerpos debido a la impureza del antígeno utilizado para inmunizar al animal. La causa principal de coloración de fondo inespecífica es la atracción no-inmunológica de sueros inmunes específicos debidas a fuerzas hidrofóbicas y electrostáticas en ciertos sitios dentro de secciones del tejido. Esta forma de coloración de fondo es uniforme generalmente y puede reducirse bloqueando esos sitios con suero normal. En muchos tejidos existe actividad endógena de la peroxidasa. La solución para eliminarla se da con un tratamiento previo del corte de tejido con peróxido de hidrógeno antes de la incubación con el anticuerpo primario. Muchos tejidos también contienen actividad endógena de fosfatasa alcalina (AP) y se deben bloquearse con un tratamiento previo del corte de tejido con levamisol. Algunos tejidos tales como el hígado y riñón contienen biotina endógena. Para evitar la unión de la avidina con la biotina endógena debe bloquearse con avidina no conjugada que luego se satura con biotina si se va a usar el sistema de detección biotina-avidina. Existe también autofluorescencia o fluorescencia natural en algunos tejidos y puede causar problemas de coloración de fondo cuando se utilizan conjugados fluorescentes. La prueba más simple es observar las secciones de tejido bajo un microscopio de fluorescencia antes de cualquier incubación con el anticuerpo marcado. Si se detecta autofluorescencia en las secciones del tejido, la mejor solución es elegir enzimas u otros métodos de conjugación. Controles: Deben correrse controles especiales para probar los protocolos y para probar la especificidad del anticuerpo utilizado. El control positivo prueba un protocolo o un procedimiento usado. Deberá utilizarse un tejido positivo conocido como control. Si el control de tejido positivo da una coloración negativa, el protocolo y el procedimiento deberán ajustarse hasta que se obtenga una buena coloración positiva.

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El control negativo prueba la especificidad del anticuerpo implicado. Primero, ninguna coloración debe observarse omitiendo el anticuerpo primario o reemplazando el anticuerpo primario específico por un suero normal (de la misma especie que el anticuerpo primario). Este es un control que debe utilizarse rutinariamente en la coloración inmunohistoquímica. En segundo lugar, la coloración debe inhibirse por adsorción del anticuerpo primario con antígeno purificado antes de su uso, pero no por la adsorción con otros antígenos relacionados o no relacionados. Este tipo de control negativo es ideal y necesario en la caracterización y evaluación de nuevos anticuerpos pero a veces es difícil obtener el antígeno purificado, por lo tanto no se utiliza rutinariamente en la coloración inmunohistoquímica.

Método directo:

El método directo consiste de un paso único, e implica un anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) que reacciona directamente con el antígeno en secciones del tejido. Esta técnica utiliza solamente un anticuerpo y el procedimiento es corto y sencillo. Sin embargo, es poco sensible debido a la poca amplificación de la reacción y ya se usa poco desde la introducción de método indirecto.

Método indirecto:

El método indirecto implica un anticuerpo primario sin conjugar (primera capa) que reacciona con el antígeno del tejido, y un anticuerpo secundario marcado (segunda capa) que reacciona con el anticuerpo primario (nota: el anticuerpo secundario debe ser contra la IgG de la especie animal en la cual se ha producido el anticuerpo primario). Este método es más sensible debido a la amplificación de la reacción con varias reacciones secundarias del anticuerpo con diversos sitios antigénicos del anticuerpo primario. Además, es económico puesto que una segunda capa marcada con anticuerpo conjugado puede reaccionar con muchos anticuerpos de la primera capa. El anticuerpo secundario puede conjugarse con un tinte fluorescente tal como FITC, rodamina o rojo de Texas, y a esto se le llama método de la inmunofluorescencia indirecta. También puede conjugarse el anticuerpo secundario con enzimas como la peroxidasa, fosfatasa alcalina o glucosa oxidasa, y a esto se le llama método indirecto inmunoenzimático.

Método PAP (método de la peroxidasa-antiperoxidasa):

El método PAP es otro desarrollo de la técnica indirecta e implica una tercera capa que se trata de un anticuerpo marcado con peroxidasa, para hacer un complejo muy estable de peroxidasa-antiperoxidasa. El complejo, integrado por la gamma-globulina y la peroxidasa, actúa como una tercera capa de antígeno y se une a la gamma-globulina sin conjugar desarrollada en otra especie de la segunda capa. La sensibilidad es cerca de 100 a 1000 veces más alta puesto que la molécula de la peroxidasa químicamente no se conjuga a la anti-IgG sino está limitada inmunológicamente, y no pierde ninguna actividad enzimática. También permite una dilución mucho más alta del anticuerpo primario, así se eliminan muchos de los anticuerpos indeseados y se reduce la coloración inespecífica de fondo.

Método del complejo Avidina-Biotina (ABC):

El método ABC es un método estándar y una de las técnicas más ampliamente utilizadas. La avidina, una glicoproteína grande, se puede conjugar con la peroxidasa o fluoresceína y tiene una afinidad muy alta por la biotina.

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La biotina, una vitamina de bajo peso molecular, se puede conjugar a una variedad de moléculas biológicas tales como anticuerpos. La técnica implica tres capas. La primera capa es un anticuerpo primario sin conjugar. La segunda capa es un anticuerpo secundario biotinlado. La tercera capa es un complejo de peroxidasa-avidina-biotina. Se desarrolla el color de la peroxidasa utilizando un sustrato adecuado para producir diversos productos finales colorimétricos.

Método de la biotina marcada con Estreptavidina (LSAB):

La estreptavidina, derivada del Streptococcus avidinii, es una innovación reciente en la que se substituye a la avidina. La molécula de la estreptavidina no se encuentra cargada en relación con el tejido, a diferencia de la avidina que tiene un punto isoeléctrico de 10, por lo que no existe unión electrostática al tejido. Además, la estreptavidina no contiene grupos carbohidrato que pudieran unirse a las lectinas del tejido, que pudieran dar como resultado una coloración del fondo. Esta es una técnica similar al método estándar ABC. La primera capa consiste de un anticuerpo primario sin marcar. La segunda se forma con un anticuerpo secundario biotinilado. La tercera capa consiste en la estreptavidina conjugada con una enzima (HRP-Estreptavidina o AP-Estreptavidina) para substituir al complejo de la avidina-biotina-peroxidasa. La enzima se visualiza utilizando soluciones de cromógeno para el substrato y así producir diversos productos finales colorimétricos. La tercera capa puede ser también una sustancia fluorescente conjugada a la Estreptavidina por ejemplo FITC. Este método es cerca de 5 a 10 veces más sensible que método estándar ABC.

Métodos poliméricos:

Existen diversos métodos comerciales basados en la polimerización de sustancias. Entre ellos se tienen: 1) DakoCytomation EnVision Systems se basa en tecnología del polímero dextrano. Este permite unir una gran cantidad de moléculas de la enzima (peroxidasa del rábano picante o fosfatasa alcalina) a un anticuerpo secundario vía la cadena principal del dextrano. Las ventajas son muchas, incluyendo sensibilidad creciente, reducción de reacciones de fondo no específico al mínimo y una reducción en el número total de pasos del análisis con respecto a técnicas convencionales. El protocolo es: i) aplicación del anticuerpo primario; ii) aplicación del polímero marcado con la enzima; iii) aplicación del cromógeno del substrato. Este se desarrolló después para proporcionar una mayor sensibilidad. 2) ImmPRESS de Vector es un sistema que se basa en un nuevo método de polimerizar enzimas y de unir estos polímeros a los anticuerpos. Se forman así “micropolímeros” que evitan el uso de dextranos u otras macromoléculas como base. La unión de un Atadura de un micropolímero único con una alta densidad de una enzima muy activa a un anticuerpo secundario genera un reactivo que proporciona una mayor accesibilidad a su blanco. El resultado es una sensibilidad excepcional, así como de intensidad de la señal, baja coloración de fondo, y unión no específica reducida. El protocolo es: i) aplicación del anticuerpo primario; ii) aplicación del polímero marcado con la enzima; iii) y aplicación del cromógeno para el substrato.

Métodos CSA de DakoCytomation:

1) Los sistemas CSA utilizan una amplificación de señal de la tiramida. Es ideal para los utilizarlo en: i) Detección de pequeñas cantidades de antígeno; ii) Aumento en el funcionamiento de

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anticuerpos con baja afinidad de ratón y conejo; iii) Permitir la compatibilidad de ciertos anticuerpos difíciles de ratón y conejo con cortes de tejido embebidos en parafina. El protocolo sería: 1. Aplicación del anticuerpo primario. 2. Aplicación del anticuerpo de unión biotinlado. 3. Aplicación del reactivo de amplificación de la tiramida. 4. Aplicación de la Estreptavidina-HRP. 5. Aplicación del sustrato cromógeno. 2) CSA II - sistema de amplificación de señal de Tiramida libre de Biotina.- es una tinción IHC altamente sensible (IHC) que incorpora un método de amplificación de señal basado en la deposición catalizada por la peroxidasa de un compuesto fenólico marcado con fluoresceína, seguido de una reacción secundaria con un anticuerpo anti-fluoresceína marcado con peroxidasa. En el procedimiento, un anticuerpo primario desarrollado en ratón se detecta con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. El paso siguiente utiliza la peroxidasa unida para catalizar la oxidación de un fenol conjugado con fluoresceína (fluorescil-tiramida) que precipita sobre la muestra. El procedimiento continúa con la detección de la fluoresceína unida a través de una anti-fluoresceína conjugada con peroxidasa. La coloración se completa al utilizar la diaminobencidina/peróxido de hidrógeno como cromógeno/substrato, y puede observarse con un microscopio de luz común. En comparación con los métodos inmunohistoquímicos estándar, los métodos de amplificación de la tiramida se han reportado como mucho más sensibles.

Métodos de coloración múltiple:

A menudo es útil poder teñir dos o más antígenos en una misma sección de tejido. Esto se puede lograr a través del método de la inmunofluorescencia utilizando diversos colorantes fluorescentes. La coloración múltiple se puede lograr también con anticuerpos conjugados con peroxidasa desarrollados con diversos substratos de cromógeno para producir productos finales de varios colores. La dilución del anticuerpo es un factor importante a considerar. Finalmente, la combinación adecuada de color es crucial también puesto que una combinación incorrecta de color puede producir resultado pobre y no poder así demostrar antígenos múltiples en la misma sección. Para un mejor resultado, se debe ser cuidadoso en el diseño y estandarización de protocolos de tinción múltiples.

Método inmunohistoquímico para microscopía electrónica

Estas técnicas se pueden dividir en dos grupos: en las que la inmunotinción se lleva a cabo antes de embeber al tejido en resina y las que la llevan a cabo después de embeber al tejido en resina. El escoger cualquiera de las dos técnicas dependerá de la distribución y características tanto del antígeno como del anticuerpo primario. Antes de llevar a cabo el método inmunohistoquímico habrá que realizar pruebas de dilución del anticuerpo primario en microscopía de luz. Varios métodos recientemente desarrollados se basan en el etiquetado con partículas de oro coloidal. Estos métodos fueron introducidos originalmente para microscopia electrónica (Faulk y Taylor 1971) debido a que las partículas oro son fácilmente visibles con el microscopio electrónico, y son útiles también útiles para la microscopia de luz. Debido a que las partículas de oro pueden fabricarse en diversos tamaños de 5 a 30 nanómetros, es posible realizar coloraciones múltiples para usarse en el microscopio electrónico, por etiquetado directo de los anticuerpos primarios con partículas de diferente tamaño. Las técnicas indirectas pueden también utilizarse en el etiquetado doble o triple en paralelo si los anticuerpos primarios son de varias especies, y en secuencia si los anticuerpos primarios son de la misma especie.

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INTERPRETACIÓN:

Debe informarse la inmunorreacción (positiva o negativa) y la distribución citológica (nuclear, membranosa o citoplásmica) y las características de expresión de los antígenos empleados.

REFERENCIAS:

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http://www.jhc.org/cgi/content/abstract/36/3/317

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CITOMETRÍA DE FLUJO

Dra. Claudia Giovanna Peñuelas Rivas

INTRODUCCIÓN

La citometría de flujo tiene como objetivo principal el separar subpoblaciones homogéneas, de poblaciones heterogéneas por los principios de tamaño, complejidad y fluorescencia relativa. En la medicina humana se ha convertido en una herramienta clínica indispensable en el diagnóstico de enfermedades como lo es la leucemia, dando así un correcto pronóstico y tratamiento de la misma. En pacientes trasplantados se puede llevar un control del sistema inmune de los pacientes. En la medicina veterinaria está empezando a ser una herramienta diagnóstica importante en enfermedades como la anemia hemolítica en equinos, linfomas en perros y en general para llevar el control de los pacientes inmunosuprimidos. La citometría de flujo puede ser utilizada para identificar propiedades físicas y fisiológicas de las células de la sangre, fluidos y tejido de pacientes humanos o veterinarios. Las características de las células pueden ser determinadas al incidir en ellas el rayo del láser del citómetro de flujo ocasionando cambios en las propiedades de dispersión de luz. Otros componentes y funciones celulares pueden ser definidos a través de la aplicación de fluorocromos afines a los componentes celulares o por medio del uso de anticuerpos monoclonales (Davis et al., 2002).

Aplicaciones de la citometría de Flujo en la medicina veterinaria

Inmunofenotipaje El inmunofenotipaje de linfocitos periféricos y de células linfoides se ha convertido en una práctica rutinaria para la investigación clínica y básica. El inmunofenotipaje más común en la medicina humana es la determinación de células T CD4+ (cooperadoras) y T CD8+ (citotóxicas) en pacientes inmunosuprimidos. En caballos, el inmunofenotipaje ha servido para caracterizar linfocitos T y B con el síndrome de inmunodeficiencia (Leber et al., 1998; Flaminio et al., 1998). También con ello se han podido definir variaciones normales que ocurren en el sistema inmune en equinos durante su crecimiento así como a la exposición a antígenos del ambiente (Balson et al., 1997; Flaminio et al., 1998a, 1999, 2000). En perros, el inmunofenotipaje es un método objetivo confiable para el pronóstico de enfermedades linfoproliferativas caracterizadas por linfocitosis (Williams et al., 2008). Enfermedades inmunomediadas La citometría de flujo se ha utilizado para detectar anticuerpos unidos a la superficie de eritrocitos y plaquetas en casos de anemia hemolítica inmunomediada y trombocitopenia (Zaruby et al., 1992). Las pruebas con anticuerpos para isotipos específicos de inmunoglobulinas equinas IgM, IgG e IgA pueden determinar el tipo de anticuerpos en casos de isoeritrolisis neonatal para dar un adecuado pronóstico de la enfermedad (Wilkerson et al., 2000). Los perros con enfermedades inmunomediadas tienen mayor riesgo de desarrollar anticuerpos contra eritrocitos. La citometría de flujo es la prueba más sensible para el diagnóstico de anemia hemolítica inmunomediada (Morley, et al., 2008).

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En el caso de neoplasias en mediastino, las más comunes en perros son los linfomas o timomas. Con el uso de anticuerpos monoclonales anti CD4+ y anti CD8+, se puede dar un diagnóstico preciso de uno u otro. En los timomas se observa que ≥10% coexpresan CD4 y CD8, mientras que en los timomas <2% son CD4+CD8+. Los linfomas además expresan células B (CD19) (Lana et al., 2006). Trombocitopenia La citometría de flujo es una herramienta para el diagnóstico y el monitoreo no invasivo de la respuesta de la médula ósea en pacientes trombocitopénicos. La trombopoiesis puede ser evaluada por la circulación de las nuevas plaquetas circulantes con una tinción de ácido nucleico, el cual se une a ARN en plaquetas reticulares jóvenes (Rusell et al., 1997 y Sellon et al., 1996). Está prueba provee un indicador de la capacidad regenerativa de la médula ósea y permite un monitoreo de la cinética de las plaquetas en equinos. Se puede además conocer la función plaquetaria y su activación evaluando la unión de anticuerpos a glicoproteínas mayores de plaquetas (GPIIb-IIIa, GPIV, y GPIb) y de antígenos dependientes de la activación (P-selectina y la proteína lisosomal integral de la membrana (LIMP)) observando que posterior a la activación, aumentan a más del doble estas uniones en comparación a los animales clínicamente sanos (Segura et al., 2004) El tromboembolismo es la mayor causa de morbilidad y mortalidad en perros que padecen anemia hemolítica inmunomediada (IMHA) gracias a la citometría de flujo se puede detectar la activación plaquetaria para dar un mejor pronóstico y un adecuado tratamiento a los pacientes (Weiss y Brazzell, 2006). Células fagocíticas La actividad funcional de células fagocíticas en sangre periférica, ya sea por las células polimorfonucleares o por los monocitos, puede ser determinada por citometría de flujo. Los leucocitos de sangre periférica son incubados con dihidrorodamina (DHR) (una tinción oxidasa-sensible) y Staphylococcus aureus marcado con yoduro de propidio (IP). La oxidación de DHR de la rodamina fluorescente 123 provee un estimado de la actividad explosión oxidativa de los neutrófilos y la ingesta de S. aureus de la actividad fagocítica. Esta prueba se ha utilizado para diagnosticar la enfermedad granulomatosa crónica en humanos (Gallin and Malech 1990). En caballos, está prueba se ha realizado para evaluar la función de neutrófilos en endotoxemia y en caballos inmunocomprometidos después de una terapia inmunomoduladora. Los efectos por el transporte y el ejercicio también se han evaluado por citometría de flujo. En estos estudios indican que la alta intensidad de trabajo disminuye la función fagocítica de las células al igual que la función de los neutrófilos. (Raidal, et al., 1995, 1997a, 1997b, 1998a, 1998b, 2000 a, 2000b). Pruebas de apoptosis La apoptosis es una forma biológicamente importante de muerte celular por lo que su detección y medida es básica y se puede realizar a través de la citometría de flujo. Esto incluye los cambios en la membrana plasmática, cambios en la permeabilidad de la membrana plasmática, cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial, activación de caspasa y en el ADN. La determinación de alguno o de la combinación de estos cambios por citometría de flujo permite la identificación y cuantificación de células apoptóticas entre una mezcla celular. También puede dar información valiosa de los mecanismos moleculares que tienen las células durante su muerte celular (Macey, 2007).

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Análisis de ADN La citometría de flujo sirve para el análisis de ADN ya que existen tinciones que se unen de manera proporcional. Esto permite la cuantificación del contenido de ADN permiten la identificación de células normales diploides, aquellas que están activas sintetizando ADN y aquellas premitóticas o mitóticas. Gracias a esta técnica se pueden detectar las distintas fases del ciclo celular. Sistema inmune Actualmente existen diversas técnicas que permiten el estudio del sistema inmune como los son los anticuerpos monoclonales, tinciones para la función celular, tetrámeros en la citometría de flujo. La capacidad multicolor del citómetro de flujo ofrece una gran ventaja para separar grupos celulares entre varios grupos como es el caso de sangre completa o de cultivos celulares mixtos. Por anticuerpo monoclonal se puede separar una población celular y a su vez analizar su viabilidad. Se pueden separar también células que no entrarían en el análisis como por ejemplo los eritrocitos, detritus celulares o células muertas. Se puede medir la capacidad proliferativa de las células utilizando tinciones como el CFSE. Las citoquinas y quimioquinas juegan un papel muy importante por lo que se han implementado técnicas para ser detectado por medio de citometría de flujo ya que de manera tradicional se realizaba por medio de pruebas de ELISA. Pruebas de fagocitosis y endocitosis La fagocitosis se puede medir por medio de citometría de flujo utilizando bacterias marcadas fluorescentemente. El análisis se realizará por el número de células fagocíticas que tengan fluorescencia y por la intensidad de fluorescencia que presentan las mismas. La citometría de flujo permite además el análisis de pruebas de adhesión. Existen diferentes protocolos para la evaluación de activación plaquetaria. Algunos citómetros presentan además un “sorter” que sirve para realizar separaciones celulares para continuar con otros experimentos en los que se requiere una población celular determinada.

Colecta y envío de muestra

Al realizar un estudio por medio de citometría de flujo es importante elaborar un adecuado diseño del experimento, es decir, se requiere tener claro el objeto de estudio para determinar el origen de la muestra. Si se realizara una prueba de viabilidad o apoptosis, la muestra se tiene que colectar y analizar lo más rápido posible para conservar las características deseables. Si es únicamente para determinar inmunofenotipaje, las células pueden ser fijadas. Para la utilización de anticuerpos monoclonales, es importante saber si hay disponibles para la especie que se va a utilizar. El citómetro de flujo es capaz de analizar cualquier partícula que mida de 1- Colecta de muestra Las células pueden ser colectadas en tejidos, fluidos o cultivos celulares dependiendo el protocolo a desarrollar y deben ser procesadas en frío y protegidas de la luz para conservar las características a analizar. Las células deben permanecer en una suspensión con un medio isotónico de pH 7.3 en un volumen final de 0.1-1 ml. La concentración celular ideal es de 100,000-1,000,000 de células por tubo.

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Envío de muestra Las muestras procesadas para citometría de flujo deben permanecer en frío y protegidas de la luz. Si las células están vivas, se deben de enviar lo más pronto posible al laboratorio de citometría de flujo (3 hrs. máximo). Si las células están fijadas pueden ser analizadas hasta 24 hrs. después. Para las muestras que requieren que el laboratorio de citometría de flujo las procese, se deben de enviar en frío en un plazo no mayor a 3hrs. En el caso de que el análisis se hiciera con sangre completa, es necesario colectar al menos 1ml de sangre con anticoagulante. Para pruebas con suero, se requiere de 1 ml de sangre sin anticoagulante.

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HIBRIDACIÓN in situ: Localización de un gen en un cromosoma

M. en C. Alberto Barbabosa Pliego *Integrante del Cuerpo Académico de Biotecnología

INTRODUCCIÓN

El término en Latín in situ, significa “en su lugar original”; hibridación es la formación de una molécula dúplex híbrida, por medio de la unión de de una hebra complementaria o parcialmente complementaria de ADN o ARN La hibridación in situ es una técnica mediante la cual se estudia la densidad de un gen o molécula de ADN o ARN en una célula o tejido, utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena. En 1969, Mary Lou Pardue y Joseph Gall desarrollaron un procedimiento en el que mediante el calentamiento del ADN, se permite que otra hebra la complemente para formar un ADN híbrido a partir de una hebra de una especie y una segunda hebra de otra. Este proceso trabaja porque el hidrógeno enlaza solamente los pares complementarios. Cuanta más semejanza hay en el ADN del híbrido, más enlaces del hidrógeno serán formados en la hibridación, de esta manera se puede determinar la localización cromosomal en secuencias repetitivas de ADN. La hibridación in situ implica la separación de cromosomas mitóticos; es decir que están en división, en un portaobjetos, desnaturalizando el ADN en un álcali algunos minutos, se lava con un buffer para remover la solución alcalina. Se incuba en una solución de hibridación que contiene copias radioactivas de la secuencia del nucleótido que nos interesa, se lava la hebra radioactiva que no hibridíza con la secuencia complementaria del cromosoma exponiendo la laminilla a emulsión fotográfica que es sensible a energía radioactiva baja, develando un a auto radiografía. Las pruebas de hibridación in situ se hacen hoy en día ligando componentes o tintes fluorescentes, este procedimiento se llama hibridación fluorescente In situ (FISH).

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La técnica consiste en preparar cortas secuencias de ADN de una sola hebra, llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de ADN que se quieren marcar y examinar. Estas sondas se "marcan" con moléculas fluorescentes como biotina o fluoresceína, las cuales hibridan o unen al ADN complementario y, como están marcadas con moléculas fluorescentes, permiten localizar las secuencias en las que se encuentran. La FISH utiliza tres tipos de sonda: Sondas específicas de un locus: estas sondas se hibridan a una región particular de un gen. Esta sonda es útil cuando se ha aislado una pequeña parte de un gen y se quiere averiguar en qué cromosoma se encuentra. Sondas alfoides o centroméricas: son sondas que contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrómeros de los cromosomas. Como pueden utilizarse sondas de diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado de manera distinta, con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el número correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma extra. Sondas para cromosomas completos: son colecciones de sondas de un tamaño reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma. Utilizando estas librerías de sondas, se puede marcar todo un cromosoma generando un cariotipo espectral. De esta manera, se consiguen imágenes en color que permiten examinar los cariotipos de una forma más exacta que los tradicionales cariotipos basados en bandas más o menos oscuras. Esta técnica es particularmente útil para examinar anormalidades cromosómicas.

EL uso de la Hibridación in situ

La hibridación In situ, analiza la expresión de un gen. Por tanto se usa para el diagnóstico de enfermedades, identificación de especie y/ o sexo de los individuos, para determinar enfermedades antes del nacimiento.

TECNICA DE HIBRIDACION IN SITU

Técnica mediante la cual estudia la distribución y densidad de un gen o molécula de ARNm en una célula o un tejido utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena. Hibridación :(proceso mediante el cual dos cadenas complementarias de ácido nucleico forman una doble hélice durante un período de unión).

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Existen variaciones en la técnica dependiendo de los tipos de sondas que se utilicen (ADNc, oligonucleótidos, ARN). Existen dos tipos de técnicas de hibridación dependiendo de cómo estén marcadas las sondas: Técnica isotópica ó radioactiva (sondas marcadas con: 32P, 35S, 3H) y Técnica no isotópica o no radioactiva. (sondas marcadas con: digoxigenina, peroxidasa, etc.). Protocolo estándar: 1-Fijación del tejido o las células con paraformaldehido (PFA) 4% durante unas horas. 2-Crioprotección del tejido en sacarosa al 30% en tampón fosfato (PB) 0,1M a 4ªC toda la noche (este paso sólo se realizará en el caso de secciones de criostato). 3-Secciones de 10 a 25 micras de grosor. 4-Hibridación -.--a)-Incubar las secciones en proteinasa K durante 15 min a 37ªC. -.--b)-Delipidar el tejido deshidratando en alcoholes crecientes comenzando por 2 x 5 min en H2O, en Dietil pirocarbonato (DPC) 0,02% (50ml DPC en 250ml H2O autoclavado), 50,70, 95, y 100% en etanol, y rehidratar hasta H2O DPC. -.--c)-Preincubar las secciones en solución de prehibridación (50% formamida desionizada, 0,1% ADN de esperma de salmón, 2 x SSC, 10X solución Denhardt´s, 0,1% SDS) durante una hora a temperatura ambiente. -.--d)-Hibridación. Añadir solución de prehibridación hasta conseguir una concentración de 0,5-2,0 x 105 cpm por 50ml de solución de hibridación. En el caso de utilizar oligo-sondas marcadas con digoxigenina se puede utilizar unos 20ng de sonda por ml de tampón. Escurrir la solución de prehibridación de las secciones. Añadir la solución de hibridación, se utilizará un volumen de unos 50ml por sección. -.--e)-Incubar las secciones toda la noche en cámara de humedad a unos 45ªC. -.--f)-Lavar las secciones con 2x SSC (NaCl-sodio citrato) cambiar la solución cada 15 min durante 3 hr a temperatura ambiente. -.--g)-Secar las secciones al aire. -.--h)-Visualización de la señal: -En el caso de la técnica radioactiva se realizará autor radiografía. Cubriendo las secciones con emulsión fotográfica y exponerlas durante 3-7 días a –70ªC. -En el caso de tratarse de la técnica no radioactiva, las secciones se incubarán con un anticuerpo secundario dirigido contra la sustancia con la que estaba marcada la sonda (ej. anticuerpo anti-digoxigenina o anti-biotina) siguiendo posteriormente el protocolo según lo expuesto en las técnicas inmunohistoquímicas. 5-Controles -Incubar con la solución de hibridación sin sonda. -Incubar con ARN asa antes de la hibridación -Incubar las secciones con solución de hibridación conteniendo 400 veces de de sonda no marcada o con sonda no relacionada de tamaño similar. Los tiempos, temperaturas y concentraciones de las sondas varían en cada caso particular dependiendo del tipo de tejido y de la sonda.

Envío de muestras

Las recomendaciones para la toma y envío de muestras para laboratorio son sencillas. Sangre: tubos estériles con EDTA, se mantienen a 4° C, hasta su procesamiento, si es inmediato no necesita refrigeración. Heces: se debe tratar de mantener la muestra lo más limpia que esta lo permita, sin hojas, pequeñas rocas, etc. Sí las heces están secas así se pueden dejar, si no se deben mantener en alcohol al 70%.

http://www3.usal.es/~histologia/aplicacion/espanol/histotec/especial/espe19/protein.htm

http://www3.usal.es/~histologia/aplicacion/espanol/histotec/especial/espe19/dietil.htm

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Pelo: la muestra de pelo se debe tomar desde la raíz y enviarla a laboratorio en un tubo seco. Raspados: estos se deben almacenar en alcohol al 70%.

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ENFERMEDADES EXÓTICAS M. en C. José Luis Zamora Espinosa *

M. en C. Benjamín Valladares Carranza* *Integrantes del Cuerpo Académico de Salud Animal

INTRODUCCIÓN

En la constante movilización de productos y subproductos de origen animal, y animales vivos en movilización de animales, la apertura comercial internacional han aumentado los riesgos de que las plagas y enfermedades que existan en otras regiones puedan introducirse y diseminarse en nuestro país, causando pérdidas a la ganadería por su rápida diseminación y difícil control. La vigilancia epizootiológica en el territorio nacional debe realizarse en las tres barreras sanitarias y estar enfocada a las enfermedades de la lista A del Código Zoosanitario Internacional, citadas en el Acuerdo mediante el cual se enlistan las enfermedades y plagas exóticas y enzoóticas de notificación obligatoria en los Estados Unidos Mexicanos, publicado el 5 de marzo de 1999 en el Diario Oficial de la Federación. Las enfermedades exóticas son de notificación obligatoria inmediata y para ello se debe usar el formato de notificación SIVE 01 del Sistema de Vigilancia Epizootiológica (SIVE), publicado el 6 de diciembre de 1995 en el Diario Oficial de la Federación o bien en el formato de reporte de la Comisión México-Estados Unidos para la Prevención de la Fiebre Aftosa y otras Enfermedades Exóticas (CPA). De confirmarse la presencia de una enfermedad exótica en el territorio nacional la SAGARPA activa el Sistema Nacional de Emergencias en Salud Animal (SINESA), cuya normatividad fue publicada en el Diario Oficial de la Federación el 16 de febrero de 1988. Sin embargo, con la nueva Ley Federal de Sanidad Animal publicada el 18 de junio de 1993 en el Diario Oficial cambia a Dispositivo Nacional de Emergencias en Salud Animal (DINESA). Este Dispositivo está integrado por ocho grupos regionales de Emergencias en Salud Animal (ESA). Las actividades que se desarrollen serán normadas y dirigidas por la Dirección General de Sanidad y Protección Agropecuaria y Forestal, con el apoyo de la CPA y ejecutadas en cada región bajo la supervisión de los coordinadores responsables. La SAGARPA integra, opera y expide las normas oficiales que establecerán las medidas de seguridad que deberán aplicarse al caso particular en el que se diagnostique la presencia de una enfermedad o plaga exótica en los animales.

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Una de las funciones que marca la NORMA Oficial Mexicana NOM-018-ZOO-1994 a los MVZ aprobados como unidades de verificación es: asistir a la autoridad en caso de emergencia zoosanitaria para la aplicación de las medidas de prevención, control o erradicación de las enfermedades o plagas de los animales que determine la Secretaría. La Ley Federal sobre Metrología y Normalización, en materia de normalización, certificación, acreditación y verificación, hace mención de fomentar la transparencia y eficiencia en la elaboración y observación de normas oficiales mexicanas y normas mexicanas.

La misma Ley en su Art. 40 en materia de norma oficial mexicana establece en su fracción II que su finalidad es dictar las características y especificaciones que deban reunir los productos y procesos cuando estos puedan constituir un riesgo para la seguridad de las personas o dañar la salud humana, animal, vegetal, el medio ambiente general y laboral, o para la preservación de recursos naturales. Y en su fracción III, las características y especificaciones que deben reunir los servicios cuando éstos puedan constituir un riesgo para la seguridad de las personas o dañar la salud humana, animal, vegetal o el medio ambiente general y laboral o cuando se trate de la prestación de servicios de forma generalizada para el consumidor.

SERVICIO DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES EXÓTICAS

Los programas de emergencia epizootiológica tienen que constituir un sistema previamente bien organizado, para hacer frente a las diferentes situaciones de urgencias eventuales, originadas por amenaza y brotes de enfermedades contagiosas muy peligrosas, exóticas o desconocidas. La desacostumbrada extensión de las medidas contraepizoóticas y sus consecuencias en la vida económica, política y cultural de los lugares afectados, exigen la aplicación de una serie de medidas que influyen en casi todos los sectores. Por eso tales procedimientos por el hecho de ser complicados y exigentes, deben ser bien preparados con anterioridad y aprobados por los organismos responsables correspondientes.

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El contenido, la forma y los componentes de estos programas tienen que ajustarse de acuerdo con el tipo y grado de peligro epizootiológico que amenaza al país. El objetivo de estos programas es posibilitar en caso necesario, la aplicación lo más pronto posible, a todos los niveles de mando, desde el local hasta el nacional, de las medidas contraepizoóticas imprescindibles. La finalidad de las actividades de control y vigilancia de las enfermedades es su identificación de forma oportuna y se debe realizar no solo con vigilancia pasiva sino que también con vigilancia activa. Por otro lado la capacidad de los laboratorios de alta seguridad para confirmar un diagnóstico de una enfermedad exótica está relacionada directamente con la calidad de la muestra y las condiciones en las que es remitida. Este organismo debe estar constituido por personal calificado en economía, estadística, mercado agropecuario y epizootiología, no sólo resulta importante en la elaboración de planes de vigilancia y análisis costo-beneficio de las enfermedades e intercambio de información a nivel internacional, sino también en forma importante en la coordinación de los diferentes servicios de salud animal y otros relacionados con la industria pecuaria, manteniéndolos informados y sensibilizados de su responsabilidad para cooperar con los planes de vigilancia y de emergencia y en los que frecuentemente se necesita constituir grupos de combate que incluyan servicios para el control de las enfermedades exóticas. Este servicio debe contar también con sistemas de rápida recuperación y de análisis de datos que

incluyan el uso de sistemas de computación tan complicados como sea el volumen de información

a manejar. Al señalar este punto debemos recordar que no siempre el mejor sistema es el más

sofisticado; sin embargo el avance actual en aspectos de computación, provee de una amplia

gama de aparatos según las necesidades de cada programa, y día a día va resultando más

necesario incorporar esta metodología a los sistemas de vigilancia tanto nacionales como

internacionales, como una opción para manejar cantidades grandes de datos en forma rápida y

eficiente.

Además este servicio cumple la importante labor de retroalimentar a sus fuentes de información a nivel de campo, con los análisis de situación obtenidos a partir de los informes operacionales. NOTA: Cuando se sospecha de la existencia de una enfermedad exótica, no se deberán movilizar animales o muestras de las granjas de origen, a menos que sea bajo la custodia del MVZ oficialmente designado. Este orden de movimiento o cuarentena, debe ser aplicada hasta que se determine el diagnóstico de laboratorio.

ACTIVIDADES A REALIZAR PARA LA TOMA, CONSERVACIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS DE UNA ENFERMEDAD EXÓTICA A LA CPA.

Para el control en la prevención y vigilancia contra cualquier enfermedad exótica, deben realizarse los siguientes procedimientos. a. Reporte y atención de brotes. 1. Cuando se reciba un reporte de sospecha de cualquier enfermedad exótica, en animales, antes de atender el reporte, se comunican inmediatamente los datos del brote al Coordinador Regional de la CPA o bien a la Comisión por vía telefónica y por cobrar, proporcionando los datos contenidos en la forma del reporte de CPA. En los casos en que no se pueda efectuar esta

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comunicación rápidamente, el médico procederá a atender el caso, reportándolo a su regreso al laboratorio o cuando le sea posible. 2. Al llegar el veterinario al predio afectado procederá a obtener los datos epizootiológicos.

3. El veterinario solicitará al propietario o encargado, que encierre el rebaño afectado en un corral, previa inspección ocular de todo el rebaño.

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Los animales enfermos o sospechosos de estar afectados por una enfermedad exótica, deben ser sacrificados para obtener muestras para el examen de laboratorio. Por lo general, el dueño provee los animales que se necesiten, pero si no fuera este el caso, se deberán hacer los arreglos necesarios para comprarlos. Deberán muestrearse de tres a cuatro animales enfermos como mínimo, dos de ellos deben estar en estado febril, para intentar el aislamiento del agente etiológico.

4. El veterinario debe colocarse overol desechable, botas y guantes, y entrará al corral con una cubeta, un sobre con desinfectante (carbonato de sodio), nariguero, tubos para toma de muestras, frascos conteniendo glicerina buferada, pinzas, tijeras y un cepillo de raíz, así como bolsas para el envío de muestras. 5. Se revisarán los animales que se noten decaídos, o que hayan disminuido bruscamente su producción, procurando que sean los animales más recientemente afectados.

6. Antes de examinar a cada animal y

especialmente si se van a tomar

muestras, es indispensable sujetar

perfectamente al animal, utilizando el

mecanismo de inmovilización

convenientemente más práctico.

En caso de que haya muerto algún animal la necropsia se debe realizar en el terreno o en un área biológicamente segura, para reducir el riesgo de diseminar la enfermedad. Los animales y el material contaminado no deben sacarse del lugar. No debemos olvidar las recomendaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-087- ECOL-1995, en lo referente a disposición final de residuos peligrosos biológico infecciosos.

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7. Las muestras deben tomarse siempre que sea posible de lesiones frescas. 8. Las muestras de tejidos lesionados deben contener por lo menos 1.5 gr; si hay varios casos, se recoge una cantidad dos o tres veces mayor. Para aislamiento de virus se deberán escoger los órganos que contengan altas concentraciones de virus como: bazo, hígado tonsilas, linfonodos mediastínicos, gastrohepáticos y mesentéricos. Las muestras de suero deberán colectarse de 4 a 6 animales adicionales para la detección de anticuerpos. 9. Si hay una cantidad elevada de animales (más de 50 cabezas) afectados, el número de animales muestreados en el rebaño quedará a criterio del veterinario, considerando que una buena muestra de tejido en ocasiones es suficiente, pero no siempre es fácil su obtención, por lo que se requiere de mayor cantidad del mismo; si el número de animales afectados es menor a 50, el número de animales muestreados será de 5 como mínimo; en el caso de existir menos de 5 animales afectados, se muestrean en su totalidad. 10. Puede suceder que cuando la enfermedad se ha presentado siete u ocho días antes de haber recibido la notificación, las lesiones se encuentran en vías de cicatrización y resulta difícil tomar la cantidad de material indicada. En tal caso, se debe tomar con cuidado la mayor cantidad posible de tejido lesionado de los lugares afectados. 11. Las muestras se colocarán de manera individual en frascos con glicerina buferada. Cada frasco se identificará con un numéricamente con lápiz y escrito sobre tela adhesiva. No debe usarse bolígrafo o tinta, pues se borra con el agua. Finalmente se sellará el tapón del frasco con cinta aislante plástica (Maskin-tape). Las muestras contenidas en frascos o bolsas de plástico, así como los tubos de sangre y suero, los frascos olas bolsitas de plástico, se enviarán empacadas en hielo, por la vía más rápida. Es preferible que las muestras lleguen al laboratorio de diagnóstico de la CPA dentro de las 24 horas posteriores a su colecta. Deberá evitarse la diseminación del virus en los envases de las muestras desinfectando la parte externa o colocándolos en bolsas perfectamente cerradas.

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12. Una vez concluida la inspección y toma de muestras se procederá a desinfectar el equipo en la puerta del potrero, en el orden siguiente: a) Vaciar el sobre de carbonato de sodio (200 gramos) en una cubeta con 5 litros de agua (para hacer una solución aproximada al 4%). b) Enjuagar perfectamente el nariguero, las pinzas, las tijeras y el otro material utilizado. Los frascos conteniendo las muestras se sumergirán en la solución, colocándolos posteriormente en una de las bolsas de plástico que se cerrará doblando la punta y presionando el dobles con una cinta elástica. Luego se sumergirá la bolsa en la solución.

c) Con ayuda del cepillo de raíz se desinfectarán las botas especialmente la suela.

d) El médico veterinario se despojará del overol y lo colocará dentro de una cubeta con desinfectante, dejándolo tirado y empapado a la entrada del corral. Sugerirá al propietario que posteriormente lo queme o lo entierre.

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e) Finalmente desinfectará los guantes y saldrá del corral con la cubeta conteniendo el desinfectante y las botas puestas. f) Junto al vehículo desinfectará de nuevo la suela de las botas y se despojará de ellas.

b. Empaque y envío de muestras. 1. Las bolsas conteniendo las muestras se colocarán dentro de otra bolsa doble que contenga a su vez hielo. Esta segunda se sellará con un doblez, presionando con una cinta elástica. 2. Ambas bolsas se colocarán dentro de la caja de cartón o poliuretano (hielo seco) para envíos, cuidando de pegar en el interior de la misma, con una cinta adhesiva, la forma de atención de reporte. El espacio sobrante se rellena con paja, periódico o aserrín. 3. Cerrar la caja sellando su tapa con cinta adhesiva y amarrarla con hilo o lazo.

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4. El envío debe rotularse "OCURRE" y con la dirección: COMISIÓN MÉXICO-ESTADOS UNIDOS PARA LA PREVENCIÓN DE LA FIEBRE AFTOSA Y OTRAS ENFERMEDADES EXÓTICAS DE LOS ANIMALES KM. 15.5 CARRETERA MÉXICO-TOLUCA, km 15.5 PALO ALTO, D.F., DELEGACIÓN CUAJIMALPA, C.P. 05110, MÉXICO, D.F. 5. El paquete conteniendo las muestras se enviará por la vía más rápida posible (autobús o avión) a la ciudad de México, para su pronto diagnóstico inmediato. 6. Después de depositar las muestras, el veterinario llamará a la CPA por cobrar; para informar el resultado de la investigación y dar los datos del envío como son: hora en que se depositó, línea de autobús o aérea en que se envió, número de recibo y hora aproximada de la salida y su arribo a la ciudad de México, y la información epizootiológica complementaria. Los teléfonos de la CPA son: (01 800) 751 2100 y 903- 8800 (01-55)5259-3035, 5259 1441, 3618-0823 al 33. FAX: 01 55 3618-0834 7. Los gastos ocasionados por la toma, empaque y envío de muestras serán pagados por la CPA a la presentación de los comprobantes de compra correspondientes. c. Comunicación de resultados. La CPA notificará a la brevedad posible los resultados de laboratorio: si el resultado es negativo a una enfermedad exótica, el Coordinador Regional de la CPA o bien el veterinario asignado informará al propietario, aprovechando para darle las instrucciones de índole sanitaria correspondientes y retirando las medidas restrictivas que se hubieran dictado. Cuando los resultados son positivos a una enfermedad exótica, el rebaño afectado será visitado

dentro de los 10 días posteriores a la primera visita para constatar que no se han presentado más

animales enfermos; pero si los hubiera, el Coordinador Regional de la CPA o bien el veterinario

asignado procederá como si fuera un reporte original.

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INMUNOSEROLOGÍA

Díaz Zarco Soledad* Alonso Fresán Ma. Uxúa*

Velázquez Ordóñez Valente*


INTRODUCCIÓN

En el periodo de 1886 a1889, Max Gruber, Rudolh Kraus y Jules Bordet descubrieron las pruebas de aglutinación, precipitación y fijación de complemento, respectivamente. La inmunoserología iniciada por estos investigadores, puede definirse como el estudio de la interacción de los anticuerpos con el antígeno. El diagnóstico serológico se basa en la determinación de anticuerpos por medio de diversas técnicas inmunológicas contra diferentes agentes infecciosos (bacterias, hongos, parásitos y virus) de importancia médica; el material de estudio es el suero y, el objeto de estudio es la presencia y comportamiento de la respuesta inmune humoral; de acuerdo con estas características, es importante definir conceptos tales como: Suero, es la porción clara de un líquido orgánico, principalmente sangre, calostro, leche y linfa, después de la coagulación del mismo. Anticuerpos o inmunoglobulinas, son proteínas producidas por los linfocitos B (células plasmáticas) estimulados por un antígeno y tiene la propiedad de combinarse con éste. Los anticuerpos son elementos importantes en la defensa del organismo contra bacterias, hongos, parásitos y virus. Su acción es de apoyo a otros sistemas tales como el complemento o la fagocitosis, que por sí solos no eliminarían a los microorganismos. Los anticuerpos de las clases IgG, IgM e IgA intervienen en esta función, pero cada uno de manera diferente. La IgG actúa fundamentalmente estimulando a la fracción C1, que es la que inicia la fijación del complemento, el cual perfora la membrana citoplasmática de bacterias y parásitos. La IgM tiene una poderosa actividad aglutinante debido a su alta valencia que favorece la fagocitosis. La IgM es más eficiente que la IgG, tanto en los procesos de bacteriólisis mediada por el complemento, como de inmovilización, su localización sérica la hace valiosa en casos de bacteriemia. En cuanto a la IgA, su actividad antibacteriana previene la adhesión de bacterias a epitelios externos, tales como el traqueobronquial, intestinal y genitourinario. El antígeno es la sustancia (bacteriana, micótica parasitaria o viral) capaz de provocar una respuesta inmune detectable después de ser introducida en un vertebrado. Sustancia reconocida por anticuerpos y linfocitos sensibilizados

CONSIDERACIONES PARA EL DIAGNÓSTICO INMUNOSEROLÓGICO

Es esencial conocer las distintas pruebas que se llevan a cabo en un laboratorio clínico, como ayuda para establecer el diagnóstico de ciertas enfermedades infecciosas.

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Es indudable que para cada tipo de microorganismo causal de infección, los procedimientos o herramientas óptimas para su diagnóstico diferirán con base en varios aspectos que siempre deberá tener presente el clínico, por ejemplo: tipo de examen, rapidez, costo del estudio, etc. La mayoría de estas reacciones inmunoserológicas, se basan en la habilidad de los anticuerpos para reaccionar con su antígeno específico y en el uso de un sistema indicador para poner de manifiesto tales reacciones. Las pruebas serológicas que se emplean pueden descubrir la existencia de infecciones recientes, pasadas o inmunizaciones previas, en general, los resultados pueden ser engañosos a menos que las muestras de suero obtenidas en un intervalo de 2 a 3 semanas pongan de relieve un creciente título de anticuerpos. El reconocimiento de una infección reciente también se puede establecer sobre la base de la observación clínica junto con una elevada reacción serológica en una sola prueba. Ciertos tipos de pruebas inmunserológicas son de ayuda para el establecimiento de un rápido diagnóstico. Es posible identificar un microorganismo aislado de un animal enfermo si al suero se le hace reaccionar in vitro con una serie de anticuerpos previamente conocidos. De igual modo la presencia de anticuerpos específicos en un animal convaleciente o vacunado, pueden evidenciarse si el suero se hace reaccionar con una serie predeterminada de antígenos. Estas reacciones se utilizan también para titular o cuantificar al antígeno presente en una preparación o cultivo de microorganismos o la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra de suero. Los procedimientos inmunoserológicos de que se disponen en microbiología se denominan por lo general, de acuerdo al tipo de sistema indicador utilizado. Las pruebas más comúnmente utilizadas son la fijación de complemento (FC), la neutralización de virus (NV), la hemoadsorción (HAd), la inhibición de la hemoadsorción (IHAd), la hemaglutinación (HA), la inhibición de la hemaglutinación (IHA), la precipitación, la aglutinación, la floculación, la difusión en agar (DA), ELISA, las técnicas de anticuerpos fluorescentes (AF) o la quimioluminiscencia. En la mayoría de las pruebas inmunoserológicas, el título de anticuerpos se expresa como el recíproco de la dilución mayor que causa el efecto esperado en la prueba. Esto es particularmente válido para las pruebas en las que se emplean antígenos no viables tales como FC, IHA y pruebas de aglutinación, precipitación y floculación. En pruebas como NV, que se basa en la habilidad de los anticuerpos para inhibir la multiplicación del agente infeccioso homólogo en cultivo de tejidos, embriones de pollo o animales, el título puede expresarse como el índice de neutralización (IN) o como la dilución más alta de suero que protege a los hospederos de los efectos específicos esperados. Esto último se denomina punto final 50% seroneutralización o virus neutralización (punto final SN50 o VN50). Las técnicas inmunoserológicas se han clasificado como: pruebas de vigilancia epidemiológica, pruebas suplementarias y pruebas confirmatorias; estos criterios son aplicados sobre todo para las pruebas de diagnóstico inmunoserológico utilizadas para enfermedades que se encuentran en campaña de erradicación permanente en nuestro país; por ejemplo la brucelosis bovina y la salmonelosis aviar. Las pruebas inmunoserológicas están diseñadas para detectar anticuerpos específicos resultantes de una vacunación, de una infección natural o bien para establecer el diagnóstico de un animal crónico, esto puede determinarse gracias al grado de sensibilidad y especificidad de cada una de las pruebas y al conocimiento del comportamiento de la respuesta inmune del hospedador ante los diversos agentes patológicos.

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En general, en la respuesta inmune desencadenada mediante vacunación los primeros anticuerpos en aparecer son los de la clase IgM e IgG, pero estos últimos declinan rápidamente y desaparecen antes que los IgM; mientras que en una infección natural los anticuerpos IgM aparecen tempranamente y durante algunos días son la única inmunoglobulina presente en el suero, más tarde aparecerá la IgG, que permanecerá hasta que la enfermedad esté presente. En cuanto a las pruebas, se entiende por sensibilidad a la capacidad de la prueba para detectar animales positivos cuando éstos están verdaderamente enfermos. En cambio la especificidad es la capacidad de la prueba para dar resultados negativos cuando un animal no está verdaderamente enfermo; estas características son expresadas en porcentaje. De acuerdo a esto es deseable que las pruebas inmunoserológicas sean altamente sensibles y específicas, lo que permitirá tener la seguridad en el diagnóstico, descartando los resultados falsos positivos y falsos negativos. El diagnóstico inmunoserológico es un proceso multifactorial, en el que la correcta, acertada y oportuna selección de la muestra influirá sobre la precisión de los resultados.

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE

Para el caso de la muestra sérica es necesario seguir las recomendaciones para la obtención adecuada de sangre, considerándose que la muestra no contendrá anticoagulante. La posición adecuada y sujeción efectiva del animal son esenciales para un muestreo exitoso, mismo que deberá minimizar la necesidad del manejo físico o químico, porque la sangre tomada del animal adrenalizado puede originar resultados equivocados, sobre todo cuando el suero se destinará para pruebas bioquímicas además de las inmunológicas. La sangre venosa es la más comúnmente obtenida de los animales, el sitio y el calibre de la aguja para la obtención dependerá de la especie. En los bovinos la sangre se obtendrá de las venas yugular, mamaria y coccígea y, de las arterias carótida, braquial y caudal. Se recomienda el uso de agujas calibre 16 ó 18, dependiendo de la vena que se desee abordar. En ovejas la vena yugular es la más accesible, pero la vena y arterias femorales son también fáciles de puncionar. Se recomienda que el calibre de la aguja sea del número 18 ó 20. En los caballos se utiliza la vena yugular y se recomienda que el calibre de la aguja sea 18 ó 20. En el cerdo se usan las venas de la oreja, de la cola y la vena cava anterior. Se recomienda que el calibre de la aguja sea 20 ó 21. En el perro y el gato las venas cefálica y safena son usadas comúnmente, pero puede recurrirse a la vena yugular. Se recomienda que el calibre de la aguja sea 18, 20 ó 22. El conejo, cobayo y otros animales de tamaño similar, es preferible la punción intracardiaca; si el muestreo se tiene que hacer repetidamente es preferible cortar la vena marginal, en el margen externo de la oreja, la elección del sitio dependerá del volumen de sangre requerido.

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En aves adultas y pavos la muestra se obtendrá de la vena braquial; en aves de talla pequeña es preferible la punción intracardiaca mediante agujas de calibre 21 ó 23.

OBTENCIÓN DEL SUERO

El suero sanguíneo se obtiene después de que se ha formado el coágulo, esto se puede acelerar incubando entre 35 7 37º C la muestra de sangre o bien inclinando el tubo para aumentar la superficie de contacto para acelerar el proceso de coagulación y la retracción del coágulo. Ya coagulada la muestra (no dejar más de 2 horas a temperatura ambiente o en caso contrario mantenerla a temperatura de refrigeración) se decanta el suero y se extrae por aspiración con una pipeta Pasteur o jeringa. Se debe evitar el daño a los eritrocitos. En la mayoría de las especies el suero se separa sin centrifugación; aunque con la centrifugación el volumen que se obtiene siempre será mayor.

MANEJO Y ENVÍO

Una vez separado el suero se traslada a un frasco estéril, evitándose así el riesgo de hemólisis. El envío al laboratorio deberá acompañarse con la historia clínica para facilitar la correcta interpretación de los resultados, así como la petición concreta de los estudios solicitados. Es importante mencionar si existen antecedentes de inmunización. Las muestras de sangre para el diagnóstico serológico se obtienen en tubos estériles sin anticoagulante. El volumen mínimo deberá ser de 2 a 5 mL para los estudios rutinarios; en tanto que para unos estudios especializados se enviará de 5 a 10 mL de suero. Si el transporte precisa de algún tiempo es recomendable la conservar a temperatura de 4 a 8º C. Entre las causas que pueden inutilizar una muestra sérica para inmunoserología se encuentran: la hemólisis, lipemia o quiluria, desnaturalización por agentes físicos o químicos, cantidad insuficiente de la muestra o muestra con anticoagulante.

BIBLIOGRAFÍA

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TOMA DE MUESTRAS EN ANIMALES DE ZOOLÓGICO

* Díaz Guadarrama.H.R., Guevara García.J.I., Friebenth Mondragón .J., *Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la U.A. E. M.

CEPANAP

EVALUACIÓN DE LOS DATOS DE LABORATORIO

El médico hoy en día se enfrenta frecuentemente a dos cuestiones respecto a los resultados de laboratorio: 1.- saber si un valor dado es o no significativamente diferente del normal y por lo tanto indicador de una enfermedad. 2.- Determinar si dos valores obtenidos a un cierto intervalo de tiempo en el curso de una afección son significativamente diferentes entre sí, y por consiguiente indicadores de mejoría o empeoramiento del proceso. Cualquiera que pueda ser el caso, como respuesta a estas sencillas cuestiones no siempre son fáciles, en especial si, el médico no posee una clara comprensión de: a) La precisión y reproducibilidad del método empleado. b) Un conocimiento perfecto de las variaciones observadas entre una población de especímenes normales. Por lo que para realizar una evaluación integral y adecuada de los resultados, de tales estudios en animales de zoológico se necesita del conocimiento de los límites normales en las diversas especies animales estudiadas.

TOMA Y RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

La preocupación de todo profesional es sin lugar a duda el efectuar sus actividades a un máximo nivel de calidad. Sin embargo esto solo será posible con un conocimiento integral de todos los factores y procedimientos que conllevan al fin de tan anhelado logro. Es indudable que gran cantidad de aspectos produzcan incertidumbre, de ahí que se haga necesario definir procedimientos y acciones que conduzcan a los profesionistas a llegar con éxito a la meta deseada. De ahí que para la toma de muestras en los animales del zoológico, los especialistas deberán considerar factores vitales tales como; temperamento del animal, especie animal, conocer las técnicas de contención física y químicas que puedan salvaguardar la integridad física del animal y de las personas que trabajan con él. Sin embargo un aspecto totalmente diferente entre las especies animales domésticas y las de zoológico es el costo de los estudios y el manejo del espécimen ya que las especies animales de zoológico deban ser manejadas en forma distinta a las domésticas. Aún cuando no existan grandes diferencias entre los animales domésticos y los animales de zoológico ya que gran parte de los procedimientos utilizados en la toma de muestras, recolección y en el envío son casi los mismos, vale la pena destacar algunos puntos sobre la responsabilidad y costo, puesto que estos se aumentan en los animales de zoológico debido a que frecuentemente se trabaja con especies raras o en peligro de extinción por lo que doblemente se debe considerar su manejo, ya que no es ético y menos operativo que en muchos de los casos de manera repetida se efectúe la toma de muestras con mucha frecuencia de manera innecesaria, de ahí que las recomendaciones vayan orientadas a considerar aspectos tales como:

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OPERADOR - Tener un conocimiento profundo del espécimen tanto fisiológica como anatómicamente y etológicamente. - Contar con todos los materiales y equipos en buen estado.

PACIENTE - Este deberá ser sujetado sin causar excitación excesiva, sedado o bien estar entrenado para el procedimiento de la toma de muestras.

MATERIALES Y EQUIPOS. - Los materiales utilizados deben estar limpios y secos y en su caso estériles. - Evitar el uso de frascos no apropiados para la muestra correspondiente. - Considerar la cantidad y tipo de conservador que se deba utilizar en relación con el volumen y tipo de muestra.

SELECCIÓN DE LOS EXÁMENES MÁS APROPIADOS

Al tener un caso clínico frente a nosotros, en el cual sea sugestiva la necesidad de estudios de laboratorio, el médico veterinario especialista, deberá escoger el examen que le proporcione la mayor información, confiable y sobre la cual pueda apoyar el diagnóstico o terapéutica, considerando el tiempo más corto. Este procedimiento de selección para elegir el examen más apropiado, se apoya en la evaluación de la historia clínica y examen físico del animal, en donde los resultados de los estudios de procedimientos rápidos, en la mayoría de las veces sugieren la necesidad de llevar a cabo exámenes adicionales. En otras ocasiones por el manejo terapéutico del espécimen se hace necesario se efectúen exámenes de laboratorio a intervalos específicos para lograr respuestas satisfactorias del animal a su tratamiento. Además de considerar las indicaciones clínicas para una prueba de laboratorio el médico especialista requiere tomar en cuenta factores tales como: - El costo del examen - La disponibilidad del equipo para efectuarlo - El grado de especificidad y precisión requerida y su significancia para el diagnóstico. Es más común usar de manera rutinaria exámenes rápidos que indiquen la presencia o ausencia de afecciones o enfermedad, puesto que los estudios son sencillos de realizar, rápidos, de bajo costo y confiables. Aunque en otros casos los exámenes son cualitativos y no muy específicos, pero pueden dar al clínico la información básica, para escoger estudios complementarios (Microhematocrito y Recuento Leucocitario). En otras ocasiones el profesional de la medicina veterinaria de animales de zoológico requiere de solicitar un estudio que está indicado por el examen clínico y la historia clínica, pero por lo complicado se requiere de equipos especiales y su costo es elevado.

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PRECISIÓN NECESARIA EN EL LABORATORIO

En muchos casos los estudios rápidos llamados “Screening Test” dan al médico información con suficiente precisión como para llegar a un diagnostico tentativo y por tanto estos exámenes pueden servir como procedimientos finales (en leucemia con el paquete leucocitario). Existen diferentes variedades de estudios y estos por lo general son: - Cualitativos - Semicuantitativos - Cuantitativos Los que van asociados con un incremento en la exactitud.

SELECCIÓN DE LA MUESTRA

Esta se apoya con el examen inicial de un paciente sospechoso de acuerdo a el padecimiento, de ahí que el tipo de estudio debe proporcionar un punto de partida para el proceder clínico, donde es importante para el objeto del diagnostico diferencial, determinar si el problema es crónico o agudo.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

- Que el recipiente sea el adecuado para el tipo de estudio. - Que el recipiente contenga una cantidad adecuada de conservador. - Que los materiales no estén húmedos o sucios - Que las muestras no se encuentren en estado de descomposición o contaminadas, puesto que no serán útiles para su fin. Para una adecuada recogida de material se hace necesaria una correcta obtención de las muestras. Puesto que los laboratorios de análisis clínicos efectúan una gran variedad de estudios a líquidos biológicos: sangre, orina, líquidos cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido amniótico, líquido de cavidades, semen, secreciones y otras muestras. Se requiere para cada líquido y para cada determinación precisas condiciones en la recolección; por lo que se hace necesario establecer protocolos específicos para ello. Y de igual forma resulta importante cuidar el mantenimiento de la muestra desde que ésta es recolectada hasta que se efectúan en ella los análisis correspondientes.

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

La calidad de un estudio de laboratorio depende en gran parte de la técnica que se emplea para su obtención. - Los recipientes para colectar las muestras de preferencia deben estar completamente limpios y secos al igual que los equipos que puedan estar en contacto con las muestras. - Evitar el manejo excesivo en animales demasiado nerviosos, para evitar el estrés o reducirlo al mínimo.

MUESTRA DE SANGRE

Se debe enviar solo cuando se sospecha que existe en el animal enfermedad que afecta la sangre o que se haya producido un cambio significativo en su composición, en tal caso se recomienda proceder a su examen.

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Los estudios que se practican más comúnmente a este tipo de muestra en lo fundamental son de tres tipos: - Hematológicos - Bioquímicos - Serológicos Para lo cual será necesario determinar el carácter de la muestra y cantidad que se requiere. Para el caso de los estudios hematológicos, la mayoría de estos se llevan a cabo con muestras de sangre, sin coagular, por lo que se recomienda agregar alguna sustancia anticoagulante que no disminuya o enmascare la confiabilidad del estudio. Cuando se realicen frotis sanguíneos para conseguir la diferenciación de las células (recuento diferencial) o determinar anormalidades de cualquiera de las series sanguíneas (hematíes, leucocitos o plaquetas) o en la búsqueda de parásitos o bacterias, se recomienda en lo posible utilizar sangre fresca sin anticoagulante. Para los estudios bioquímicos existen grandes diferencias en base a el tipo de pruebas que se tengan instaladas en cada laboratorio, pero en un sentido estricto puede enviarse sangre sin anticoagulante o preferentemente el suero sanguíneo, esta misma recomendación es válida para serología. La sangre para análisis puede obtenerse de las venas, las arterias o los capilares. La mayoría de las muestras de sangre se obtienen por punción venosa. La vena se detecta por palpación y, en los casos en que no sea fácilmente localizable, se hará por su disposición anatómica de acuerdo a la especie. La zona que circunda al punto de punción debe desinfectarse con un algodón empapado de alcohol. Las muestras de sangre venosa pueden extraerse por medio de jeringas desechables para evitar contagios o tubos de vacío. Jeringa y aguja deben alinearse con la vena, introduciéndose con un ángulo de unos 15·. Cuando se ha salvado la resistencia inicial de la pared de la vena, la sangre fluye a la jeringa tirando suavemente del émbolo. Extraída ésta, debe sujetar fuertemente un algodón sobre el lugar de punción para impedir la salida de la sangre. Una vez realizada la toma, la sangre de la jeringa se transfiere, con una presión suave sobre el émbolo, a los tubos adecuados. Los que contengan anticoagulantes deben taparse y mezclarse por inversión. La figura muestra el sistema de recogida de muestras de sangre con tubos de vacío.

VacutainerTM Becton Dickinson and Company

Este sistema permite obtener sangre en diversas condiciones de recogida, usando la misma aguja y con un mínimo de molestias. La aguja se enrosca en el dispositivo de sujeción y se inserta en la vena. Se presiona el tubo sobre el extremo de la aguja, hasta pinchar el tapón y liberar el vacío. Cuando la sangre comienza a fluir en el tubo, se suelta el torniquete y se puede insertar otro el tubo al dispositivo de sujeción. De esta manera pueden utilizarse los tubos que sean necesarios.

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En la tabla se muestran los diferentes tubos de vacío; en ellos, el color del tapón de goma indica el tipo de anticoagulante o preservador que llevan. Los tubos de vacío están recubiertos interiormente de silicona, para reducir la adhesión de los coágulos a las paredes y para disminuir el riesgo de hemólisis. El tamaño de los tubos permite obtener sangre entre 3 y 15 mL. Los tubos de suero con separador contienen un gel inerte que, cuando se centrifuga la sangre, una vez coagulada, se interpone entre el suero y el coágulo estableciendo entre ambos una barrera. Estos tubos pueden utilizarse como tubos primarios de los que aspirar la muestra en los analizadores automáticos que contienen sensores de nivel en las pipetas de aspiración. Para la medida de pH y gases en sangre se utilizan extracciones de sangre arterial.

TABLA. TUBOS DE VACIÓ PARA EXTRACCIÓN DE SANGRE

TAPÓN MUESTRA ANTICOAGULANTE O PRESERVADOR

APLICACIÓN

Rojo/gris Suero - Química

Verde Plasma Heparina Química

Violeta Sangre EDTA Hematología

Azul Plasma Citrato Coagulación

Negro Sangre Oxalato Velocidad

Gris Plasma Fluoruro Glucosa

Naranja Suero Trombina Química

Las extracciones de sangre arterial deben realizarse con mucho cuidado, debido a la fragilidad de las arterias y al peligro de formación de hematomas. La extracción de sangre arterial se lleva a cabo con una jeringa de vidrio heparinizada. No deben utilizarse jeringas de plástico normales pues el émbolo no sube sólo con la presión arterial, ni tubos de vacío. La arteria se localiza por su latido, se pincha con la aguja y se deja que la sangre fluya por su propia presión arterial. Cuando se separa la aguja de la arteria, conviene doblarla, para evitar la entrada de aire, o quitar la aguja y tapar el cono de sujeción de ésta. En algunas ocasiones, sobre todo en especies de animales pequeños (aves, reptiles y pequeños mamíferos), se realizan extracciones de sangre capilar, dejando que fluya la sangre y cargando un capilar heparinizado. Para aumentar la circulación de la sangre puede caldearse la zona del pinchazo con un paño seco y caliente.

ANTICOAGULANTES Y PRESERVADORES

Cuando se requiera sangre total o plasma, debe añadirse a la muestra un anticoagulante durante el proceso de recogida. Existen varias sustancias capaces de impedir la coagulación de la sangre. El anticoagulante debe elegirse de acuerdo con las determinaciones que se vayan a realizar, asegurándose de que su presencia no afecte a la medida, ejemplo, si se quieren medir los iones sodio o potasio, no puede utilizarse como anticoagulante ninguna sustancia que contenga estos iones.

ANTICOAGULANTES MÁS USADOS

- EDTA (1 a 2 mg/mL) - Oxalato de Sodios compuesto (2 mg/mL) - Citrato bisódico al 3.8 % (en proporción 1:9) - Heparina (0.1 mg/mL) - Fluoruros

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Todos ellos tienen sus limitaciones para ser usados ninguno puede ser utilizado en todas las determinaciones. La heparina es el anticoagulante que menos interfiere en la mayoría de las determinaciones de sustancias químicas. Polisacárido presente en la mayoría de los tejidos, en concentraciones menores a las necesarias, para evitar la coagulación de la sangre. La heparina se presenta como sal sódica, potásica, de amonio o de litio, y la dosis a utilizar es de unas 20 U/m de sangre extraída, actúa como anticoagulante evitando la transformación de protrombina y, por tanto, evitando la formación de fibrina a partir del fibrinógeno. El oxalato actúa como anticoagulante por la formación de complejos con el calcio, ion que es fundamental en el mecanismo de coagulación. La sal más utilizada es el oxalato potásico, en una concentración de alrededor de 2 mg/mL de sangre. Las sales de oxalato se utilizan como anticoagulantes en las determinaciones hematológicas de recuentos celulares y hematocrito. El citrato es otro anticoagulante que actúa por formación de complejos con el calcio. Alrededor de 30 mg/mL de sangre es la concentración que suele utilizarse. El citrato sódico se emplea para las medidas de velocidad de sedimentación y estudios de coagulación. El EDTA (etilendiaminotetracetato) sódico o potásico se utiliza en concentraciones de 1 a 2 mg/mL de sangre para los recuentos hematológicos. Su acción se debe también a la formación de quelatos con el calcio. El fluoruro es un preservador que inhibe un gran número de enzimas, por lo que impide el metabolismo de diversas sustancias sanguíneas, útil para las determinaciones de glucosa cuando entre la toma y la centrifugación de la sangre haya de transcurrir más de una hora.

MUESTRAS DE SANGRE PARA HEMOCULTIVOS

Las extracciones de sangre para hemocultivos deben realizarse en condiciones especiales. Para ello se limpia la piel con alcohol al 70% o con una mezcla de éter-alcohol y se extraen de 5 a 10 mL de sangre con una jeringa estéril. Se punciona con la aguja en el tapón de goma del recipiente que contiene el medio y se descarga la jeringa mezclando bien la sangre con el medio de transporte. La selección del medio para el transporte de la sangre sobre la que se va a realizar el hemocultivo depende del organismo del que se sospeche. Para la mayoría de los hemocultivos, la tripsina soya es la más recomendada.

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ESPECIES LUGAR DE PUNCIÓN

Llamas y Guanacos Yugular en bifurcación

Carnívoros Felinos

Safena, radial, vena caudal “cola”, femoral (interior).

Osos Femoral, safena

Primates Femoral, safena, cefálica brazo

Herbívoros Bongos

Yugular, radical, safena

Elefantes Auriculares en orejas

Rinocerontes Radial, cefálica

Jirafa Yugular

Hipopótamo Auriculares en orejas, cefálica

Equinos Cebras, bongos

Yugular

Antílopes Yugular, radial, safena

Cérvidos, venados Yugular, radia, safena

Pecarí tejón, elefante coatí Cava, tórax, yugular

Aves Plexo braquial, ala, corazón

Avestruces Plexo braquial

Tortuga Corazón

MUESTRA DE ORINA

La orina ha de recogerse inmovilizando al animal, utilizando sonda, de acuerdo con el análisis que se va a realizar en ella. Debe señalarse que una correcta recogida de orina condicionará la adecuada interpretación de los datos obtenidos. En el pasado, y hoy en día, se utiliza todo tipo de recipientes para su recogida, lo que origina un gran número de errores, debido a las interferencias producidas por contaminantes contenidos en los recipientes. Para evitar estos problemas, conviene usar recipientes limpios de plástico desechable, de un solo uso.

CONSERVADORES PARA LAS RECOGIDAS DE ORINA

En las recogidas de orina, de acuerdo con las determinaciones que haya que realizar, deben adicionarse a los recipientes de almacenamiento los conservadores adecuados. Estos tienen diferentes funciones; las principales son reducir la acción bacteriana y la descomposición química, solubilizar los constituyentes urinarios que puedan precipitar y evitar la oxidación de compuestos inestables. En cualquier caso, debe procurarse mantener la orina, en refrigeración, según se va recogiendo. Los conservadores más empleados son el ácido clorhídrico concentrado para las determinaciones de catecolaminas, calcio, y el ácido acético glacial para los 17 cetosteroides, los 17 hidroxicorticoides, estrógenos y cortisol libre. La creatinina, el ácido úrico y el fosfato no requieren conservadores. -MUESTRAS DE ORINA PARA CULTIVOS: Las muestras para cultivos bacterianos de orina (urocultivos) deben recogerse en recipientes estériles. Para la recogida de estas orinas. A veces

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se emplea la cateterización de vejiga y la aspiración suprapúbica; sin embargo, debido a sus complicaciones, es raro su uso.

MUESTRAS DE HECES

En el laboratorio de química clínica, las heces se recogen para dos tipos principales de análisis: determinación de sangre oculta y estudios de contenido de nitrógeno y grasas. El análisis de sangre oculta se realiza con pequeñas porciones de heces, recogidas con una espátula. Las heces se aplican directamente sobre las películas reactivas y se llevan al laboratorio para su análisis. Los estudios microbiológicos (coprocultivo) requieren la recogida de las heces en condiciones estériles. Los recipientes de recogida suelen tener unido al tapón una pequeña cucharilla para extraer las heces en el laboratorio. Para los análisis parasitológicos deben llevarse las muestras lo más rápidamente posible al laboratorio, pues el examen conviene efectuarlo sobre heces frescas, recién emitidas. Cuando no pueda hacerse así, de debe utilizarse un medio de conservación que fije y conserve los protozoos.

MUESTRAS DE LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO

El líquido cefalorraquídeo se obtiene normalmente por punción lumbar, que debe ser hecha siempre por un médico y estando el animal inmovilizado. En caso de punción hemorrágica, la primera muestra es la más hemática, pero si ya existe hemorragia, las tres muestras son igualmente hemáticas. El líquido cefalorraquídeo del primer recipiente o el del tercero se utiliza, en parte, para el recuento de células y el resto se centrifuga y se hace una extensión del sedimento, que se tiñe con Giemsa para determinar la fórmula leucocitaria y con Gram para observar la presencia de microorganismos. El sobrenadante se emplea para las determinaciones bioquímicas. El líquido del segundo recipiente se usa para los cultivos microbiológicos. El LCR debe cultivarse lo antes posible; cuando no pueda hacerse así, debe mantenerse a 4·C en refrigerador hasta que pueda realizarse el cultivo.

MUESTRAS DE EFUSIONES SEROSAS

Una efusión es la acumulación patológica de líquido en cualquiera de los espacios del cuerpo, entre los que se incluyen el saco pericárdico, el espacio pleural, el espacio peritoneal y los espacios articulares. Los líquidos de estos espacios se denominan, respectivamente, líquido pericárdico, pleural, peritoneal (ascético) y articular (sinovial). En condiciones normales, el volumen de estos líquidos es muy escaso, pero en condiciones patológicas puede acumularse en grandes cantidades. Los principales análisis que se realizan en las efusiones serosas son: examen físico, estudio bioquímico, estudio bacteriológico y estudio citológico. Los líquidos se obtienen en varios recipientes estériles, uno de los cuales debe llevar un anticoagulante para el recuento celular total y el diferencial de leucocitos. La técnica de obtención del líquido pericárdico se denomina pericardiocentesis; la del líquido pleural, toracocentesis; la del peritoneal, laparocentesis, y la del articular, artrocentesis.

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MUESTRAS DE LÍQUIDO AMNIOTICO

El líquido amniótico se obtiene por punción abdominal, mediante una técnica denominada amniocentesis. -HISOPOS: Las muestras de material de superficies o exudados para los análisis microbiológicos se recogen con un hisopo, que es una torunda de algodón enrollado alrededor de un palito de madera o papel. Se han comercializado una gran cantidad de hisopos con medios de transporte adecuados. Los hisopos existentes en el mercado consisten en un recipiente cilíndrico, cerrado y esterilizado, que contiene el medio de transporte. Una vez usado el hisopo, se introduce en la cámara que contiene el medio, quedando la muestra sumergida en éste. De esta forma puede mantenerse durante varios días, aunque lo más adecuado es llevarlo cuanto antes al laboratorio para su análisis.

IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS

La identificación de las muestras puede ser directa o indirecta. En la identificación directa, el contenedor de la muestra lleva unas marcas que, en cualquier momento de su procesado, la asocia con el paciente, la identificación indirecta de las muestras, que es la que aún se utiliza en la mayoría de los laboratorios, asocia la posición del contenedor de la muestra a una secuencia, con una lista de colocaciones de forma manual o por medio de un ordenador. Las determinaciones que requieren extraer la muestra del tubo original, como el plasma o el suero, generan marcas secundarias, que deben llevar la misma información que la original. En la actualidad, para evitar confusiones, la mayoría de los analizadores pueden aspirar la muestra del tubo original de extracción, con lo que no es necesario sacar la muestra de su contenedor original y generar marcas secundarias en otros recipientes. Los sistemas de identificación directa más utilizados son los que se adhieren a los tubos de extracción o a los recipientes donde se coloca la muestra. De todos ellos, el más empleado es el sistema de código de barras. En los métodos de identificación indirecta de las muestras, pueden diferenciarse las colocaciones seriadas y las colocaciones posicionales. En los procedimientos de colocación seriada, las muestras son alimentadas secuencialmente, de forma que la misma muestra normalmente tiene posiciones diferentes en varias series analíticas.

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

El tiempo que transcurre entre la obtención de las muestras y su llegada al laboratorio suele ser corto, por lo que para la mayoría de las determinaciones no son necesarias condiciones especiales de transporte. Sin embargo, algunas de ellas requieren la refrigeración de la muestra desde el momento de la extracción. El transporte de los especímenes desde los lugares de recogida hasta el laboratorio suele hacerse en gradillas. En algunos centros, debe tenerse especial cuidado y fijar bien los tubos de extracción dentro del contenedor, para evitar su movimiento, lo que puede producir hemólisis. - Considerar el tiempo de vida medio para cada tipo de muestra. - La mayoría de muestras para que sean validas deberán ser refrigeradas. - No es recomendable agregar conservadores químicos. - Las muestras alteradas o afectadas no son útiles para efectuar estudios de laboratorio. - Los recipientes para contener las muestras deberán de ser de fácil manejo y apropiados para este uso.

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- Evitar al máximo posible que la muestra se descomponga por: desecación, evaporación, hemolisis o contaminación.

ENVÍO DE LA MUESTRA

- Remitirla lo más pronto posible al laboratorio. - Identificarla adecuadamente. - Tapar el recipiente que la contenga herméticamente o con tapón de rosca. - Considerar la cantidad de muestra la suficiente, para que se efectúen los estudios solicitados. - Anexar una reseña de la historia clínica con estudios que se solicitan y diagnóstico presuntivo. El envío de las muestras de unos laboratorios a otros debe hacerse en condiciones adecuadas. Los recipientes donde vayan las muestras (polietileno o polipropileno). Estos se introducen en los contenedores de transporte (sobres especiales o cajas). Las muestras que necesiten congelación deben enviarse en recipientes de poliestireno expandido con hielo seco o bolsas congeladoras.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Aspectos importantes del trabajo de los laboratorios es la preparación de las muestras. La mayor parte de las determinaciones hematológicas se realizan en sangre total anticoagulada, obtenida con EDTA, y no requieren un tratamiento previo, pueden almacenarse hasta 24 horas a 4·C. Las extensiones para la fórmula leucocitaria han de hacerse lo antes posible. La sangre obtenida con citrato para la medida de la velocidad de sedimentación globular puede mantenerse de 4 a 5 horas a temperatura ambiente. Las determinaciones bioquímicas se realizan en suero o plasma sanguíneo. Cuando no se ha añadido anticoagulante a la sangre extraída, debe dejarse que se complete la coagulación y se retraiga el coágulo antes de centrifugar, ya que si no, la formación de fibrina puede posteriormente causar problemas de obstrucción en pipetas y en las puntas de aspiración de las muestras de los analizadores. La sangre se coagula normalmente entre 20 y 40 min. La separación de la fracción líquida de la sangre de los componentes celulares se realiza por centrifugación a 1.000-1.500 x g durante 10 min. Las muestras para determinaciones de pH y gases deben colocarse en un baño de hielo y analizarse lo más rápidamente posible. Cuando algún análisis no pueda realizarse en el mismo día de la extracción, para las determinaciones bioquímicas, debe taparse el tubo y guardarse en refrigerador a 4·C o congelarse a -20·C hasta su análisis. Obtenida la muestra adecuada deben repartirse a las diferentes secciones de laboratorio. Esta operación se realiza generalmente, de forma manual. Para evitar trasvases que pueden dar lugar a errores, muchos analizadores automáticos pueden utilizar los mismos tubos de extracción, tal y como se ha señalado antes. Recientemente han aparecido en el mercado sistemas para la preparación de las gradillas para las diferentes secciones analíticas de laboratorio. Los más corrientes son dispositivos con pipetas capaces de moverse en dos direcciones. También se han fabricado robots capaces de manipular los tubos con las muestras. Estos robots tienen “Manos” y “Dedos” que manejan los tubos y distribuyen las muestras en las gradillas de cada sección analítica de laboratorio.

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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

El veterinario al examinar al paciente y realizar la historia clínica completa debe escoger los procedimientos indicados de laboratorio, para interpretar con mayor facilidad los resultados, no dejando de hacer énfasis en ciertos aspectos tales como: 1.- Variaciones normales Para reconocer los valores normales, el clínico tiene que conocer los promedios y variaciones que se consideran dentro de los límites de normalidad para cada especie, puesto que existen variaciones fisiológicas, propias a su metabolismo y al ambiente. 2.- Especificidad de un examen No debe olvidarse que casi no hay resultado de laboratorio, que siendo este anormal sea patognomónico para una sola enfermedad.

LIMITES DE UN EXAMEN

En este caso el médico se debe familiarizar con las técnicas que se usan en el laboratorio, porque muchas veces la interpretación se basa en la precisión inherente a la prueba (es decir se debe contar con información sobre la exactitud de las técnicas de laboratorio). Por lo que el clínico especialista debe usar el laboratorio solo como un auxiliar en el diagnostico y no esperar que el laboratorio haga el diagnóstico, en otras palabras lo puede usar para apoyar o eliminar diagnósticos posibles. Para terminar con la participación en el tema se diría que en la toma de muestras para animales de zoológico podrá haber muchas diferencias en aspectos, factores, errores y variables que puedan interferir. Pero para un profesionista no deben existir tales diferencias en su trabajo cotidiano ya que cualquiera que pudiera ser su paciente requiere de todos sus sentidos y del máximo de responsabilidad para que sus habilidades y destrezas sean puestas a funcionar en el momento en que los pacientes lo requieran, ya que no deben existir clases o niveles de calidad en los servicios que se prestan, convirtiéndose esta tarea doblemente importante, ya que cuando se trabaja con animales en peligro de extinción, la extinción será permanente y definitiva.

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CONTENCION FÍSICA Y QUÍMICA DE FAUNA SILVESTRE

M. EN C. ARTURO LUNA BLASIO

INTRODUCCION.

La contención de animales salvajes tanto en vida silvestre (in situ), como los que se encuentran alojados en cautiverio (ex situ), tal es el caso de las unidades de manejo para la conservación de la vida silvestre (UMA’s) y los parques zoológicos, es de vital importancia para un sinnúmero de procedimientos, entre los que destacan:

El estudio cercano de las enfermedades, realizando el examen físico del individuo o grupo de animales en cuestión.

Aplicarles un sistema de identificación (anillos, microchip, aretes, etc.) La captura para transportarlos a otros sitios, generalmente bajo un previo entrenamiento. Nos facilita la toma de muestras, ya sea en un monitoreo durante su cuarentena o para

verificar su estado de salud o también como medio de diagnóstico cuando sospechamos de un problema patológico.

Cada método tiene sus peculiaridades para ser empleado y particularmente cuando se requiere tomar una muestra para análisis clínicos habrá que analizar si el ejemplar en cuestión está recién capturado, ha recibido inmovilizaciones previas, nació en cautiverio o incluso si está influenciado bajo el tipo de aprendizaje denominado “impronta” o “troquelado” con el humano, situación (esta última) que facilita el manejo. En conclusión, para poder realizar un muestreo en este tipo de animales es indispensable elegir y emplear el método de inmovilización idóneo a las circunstancias.

PRECAUCIONES ANTES DE SELECCIONAR UN METODO DE INMOVILIZACION.

1. Tener seguridad para el personal médico y de apoyo que interviene durante el proceso.

2. Que sea seguro para el animal. 3. Observar constantemente los efectos físicos, químicos y conductuales, particularmente cuando se empleen agentes inmovilizantes. 4. Los animales no deben ser inmovilizados en un ambiente con temperatura superior a 32º C y humedad relativa arriba del 70%

MÉTODOS DE MANEJO FÍSICO.

1. Mecanismos fisiológicos. Podemos emplear elementos como la voz y la manipulación con las manos (señales) como parte del entrenamiento con algunos animales en donde la contención química se complica, tal es el caso de animales cuyo volumen corporal es considerable (elefantes, cebras, jirafas, hipopótamos, rinocerontes y varios artiodáctilos). La voz es una herramienta frecuentemente usada por los manejadores de animales por ser fácil de emplear; diversos estados emocionales son reflejados a través de la voz y son percibidos por los animales. Otro mecanismo para restringir la actividad de un animal es mediante el movimiento de las manos, ya que con diversos ademanes el animal puede obedecer una orden o instrucción a realizar.

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Es notable el establecimiento en animales salvajes de una dominancia entre el manejador y el animal; tanto el empleo de la voz, como el movimiento de las manos es utilizado en ejemplares con manejos previos, ejemplo de ello, son los primates que se ocupan en bioterios y laboratorios de investigación biomédica, los animales de circo e incluso los mamíferos marinos, éstos últimos entrenados para espectáculos, mediante señales y sometidos al aprendizaje de diversas rutinas mediante condicionamiento operante responden a las instrucciones que reciben de sus entrenadores e incluso de esta manera, también obtienen las muestras para laboratorio, cuando están enfermos o en sus chequeos clínicos periódicos. Hoy en día ha surgido el entrenamiento por contacto protegido mediante el condicionamiento operante, como una herramienta en el manejo de animales en cautiverio, ya que el animal participa de forma voluntaria para la realización de diversos procedimientos clínicos de manera rutinaria, como es el muestreo de sangre (fig. 1), exámenes físicos, vacunaciones, medicación, etc.; todo lo anterior bajo ensayo y error siempre con un refuerzo positivo (obtención de alimento).

2. Disminución de los sentidos:

a) Caperuzas en aves rapaces (animales con manejo previo). b) Cubiertas en aves corredoras u otro tipo de aves.

La reducción o eliminación de la comunicación o campo visual de un animal con el medio que le rodea, es una importante técnica de restricción física. El ejemplar con los ojos cubiertos puede permanecer quieto por un largo periodo de tiempo, siempre y cuando no se realicen procedimientos que le causen demasiado estrés. Este método es ocupado en aves rapaces, mediante el empleo de las llamadas caperuzas, sobre todo en aquellas entrenadas para la cetrería; también se ocupan fundas para la cabeza en las

Fig. 1 Muestreo de sangre de un ejemplar de rinoceronte

entrenado bajo condicionamiento operante.

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aves corredoras (avestruz, ñandú y emú). Se pueden ocupar otro tipo de objetos para impedir su visión de las aves como son los guantes, tela, etc., siempre con el debido cuidado de no obstruir su respiración. Los sonidos excesivos de motores, vehículos o ruidos extraños pueden inquietar al animal, por lo que se recomienda realizar los manejos en silencio, e incluso algunos animales pueden reaccionar negativamente cuando son tocados por el hombre, mostrando conducta agonística como respuesta, por lo que habrá que extremar precauciones. 3. Confinamiento Cajas de transporte de madera y metal. Jaulas de compresión: a) Móvil chica. b) Móvil grande.

c) Fija de concreto y metal. Un confinamiento aceptable varía considerablemente, dependiendo de la especie, edad y situación, por ejemplo: un animal adulto que se captura en vida libre y se le confina inadecuadamente para su transportación, es una situación que le causa mucho estrés e incluso puede causarle la muerte. El estrés o tensión ambiental que causa el confinamiento puede ser gradualmente intensificado mediante el movimiento, a través de un entrenamiento, de ejemplares a cajas o encierros cada vez más pequeños, pero acordes a su talla. Existen diversos tipos de confinamiento: a) Cajas de madera o metal. Utilizadas generalmente para transportar ejemplares de un sitio a otro; deben tener una tapa deslizable en uno de los extremos que permita la salida y entrada del animal, sin poner en riesgo al operador. Deben tener un sistema que permita ventilar adecuadamente y orificios para vigilar y suministrar agua y alimento, en caso necesario. b) Fija. Es un tipo de confinamiento que incluye las llamadas jaulas de compresión, que en el caso de ser fijas se hallan dentro de los albergues, en el área del dormitorio; se caracterizan por tener una pared que se mueve a través de poleas y una manivela, lo que hace que al ponerlas en funcionamiento compriman contra la pared opuesta al animal y de esa manera podemos realizar diversos procedimientos clínicos e incluso cirugías menores o curaciones; éstas cajas o jaulas se pueden ocupar con animales de volumen corporal considerable de hasta 150 o 200 Kg (Fig. 2). c) Móviles. Incluye las jaulas de compresión que pueden tener ruedas, permitiéndonos el movimiento hacia los albergues o áreas en donde se requiera el confinamiento de un animal; las hay de diversos tamaños: pequeñas, para algunos primates de poco peso o carnívoros, la compresión se realiza manualmente; y también las hay grandes para animales de mayor talla. Escoger la jaula de compresión más adecuada, debe ser tomando en cuenta las variantes que existen entre los animales entre su conformación anatómica y sus requerimientos fisiológicos y así realizar el procedimiento con mayor seguridad.

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4. Sujetadores o domadores. Los domadores o sujetadores son herramientas muy útiles para el manejo físico de animales salvajes; son tubos largos (1.5 a 2 m.) y con cuerdas de nylon o cable en uno de sus extremos, permiten su colocación en el cuello del ejemplar que se va a manejar, mientras que en el otro extremo podemos jalar y ajustar el cierre de la cuerda o cable, siempre cuidando de no ajustarlo demasiado para no producirle asfixia; se ocupan para el manejo de pequeños carnívoros (mapaches, coatís, coyotes, felinos, etc.). 5. Redes. Las redes son uno de los equipos de manejo físico de mayor importancia y uso frecuente, tanto en animales de vida libre para su captura, como para la contención en el cautiverio, permitiéndonos realizar con cierta facilidad algunos procedimientos como son: la identificación, medicación, revisión clínica, aplicación de inyecciones, obtención de muestras para laboratorio, entre otros. Existe una amplia variedad de redes y tamaños para el manejo de especies, hay redes para la captura en vida libre de aves (ornitológica) y mamíferos y redes fijas a un tubo y unidas a un aro, útiles para la contención de ejemplares en el cautiverio. Los mamíferos marinos en particular, ya sean los pinnípedos o los cetáceos son manejados comúnmente a través del uso de redes (fig. 3); cuando es necesario su manejo para transporte, entonces los cetáceos (delfines, orcas) son colocados en unas camillas de lona o red con orificios laterales, que permiten el libre movimiento de sus aletas, mientras que los pinnípedos pueden transportarse en las propias redes.

Fig. 2 Tigre de bengala en una jaula de compresión fija

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6. Barreras Físicas a) Plásticos opacos. b) Láminas. c) Escudos. Las barreras físicas pueden ser usadas para protección entre un manejador y el animal; entre los artefactos que se pueden ocupar tenemos los escudos, el cual consiste en una lámina de madera o de plástico o acrílico rígido equipada con un asa al reverso que permite su manipulación. Los escudos de madera o plástico se pueden usar con reptiles no venenosos, algunos mamíferos pequeños, aves, primates de talla pequeña o mediana y algunos roedores, por ejemplo, para movilizarlos de su albergue hacia una jaula de transporte o de compresión o viceversa. Otras barreras empleadas son las mantas o plásticos opacos, las cuales protegen al manejador de las patadas o embestidas con los cuernos o astas; se utilizan en el caso de varias especies de artiodáctilos pequeños y medianos, que permiten conducir grupos numerosos de animales de un sitio a otro o hacia una manga de manejo. 7. Fuerza Física: a) Guantes de cuero, carnaza. b) Manual. Muchos procedimientos que se realizan en los animales salvajes requieren el uso de las manos, sin embargo, debemos tomar una decisión acertada de cuando utilizarlo, por nuestra propia seguridad, dependiendo del tipo de animal a manejar. La cantidad de fuerza que vamos a aplicar es muy importante, ya que no será lo mismo manejar una musaraña de 50 g. que un primate de 10 kg. Por ejemplo; algunos de los daños que podemos causar son la sofocación e incluso asfixia por presión en el cuello o tórax o bien fracturas de miembros o costillas por aplicar demasiada fuerza. Para mayor protección es recomendable emplear guantes, ya sea de algodón o piel, para evitar algún daño por mordidas o presión con las garras, por ejemplo cuando manejamos aves rapaces, roedores y algunos primates de talla pequeña o media, aunque existe el riesgo también de cometer algún error porque disminuye nuestro tacto con los guantes.

Fig. 3 Contención de un delfín con red.

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Son muy numerosas las especies en las que podemos emplear la fuerza física, como son la mayor parte de especies de aves, algunos reptiles, como es el caso de las tortugas, cocodrilos jóvenes, la mayoría de saurios, incluyendo al Heloderma o monstruo de Gila, que a pesar de ser el único saurio venenoso, debido a sus movimientos lentos puede ser manejado por este método. Las serpientes del tipo constrictor, se pueden manejar mediante la fuerza física, para lo cual se toma la cabeza empleando los dedos medio y pulgar y el cuerpo con la otra mano, impidiendo que el animal enrolle nuestro brazo. El grupo de mamíferos que puede ser inmovilizados a través de la fuerza física son: roedores, insectívoros, quirópteros (fig. 4), carnívoros, marsupiales, varias especies de primates, desdentados y lagomorfos, además de las crías de gran volumen corporal, evitando el empleo de la inmovilización química.

8. Manejo de serpientes. Para el caso específico de algunos reptiles, particularmente las serpientes venenosas, requieren de un manejo especial, este se realiza a través de los llamados ganchos herpetológicos, los cuales están diseñados acorde a la anatomía de los ofidios, permitiéndonos su manejo y con el auxilio de otras herramientas, como los limpiadores de vidrios y tubos, podemos manipular su cuerpo y utilizar las manos para diversos procedimientos clínicos e incluso extraer su veneno. Finalmente, es importante mencionar que existen otros tipos de confinamiento que se ocupan en las propias serpientes, algunos reptiles, pequeños mamíferos y aves, en donde se pueden introducir dentro de tubos de plástico o acrílico transparente y nos permiten realizar estudios radiográficos, aplicación de inyecciones, obtención de muestras para laboratorio o cualquier otro procedimiento menor.

Fig. 4 Contención mediante fuerza física de un

microquiróptero.

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MÉTODOS Y EQUIPO DE MANEJO QUÍMICO

CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS PARA CONTENCIÓN QUÍMICA Y ADMINISTRACIÓN DE

FÁRMACOS

Los métodos de contención química y para la administración de fármacos como pueden ser por ejemplo los antibióticos, desparasitantes, analgésicos, etcétera, se clasifican de la siguiente manera: 1. PASIVA: A través de la administración de cápsulas, grageas, tabletas, soluciones. La administración directa se puede llevar a cabo de manera manual colocando el fármaco en la boca, o bien empleando tubos o sondas, mientras que la administración indirecta se puede realizar depositando el fármaco o la sustancia química ya sea en el agua de bebida o en el alimento; dicho alimento tendrá que ser de gran predilección por parte del animal, para que lo ingiera con gran voracidad y no detecte la presencia del fármaco o sustancia química depositada. 2. ACTIVA:

La administración activa se puede llevar a cabo de manera manual directamente, empleando jeringas hipodérmicas, a través de bastones o también denominado telecisto (fig. 5) o teniendo al animal parcialmente inmovilizado en una jaula de compresión o red por ejemplo. Otro método de contención o de administración de fármacos es de manera remota o a distancia, para ello ocupamos: a) Propulsores Potentes y medianos: rifle y pistola con cargas explosivas de largo alcance. b) Propulsores bajos: disparadores con tanques de bióxido de carbono comprimido y dardos con aire a presión.

Fig. 5 Empleo del telecisto con un oso negro

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Dentro de los propulsores potentes y medianos tenemos a los rifles y pistolas que ocupan cargas explosivas, a base de bióxido de carbono comprimido para impulsar los dardos que contienen las sustancias químicas y que son ocupados principalmente para llevar a cabo captura de animales salvajes en vida libre y pueden fácilmente cubrir distancias que van desde 15 hasta 80 metros máximo, variando de acuerdo a la potencia de carga que utilicemos. Los dardos que se ocupan para estos equipos son metálicos y presentan diversas capacidades que van desde 1 hasta 15 ml., requieren agujas metálicas atornillables; están compuestos por: una cámara de sustancias, un émbolo y cola direccional (fig. 6); ocupan también cargas explosivas, cuya función es impulsar el émbolo al momento en que el dardo impacta en el animal.

c) Propulsores bajos: Rifle, sistema Teleinyect que emplean dardos (con aire a presión) Este tipo de propulsores ocupan cerbatanas conectadas a un rifle o a un disparador, que en ambos casos se integra a un compresor de aire o bien ocupan un tanque con bióxido de carbono comprimido, el cual dependiendo de la distancia que se desee cubrir, proporcionará la cantidad de libras de presión que se requieren; este equipo normalmente puede cubrir distancias de hasta 30 metros en promedio. d) Propulsores Suaves o de Aliento: Cerbatanas

Son denominados como propulsores bajos o de aliento, porque el envío de los dardos a través de la cerbatana, se realiza con el aire expulsado por una persona; la potencia irá en proporción a la capacidad torácica del operador, por lo tanto las distancias que se cubren normalmente son de hasta 5 o 10 metros. Los dardos que se ocupan tanto para los propulsores bajos en el sistema Teleinyect, o Dainyect como con los propulsores bajos o de aliento están compuestos de las siguientes partes: capuchón de la aguja; aguja con la punta obturada y orificio de salida lateral; tapón elástico corredizo; una

Fig. 6 Dardo con carga explosiva mostrando: a) cola

direccional, b) émbolo con carga explosiva y c) aguja

atornillable

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cámara de sustancias químicas; un émbolo; una cámara de aire comprimido con un tapón y una cola direccional (fig. 7). El equipo también se compone de algunos elementos anexos como son un pequeño gancho para remover el tapón de la cámara de aire comprimido y un conector para el paso de sustancias de una jeringa convencional hacia la cámara de sustancias químicas del dardo o para aplicar aire.

La capacidad de los dardos es variable, los más comunes son de 1, 3, 5 y hasta 10 ml, por lo que será necesario emplear fármacos o agentes inmovilizantes muy concentrados, ya que no es recomendable administrar sustancias químicas en grandes cantidades aplicando varios dardos.

La forma de preparar los dardos lleva una serie de pasos que son los siguientes: 1. El fármaco o agente inmovilizante que se va a emplear se carga en una jeringa convencional,

en condiciones asépticas. 2. Se remueve el tapón de la cámara de aire comprimido del dardo, introduciendo un gancho -

elaborado ex profeso para ello- a través del orificio que comunica con dicha cámara. 3. Por medio de un conector se une con firmeza la jeringa convencional (sin la aguja) y ya

cargada con el fármaco a la cámara de sustancias del dardo. 4. Una vez unidas la jeringa y el dardo, se empuja el émbolo de la jeringa convencional para

permitir el paso del fármaco a la cámara de sustancias del dardo, sosteniéndolos con firmeza para evitar un accidente.

5. Se coloca la aguja del dardo, conectándola al orificio de salida de la cámara de sustancias

químicas y el tapón corredizo se jala para cubrir el orificio de salida lateral de la aguja; se deberá poner mucho cuidado en este procedimiento para evitar accidentes, como puede ser un pinchamiento con la aguja o la salida del medicamento, que en ocasiones son muy tóxicos o potentes, con efectos lamentables para el humano.

6. Se coloca el capuchón que protege la aguja del dardo, esto con la finalidad de evitar algún otro

accidente como puede ser la expulsión prematura del medicamento, por falla del tapón

Fig. 7 Dardo con aire a presión mostrando: a) cámara de aire a presión con

tapón hermético, b) émbolo y c) aguja con tapón corredizo

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corredizo o la expulsión de la aguja (si no quedó bien puesta), todo esto antes de introducir aire a la cámara de aire comprimido del dardo; dicha cámara se une mediante un conector a una jeringa convencional (de 10 o 20 ml.) cargada con aire. Se introduce la cantidad de aire que sea necesaria hasta que encontremos resistencia.

7. El paso final de preparación del dardo es la colocación de la cola direccional, ocluyendo el

orificio de salida de la cámara de aire comprimido. 8. Una vez preparado el dardo retiramos el capuchón protector de la aguja, lo introducimos a la

cerbatana y ésta a su vez se conecta al rifle o al disparador y de acuerdo a la distancia que necesitemos cubrir aplicamos una determinada cantidad de libras de presión, de acuerdo a la tabla de especificación del equipo Teleinyect o bien expulsamos el dardo acorde a la capacidad torácica.

El principio que rige el funcionamiento de los dardos consiste en que en el momento que el dardo es expulsado a través de la cerbatana e impacta la aguja en la masa muscular del animal el tapón corredizo se desliza y debido a una presión positiva que ejerce el aire contenido en la cámara de aire comprimido, el émbolo del dardo es empujado permitiendo la salida de la sustancia química, depositándola en el músculo del animal. Lo más importante en este procedimiento es que el dardo se aloje en una masa muscular adecuada, esto variará de acuerdo a la especie animal que vaya a ser inmovilizada y su condición corporal, pero las regiones que generalmente se consideran idóneas para el impacto de los dardos son la cervical media (tabla del cuello), la braquial lateral y las femorales craneal y caudolateral (fig. 8).

Por lo tanto, se deberá tener una gran práctica sobre todo cuando se realiza un disparo a gran distancia, ya que un dardo mal dirigido puede impactar en sitios que pueden poner en riesgo la

Fig. 8 Impacto de un dardo en la región braquial lateral en un

venado cola blanca

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vida del animal como podría ser la cabeza, la región cervical ventral y las cavidades torácica o abdominal. Finalmente, es importante advertir que durante una inmovilización se pueden presentar efectos adversos como pueden ser: 1. Por el equipo: jeringas inadecuadas o no esterilizadas, agujas sin filo, cargas de bióxido de

carbono o de los dardos metálicos insuficientes, etc.

2. Fallas del operador: inyección en sitios inadecuados, mal cálculo de la distancia y lesiones por impacto muy fuerte en el animal.

3. Condiciones diversas: viento, calor, estrés y humedad relativa muy elevada.

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DISPOSICIÓN FINAL DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICOS-INFECCIOSOS (DISPOSICIÓN FINAL DE CADÁVERES Y MUESTRAS BIOLÓGICAS)

Zamora Espinosa José Luis

Valladares Carranza Benjamín* Integrantes del Cuerpo Académico de Salud Animal

INTRODUCCIÓN

En nuestra profesión existen actividades inherentes a la práctica profesional, consideradas de alto riesgo, en particular, nos referimos a que existe un gran problema higiénico-sanitario en la disposición final tanto de los animales procedentes de una necropsia realizada en una sala de necropsia o en campo como de muestras biológicas que son procesadas en los laboratorios de diagnóstico, considerados actualmente como residuos peligrosos biológico infecciosos, debido a que pueden contener bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infección o que pueden contener toxinas producidas por microorganismos que provocan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente. Lo que en realidad un problema, porque de su mala disposición derivan una serie de trastornos que afectan no sólo al personal involucrado en esta tarea, sino además representan un riesgo potencial en el medio ambiente en donde pueden estar involucrados en diversas formas la población animal, la población humana y el medio ambiente.

En este sentido la Secretaría de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca tiene como objetivo preservar y restaurar el equilibrio ecológico, así como la protección al ambiente.

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Sus disposiciones tienen por objeto propiciar y garantizar el derecho de toda persona a vivir en un ambiente adecuado para su desarrollo, salud y bienestar; así como la prevención y el control de la contaminación del aire, agua y suelo. La misma ley en su capítulo IV en prevención y control de la contaminación del suelo en su Art. 134 fracción V, menciona: En los suelos contaminados por la presencia de materiales o residuos peligrosos, deberán llevarse a cabo las acciones necesarias para recuperar o restablecer sus condiciones, de tal manera que puedan ser utilizados en cualquier tipo de actividades previstas por el programa de desarrollo urbano o de ordenamiento ecológico que resulte aplicable, para el predio o zona respectiva. No deberán emitirse contaminantes o material peligroso que al incorporarse o actuar en la atmósfera, suelo, flora, fauna, o cualquier elemento natural ocasionen desequilibrios ecológicos o daños al ambiente. La Secretaría establece la clasificación de las actividades que se consideran altamente riesgosas, en virtud de las características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, flamables o biológico infecciosas para el equilibrio ecológico o el ambiente de los materiales que se generan o manejen en los establecimientos industriales, comerciales o de servicios, considerando además, los volúmenes de manejo y la ubicación del establecimiento. La Secretaría promoverá programas tendientes a prevenir y reducir la generación de residuos peligrosos, así como a estimular su reuso y reciclaje. La responsabilidad del manejo y disposición final de los residuos peligrosos corresponde a quien los genera, excepto en aquellos casos en que se contraten empresas autorizadas por la Secretaría para el manejo y disposición final de estos residuos, tomando estas últimas la responsabilidad para tal actividad.

CLASIFICACIÓN DE LOS ESTABLECIMIENTOS GENERADORES DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO INFECCIOSOS

NIVEL I 1.- Clínicas de consulta externa y veterinarias de pequeñas especies. 2.- Laboratorios clínicos que realicen de 1 a 20 análisis al día. NIVEL II 1.- Hospitales que tengan de 1 a 50 camas. 2.- Laboratorios clínicos que realicen de 21 a 100 análisis al día.

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NIVEL III 1.- Hospitales con más de 50 camas. 2.- Laboratorios clínicos que realicen más de 100 análisis clínicos al día. 3.- Laboratorios para la producción de biológicos. 4.- Centros de enseñanza e investigación. 5.- Centros antirrábicos.

El equipo mínimo de protección personal para quien efectúe la recolección, consistirá en uniforme completo, guantes y mascarilla o cubreboca. Si se manejan residuos líquidos se deberán usar anteojos de protección o careta.

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Los envases deben estar etiquetados con la leyenda que indique “PELIGRO, RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO INFECCIOSOS”, y rotulados con el símbolo universal de RIESGO BIOLÓGICO.

SÍMBOLO UNIVERSAL DE RIESGO BIOLÓGICO Fuente: NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995.

Esto se respalda en la Ley Federal sobre Metrología y Normalización en su Art. 76, que, indica las características de las marcas y contraseñas oficiales que deberán llevar los productos sujetos al cumplimiento de las Normas Oficiales Mexicanas. Los residuos peligrosos biológico infecciosos envasados deberán almacenarse en contenedores con tapa y rotulados, para lo cual se destinará una área específica cuyas características deberán regirse por la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995. El período de almacenamiento temporal a temperatura ambiente estará sujeto al tipo de establecimiento, como sigue: NIVEL I: Hasta 7 días NIVEL II: Hasta 96 horas NIVEL III: Hasta 48 horas

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Los residuos de necropsias deberán conservarse a una temperatura no mayor de 4º C. Una vez terminada la necropsia, de ser posible es importante contar con un incinerador contiguo a la sala de necropsias. En el caso de que los residuos sean transportados a un predio distinto a aquél en el que se generaron, se ajustará a lo dispuesto en la normatividad aplicable al transporte terrestre de residuos peligrosos, de manera muy conservadora podemos sugerir: si los desechos tienen que ser transportados, la ruta que deba emplearse será la que ofrezca menos riesgo de propagación de los agentes patógenos aun sea a poca distancia, es recomendable limpiar y desinfectar después de cada operación con un desinfectante eficaz, debido al peligro de contaminación evidente particularmente en casos de enfermedades infecciosas, en especial si se trata de enfermedades exóticas. Los residuos peligrosos biológico infecciosos deberán ser tratados por métodos físicos o químicos, los cuales serán autorizados por la Secretaría del Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, a través del Instituto Nacional de Ecología y deberán cumplir los siguientes criterios generales: Deberá garantizar la eliminación de microorganismos patógenos y deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico infecciosos. Disposición final. Una vez tratados e irreconocibles, los residuos peligrosos biológicos infecciosos se eliminarán como residuos no peligrosos. En localidades con una población hasta de 100,000 habitantes, se podrán disponer los residuos peligrosos biológico infecciosos sin tratamiento en celdas especiales, conforme a lo establecido en el Anexo 2 de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995. El diseño, la construcción y la operación de las celdas especiales serán autorizadas por la Secretaría de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, a través del Instituto Nacional de Ecología.

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Los cadáveres de los animales muertos por enfermedad, sacrificados sanitariamente o decomisados, así como sus órganos y desechos de orina u otros exudados, representan, una fuente potencial de agentes etiológicos y por lo tanto deben ser desactivados apropiadamente, utilizando diferentes procesos que dependen de recursos económicos, infraestructura y características particulares. Estos procedimientos aseguran el desecho de estos residuos biológico infecciosos potenciales que podrían servir para perpetuar la enfermedad. Esta actividad de realizar una disposición final adecuada es factible en clínicas, veterinarias, centros de control y vigilancia epidemiológica de la rabia y centros de enseñanza e investigación. Sin embargo se dificulta en aquellos lugares muy alejados en donde el propietario o veterinario no disponen de lo mínimo para acatar esta normatividad y debe implementar otras medidas que no afecten el medio ambiente y que al mismo tiempo no pongan en riesgo la salud animal, ni existan repercusiones en la salud pública. Debido a lo anterior se hace necesario considerar aspectos estéticos, sanitarios y económicos.

Estético. No es nada agradable el ver y oler un cadáver en estado de putrefacción. El Reglamento de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la protección al ambiente en su Art. 5 13 para la Protección de la Atmósfera considera los siguientes criterios: Fracción I; la calidad del aire debe ser satisfactorio en todos los asentamientos humanos y regiones del país; y en su Fracción II, en las emisiones de contaminación a la atmósfera que sean de fuentes artificiales o naturales fijas o móviles, deben ser reducidas o controladas para asegurar una calidad del aire satisfactoria para el bienestar de la población y el equilibrio ecológico.

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Sanitario. La inadecuada disposición final de residuos peligrosos biológicos infecciosos, puede ser la fuente de contagio de enfermedades graves, tales como el carbunco, propagado por moscas, el viento, el polvo y las corrientes de agua.

Económico. Puede tener como consecuencia la pérdida de otros animales que se contagien con los residuos contaminados. Sin embargo sabemos que la solución del problema no es sencilla, pero se agrava más con las prácticas inadecuadas que se realizan con los residuos peligrosos, ya sea por ignorancia o irresponsabilidad del personal técnico. Regularmente el destino para la degradación de los residuos peligrosos biológicos infecciosos, principalmente animales muertos se da en los siguientes términos: 1. Quedan abandonados en el lugar donde han muerto, a merced de perros y aves de rapiña. 2. Son enterrados a poca profundidad y sin tomar precauciones, lo que permite a los perros y cerdos que al poco tiempo pongan los despojos al descubierto. 3. Intentan incinerar el cadáver y realmente sólo lo hacen en forma parcial y superficial. 4. Para las muestras biológicas, tienen una disposición final de forma rutinaria sin considerar el riesgo biológico que esto implica como impacto ambiental. La disposición final de residuos peligrosos biológico infecciosos, constituye un problema serio en las explotaciones ganaderas, un animal enfermo que muere o procede de una necropsia en campo representa una fuente de infección, la cual puede ser propagada por otros vectores a grandes distancias; ser empleada como alimento o producir impacto ambiental en lugares como fuentes de agua, en el microclima, macroclima y suelos cultivados. Por lo anterior debemos realizar propuestas realistas para estos casos sugiriendo las estrategias siguientes: Enterramiento. Las recomendaciones siguientes se deberán adecuar a la normatividad citada. Se utiliza cuando el animal haya muerto por una enfermedad no esporogénica, ya que las esporas pueden sobrevivir durante varios años en los cadáveres enterrados. Se debe realizar en sitios adecuados sin desplazar el cadáver largas distancias, cuyas características son: Alejados de asentamientos humanos, establos, pozos, ríos, corrales; el terreno debe ser seco, alto y no inundable, ausencia superficial de mantos acuíferos no laborable y no rocoso.

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Desde el punto de vista de salud pública no debe estar cerca de suministros de aguas municipales ni producir contaminación ambiental. Las medidas de las fosas que se recomiendan son: de 1.20 m de ancho por 1.20-1.60 m de longitud y 1-2 m de profundidad. Antes de colocar en cadáver se agrega una capa de cal viva (hidróxido de calcio), se deposita el cadáver y se cubre con cal viva, se tapa con tierra y se compacta, posteriormente se agrega una capa de 8 a 10 cm de espesor de cal viva, para entonces terminar adicionando tierra hasta cubrir el agujero. Ya que se tapó completamente se apisona ésta para compactar el terreno y evitar filtraciones pluviales y por ello el drenaje de posibles contaminaciones a otros lugares. Se queman los pastos en donde cayó el animal y se desinfecta el material y equipo que haya estado en contacto con el cadáver, lazos, palas etc. Aquellos animales que murieron de fiebre carbonosa, deben ser enterrados a una profundidad mínima de 2 m y cubiertos con cal viva, para finalmente cubrirlo con tierra.

Enterramiento

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Para el enterramiento en masa se calcula un espacio de un metro cuadrado de piso por un animal de unos 500 kg o por 8 cerdos adultos u 8 ovejas. Si son depositados en cementerios o para animales, estos deben ser señalados y cercados. Incineración o cremación. La selección del lugar para esta actividad debe contar con las siguientes características: accesibilidad a vehículos pesados o semipesados, fuera de la vista pública, lejos de edificios, pueblos o ciudades, lejos de material combustible, etc. Este tipo de proceso consiste en convertir la materia orgánica a cenizas, además de destruir todos los agentes etiológicos biológicos en forma directa e inmediata, es uno de los métodos más seguros y adecuados. En la destrucción de un gran número de cadáveres en los focos de enfermedades infectocontagiosas peligrosas, a menudo se emplea la incineración colectiva directamente en las fosas cuyas dimensiones son de acuerdo con el número y tamaño de los animales que se van a incinerar.

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Estos deben quemarse dentro de una zanja construida en orientación de preferencia con el eje mayor de la misma y en dirección de los vientos dominantes para que facilite un fuego vivo todo el tiempo que dure la operación, colocando madera u otro material resistente que sea capaz de sostener el peso de los cadáveres y la acción del fuego, estos se alinean encima de la cama, alternando la cabeza de un animal al lado de la cola del otro, cuando la incineración es colectiva las zanjas se rellenan con llantas, paja, leña o carbón mojado con petróleo o gasolina, con el mismo material se cubren los cadáveres y se enciende el combustible. El tiempo esperado de combustión total de las canales será de 48 horas, si las condiciones climatológicas lo permiten,

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después que han sido incinerados, se aplica un desinfectante y se procede al relleno de la fosa y a la limpieza del terreno. Se indicará con un ejemplo los materiales necesarios para la incineración tomando como referencia 5 cerdos adultos: 3 pacas de paja o heno ó 50 kg de leña de fácil combustión ó 4 llantas ó 1135 kg de carbón ó 1 galón de aceite combustible. Las llantas sólo se usarán cuando la Secretaría de Desarrollo Urbano y Ecología lo autorice ya que producen alta contaminación ambiental. Nunca deben quemarse al aire libre los cadáveres o tejidos de animales sospechosos de ántrax y otras enfermedades causadas por gérmenes que forman esporas, ya que éstas resisten altas temperaturas y pueden ser levantadas y diseminadas con el humo. Para laboratorios de diagnóstico, unidades ganaderas grandes y rastros es recomendable tener un crematorio particular, ya que permite una buena disposición final de residuos peligrosos biológicos infecciosos, reduciendo al mínimo el riesgo a la población humana, animal y contaminación ambiental. Proceso técnico. Este método asegura la esterilización del material, ya que es sometido a altas temperaturas o por medio de preparados químicos. El material se procesa en forma de harina de carne, harina de hueso. Para este proceso se deben construir plantas especializadas. Un ejemplo que ha dado buenos resultados es la esterilización por espacio de 30 minutos a una temperatura de 130-140oC a una presión de 3 atmósferas con la consecuente cocción del material, hasta llegar a su desintegración.

BIBLIOGRAFÍA

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4. Secretaría de Desarrollo Urbano y Ecología. (1988): Ley General del Equilibrio Ecológico y

la Protección al Ambiente. Diario Oficial de la Federación, 28 de enero de 1988. 5. Secretaría de Desarrollo Urbano y Ecología. (1988): REGLAMENTO de la Ley General del

Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente en Materia de Prevención y Control de la Contaminación de la Atmósfera. Diario Oficial de la Federación, 25 de noviembre de 1988.

6. Secretaría de Desarrollo Urbano y Ecología. (1988): REGLAMENTO de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente en Materia de Residuos Peligrosos. Diario Oficial de la Federación, 25 de noviembre de 1988.

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8. Secretaría de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca. (1996): Decreto que reforma, adiciona y deroga diversas disposiciones de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente. Diario Oficial de la Federación, 13 de diciembre de 1996.

9. Vaclav, K., (1987). Epizootiología General. Pueblo y Educación. La Habana, Cuba.

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