2. Tecnica Histologica2
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Dr. Miguel Lecuona Rodríguez Departamento de Biología Celular y Tisular Facultad de Medicina, UNAM Universidad Autónoma del Estado de México. 2015 Técnicas de Procesamiento Curso de Histología
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Dr. Miguel Lecuona Rodríguez
Departamento de Biología Celular y Tisular
Facultad de Medicina, UNAM
Universidad Autónoma del Estado de México.
2015
Técnicas de Procesamiento
Curso de Histología
¿Qué es la Técnica Histológica?
Son una serie de pasos físicos y químicos
para obtener una muestra susceptible de
ser analizada al microscopio
Células NO procesadas
Se observan en microscopio de contraste de
fases o de campo oscuro:
– Células de la sangre
– Células de descamación
Células Procesadas
• Técnica histológica ordinaria
• Técnica de corte por congelación
• Técnicas de tinción selectiva
• Técnicas de histoquímica enzimática
• Técnicas de inmunomarcaje
Otras Técnicas (Investigación)
• Técnicas para microscopia electrónica
• Técnica de impregnación metálica o
argéntica
• Ultracentrifugación diferencial
• Cultivo de células o tejidos
Técnica Histológica Ordinaria
1. Obtención de la muestra
2. Fijación
3. Deshidratación
4. Aclaración o diafanización
5. Infiltración
6. Inclusión
7. Corte
8. Desparafinización
9. Rehidratación
10. Tinción
11. Deshidratación
12. Aclaración
13. Montaje
Obtención de la muestra Ser vivo: biopsia
• Circunstancias o condiciones: – De rutina
– Transoperatoria
• Cantidad de tejido que se toma de la lesión:
– Insicional: un fragmento de la lesión
– Excisional: toda la lesión, pudiendo tener fin terapéutico
• Procedimientos:
– Corte
– Raspado: de sistemas epiteliales ó citologia exfoliativa (cervico-vaginal – citobrush o abatelenguas)
– Legrado
– Punción • Aspiración con aguja fina (BAAF)
• Aspiración con aguja gruesa (Tru-cut)
– Endoscopia
Cadáver: necropsia
FIJACIÓN
• Conservación de la estructura, evitar cambios postmortem, como la autolisis, la putrefacción o la proliferación
• Química: desnaturaliza proteínas proteolíticas, estabiliza membranas, inactiva enzimas (autolisis), antisépticos (evita proliferación de microorganismos)
• Física: congelación
FIJACIÓN
Los fijadores mas usados son:
• Formol (formaldehído) al 10%: endurece el tejido y tiene capacidad de penetración al espacio intracelular, buen poder fijador; se usa de 12 a 24 horas (ideal); se utiliza un volumen de 1 a 20 veces el tamaño de la muestra.
• Glutaraldehido, tetraóxido de osmio (para ME)
• Alcohol Etílico al 50% o 70%
• Mezclas fijadoras; spray: formol-fosfato
• Otros: Bouin, Zenker, Sanboni
Deshidratación
• Es gradual para evitar la refracción
• Se utiliza etanol o alcohol etílico al 30%,
50%, 70% y 100%
Aclaramiento o diafanización
• Se utiliza como ayudante para observar con mayor calidad los compartimientos celulares
• Se utilizan solventes como: Xilol, Toluol o
Cloroformo (Agentes Aclarantes)
• Se dan 2 baños al menos
Infiltración
Se da en parafina líquida o celoidina
INCLUSIÓN
• Solubles en agua: gelatina, carbowax,
metacrilato de glicol
• Solventes orgánicos: parafina, celoidina
CORTE
• Se utiliza el micrótomo
• Van de 4 a 8 micras por lo general
• Se va generando un “listón” de cortes
• Se colocan en una bandeja en “baño María” con gelatina o albúmina
• Se separan y se colocan en portaobjetos
Desparafinización
• Se realiza con Xilol (Agente aclarante)
Rehidratación
• De forma gradual, con agua
TINCIÓN
Se utiliza para dar contaste a la muestra
• Monocrómica (1 colorante) Azul de toluidina
• Bicrómica (2 colorantes) H-E núcleo azul-morado, el resto rosa-naranja
• Tricrómica (3 colorantes) Masson: núcleo-azul oscuro, citoplasma-rojo, colágena-azul, músculo- rojo;
TINCIÓN
• Hematoxilina: azul-morado, base
(basofilia). Núcleos (ácido y basofilo)
• Eosina: rosa-naranja, ácido (acidofilia)
citoplasma (básico y acidofilo)
TINCIÓN
• Ortocromasia: se respeta el color del colorante
• Metacromasia: cambio del color original del colorante (tonalidades) Vg. Azul de Toluidina
• Pancromasia: mezcla de varias colorantes neutros, da como resultado varios colores y tonalidades Vg. Wright y Giemsa
Deshidratación
• Se saca el agua propia de los colorantes
con alcohol
Aclaración
• Se da un baño en Agente Aclarante para
aumentar la transparencia de la muestra
MONTAJE
• Se coloca un cubreobjetos a la muestra
junto con Resina Sintética o Bálsamo de
Canadá, como pegamento formando una
capa transparente y adhesiva.
TÉCNICA DE CORTE POR
CONGELACIÓN • Usos: en procesamiento de biopsias
transoperatorias
• Obtención: biopsia transoperatoria
• Fijación: por congelación
• Corte: criostato (micrótomo en gabinete refrigerado a una temp. de -20º C en el interior)
• Tinción: HE
• Tiempo estimado: 10 minutos
• La preparación solo se puede observar al momento
• Otros usos: pruebas de histoquímica enzimática, evitando el uso de AA polares como xilol.
TÉCNICAS DE TINCIÓN SELECTIVA
Se tiñen determinados componentes celulares con colorantes específicos:
• Para lípidos: – Sudan III y IV: rojos o naranjas
– Sudan negro: negro
– Rojo oleoso: rojo
– Ácido osmico (tetraoxido de osmio): negro
• Para glucógeno y glucoproteínas: – Ácido peryódico de Schiff (PAS); Rojo-magenta para glucógeno, Rojo para glucoproteínas
– Carmín de Best: glucogeno
• Para DNA sin RNA – Técnica de Feulgen: rojo ( el RNA no reacciona)
• Bensley y Cains: para mitocondrias
• Dafano (sales de plata): para aparato de Golgi
• Wilder (argentica): para fibras reticulares: café a negro
• Reyes (rojo), Orceina (amarillo), Verhoeff (café): para fibras elásticas
HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA
• Detecta un grupo de enzimas específicas
(la misma enzima)
• Se va a observar en forma de precipitado
denominado MARCA
• Enzima + sustrato = producto(s) +
revelador = MARCA
INMUNOMARCAJE
Se utilizan anticuerpos, se identifican moléculas altamente específicas
Inmunoflorescencia
• se utiliza un compuesto fluorescente
• muestra fluorescentes los anticuerpos a los cuales se les pega el antigeno
• Puede ser directa: 1 antígeno por 1 anticuerpo
• Puede ser indirecta: 1 antígeno por varios anticuerpos
Inmunohistoquímica
• se utiliza para marcar enzimas
Joaquín Carrillo Farga
Joaquín Carrillo Farga
Joaquín Carrillo Farga
Joaquín Carrillo Farga
Joaquín Carrillo Farga
IHQ indirecta
IHQ negativa
IHQ positiva
CASO CLÍNICO
Mujer de 58 años
– Lesión difusa en mama derecha que infiltra piel y
complejo aréola – pezón
Receptores de estrógeno y progesterona
Her2-neu
DIAGNÓSTICO
Carcinoma ductal infiltrante:
• RE y RP (+)
• Her-2 Neu (+)
TÉCNICA PARA MET Mismos pasos que la técnica ordinaria:
Diferencias:
• Fijación; en vez de formaldehído se utiliza glutaraldehido
• Infiltración; en vez de parafina se utilizan resinas plásticas (epóxicas) Vg. EPON y Araldita
• Corte: va de 60 a 100 nanometros, se utiliza un ultramicrótomo cuyas cuchillas son de vidrio o diamante
• Se utilizan rejillas de cobre en lugar de portaobjetos
• No se quita la resina
• Para el contrastado se utilizan sales de metales pesados como el acetato de plomo y el acetato de Uranilo
IMPREGNACIONES METÁLICAS O
ARGÉNTICAS
• En lugar de usar tinción de color, se
utilizan sales de Oro y Plata (tonos de
café a negro)
• Se utilizan para procesar muestras de:
– tejido nervioso (se tiñen bien las diferentes
células gliales)
• La metenamina de plata permite marcar o
teñir laminas basales al igual que PAS
ULTRACENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
• Se utiliza para separar organelos
• Después de la centrifugación se obtiene un sedimento y un sobrenadante
Ejemplo:
• 1. A la primera centrifugación quedan: en sedimento células completas y en el sobrenadante mitocondrias y otros organelos
• 2. Al repetir el proceso en el sedimento quedan los núcleos y en el sobrenadante los demás organelos
• 3. Al repetir el proceso en el sedimento quedan mitocondrias y en el sobrenadante ribosomas
CULTIVO DE CÉLULAS Y/O TEJIDOS
El procedimiento general es el siguiente:
• Obtención de células
• Separación de células (si es que no están separadas)
• Se colocan en cajas con medio de cultivo (líquidos a semi-líquidos, tienen nutrientes y son distintos a los de las bacterias)
• Se introducen en incubadores de cultivo, manteniendo temperaturas de 37ºC aprox.
• Se da un intercambio gaseoso 02-CO2
– En buenos cultivos las células se pueden reproducir (se resiembran)
– Esta técnica se usa en investigación mas que en clínica
– En cultivo de tejidos las células deben organizarse para formar el tejido (Ingeniería de cultivo de tejidos); las cepas de HELA, es la que se ha adaptado mejor a las condiciones de cultivo, estas vienen del tumor de una mujer desde finales de 1950.
