2. Transferencia de Material Genético y Selección Bacteriana

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Genética molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material genético y selección bacteriana Ingeniería en Biotecnología Noveno cuatrimestre Genética molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material genético y selección bacteriana Clave 190930933 Universidad Abierta y a Distancia de México

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  • Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Ingeniera en Biotecnologa

    Noveno cuatrimestre

    Gentica molecular bacteriana

    Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin

    bacteriana

    Clave

    190930933

    Universidad Abierta y a Distancia de Mxico

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Presentacin

    Las bacterias ocupan una posicin nica en el mundo biolgico (Srivastava 2013). Sin ir

    muy lejos podemos evidenciar su relevancia al revisar el microbioma humano

    , donde por ejemplo, por cada centmetro cuadrado de superficie de la piel hay unas

    10,000 bacterias, en la que existe una gran diversidad de especies. Para darnos una idea,

    si utilizamos el ecosistema del suelo como analoga del ecosistema de la piel humana,

    considerando que esta puede tener distintos nichos: "la axila podra ser tan diferente del

    tronco como una selva tropical de un desierto" (Fredricks 2001).

    Si deseas conocer ms acerca del Microbioma humano, revisa el siguiente recurso:

    Crdenas Guzmn G (2012). El microbioma humano. Cmo ves?

    167:10-14 Recuperado de

    http://www.comoves.unam.mx/assets/revista/167/el-microbioma-

    humano.pdf

    Pero cmo es qu se conoce la identidad y fisiologa de las bacterias si son tan

    numerosas y diversas? El mtodo tradicional ha sido aislar o separar las bacterias de las

    muestras biolgicas y cultivarlas en el laboratorio, siendo una labor lenta y costosa, ya

    que se presenta complicada en trminos de determinar las condiciones ptimas de cultivo,

    como temperatura y nutrientes. Se estima que de todas las bacterias que existen en el

    planeta, slo se han cultivado menos del 1%. Afortunadamente, la tecnologa avanza a

    pasos agigantados y la biologa molecular ha permitido el desarrollo de nuevas reas de

    investigacin en este campo, como la metagenmica, donde a travs de utilizar tcnicas

    similares a las que se utilizaron para descifrar el genoma humano, ahora se emplean para

    la identificacin de las diferentes especies de bacterias en nuestro planeta (Crdenas

    Guzmn, 2012).

    Y para qu y por qu nos interesara conocer las diferentes especies bacterianas? Las

    respuestas pueden ser muchas, desde el punto de vista de las ciencias de la salud,

    definitivamente el identificar aquellas especies patgenas se puede relacionar

    directamente con la bsqueda de medicamentos; algunos casos de bacterias claramente

    identificadas han sido utilizadas como sistemas modelo de estudio que han permitido

    comprender ms de la estructura celular, el metabolismo, relaciones estructura-funcin de

    protenas, el crecimiento y reproduccin bacteriana (Srivastava 2013).

    Para la biotecnologa, este conocimiento es indispensable, ya que esta disciplina pretende

    estudiar, modificar y utilizar los sistemas biolgicos para un fin en especfico y mnimo se

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    requiere la identificacin de la especie en cuestin. Ahora bien, es de nuestro inters este

    estudio porque contribuye importantemente al quehacer de la biotecnologa, ya que

    gracias al uso de las bacterias genticamente modificadas esta disciplina ha tenido una

    gran influencia en la solucin de distintos problemas de la salud, de alimentos y

    proteccin del ambiente.

    En este sentido, la unidad 1 del curso proporcion las bases fundamentales de los

    procesos moleculares que se expresan en las bacterias, en otras palabras se esboza el

    flujo de la informacin gentica en los procariontes, ms ahora la tarea es desentraar, en

    forma detallada los mecanismos de regulacin de la expresin gentica y cmo este

    conocimiento puede contribuir al desempeo eficiente de la biotecnologa en cuanto al

    desarrollo de bacterias genticamente modificadas (BGM).

    Acorde a lo anterior, primeramente revisaremos las estrategias de transferencia de

    material gentico que pueden manifestar las bacterias, para posteriormente identificar las

    herramientas que nos permiten realizar su aislamiento.

    Propsitos de la unidad

    Identificar y relacionar las estrategias de transferencia de

    material gentico y de seleccin bacteriana con objeto de

    utilizarlas como herramientas en la generacin de bacterias

    genticamente modificadas.

    Competencia especfica

    Relacionar estrategias moleculares de ingeniera gentica

    mediante la descripcin de tcnicas de seleccin bacteriana y

    gentica molecular para la produccin de BGM.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Temario

    2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinacin de ADN y resistencia

    a drogas

    2.1.1. Recombinacin

    2.1.2. Transformacin

    2.1.3. Conjugacin

    2.1.4. Transduccin

    2.1.5. Resistencia a drogas

    2.2. Herramientas en la clonacin y expresin de genes para obtener bacterias

    recombinantes

    2.2.1. Los plsmidos como vectores de clonacin

    2.2.2. Bacterifagos

    2.2.3. Cepas bacterianas

    2.2.4. Seleccin de bacterias recombinantes por resistencia a drogas

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    En la presente unidad 2, se revisarn dos aspectos fundamentales para poder determinar

    y establecer en la prctica las utilidades y grandes ventajas que puede retribuir la gentica

    molecular bacteriana al desarrollo de toda biotecnologa. Por ello, se revisar, conocer y

    comprender la dinmica que opera en los mecanismos a travs de los cuales las

    bacterias pueden transmitir su informacin gentica, particularmente es de inters poder

    saber cmo molecularmente estos microorganismos son capaces de transmitir su

    adaptabilidad a diferentes condiciones ambientales, evidenciando al menos

    inmediatamente una aplicacin teraputica, pero cabe aclarar que pueden ser

    microorganismos con un alto potencial para estudiar, modificar y utilizar en diferentes

    campos. Por tanto, se abordar las bases moleculares, los elementos asociados y

    algunos ejemplos de cada uno de los tres diferentes mecanismos de transferencia de la

    informacin gentica bacteriana: transformacin, conjugacin y la transduccin.

    Como primera incursin, se reconocer y fortalecer el concepto de la recombinacin

    desde el punto de vista de la gentica bacteriana y cmo es un evento que ser comn

    para los diferentes mecanismos de transferencia a discutir.

    Asociado a lo anterior, adems de contar con todo este conocimiento previo que facilita a

    la biotecnologa la eleccin del mejor sistema para poder transmitir la informacin

    gentica de una forma dirigida, resulta crtico contar con un bagaje amplio en cuanto a las

    herramientas tcnicas que pueden facilitar dicha transferencia de la informacin. Resulta

    entonces comprensible, la necesidad de repasar diferentes tcnicas, estudiadas

    previamente en la carrera, pero ahora especficamente enfocadas a su aplicacin en la

    gentica bacteriana. Con objeto de alcanzar estos propsitos se identificar de aquellas

    herramientas que pueden establecer y determinar la clonacin y expresin gnica, las que

    resulten ser las ms adecuadas para la obtencin especfica de bacterias genticamente

    modificadas (BGM).

    2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinacin de ADN y

    resistencia a drogas

    Los procariontes son microorganismos que sobresalen en cuanto a su fascinante

    capacidad de adaptacin a diferentes condiciones ambientales. Con objeto de dilucidar

    los mecanismos que pueden estar involucrados resulta fundamental conocer desde la

    estructura de su material gentico hasta como fluye dicha informacin (Betancor et. al.,

    2006) para entonces poder estudiar su regulacin y finalmente reconocer su utilidad

    biotecnolgica.

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    Por ejemplo, la capacidad infecciosa de una bacteria patgena reside en que contiene la

    informacin gentica necesaria para colonizar, invadir y/o producir sustancias txicas

    causantes de la enfermedad. Es importante puntualizar que dicha informacin se

    transmite y se hereda a la siguiente generacin, por lo que resulta necesario conocer su

    funcionamiento gentico. El hecho de que estos microorganismos sean de relativo fcil

    manejo en el laboratorio, ha favorecido que podamos utilizarlas para sintetizar productos

    tiles para distintos sectores (Betancor et. al. 2006).

    Por ello, en esta unidad revisaremos las estrategias de transferencia que pueden

    manifestar las bacterias con objeto de recombinar su material gentico y de este modo

    adquirir cambios como la resistencia a ciertos antibiticos u otras drogas.

    2.1.1. Recombinacin

    La recombinacin es un proceso que combina elementos genticos contenidos en los

    genomas de diferentes individuos, dando como resultado en algunos casos que se

    adquiera una nueva funcin, como una mejor adaptacin a los cambios ambientales, lo

    cual resulta ser un evento evolutivo de gran importancia, ya que implica una transferencia

    de la informacin gentica que puede permitir a una especie adquirir una mejor capacidad

    de adaptacin y por tanto, de sobrevivencia. En los procariontes, a diferencia de los

    eucariontes, la recombinacin comprende una serie de mecanismos que son

    independientes de su reproduccin sexual.

    Un requisito comn de todas las formas de transferencia de genes entre bacterias,

    exceptuando la transferencia de plsmidos (que pueden replicarse de forma

    independiente), es que el fragmento de ADN, sujeto a ser transferido, debe ser insertado

    en el cromosoma receptor, esto se logra a travs de la ruptura de ambas molculas de

    ADN, su entrecruzamiento y su unin (Figura 1).

    Figura 1. Recombinacin entre dos molculas de ADN lineal.

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    Existen diferentes formas de recombinacin, donde la recombinacin homloga, se refiere

    a que ambos fragmentos de ADN proceden del mismo tipo de especie o bien muy

    cercana, es decir son muy similares, aunque no tienen que ser idnticos. Por su parte, en

    la recombinacin heterloga, la fuentes del material gentico provienen de diferentes

    especies puede observarse en la siguiente figura.

    Figura 2. Recombinacin homloga y heterloga.

    El evento que determin el surgimiento de lo que ahora conocemos como ingeniera

    gentica o ADN recombinante sucedi en 1970 cuando Hamilton Smith y Daniel Nathans

    descubrieron una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias especficas.

    Las enzimas de restriccin, actoras determinantes durante la recombinacin

    Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen ADN, los

    cuales son llamados sistemas de modificacin-restriccin, y son anlogos a un sistema

    inmune en cuanto a su funcin, es decir son protectores porque pueden inducir cambios

    con objeto de lograr la sobrevivencia de la especie. En ciertas bacterias, el propio ADN

    puede ser modificado en secuencias especficas a travs de una enzima de modificacin,

    la cual puede cambiar una base por otra; por su parte, una enzima de restriccin solo

    realiza un corte (digestin) cuando reconoce una secuencia en especfico. Las enzimas

    de restriccin suelen identificar secuencias palindrmicas, que son iguales si se leen en

    una direccin, o en la direccin contraria, como las palabras oso o ala.

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    -5'CCCGGG3'- -5'TAACCG3'-

    -3'GGGCCC5'- -5'GCCAAT3'-

    Secuencias palindrmicas

    En estas secuencias dependiendo de la posicin del corte, implica que queden extremos

    con caractersticas particulares, por ejemplo en forma escalonada y se definen como

    extremos cohesivos o pegajosos, porque pueden hibridar nuevamente (Figura 3). Si ahora

    los extremos no quedan escalonados sino rectos, se denominan extremos romos y estos

    no hibridan fcilmente (Figura 3):

    Figura 3. Mecanismo de accin de las enzimas de restriccin.

    Una vez que las enzimas ejercen su accin, se produce un conjunto definido de diferentes

    segmentos, mismos que pueden visualizarse si se utiliza una electroforesis, ya que los

    fragmentos pueden separarse por su peso molecular, en un proceso que es anlogo a la

    separacin de protenas:

    Ahora bien, si el fragmento de ADN producto de la digestin de una enzima de restriccin

    de un organismo se asocia con otro segmento de ADN, generado por la misma enzima

    pero de un organismo diferente, se puede obtener una molcula hbrida o una molcula

    de ADN recombinante (Sobern 2009).

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    Para que se renan las hebras cortadas, se requiere de la accin de otra enzima que es

    la ADN ligasa, la cual cataliza la formacin del enlace fosfodister necesario para que se

    unan las hebras del material gentico. Para que la recombinacin sea exitosa es requisito

    que la nueva secuencia se transcriba y traduzca en una clula y que adems se replique.

    La recombinacin sucede tanto en eucariontes como procariontes, e implica la generacin

    de un nuevo genotipo como resultado del intercambio de material gentico entre

    secuencias homlogas de ADN de dos orgenes diferentes.

    Recombinacin gentica en bacterias

    A diferencia de las clulas eucariontes, las bacterias slo tienen un nico cromosoma.

    Por tanto, para que suceda la recombinacin, el cromosoma homlogo debe ser

    transferido de una bacteria donadora a una receptora, si se considera que el cromosoma

    donador debe ser homlogo con el receptor, entonces es de esperarse que ambas

    bacterias pertenezcan a la misma especie o a especies muy relacionadas. Por tanto, la

    recombinacin bacteriana sucede si y solo si sucede una transferencia del material

    gentico, fragmento de ADN, de la bacteria donadora hacia una clula receptora y se

    manifiesta porque dicho fragmento se puede transcribir, traducir y replicar en la clula

    aceptor. Si no hay recombinacin, el fragmento de ADN de la bacteria donadora se

    pierde, porque no se puede replicar de forma independiente.

    Ahora bien, tambin puede suceder la recombinacin heterloga, la cual ha sido

    ampliamente utilizada por la biotecnologa, donde hay muchos ejemplos de genes de

    origen animal expresados en bacterias y plantas con la finalidad de obtener diversas

    protenas recombinantes de gran inters en la industria farmacutica y alimentaria.

    Por tanto, la recombinacin gentica bacteriana sucede cuando se transfieren fragmentos

    de ADN de una clula donadora a una receptora, ahora es de nuestro inters conocer

    dichos mecanismos de transferencia que tienen caractersticas, ventajas y desventajas

    particulares, los cuales son: transformacin, conjugacin o transduccin.

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    2.1.2. Transformacin

    La transformacin es un proceso de recombinacin gnica mediante el cual las bacterias

    pueden incorporar ADN exgeno o extrao, que puede provenir de otras bacterias y que

    se encuentra libre en el medio (Figura 4).

    Figura 4. Recombinacin bacteriana por transformacin.

    No todas las bacterias pueden captar este ADN exgeno, cuando lo conservan en

    forma estable e interaccionan con el mismo, se dice que son competentes. Esta

    competencia depende de la presencia de un sistema de captacin de ADN especfico y

    que se encuentra asociado a la membrana celular. Como ejemplos de bacterias

    competentes se encuentran Haemophilus influenzae, Neisseria sp, Streptococcus

    pneumoniae, etc. Aun cuando no todas las especies de bacterias pueden ser

    competentes, esta se puede inducir en el laboratorio al generar alteraciones en la

    membrana celular (Betancor et al. 2006).

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    Dentro de las tcnicas comunes para inducir la competencia se encuentra la

    electroporacin, que consiste en la aplicacin de un pulso elctrico. Tambin se puede

    utilizar agentes qumicos como el cloruro de calcio, y el choque trmico es una

    herramienta ampliamente utilizada. Es importante precisar que no en todas las clulas

    procariontes se puede inducir la competencia y lo usual es probar ms de una tcnica

    para alcanzarla.

    2.1.3. Conjugacin

    En la conjugacin, la transmisin de ADN se realiza directamente de una clula

    bacteriana a otra. Los plsmidos son los elementos genticos que con mayor frecuencia

    se transmiten a travs de este mecanismo. Esta capacidad de transferencia va a

    depender de la presencia de plsmidos conjugativos que contienen los genes necesarios

    para realizar dicho evento (Betancor et al. 2006).

    Pero qu caractersticas presenta y cmo es que se puede favorecer la conjugacin?

    Resulta que para que se d la transferencia de genes generalmente contenidos en un

    plsmido, ya sea de una bacteria a otra bacteria, o bien de una interaccin bacteria-clula

    hospedera, debe existir primeramente un contacto fsico entre ambos tipos celulares y

    establecerse un puente de unin entre las superficies de ambos, para poder introducir y

    recombinar el material gentico. Aun con todos los avances tecnolgicos alcanzados,

    dichos eventos an no han sido del todo dilucidados, pero se tiene conocimiento muy

    valioso de cmo pueden operar estos sistemas (Thanassi et al. 2012; Arutyunov y Frost

    2013).

    Acorde a lo anterior, el primer requisito es que se establezca una unin entre las bacterias

    involucradas sujetas a ser modificadas genticamente:

    1) Debe existir un acercamiento fsico entre ambos tipos celulares, lo cual se alcanza a

    travs de organelos de superficie como el pili, el cual se localiza en la bacteria donante

    del plsmido y uno de sus objetivos es identificar y promover el acercamiento a la clula

    receptora.

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    2) Una vez establecido el puente de comunicacin entre los dos tipos celulares, comienza

    un flujo de material desde la bacteria hacia la clula receptora, donde los sistemas de

    secrecin bacterianos, se encargan de producir y excretar diversas molculas que no solo

    pueden favorecer el fortalecimiento del puente de unin, sino tambin la entrada de

    factores de virulencia y el ADN candidato a ser insertado en el cromosoma de la clula

    receptora. Hay que recordar que la recombinacin es exitosa si y solo si el fragmento de

    ADN se transcribe, traduce y replica.

    Figura 5. Transferencia por conjugacin de un plsmido resistente. La cepa donadora es

    sensible a cido nalidxico y acarrea un plsmido que confiere resistencia a ampicilina

    (amp). La bacteria receptora es resistente a cido nalidxico, debido a una mutacin

    cromosomal y es sensible a ampicilina. Despus de haber crecido en la mezcla de cultivo,

    el plaqueo sobre agar conteniendo tanto ampicilina como cido nalidxico, selecciona

    aquellos receptores que han recibido el plsmido (transconjugantes). El cromosoma

    bacteriano es omitido para mejorar la claridad (Basado en Dale y Park, 2004).

    Transferencia de genes

    Bacteria sensible al cido Nalidxico.Bacteria donadora que acarrea el plsmido resistente a ampicilina

    amp

    Bacteria resistente al cido Nalidxico.

    Mezcla del cultivo

    Agar selectivo que contienecido nalidxico y ampicilina

    Bacteria receptora con mutacin cromosomalresistente a cido nalidxico que contiene elplsmido que confiere resistencia a ampicilina

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    La Figura 5 ilustra un ejemplo de una estrategia experimental para llevar a cabo la

    conjugacin, en breve, esta transferencia se obtiene por la mezcla de dos cepas, por

    ejemplo cada una de ellas puede contener informacin gentica que les confiere

    resistencia a algn antibitico, esta mezcla despus de un periodo de incubacin,

    momento en el que sucede la conjugacin, se coloca sobre un medio que contenga

    ambas sustancias ante las que presentan la resistencia, por tanto solo crecern las

    bacterias que contenga genes de ambos progenitores. Por ejemplo, en los experimentos

    mostrados en la Figura 5, una cepa (la donadora) lleva un plsmido que le confiere

    resistencia a ampicilina, mientras que la segunda cepa no tiene el plsmido pero tiene una

    mutacin cromosmica que la hace resistente a cido nalidxico. Despus de la

    incubacin del cultivo mixto, una muestra es transferida dentro de un medio que contiene

    ambos antibiticos. Ninguno de los progenitores puede crecer sobre este medio, por tanto

    las colonias que se observen sern debido a la transferencia de una copia del plsmido

    del donador a la clula receptora. Este evento tiene una elevada sensibilidad, ya que se

    ha observado que basta con que 1 en 106 clulas receptoras haya obtenido una copia del

    plsmido transferido, es suficiente para que se obtenga un crecimiento de la progenie en

    el medio provisto por los dos antibiticos.

    Entre las bacterias donde la conjugacin se presenta con mayor frecuencia, se

    encuentran miembros de las Enterobacterias y las bacterias Gram negativas (como los

    Vibrios y Pseudomonas). Varios gneros de bacterias Gram positivas poseen sistemas de

    conjugacin razonablemente bien caracterizados. Estos sistemas caracterizados incluyen

    las especias Streptomyces, que tienen importancia comercial como los mayores

    productores de antibiticos; as como los estreptococos lcticos, que tambin tienen

    importancia comercial por sus aplicaciones en varios aspectos de la industria lctea.

    La significancia ms evidente de la conjugacin es que permite la transmisin de

    plsmidos de un cultivo a otro. Considerando que la conjugacin no necesariamente est

    confinada a miembros de la misma especie, esto provee una ruta para el flujo de

    informacin gentica a travs de una amplia frontera taxonmica. Una consecuencia

    prctica por ejemplificar, sera que los plsmidos que estn presentes en la flora intestinal

    normal puede ser transferida a patgenos infectivos, los cuales pueden entonces volverse

    resistentes a un amplio espectro de diferentes antibiticos (Dale y Park 2004).

    MECANISMOS DE CONJUGACIN

    Formacin de parejas de apareamiento

    En la mayora de los casos, la incidencia de la conjugacin, depende de la presencia de

    una cepa donadora que contenga un plsmido que contiene los genes requeridos para

    promover la transferencia de ADN. En E. coli y otras bacterias Gram-negativas, las clulas

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    donadoras acarrean apndices sobre la superficie celular (pilis). Los pilis, varan

    considerablemente en estructura, por ejemplo, el pili especfico para el plsmido F es

    largo, delgado y flexible, mientras que el pili para el plsmido RP4 es corto, grueso y

    rgido. Los pilis hacen contacto con receptores sobre la superficie de la clulas, as forman

    las parejas de apareamiento (Figura 6). El pili, por tanto, atrae la clula para un contacto

    ntimo y hacer un canal o un poro por medio del cual el ADN pase del donador al receptor.

    Figura 6. Transferencia de ADN por conjugacin (Tomado de Dale y Park, 2004).

    Interesantemente, este mecanismo tiene mucho en comn con el sistema de secrecin de

    protenas, el cual es usado por algunas bacterias para entregar protenas txicas

    directamente dentro de las clulas husped.

    Por transferencia de ADN

    La transferencia de ADN de un donador a un receptor (Figura 7) se inicia por una protena

    que hace un corte sitio especfico en una hebra de ADN, conocido como el origen de

    transferencia (oriT). Un plsmido que codifica para una helicasa desenreda el ADN del

    plsmido y la hebra cortada es transferida al receptor comenzando por el extremo terminal

    PlsmidoPilis

    Donador

    Cromosomabacteriano

    El pili hace contacto con el receptor

    Receptor

    Copia del plsmidotransferido al receptor

    Pareja de apareamiento

    Transconjugante Donador

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    5 generado por el corte. Al mismo tiempo, el extremo terminal libre 3 de la hebra cortada

    es extendido para remplazar el ADN transferido, por un proceso conocido como

    replicacin en crculo rodante el cual es anlogo a la replicacin de hebras simples de

    plsmidos y bacterifagos. La protena cortadora permanece unida al extremo terminal 5

    del ADN transferido. La sntesis de ADN en el receptor convierte la hebra en una molcula

    de hebra doble.

    Hay que hacer notar que este es un proceso de replicacin. As, si bien se ha

    puntualizado la transferencia de plsmidos de una clula a otra, lo que realmente significa

    es la transferencia de la copia de un plsmido. La cepa donadora todava tiene una

    copia del plsmido y puede involucrarse en posteriores apareamientos con otros

    receptores. Es tambin digno de mencin que, despus de la conjugacin, la clula

    receptora tiene una copia del plsmido y puede transferir la copia a otra clula receptora.

    Las consecuencias pueden ser la diseminacin de un plsmido a travs de una poblacin

    mezclada.

    Figura 7. Mecanismo de transferencia por conjugacin de ADN plasmdico. Para mayor

    claridad, solo el plsmido es mostrado (Basado de Dale y Park, 2004).

    Donador Receptor

    El plsmido es cortadoen un sitio especfico,oriT

    Pareja de apareamiento

    Sintesis de ADN en el donador por extensin del extremo terminal 3 de la hebra cortada

    Hebra simpletransferida

    ADN transferides copiado en la clula receptora.

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    Movilizacin y transferencia cromosomal

    No todos los plsmidos son capaces de ser transferidos a otra clula, los plsmidos que

    pueden hacerlo, como ya se haba comentado previamente, son conocidos como

    plsmidos conjugativos. En algunos casos los plsmidos conjugativos son capaces de

    promover la transferencia (movilizacin) de un segundo plsmido no conjugativo de la

    misma clula donadora. Esto no sucede por casualidad y no todos los plsmidos no

    conjugativos pueden ser movilizados.

    La movilizacin involucra un gene mob, el cual codifica una nucleasa especfica, y el sitio

    bom (=oriT, el origen de la transferencia), donde la nucleasa mob hace un corte en el

    ADN. ColE1 tiene los genes para la transferencia de ADN, pero no trae consigo los genes

    requeridos para la formacin de una pareja de apareamiento. La presencia de otro

    plsmido (conjugativo) permite que el donador pueda formar una pareja de apareamiento

    con la clula receptora y as puede usar su propia maquinaria para acarrear el ADN

    transferido.

    Algunos plsmidos pueden ser movilizados sin importar el gene mob, dicha movilizacin

    depende sobre la habilidad de la nucleasa mob del plsmido conjugativo para reconocer

    el sitio bom del plsmido a ser movilizado. Esto slo funciona si los dos plsmidos estn

    estrechamente relacionados. Por otro lado, el sitio bom es esencial para la movilizacin.

    Este es un factor importante durante la modificacin gentica promovida por la

    conjugacin, la remocin del sitio bom de un vector plasmdico asegura que el plsmido

    modificado no podr ser transferido a otras cepas bacterianas.

    En la mayora de los casos, el ADN que es transferido de un donador a un receptor

    consiste nicamente de una copia de un plsmido. Sin embargo, algunos tipos de

    plsmidos pueden promover la transferencia del ADN cromosomal. El primero que fue

    descubierto, y mejor conocido, es el plsmido F (fertilidad) de E. coli, pero sistemas

    similares existen en otras especies, como en Pseudomonas aeruginosa. En algunos

    casos, como se describe a continuacin, esto involucra la integracin del plsmido

    conjugativo dentro del cromosoma donador (por tanto si el cromosoma es en efecto

    transferido como parte del plsmido). Sin embargo, en muchos casos la transferencia

    cromosomal ocurre sin ninguna asociacin estable con el plsmido, posible por un

    mecanismo anlogo a movilizarse de un plsmido no conjugado.

    Cuando un plsmido es transferido de una clula a otra por conjugacin, el plsmido

    completo ha sido transferido. En contraste, la transferencia cromosmica no involucra una

    copia intacta. Una razn para esto es el tiempo que es requerido para la transferencia. El

    proceso es menos eficiente que la replicacin normal de ADN y la transferencia de todo el

    cromosoma podra tomar 100 min (en E. coli). La pareja de apareamiento muy raramente

    permanece junta por mucho tiempo. En contraste, un plsmido de unos 40 kb (kb = kilo

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    17

    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    bases, 1 kb = 1000 nucletidos) es equivalente al 1% del tamao del cromosoma, - as la

    transferencia del plsmido podra esperarse que se complete en 1 min. La transferencia

    incompleta del ADN cromosmico significa que esto no constituye un replicn intacto de la

    clula receptora (Dale y Park, 2004).

    El plsmido F

    El plsmido fue descubierto originalmente durante intentos para demostrar el intercambio

    gentico en E. coli por cultivos mezclados de dos o ms cultivos auxotrficos, por tanto se

    cultivaban sobre medios mnimos para permitir que nicamente los recombinantes

    crezcan. Fue mostrado muy pronto que los recombinantes eran todos derivados de una

    cepa progenitora y que una sola va de transferencia de informacin era la que estaba

    involucrada, por parte del donador (macho) al receptor (hembra). La cepa donadora

    acarreaba el plsmido (F+) mientras que el receptor es F-. Una caracterstica de este

    sistema que parece ser curioso al mismo tiempo es que la co-cultivacin de una cepa F+ y

    una cepa F- resulta en que las hembras son convertidas en machos. Esto es debido a que

    la transmisin del plsmido F, por s mismo, ocurre muy frecuentemente, en contraste a la

    transferencia de marcadores cromosomales, los cuales son ineficientes ante un F+

    donador.

    Cepas Hfr

    La utilidad de la conjugacin para el anlisis gentico fue enormemente incrementada por

    el descubrimiento de las cepas donadoras en las cuales la transferencia de ADN

    cromosomal ocurra ms comnmente. Estas cepas Hfr (High Frequency of

    Recombination, por sus siglas en ingles que significa alta frecuencia de recombinacin)

    surgen de la integracin del plsmido F dentro del cromosoma bacteriano. Una

    caracterstica adicional de una cepa Hfr es que la transferencia cromosomal empieza de

    un punto definido y procede en una direccin especfica. El origen de la transferencia est

    determinada por un sitio de insercin del plsmido F y la direccin est gobernada por la

    orientacin del plsmido insertado. Esto puede quedar aclarado remarcando la molcula

    circular en la Figura 7 que contiene un plsmido F integrado al ADN cromosomal. La

    transferencia es as iniciada del sitio oriT del plsmido integrado, pero que ahora resulta

    en la transferencia de una copia del cromosoma bacteriano en vez de solamente el

    plsmido. Un donador F+, en contraste, transfiere genes de una forma ms o menos

    aleatoria, ya que la transferencia no se inicia desde un sitio definido en el cromosoma. La

    combinacin de la transferencia parcial de ADN cromosmico con la transferencia

    ordenada de los genes, hizo de la conjugacin una herramienta importante en el mapeo

    de los cromosomas bacterianos.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Integracin y la escisin de F: formacin de plsmido F

    La integracin del plsmido F se produce por recombinacin entre una secuencia en el

    plsmido y un sitio cromosmico. En la Figura 8a se muestra que ocurre adyacente al

    opern de lactosa, pero puede ocurrir en un gran nmero de sitios. Despus de la

    integracin, el plsmido F se encuentra en una forma lineal en el sitio de integracin

    (Figura 8c). La integracin es reversible ya que la recombinacin entre los sitios en los

    extremos del plsmido integrado dar lugar a su escisin del cromosoma como una

    molcula circular independiente (Figura 8, pasos c-a). Sin embargo, es posible que para

    esta escisin se produzca de forma, es decir, la recombinacin se produce en un sitio

    diferente. Si esto sucede, el plsmido resultante habr incorporado una pequea cantidad

    de ADN bacteriano. Esta forma se le conoce como una plsmido F (F-prima). Figura 8c-e

    muestra la formacin de un plsmido Flac, donde el evento de recombinacin que lleva a

    la escisin ha ocurrido en un sitio ms all del opern lac (lactosa), en lugar de entre los

    sitios que flanquean el plsmido F integrado. El opern lac por lo tanto, se ha incorporado

    en el plsmido (al mismo tiempo que genera una delecin en el cromosoma) y ser

    transferido con el plsmido a una cepa receptora. Este es un mecanismo por el cual un

    plsmido puede adquirir genes adicionales a partir de un cromosoma y transferirlos a otra

    cepa o especie.

    Antes de la llegada de la clonacin de genes, los plsmidos F fueron tiles en un buen

    nmero de formas, incluyendo el aislamiento de genes especficos y su transferencia a

    otras cepas husped. Esto permiti la creacin de diploides parciales, es decir, cepas con

    una copia de un determinado gen en el plsmido adems de la copia cromosmica.

    Conjugacin en otras bacterias

    La descripcin anterior de la conjugacin se aplica principalmente a bacterias Gram-

    negativas tales como E. coli y Pseudomonas. Muchas de las especies Gram-positivas,

    que van desde Streptomyces a Enterococcus, tambin poseen plsmidos que son

    transmisibles por conjugacin y en muchos casos, el mecanismo de transferencia de ADN

    es bastante similar a lo descrito anteriormente. Sin embargo, hay diferencias sustanciales

    en los dems aspectos.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Figura 8. La integracin y la escisin del plsmido F. La integracin se produce mediante

    recombinacin con un sitio cromosmico (a-c). Escisin exacta se produce por

    recombinacin en el mismo sitio, pero la recombinacin con diferentes sitios

    cromosmicos resulta en la incorporacin de ADN cromosmico adyacente (en este caso

    el gene lac) dentro del plsmido (d, e), formando un plsmido F y causando una delecin

    cromosmica (Dale y Park 2004).

    En general, el nmero de genes necesarios para la transferencia por conjugacin es de

    tan slo como cinco genes, y es mucho menor que en las bacterias Gram-negativas,

    donde se necesitan 20 o ms genes. El nmero de plsmidos conjugativos en bacterias

    Gram-positivos, por lo tanto, pueden ser considerablemente ms pequeo. Una de las

    razones para un menor nmero de genes que se requieren es que parece que no hay

    necesidad para producir un pili. Esta es probablemente, al menos en parte, un reflejo de la

    arquitectura diferente de la pared celular en bacterias Gram-positivas que carecen de la

    membrana exterior caracterstica de los Gram-negativos.

    Un grupo de bacterias Gram-positivas, donde los sistemas de conjugacin han sido

    estudiado en detalle son los enterococos, principalmente Enterococcus faecalis. Algunas

    cepas de E. faecalis secretan pptidos difusibles que tienen una accin similar a las

    feromonas que puede estimular la expresin de los genes de transferencia (tra) de un

    plsmido especfico en una clula vecina. Hay que hacer notar que, de manera

    sorprendente es la clula receptora la que produce las feromonas. La clula donante, que

    lleva el plsmido, tiene un receptor plsmido codificado en la superficie celular al que se

    une la feromona. Diferentes tipos de plsmidos codificado para diferentes tipos de

    receptores y que son estimulados por diferentes feromonas. Sin embargo, el receptor

    lac Cromosoma

    Escisin Integracin

    Plsmido F

    Escisin aberrante

    Delecionde lac

    a

    b

    c

    d

    e

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    produce una gama de feromonas y por lo tanto es capaz de aparearse con las clulas que

    llevan plsmidos diferentes.

    Despus de que la feromona se ha unido al receptor de la superficie celular, es

    transportado al citoplasma por una protena de transporte especfica, donde interacciona

    con una protena llamada TraA. Esta protena es un represor de los genes tra en el

    plsmido y la unin del pptido alivia aquella represin, estimulando de este modo la

    expresin de los genes tra. Un resultado es la formacin de productos de agregacin que

    causan la formacin de un agregado de acoplamiento que contiene unidas las clulas

    donantes y receptoras. Una consecuencia adicional de la expresin de los genes tra es la

    estimulacin de los eventos necesarios para la transferencia del plsmido, que se produce

    por un mecanismo similar al descrito anteriormente.

    Una ventaja de este sistema es que las clulas que contienen el plsmido no expresan los

    genes necesarios para la transferencia de plsmido a menos que exista un receptor

    adecuado en las proximidades. Esto no slo reduce la carga metablica en la clula, sino

    que tambin significa que no estn expresando antgenos de superficie (tales como pili

    conjugativo) que podran ser reconocidas por el sistema inmune del husped.

    Transposones conjugativos

    E. faecalis tambin proporciona un ejemplo de una excepcin a la regla general de que la

    conjugacin es mediada por plsmidos. Algunas cepas de E. faecalis contienen un

    transposn conocido como Tn916. Los transposones no se cubren particularmente en

    esta unidad, pero por el momento es suficiente saber que son elementos genticos

    mviles que son capaces de moverse de un sitio a otro del ADN. Lo que diferencia a

    Tn916 aparte de otros transposones es su capacidad de transferir de una clula a otra por

    conjugacin.

    Transposones conjugativos tales como Tn916 difieren de los plsmidos en que se replican

    y heredan como parte del cromosoma. No hay forma estable de replicacin independiente

    como la hay con un plsmido. Sin embargo, una inspeccin ms detallada del mtodo de

    transferencia (Fig. 9) muestra que existe una similitud significativa a la transferencia de un

    plsmido. En particular, Tn916 contiene un origen de transferencia (oriT) que es bastante

    similar a la que se encuentra en muchos plsmidos. El primer paso en la transferencia es

    la escisin del transposn a partir del cromosoma, usando enzimas transposn-

    codificadas (Int y Xis) que estn relacionadas con los responsables de la integracin y la

    escisin del bacterifago lambda. Produce una molcula circular que se asemeja a un

    plsmido en todos menos un rasgo vital - que no tiene un origen de replicacin por lo que

    es incapaz de ser copiados en la forma normal. Sin embargo, ya que tiene un sitio de oriT

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    y lleva los genes tra necesarios para la transferencia conjugacional, es como puede ser

    transferido a una clula receptora.

    Al igual que con los sistemas de transferencia de plsmido descrito anteriormente, la

    transferencia de Tn916 implica la sntesis de ADN de hebra sencilla iniciado en oriT y la

    transferencia de la cadena desplazada al receptor. La nica hebra transferida a

    continuacin, se circulariz y convierte a una forma circular de doble cadena que se

    inserta aleatoriamente en el cromosoma receptor por la accin de la integrasa.

    Una caracterstica adicional de Tn916 que vale la pena considerar es, si la transferencia

    se produjo sin la escisin a partir del cromosoma entonces, se esperara que la

    movilizacin del cromosoma ocurriera con la transferencia incompleta del transposn.

    Transferencia comienza a partir de oriT y tendra que trabajar justo a la vuelta del

    cromosoma antes de llegar al resto del transposn. Esto no parece suceder. La razn es

    que el promotor para la expresin de los genes tra se encuentra hacia el extremo

    izquierdo del transposn (en la Fig. 9) y se encuentra lejos de los genes tra. En la forma

    lineal no se pueden expresar los genes tra. Sin embargo, cuando el transposn se

    escinde del cromosoma y es circularizado, esto trae al promotor a la posicin y orientacin

    correcta para la transcripcin de los genes tra. Por lo tanto, se expresan a partir del

    intermediario circular, pero no de la forma lineal. Esto asegura que el sistema de

    transferencia slo se activar despus de haberse producido la escisin.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Figura 9. Transferencia del transposn conjugativo Tn916. El transposn se escinde del

    cromosoma, usando las enzimas Int y Xis y posteriormente es circularizado. Esto permite

    a los genes tra ser expresados a partir del promotor mostrado y la transferencia por

    conjugacin se inicia a partir de oriT. En el receptor, el ADN transferido es circularizado, la

    segunda hebra se hace y el transposn se integra en el cromosoma (Dale y Park 2004).

    Tn916 es el prototipo de una familia de transposones conjugativos relacionados que son

    especialmente extendido en cocos Gram-positivos, aunque los elementos relacionados

    tambin se producen en bacterias Gram-negativas (por ejemplo, Bacteroides). Para

    muchos de estos elementos, incluyendo Tn916, la transmisin conjugativa es promiscua

    ya que se puede transferir a otras especies o gneros. Es de suponer, pues, que los

    transposones conjugativos han jugado un papel importante en la difusin de material

    gentico, incluidos los genes de resistencia a antibiticos en todo el reino bacteriano. En

    Escisin

    Iniciacinde la transferencia

    a partir de oriT

    Donador

    Receptor

    Hebra sencillatransferida y circularizada

    Sntesis dela segunda

    hebra

    Integracin

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    particular, muchos de estos transposones, incluyendo Tn916, llevan un gen de resistencia

    a tetraciclina (tetM) que se encuentra en una amplia gama de especies bacterianas, lo

    que sugiere que han desempeado un papel en la dispersin de este gen en particular.

    2.1.4. Transduccin

    Transduccin es la transferencia mediada por fagos de material gentico. El paso clave

    en la transduccin es el envase de ADN en las cabezas de fagos durante el crecimiento

    ltico del fago. Este proceso es normalmente altamente especfico para el ADN del fago.

    Sin embargo, con algunos fagos, los errores pueden ocurrir en fragmentos de ADN

    bacteriano (producido por la degradacin del cromosoma del husped mediada por fagos)

    se empaquetan de vez en cuando por error conduciendo a partculas tipo fago que

    contienen un segmento de genoma bacteriano (vase la Figura 10).

    Estas partculas de transduccin son capaces de infectar una clula receptora, ya que la

    informacin necesaria para la unin y la inyeccin de ADN se realiza por las protenas de

    la partcula del fago, cualquiera que sea el cido nucleico que contenga. El segmento de

    ADN transducido se puede inyectar en una nueva clula husped.

    No todos los bacterifagos son capaces de llevar a cabo la transduccin. Los requisitos

    bsicos de un fago transductor eficaz son que, la infeccin debera dar como resultado un

    nivel apropiado de la degradacin del ADN cromosmico para formar fragmentos de

    tamao adecuado en el momento adecuado para el envasado y que la especificidad del

    proceso de envasado debe ser comparativamente baja.

    En algunos casos, el ADN transducido es un plsmido bacteriano, en cuyo caso la

    molcula de ADN inyectado es capaz de ser replicado y heredado. Ms comnmente el

    ADN incorporado en la partcula de transduccin es un fragmento de ADN cromosmico

    que ser incapaz de replicarse en la clula receptora. Para que sea replica y heredada,

    debe ser incorporada en el cromosoma receptor (por recombinacin homloga), como es

    el caso con otros mecanismos de transferencia de genes.

    Este proceso se conoce como transduccin generalizada (en oposicin a la transduccin

    especializada), ya que prcticamente cualquier gen tiene la misma probabilidad de ser

    transducido.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Figura 10. Transduccin generalizada (Dale y Park, 2004).

    Transduccin especializada

    Algunos fagos (fagos atenuados) son capaces de establecer un estado conocido como

    lisogenia, en la que se reprime la expresin de genes del fago y de replicacin del fago.

    En muchos casos, el profago se inserta en el ADN bacteriano y se replica como parte del

    cromosoma. Cuando empieza la lisogenia y el fago entra en el ciclo ltico, que se escinde

    del cromosoma por recombinacin entre las secuencias en cada extremo del profago

    integrado. Si este evento de recombinacin ocurre en el lugar equivocado, una regin

    adyacente de ADN bacteriano se incorpora en el ADN del fago. Toda la progenie de este

    fago contendr entonces este gen bacteriano que por lo tanto, ser transducido a una

    Bacteria donadora Replicacin de ADNSntesis de partculas del fago

    Empaquetamiento del ADNDentro de las cabezas de losfagos

    Infeccin ltica

    Incorporacin delADN cromosomal

    Lisis

    Partculatransductora

    Infeccin delreceptor

    Recombinacin conel ADN del husped

    Fragmento de ADNtransducido

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    frecuencia muy alta (efectivamente 100 por ciento por partcula de fago) una vez que el

    fago transductor ha sido aislado. Dado que el ADN transferido se limita a una regin muy

    pequea del cromosoma, el fenmeno se conoce como transduccin especializada (o

    restringida). Esto es muy similar a la formacin de plsmidos F' mencionados

    anteriormente (vase la Figura 8). Al igual que con los plsmidos F', ahora es mucho ms

    fcil aadir genes lambda ADN creando recombinantes in vitro.

    Otro fago que se ha empleado de forma similar es el fago Mu que tiene la ventaja de

    insertarse en mltiples sitios en el cromosoma por un mecanismo tipo transposn. Por lo

    tanto, es mucho ms fcil para crear una amplia gama de fagos transductores

    especializados con Mu que se puede utilizar tanto en el mapeo gentica y en

    mutagnesis.

    2.1.5. Resistencia a drogas

    Durante los ltimos aos el pblico est cada vez ms alarmado por los nuevos datos

    cientficos en los medios de comunicacin sobre la conexin entre el abuso drogas en la

    medicina, la industria agroalimentaria y la agricultura, y la aparicin y propagacin de

    bacterias resistentes a drogas. La resistencia de bacterias a drogas va en aumento. Ms

    de 150 drogas antibacterianas estn disponibles, los cuales se clasifican en 20 diferentes

    clases y 10 de estas clases tienen objetivos especficos de accin, incluyendo las paredes

    y membranas celulares, cidos nucleicos y protenas y la sntesis de cido flico. Con un

    menor nmero de nuevas drogas que llegan al mercado, el problema de resistencia a

    drogas que ya estn en uso se ha convertido en una crisis de salud pblica. Un estudio

    estima que los costos hospitalarios directos de la gestin de resistencia a drogas en los

    Estados Unidos son de $ 100 a 10,000 millones de dlares al ao, y la Oficina de

    Evaluacin de Tecnologas de Estados Unidos ha estimado que los costos hospitalarios

    mnimos de 5 tipos de infeccin nosocomial (por ejemplo, infeccin de la herida quirrgica

    y la neumona) debido a la resistencia a drogas fueron de $ 4500 millones de dlares por

    ao.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    La resistencia microbiana a drogas va en aumento, en parte, debido al uso inadecuado de

    los antibiticos en medicina, as como tambin a las prcticas inadecuadas de la industria

    agrcola, donde la produccin animal intensiva implica dar a los animales de ganado

    grandes cantidades de drogas (antibiticos) para promover el crecimiento y prevenir

    infecciones. Estos usos promueven la seleccin de resistencia a antibiticos en

    poblaciones bacterianas. Las bacterias resistentes de entornos agrcolas pueden ser

    transmitidas a los seres humanos, en los que causan la enfermedad que no puede ser

    atendida por los antibiticos convencionales que actualmente existen en el mercado.

    Se necesitan dos condiciones para para desarrollar resistencia a drogas en bacterias. En

    primer lugar, el organismo debe entrar en contacto con la droga. Entonces, la resistencia

    contra el agente se debe desarrollar, junto con un mecanismo para transferir la resistencia

    a la progenie o directamente a otros miembros de la misma especie.

    Cada droga acta en un sitio especfico dentro de la clula bacteriana. Por ejemplo,

    algunos se dirigen a las paredes celulares (por ejemplo, bacitracina, cefalosporinas y

    penicilinas), otras tienen como blanco la membrana celular (por ejemplo, los ionforos y

    polimixinas), componentes de las clulas responsables de la sntesis de protenas (por

    ejemplo, aminoglicsidos, cloranfenicol y tetraciclina), ARN (por ejemplo, rifamicinas),

    ADN (por ejemplo, cido nalidxico y quinolonas) o particulares vas bioqumicas tales

    como la sntesis de cido flico (por ejemplo, metotrexato y sulfonamidas). Por lo tanto,

    cuando surgen organismos resistentes, su resistencia es especfica a drogas particulares.

    Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos para transmitir rasgos de resistencia

    a otros miembros de su propia especie y para otras especies. Rasgos genticos para la

    resistencia a drogas se codifican en dos lugares en bacterias: los cromosomas y los

    elementos extra-cromosmicos (plsmidos y transposones). Las mutaciones pueden

    provocar que los genes cromosmicos que por lo general codifican para sensibilidad a las

    drogas, comiencen a codificar resistencia; tales mutaciones se producen a razn de uno

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    por milln a uno por mil millones de clulas. Los elementos extra-cromosmicos

    (plsmidos y transposones) son piezas ms pequeas de ADN circular, cada uno

    equivalente en tamao a aproximadamente 1% del cromosoma bacteriano. Los plsmidos

    pueden ser no conjugativos o conjugativos; este ltimo puede moverse desde una

    bacteria a otra.

    El intercambio gentico es otro mecanismo por el cual los plsmidos resistentes a drogas

    se pueden mover entre bacterias (Figuras 6, 7 y 9). Algunas bacterias son consideradas

    como "promiscuas", porque una vez que han adquirido plsmidos resistentes a drogas,

    realizan la transferencia de la resistencia tanto entre la misma especie como con otras

    especies bacterianas con independencia del medio ambiente (es decir, si las drogas estn

    presentes o no).

    Transferencia inusual de secuencias de ADN resistentes a los antibiticos entre especies

    bacterianas y entre los diferentes nichos ecolgicos (por ejemplo, entre los seres

    humanos y rumiantes) se han documentado. Por ejemplo, en Staphylococcus aureus, una

    bacteria gram-positiva, el gen cromosmico para la resistencia a la meticilina se origin

    como un gen de -lactamasa estafiloccica y un segmento de un gen de unin a penicilina

    procedentes de una bacteria donante desconocido, tal vez Escherichia coli, un gramo

    bacteria-negativo.

    En lo que se refiere a mecanismos de resistencia, algunas especies de bacterias son

    intrnsecamente insensibles a ciertos antibiticos, mientras que otras son sensibles. La

    sensibilidad tiene 3 requisitos: 1) un objetivo para la reaccin, 2) un mecanismo para el

    transporte en la clula antes de la accin de los antibiticos y 3) la ausencia de enzimas

    que podran inactivar o modificar el antibitico. Un cambio en cualquiera de estos

    requisitos previos podra hacer que una bacteria se vuelva resistente a la droga o

    antibiotico. Por ejemplo, una o ms mutaciones pueden ser adquiridas al cambiar el

    objetivo de la accin, la captacin, el flujo de salida de extrusin de los antibiticos, o la

    capacidad de la bacteria para inactivar o modificar el antibitico.

    Los frmacos antimicrobianos utilizados para la terapia humana a menudo tienen

    importantes similitudes estructurales a los que se usan para los animales, lo que lleva a la

    posibilidad de problemas adicionales. Por ejemplo, la resistencia a la ormetoprim, un

    medicamento veterinario, podra fomentar la resistencia a la trimetoprima, un compuesto

    estructuralmente similar que se especifica para su uso en seres humanos.

    Las bacterias resistentes a la estreptogramina, quinupristina y dalfopristina se han

    encontrado en los pavos que se haban dado virginiamicina, pero no cualquiera de los

    otros antibiticos, sin embargo, todos estos compuestos tienen una estructura similar.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    El uso de alimentos para animales suplementado con tilosina se ha traducido en el

    desarrollo de resistentes cepas resistentes a eritromicina de estreptococos y

    estafilococos, no slo en los animales, sino tambin en sus cuidadores.

    2.2. Herramientas en la clonacin y expresin de genes para obtener bacterias recombinantes

    La gentica bacteriana est pasando por una fase interesante de su historia. Las nuevas

    metodologas y comprensin concomitante de la biologa molecular han dado a los

    cientficos nuevos conocimientos que hasta ahora es complicado estimar su impacto final.

    La gentica bacteriana se est convirtiendo en una herramienta poderosa para el estudio

    de sistemas genticos diferentes al de las mismas bacterias, as como desarrollo de

    procesos aplicables a problemas especficos a nivel industrial, ecolgicos, farmacuticos,

    u otros problemas especficos en desarrollo (por ejemplo, problemas de fermentacin y

    problemas bioqumicos).

    As, dentro de la gentica bacteriana hay varias herramientas, algunas de las cuales

    sern abordadas en los presentes tpicos.

    2.2.1. Los plsmidos como vectores de clonacin

    La constitucin genmica de varias bacterias puede consistir en dos componentes, a

    saber, el cromosoma que lleva los genes para todas las funciones esenciales y su

    regulacin, y de una unidad cromosmica adicional pero autnoma denominado plsmido

    que inicialmente se pens para llevar las funciones necesarias para su propia replicacin,

    mantenimiento, y distribucin. Sin embargo, los plsmidos no deben ser considerados

    molculas egostas o promiscuas ya que muchos de ellos se han descrito para transportar

    genes que proporcionan funciones de ventaja selectiva. Por ejemplo, se pueden codificar

    resistencia a varios agentes antimicrobianos, tales como antibiticos, metales pesados o

    toxinas, o para la produccin de antibiticos, pigmentos, toxinas, H2S, y otros, o pueden

    proporcionar capacidades catablicas inusuales, o dotar fertilidad, etc. Tambin pueden

    inducir tumores de plantas, y otras respuestas simbiticas y patgenas en plantas y

    animales, para nombrar unos pocos. Adems, un plsmido tambin puede llevar algunos

    genes esenciales.

    Los plsmidos han jugado un papel muy importante en la evolucin bacteriana ya que

    clula que contuvo, en su momento, un plsmido puede haber tenido una ventaja

    adaptativa sobre las bacterias libres de plsmidos. En los ltimos aos, su importancia se

    ha incrementado enormemente debido a su aplicacin en la investigacin en ingeniera

    gentica como un portador de ADN recombinante, y les ha trado reconocimiento

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    29

    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    generalizado. Una clula bacteriana puede o no llevar a un plsmido o puede llevar ms

    de un tipo o de copias de un plsmido. Los plsmidos que a menudo han sido

    comparados con los organismos vivos mediante la aplicacin de los mismos atributos que

    se hace en busca de virus. Por lo tanto, un organismo'' es el elemento unidad de un linaje

    continuo con una historia evolutiva individuo''. Esta definicin se ajusta muy bien sobre los

    virus, plsmidos, y ciertos transposones, todos los cuales han sido considerados para

    pertenecer a una familia de organismos primitivos. La caracterstica comn entre estas

    unidades es su replicacin, el mantenimiento, y la difusin.

    As, los plsmidos son molculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una

    unidad de replicacin independiente del cromosoma, razn por la que pueden presentarse

    en ms de una copia dentro de la clula bacteriana. Los plsmidos representan uno de los

    principales agentes que contribuyen en la diseminacin de la resistencia antimicrobiana.

    Contribuyen en la expansin de importantes determinantes de resistencia, promueven la

    transferencia de genes horizontal entre especies no relacionadas, Curiosamente, los

    plsmidos fueron identificados en cepas de bacterias no relacionadas que se aislaron de

    reas geogrficamente muy separadas sin ningn problema epidemiolgico involucrado.

    Los plsmidos provienen de familias de bacterias que prevalecen importantemente en

    forma natural, normalmente poseen mltiples determinantes genticos que les confieren a

    las bacterias la resistencia a mltiples clases de antibiticos. Pero adems contienen

    factores de virulencia y sistemas adicionales que promueven su estabilidad y

    mantenimiento en la bacteria hospedera en diferentes condiciones ambientales (Carattoli

    2013).

    La caractersticas transmitidas por los plsmidos que ha sido ms estudiada, es el de la

    resistencia a los drogas (Figura 11). Muchas bacterias pueden volverse resistentes a

    drogas por la adquisicin de un plsmido. Aunque no todas las resistencias a antibiticos

    son transferidas por plsmidos como lo es la resistencia a algunos frmacos tales como el

    cido nalidxico y la rifampicina (en ambos casos, la resistencia se produjo por la mutacin

    del gen que codifica para la protena blanco en ambos casos). Los genes involucrados en

    la resistencia a antibiticos son muchos y variados, que van desde enzimas llamadas beta

    lactamasas codificadas en plsmidos que destruyen las penicilinas, hasta protenas de

    membrana que reducen la acumulacin intracelular de tetraciclina. La capacidad de los

    plsmidos para ser transferido de una bacteria a otra, a veces incluso entre especies muy

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    diferentes, ha contribuido en gran medida a la amplia difusin de genes de resistencia a

    antibiticos. Las bacterias pueden volverse resistentes a un nmero variado de

    antibiticos, ya sea por la adquisicin de varios plsmidos independientes o mediante la

    adquisicin de un nico plsmido con muchos determinantes de resistencia en l. Se cree

    que los transposones han desempeado un papel importante en el desarrollo de

    plsmidos con resistencia a drogas, mediante la circulacin, entre diferentes plsmidos,

    de los genes responsables de la resistencia a drogas o directamente a partir del

    cromosoma de un organismo resistente, copiado y transmitido, naturalmente, en un

    plsmido.

    Se debe apreciar que tambin se producen otros mecanismos de resistencia a drogas y

    que tal resistencia no siempre es debido a plsmidos: de hecho muchas de las bacterias

    que actualmente estn causando problemas en hospitales debido a infecciones cruzadas

    son o bien intrnsecamente resistentes o deben su resistencia a drogas por genes

    cromosmicos propios.

    Figura 11. La resistencia a una droga es el resultado de una recombinacin exitosa

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    31

    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    2.2.2. Bacterifagos

    Los bacterifagos (fagos o para abreviar) son simplemente los virus que infectan

    bacterias. Ellos jugaron un papel central en el desarrollo de la biologa molecular,

    especialmente en nuestra comprensin de la estructura del gen, la expresin y son

    tambin importantes en el laboratorio y en la naturaleza como proveedores de medios por

    los cuales los genes se pueden transferir de una bacteria a otra. Con el desarrollo de la

    clonacin de genes, los fagos se llevaron en un papel adicional como vectores para la

    clonacin de ADN.

    En muchas de sus propiedades bsicas, los fagos son similares a otros virus. Ellos

    contienen ARN o ADN encerrado en una capa de protena. El fago infecta mediante la

    unin a un receptor especfico en la superficie de la bacteria y el cido nucleico entra en la

    clula. Algunos de los genes del fago (los genes tempranos) se expresan casi de

    inmediato, utilizando enzimas del husped pre existentes, en general, stos codifican para

    las protenas necesarias para la replicacin del cido nucleico del fago. A continuacin, se

    realizan varias copias del cido nucleico del fago, y la expresin de los genes tardos

    comienza: estos genes son los que se necesitan para la produccin de la partcula del

    fago. La naturaleza de la transicin desde la primera expresin del gen a la expresin

    tarda del mismo vara entre diferentes fagos. Las partculas de fago se ensamblan y la

    clula sufre lisis, liberando una serie de partculas de fago, cada uno de los cuales pueden

    luego pasar a infectar otra clula bacteriana (vase la Figura 12).

    Figura 12. Crecimiento ltico de bacterifagos (Dale y Park, 2004).

    Inyeccin del ADN del Fago

    Replicacin del ADN

    Sintsis de partculasdel fago

    Empaquetamiento del ADN en lascabezas del fago

    Lisis

    Infeccin

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Si un bacterifago infecta un cultivo lquido de bacterias, puede dar como resultado un

    aclaramiento completo del medio. Por otro lado, si las bacterias estn esparcidas en la

    superficie de una placa de agar, las partculas de fago liberadas de una clula infectada

    individual slo ser capaces de infectar a bacterias vecinas que se traducir en un

    aclaramiento localizado en las cercanas de la colonia bacteriana, misma que son

    conocidas o referidas como placas. Esto nos permite determinar la concentracin de

    partculas de bacterifago en una suspensin (esto recibe el ttulo de fago), usando la

    suposicin de que el nmero de placas se corresponde con el nmero de partculas de

    bacterifagos presentes en la muestra. Dado que la suposicin no siempre es vlida, los

    resultados se expresan generalmente en trminos de Unidades Formadoras de Placa, o

    UFP.

    En la prctica, dichos ensayos son realizados generalmente con el cultivo bacteriano (las

    clulas indicadoras) y el fago suspendido en agar blando que se vierte como una

    sobrecapa en la parte superior de una placa de agar, en lugar de esparcirla en la

    superficie. Esto le da a una placa de tres dimensiones, que es ms fcil de ver.

    Algunos bacterifagos, tales como (lambda), no siempre entran en el ciclo ltico descrito

    anteriormente. Estos fagos son llamados temperamentales y pueden establecer una

    relacin ms o menos estable con la clula husped, conocido como lisogenia. En este

    estado, casi todos los genes del fago estn completamente reprimidos, como es la

    replicacin del cido nucleico, por lo que no se producen partculas de fago hasta que se

    rompe el estado lisognico una vez ms. Los bacterifagos temperamentales por lo

    general producen placas en una capa de agar utilizando un indicador bacteriano

    adecuado ya que muchas de las clulas infectadas se lisan en lugar de convertirse

    lisognicas. Sin embargo, como las clulas que entran en el estado lisognico seguirn

    creciendo (y son ms resistentes a una posterior infeccin), las placas sern turbias en

    lugar de las placas claras se observan con un fago virulento (por ejemplo, un fago que no

    puede establecer lisogenia).

    Muchos fagos se han caracterizado en mayor o menor medida, los principales ejemplos

    son todos los virus que infectan a E. coli. Estos vienen en una variedad de formas y

    tamaos como se muestra en la Figura 13, incluyendo estructuras simples y pequeas

    como X174 y MS2 a estructuras ms complejas con cabezas y colas identificables

    (lambda, T4) y estructuras filamentosos tales como M13.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Figura 13. Morfologa de algunos bacterifagos seleccionados. Hay que hacer notar que

    la estructura filamentosa del fago M13 es muy larga y no puede ser tomada su

    representacin en este esquema como representativa de su verdadero tamao (Dale y

    Park, 2004).

    La partcula de fago se compone de una molcula de cido nucleico contenido dentro de

    una capa de protena. En los fagos ms simples, tales como MS2, la capa contiene un

    nmero de copias de una sola protena importante que esencialmente polimeriza

    espontneamente. La forma en que se asocian define tanto la forma como el tamao de la

    partcula del fago. En principio, estructuras filamentosas tambin se pueden producir por

    polimerizacin espontnea de subunidades proteicas, pero esto no es suficiente para

    definir la longitud del filamento. Una forma comn de asegurar que se producen

    filamentos de una longitud definida es utilizar una plantilla o molde, alrededor de la cual la

    protena se polimeriza. Con fagos filamentosos tales como M13 el ADN del fago

    proporciona la plantilla o molde.

    El montaje de M13, donde las protenas de la cubierta del fago se polimerizan alrededor

    del ADN, hace un marcado contraste con fagos ms grandes, tales como (lambda) y T4,

    en donde el DNA se empaqueta en cabezas de fagos vacos pre formados y por lo tanto

    el tamao de la cabeza del fago se define por las protenas de las que est compuesto. El

    tamao y la complejidad de estas estructuras requiere un enfoque diferente para su

    produccin, la polimerizacin espontnea sera demasiado ineficiente y las estructuras

    son generalmente inestables hasta que estn completas. El ensamblaje de estos fagos se

    dirige por lo tanto por la presencia temporal de un nmero de protenas adicionales, que

    se eliminan antes de la maduracin final del fago (vase la Figura 14). Estos

    componentes que ayudan con el montaje, pero no estn presentes en la partcula final se

    denominan protenas de andamiaje.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Figura 14. Montaje del andamiaje. Ensamble de fagos complejos con la asistencia de

    protenas andamios. Estas se eliminan una vez ensamblado la estructura (Dale y Park

    2004).

    Los bacterifagos tambin difieren en la naturaleza de su contenido de cido nucleico.

    Los fagos M13 y X174 contienen ADN circular de cadena sencilla, MS2 tiene un genoma

    de ARN, mientras y las partculas del fago T4 contienen ADN de doble hebra.

    2.2.3. Cepas bacterianas

    Acorde a lo revisado, los procariontes modifican su expresin gentica acorde a las

    condiciones ambientales, ya sea promoviendo o inhibiendo la sntesis de protenas. Estos

    mecanismos determinan la variacin fenotpica, lo cual se manifiesta con cambios en el

    fenotipo celular o de la poblacin procarionte. A su vez, tambin tienen mecanismos de

    variacin genotpica, que sern igualmente traducidos en cambios fenotpicos, pero que

    se basan en una modificacin de la informacin gentica contenida en la clula (Betancor

    et. al. 2006).

    La diversidad gentica en ltima instancia, puede explicar la variabilidad fenotpica en la

    mayora de las bacterias, como la distribucin geogrfica, la especificidad de husped, de

    patogenicidad o resistencia a los antibiticos, y la virulencia. Esto, nos lleva a la

    generacin de variantes, la seleccin de variantes con propiedades deseables y el surtido

    de caractersticas entre las cepas por intercambio gentico. Por ende, a la aplicacin de

    programas de mejora de cepas de microorganismos comercialmente tiles, sobre todo

    para aumentar la formacin de un producto deseado (Li, et.al. 2009).

    Se definir, antes de proseguir, que es una cepa bacteriana. De acuerdo con la primera

    edicin del Manual de Bergeys de Bacteriologa sistemtica, una cepa se compone de

    los descendientes de un solo aislamiento en cultivo puro y por lo general se compone de

    Montaje del andamio

    Eliminacin del andamio

    Subunidadde la cpside

    EnsambleEstructura

    madura

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    una sucesin de cultivos que en ltima instancia son derivados de una sola colonia inicial

    (Dijkshoorn et al. 2000).

    As, dada esta definicin, podemos mencionar que hay cuatro tipos de bacterias, de las

    cuales se obtienen cepas bacterianas de inters prctico para la actividad humana. Estos

    tipos de bacterias son:

    Staphylococcus aureus

    El Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva de forma esfrica que crece

    entre los 10 y45C, con un pH de entre 4 y 9. Sin embargo, su temperatura ptima de

    desarrollo est comprendida entre los 30 y 37C, y el rango ptimo de pH oscila entre 7 y

    7,5.A pesar de no ser esporgenas, las bacterias estafilococos muestran una notable

    resistencia a las condiciones ambientales desfavorables. Generalmente, se encuentra en

    el agua, en la piel y en las mucosas. Cuando se introduce en nuestro organismo, puede

    generar infecciones de distinta naturaleza.

    Las infecciones provocadas por el Staphylococcus aureus, contradas en ambientes

    hospitalarios, suelen estar causadas por estpites resistentes a las quimioterapias y, a

    menudo, se manifiestan en forma epidmica. El brote de estas epidemias puede significar,

    en determinadas salas, un evento de particular gravedad, que puede ocasionar serios

    problemas profilcticos y teraputicos (Suzuki et. al. 2012, Rolo et. al. 2012).

    Escherichia coli (E.coli)

    Pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae, microorganismos Gram negativos

    ubiquitarios, que se encuentran en el suelo, el agua, la vegetacin y forman parte de la

    flora intestinal de la mayor parte de los animales, incluido, el ser humano. Su cultivo es

    muy sencillo y presenta una gran tolerancia de variacin de pH, con un valor ptimo de

    7.5; la temperatura ideal de crecimiento es 37C. Esta bacteria es resistente al calor:

    temperatura de encubado 45C.

    El Escherichia coli es un husped habitual del organismo humano y representa la especie

    predominante de la comunidad bacteriana facultativa que reside en el intestino grueso;

    por ello, su presencia en un material determinado (por ejemplo, agua) puede considerarse

    un indicio seguro de contaminacin fecal (Jafari et. al. 2012, Pobiega et. al. 2013).

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Pseudomonas aeruginosa

    La Peudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, que crece a temperaturas

    que oscilan entre los 4 y 42C. Sin embargo, no puede desarrollarse con un pH inferior a

    4,5. Generalmente se le encuentra en el agua, el suelo y, como husped, en la piel y el

    intestino. Su desarrollo se vea favorecido por cualquier tratamiento con medicamentos

    antibacteriales, ya que su desarrollo se ve favorecido por cualquier antibitico. Al reducir

    el resto de la poblacin microbiana, permite que la bacteria incremente su nmero; bajo

    otras circunstancias, este incremento resultara imposible (Haynes 1951).

    Enterococcus faecalis

    Dentro de las especies de procariontes clasificadas como Gram positivas, los enterococos

    representan una especie que suele estar presente de forma natural en la microbiota

    intestinal de los animales, aunque tambin pueden estar presentes en las plantas e

    insectos. Acorde a lo anterior suelen ser empleados como indicadores de contaminacin

    fecal en el agua y en los alimentos. Las condiciones de crecimiento que las favorecen,

    involucran temperaturas entre los 10o y los 45o, incluso pueden sobrevivir a 60o durante un

    tiempo de 30 minutos; en medios con soluciones de NaCl al 6,5% y pH de 9,6.

    Los enterococos son bacterias dotadas de un bajo poder patgeno pero poseen genes

    que codifican la resistencia a algunos antibiticos y, por consiguiente, logran sobrevivir en

    ambientes en los que stos son muy utilizados. De hecho, en los ltimos 15 aos, han

    sido frecuentemente causa de infecciones hospitalarias (Jett et. al. 1994).

    Las cepas bacterianas relacionadas con las bacterias relacionadas anteriormente se

    presentan en la siguiente tabla:

    Nombre de cepa Nmero

    Identificacin Caracterstica

    Escherichia coli O157:H7 Sin nmero

    Bacilo gramnegativo

    Enteropatgeno Grupo E. coli

    Enterohemorrgico, ECEH. Cepa

    No Toxignica

    Escherichia coli ATCC 25922 Bacilo gramnegativo, familia

    Enterobacteriaceae

    Escherichia coli ATCC 35218 Bacilo gramnegativo

    Familia Enterobacteriaceae

    Enterococcus faecalis ATCC 29212 Coccea grampositiva

    Enterococcus faecalis ATCC 51299 Coccea grampositiva, resistente a

    vancomicina fenotipo Van B.

    Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bacilo gramnegativo, no

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    fermentador (BNF)

    Staphylococcus aureus ATCC 25923 Coccea grampositiva, en racimo

    Staphylococcus aureus ATCC BA 976

    Coccea grampostiva, negativa

    resistencia inducible a clindamicina.

    gen msrA

    Staphylococcus aureus ATCC BA 977

    Coccea grampostiva, positiva

    resistencia inducible a clindamicina.

    gen ermA

    * Las siglas ATCC significan American Type Culture Collection.

    Como las cepas bacterianas suponen cada vez mayores retos para la salud humana,

    incluyendo aumento de la virulencia y la transmisibilidad, la resistencia a mltiples

    antibiticos, la expansin de los espectros de acogida, y la posibilidad de manipulacin

    gentica para el bioterrorismo. Se han creado nuevas herramientas para la tipificacin de

    cepas bacterianas o la identificacin de las bacterias a nivel de cepa, es particularmente

    importante para el diagnstico, tratamiento y vigilancia epidemiolgica de las infecciones

    bacterianas. Este es especialmente el caso para las bacterias que exhiben altos niveles

    de resistencia a los antibiticos o la virulencia, y aquellos implicados en las infecciones

    nosocomiales o pandemias.

    As, durante las dos ltimas dcadas, los mtodos moleculares han reemplazado

    progresivamente ensayos fenotpicos para describir cepas bacterianas. En teora, hay dos

    sistemas de tipificacin distintos: fenotipificacin y genotipificacin. El fenotipo bacteriano

    es determinado por la morfologa de las colonias en diversos medios de cultivo, pruebas

    bioqumicas, serolgicas, patogenicidad y susceptibilidad a los antibiticos. Ms

    recientemente, la genotipificacin, que se refiere a la discriminacin de las cepas

    bacterianas en funcin de su contenido gentico, se ha convertido en la tipificacin

    ampliamente utilizada para una cepa bacteriana debido a su alta resolucin. El perfil

    gentico de una cepa dada generada por un mtodo de determinacin del genotipo

    especfico puede ser tan nico como una huella dactilar. Por lo tanto, genotipificacin

    tambin se conoce como huella de ADN.

    Mtodos de caracterizacin de cepas bacterianas actuales pueden clasificarse en tres

    categoras principales: patrn de bandas de ADN, secuenciacin de ADN, y los mtodos

    basados en la hibridacin de ADN. Los mtodos basados en el patrn de bandas ADN

    discriminan las cepas estudiadas sobre la base de las diferencias en el tamao de las

    bandas de ADN (fragmentos) generados por la amplificacin de ADN genmico o

    mediante la escisin de ADN utilizando enzimas de restriccin (ER).

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Los mtodos basados en la secuenciacin de ADN generan una secuencia original de

    nucletidos y discrimina entre las cepas bacterianas directamente de polimorfismos en el

    ADN. Los mtodos basados en la hibridacin de ADN se refiere principalmente a que el

    estudios de microarreglos de ADN. En esta tcnica, las cepas bacterianas se discriminan

    por el anlisis de la hibridacin de su ADN para sondas de secuencias conocidas.

    Con la excepcin de la secuenciacin del genoma, la capacidad discriminatoria de

    mtodos de genotipificacin es dependiente de la especie (Li et. al. 2009)

    2.2.4. Seleccin de bacterias recombinantes por resistencia a drogas

    Con objeto de identificar el xito de la recombinacin, resulta fundamental revisar el

    concepto de seleccin, ya que cuando se trata de examinar una poblacin bacteriana

    (ms de 108 clulas/mL promedio en un cultivo celular) no es factible realizar un anlisis

    macroscpico, ya que en muchas ocasiones los cambios involucrados suelen ser a nivel

    de una ruta metablica y resulta imposible distinguir un cambio fsico a simple vista en la

    poblacin bacteriana. Por tanto, valorar el crecimiento en determinadas condiciones

    nutrimentales o bien ambientales, resulta ser una excelente estrategia, ya que solo

    aquellas clulas que hayan adquirido un nuevo fenotipo (una o ms caracterstica

    observables) como resultado de la transferencia de ADN sern capaces de crecer y

    dividirse en dichas condiciones. Ejemplos de agentes de seleccin utilizados para prevenir

    el crecimiento de las clulas parenterales (aquellas que carecen de ADN recombinante)

    son: antibiticos, bacterifagos y pueden requerir de factores de crecimiento (Birge 2006).

    Ahora bien la eleccin de dichos agentes para la seleccin bacteriana va a depender del

    sistema de expresin que se utilice, es decir, en el caso de un plsmido, el uso de un

    antibitico determinado depender de que dicho vector de expresin tenga el gen que le

    confiere la resistencia al antibitico (Figura 11).

    A continuacin se presentan los pasos generales para determinar el xito del evento de

    transferencia del material gentico a travs de valorar su transmisin a la progenie por su

    resistencia a una droga que fue adquirida por la clula receptora, siendo el principio para

    la obtencin de una bacteria genticamente modificada.

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    Actividad 1. Uso y manejo de GMO

    Con la finalidad de confirmar el aprendizaje de los conceptos revisados, debers discutir

    con tus compaeros(as) sobre el uso y manejo de los organismos genticamente

    modificados. Plantears una postura y argumentars tu aportacin en funcin de la

    lectura de un artculo previamente proporcionado.

    1. Revisa detenidamente el siguiente artculo:

    Comit de Biotecnologa de la Academia Mexicana de Ciencias (2007). Por un

    uso responsable de los organismos genticamente modificados. Recuperado de:

    http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/por_un_uso_responsable_ogms.pdf

    Si lo deseas, puedes descargarlo desde la pestaa de la unidad.

    2. Ingresa al foro destinado a la actividad y elabora una aportacin que desarrolle

    los siguientes puntos:

    a) Asume una postura ante el uso y manejo de los GMO.

    b) Justifica tu postura indicando:

    i. Por lo menos una ventaja o desventaja del uso y manejo de los GMO.

    ii. Un ejemplo o producto de GMO.

    iii. Una implicacin ambiental del uso y manejo del GMO o producto

    GMO.

    iv. Una perspectiva de esta aplicacin.

    3. Brinda un comentario a dos compaeros, tomando como base los puntos

    solicitados.

    4. No olvides ser claro y breve en tus participaciones, abarcando slo los aspectos

    que realmente consideres relevantes.

    *Recuerda que puedes descargar la rbrica general para actividades en el Foro en la

    pestaa de la unidad.

    Actividad 2. Transferencia de material gentico (Tarea)

    Se revisaron trminos necesarios para la comprensin de los mecanismos de

    transferencia de la informacin gentica, conceptos tericos esenciales para realizar

    estrategias de biologa molecular y tecnologa recombinante.

    Para demostrar que puedes describir los conceptos revisados, debers realizar la

  • Ciencias de la Salud Biolgicas y Ambientales | Ingeniera en Biotecnologa

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    Gentica molecular bacteriana Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

    siguiente actividad:

    1. Elabora un cuadro comparativo en el que describas las tres estrategias de

    transferencia de material gentico donde incluyas las diferencias y similitudes

    entre las mismas.

    2. Compara las ventajas de cada tipo de mecanismo de recombinacin bacteriana

    y describe un ejemplo en cada caso, puedes apoyarte en imgenes.

    3. Guarda tu trabajo en un archivo de Power point y envalo a la seccin Tareas

    con la siguiente nomenclatura: BGMB_U2_A2_XXYZ.

    4. Espera l