Caracterización de bacterias filamentosas en biorreactores de estaciones depuradoras del sector petroquímico

A. Zornozaa,b, J.L. Alonsoc, G. Cuestad, A. Solerd

a Grupo Aguas de Valencia. EDAR Quart Benager, EPSAR. Camino de Picaña 16, 46014 Valencia, (E-mail: azornoza@aguasdevalencia.es)b Asociación Científica Grupo Bioindicación de Sevilla (GBS), EDAR La Ranilla. San José de Palmete s/n, Sevilla 41006. Apdo 7279 (E-mail: grupobioindicacionsevilla@hotmail.com)c Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera 14, 46022 Valencia, (E-mail: jalonso@ihdr.upv.es)d Área de Microbiología. Departamento de Biotecnología. E. T. S. I. Agrónomos, Universidad Politécnica de Valencia, (E-mail: goncueam@btc.upv.es; alsoher@etsia.upv.es)* Con la colaboración de las unidades de Protección Ambiental y plantas de CEPSA. Av. Partenón 12 2ª, 28042 Madrid (E-mail: manuel.pacheco@cepsa.com)

Los residuos industriales líquidos (RILES) son aguas de desecho generadas en la industria. Estos vertidos plantean, por sus particulares características, una grave problemática para su incorporación a redes urbanas o su vertido directo, que para ser desechados necesitan ser tratados previamente. El conseguir los niveles de depuración exigibles para las aguas residuales de cualquier comunidad, pasa por exigir los mecanismos correspondientes de depuración a las estaciones depuradoras de aguas residuales industriales (EDARI). Sus biorreactores se caracterizan por la escasa biodiversidad dentro de la comunidad de protozoos y metazoos, llegando incluso en muchos casos a estar ausentes. Por el contrario, es frecuente la presencia de bacterias filamentosas adaptadas a las diversas condicionesambientales que ofrecen los distintos sectores industriales. Incluso dentro de cada sector, y dado la multitud de procesos y maneras de operar, la diversidad prevalece ofreciendo una fuente importante de estudio dentro del campo de la taxonomía, ecología y biotecnología. En el sector de refino de petróleo, los contaminantes que llegan a la EDARI varían en función de los crudos que se procesan, de la complejidad y tipos de procesos de cada planta, la integración y tipo de petroquímica derivada que incorporen, tratamientos específicos de corrientes, etc. Estos están representados de forma general por: hidrocarburos alifáticos, aromáticos, minerales insolubles, arenas y arcillas, sulfuros, ácidos orgánicos, mercaptanos, fenoles, cresoles, aldehidos, amonio, urea, aminas, tiosulfatos, fluoruros. Los contaminantes de las plantas petroquímicas son específicos de cada proceso. En la fabricación de fenol-acetona: fenol, cumenos y derivados e intermedios y en la síntesis de aminas: alquilaminas. En la síntesis de isómeros de ácido ftálico: ácidos, intermedios y derivados. El objetivo de este trabajo es la identificación de bacterias filamentosas presentes en fangos activos de instalaciones depuradoras dentro de estos sectores, tanto a nivel convencional como utilizando la técnica de hibridación in situ (FISH), así como el asislamiento de actinomicetos nocardioformes.

Resultados y discusión

Materiales y métodos

Introducción

Patrocinadores GBS: COSELA, AGUA Y GESTION-BEFESA, TECNOLOGIA DEL AGUA, DAM, GRUPO AGUAS DE VALENCIA, SURCIS, IZASA y EMASESA

Tabla 1: CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS Y RESPUESTA A TINCIONES

Se han tomado 24 muestras de biorreactores en 4 estaciones depuradoras de las distintas factorías de la empresa CEPSA: planta de Palos de la Frontera, Guadarranque, refinería la Rábida y Gibraltar-San Roque. El análisis microscópico convencional de las bacterias filamentosas se ha llevado a cabo siguiendo los criterios descritos en Eikelboom (2000) y Jenkins et al., 2004, tomándose como referencia la relación de organismos filamentosos en EDARI descritos por Eikelboom (2006). Técnica FISH: Las sondas utilizadas para la identificación de los morfotipos filamentosos y comunidades de bacterias del flóculo han sido: EUB 338 I, II, III y IV, ALF1b, BET42a, GAM42a, HGC69a y HGC1156, GNSB941 y CFX1223, TM7-905, LGC mix: sondas LGC354A, 354B y 354C, CF319a NLIM mix: sondas 301, ML 792 y 830, MYC657, Mpa-all-1410, MPA645, Mpa-T1-1260, GOR0596, Noli-644; AHW183, Meg 983 y 1028, HHY, HHYall-654, LDI, CHL1851. Las muestras con la sonda de mycolata se trataron con mutanolisina antes de la hibridación, y las muestras con las sondas de Actinobacteria, Gordonia y Firmicutes se trataron con lisozima antes de la hibridación.Para el aislamiento de actinomicetos nocardioformes que contienen ácidos micólicos (mycolata) se ha utilizado el medio Czapeck modificado suplementado con ácido nalidixico. Las colonias con morfología típica y las más abundantes fueron sembradas en el medio ISP-2 para obtener un cultivo puro. El contenido en ácidos micólicos se determinó por cromatografía en capa fina. Las cepas se sembraron en el medio M9 conteniendo fenol como única fuente de carbono a diferentes concentraciones. Como control positivo se utilizó el medio M9 conteniendo glucosa como fuente de carbono.

Con la técnica FISH se han identificado morfotipos filamentososasociándolos a distinto nivel taxonómico con los resultados obtenidos a nivel convencional. En la planta de Palos de la Frontera las bacterias del flóculo han correspondido a la clase alfa-Proteobacteria y al phylumActinobacteria, encontrandose la clase beta-Proteobacteria muy poco representada. En la planta de Guadarranque las comunidades de bacterias dominantes en el flóculo han sido las beta-Proteobacteria, alfa-Proteobacteria y phylum Actinobacteria. En la EDAR de la refinería la Rábida las comunidades bacterianas del flóculo correspondían a las clases alfa-Proteobacteria, beta-Proteobacteria, gamma-Proteobacteria y al phylum Actinobacteria. En la EDAR de la refinería de Gibraltar la comunidad bacteriana dominante ha sido la beta-Proteobacteria, seguida de alfa-Proteobacteria y gamma-Proteobacteria. Algunos ejemplos de morfotipos filamentosos identificados con la técnica FISH son el grupo Mycolata (CP-18), Isosphaera sp. (CP-08), correspondiente al morfotipoNostocoida limicola III y que aparece tanto en forma filamentosa como células aisladas. Otro morfotipo filamentoso identificado ha sido Ca. “Monilibacter batavus” (CP-15), que aparece ramificado y que también es un morfotipo N. limicola. Los morfotipos N. limicola I, II y III se asocian con bajas cargas másicas, déficit de nutrientes (fósforo, nitrógeno) y niveles bajos de O2 disuelto (Jenkins et al., 1993; Eikelboom, 1983). Sin embargo, los resultados obtenidos demuestran que pueden corresponder a diferentes especies de bacterias, con características fisiológicas y ecológicas diferentes. Por tanto, establecer medidas de control de estos en función solo de sus características morfológicas puede ser arriesgado, como señalan también otros autores (Liu y Seviour, 2001).Se han obtenido en cultivo puro 18 cepas de actinomicetos de las plantas estudiadas. Todas son Gram positivas con morfología que varia desdeformas cocoides, filamentosas y ramificadas. Todas las cepas aisladas excepto una contenian ácidos micólicos. Esta última fué aislada de la planta Palos de la Frontera y es la bacteria más abundante. Estudios morfologícosy de FISH confirman tambien en esta planta la presencia de un organismo filamentoso similar a M. parvicella (CP-02) que pertenece al phylum Actinobacteria pero que no hibrida con las sondas de Mycolata y M. parvicella. En el mismo bioreactor se ha aislado una cepa que es capaz de crecer utilizando fenol como única fuente de carbono.

FISH: CP-18sonda Myc657 Mycolata, 1.000x

FISH: CP-08 Isosphaera sp. Sonda mix: NLIMIII 301, NLIMIII 792, NLIMIII 830, 1.000x

FISH: CP-15 Ca.“Monilibacter batavus”Sonda MC2-649, 1.000x

Bacterias en medio Czapeck de la refineria de la Rábida. Las colonias naranjas son mycolata

Cultivo puro de mycolata de la refinería de la Rabida en medio ISP-2

Bacterias en medio Czapeck de la refineria de Palos de la Frontera.

Colonia aislada de la refinería de Palos de la Frontera creciendo en el medio M9 con fenol como única fuente de carbono

Fenol 0,1%

Control positivo con glucosa 0,1%

Se han descrito 20 bacterias filamentosas que responden a diferentes características morfológicas y tinciones simples diferenciales (tabla 1). De manera provisional y para facilitar su manejo han sido nombradas con un código numérico precedido de unas siglas “CP-XX” (1000x).

BACTERIAFILAMENTOSA

(presencia)

Morf.Tricoma

Localización deltricoma

Diámetro tricoma (µm)

Longitudtricoma(µm)

Morf.celular

Ramif SeptosCelulares

Constricc.en septos

Crec.Epifítico

CristalVioleta (vaina)

TinciónGram

TinciónNeissertricoma

TinciónNeissergránulos

PHA

CP-01(Palos)

Recto, lig. curvado

Extendiéndose desde el floc., libre

Aprox. 1 < 200 Rectangular(difícil ver)

NO SI(difícil ver)

NO NO SI - - + (debil)

NO

CP-02(Palos)

Torcido, curvado Extendiéndose desde el floc., libre

< 1 < 200 No se observa

NO NO NO NO NO + - + NO

CP-03(Palos)

Torcido, curvado (irregular)

Extendiéndose desde el floc., libre

Aprox. 1 < 200 Oval(difícil ver)

NO SI(difícil ver)

SI NO NO + (fuerte)

- + NO

CP-04(Palos)

Micelial Interior > 1 < 200 No se observa

SI SI SI NO NO + (fuerte)

- - NO

CP-05(Palos,

Gibr.,Guad.Rab.)

Recto Extendiéndose desde el flóculo

< 1 < 200 Rectangular(difícil ver)

NO SI(difícil ver)

NO NO NO - - - NO

CP-06(Palos)

Torcido, curvado Libre, interior Aprox. 1 < 200 Esférica NO SI SI NO NO + (fuerte)

- + NO

CP-07(Guadarranque)

Torcido, curvado Libre, interior > 1 < 200 Esférica oval,

discoidal

NO SI SI NO NO - - - NO

CP-08(Gibr.,Guad.,Rab.)

Torcido, curvado Libre, interior > 1 < 200 Oval, esférica

NO SI SI NO SI - - - NO

CP-09(Guadarranque)

Recto, torcido, lig. curvado

Extendiéndose desde el flóculo

> 1 > 200 Rectangular NO SI NO SI SI - variable - NO

CP-10(Guadarranque)

Recto, curvado Extendiéndose desde el flóculo

> 1 > 200 Cuadrada(difícil ver)

NO SI(difícil ver)

NO SI SI - - - SI

CP-11(Gibr., Rab.)

Recto, torcido, lig. curvado

Extendiéndose desde el flóc. libre

> 1 < 200 Rectangular,cuadrada

NO SI NO SI SI - - + NO

CP-12(Rabida)

Recto y curvado Extendiéndose desde el floc., libre

< 1 < 200 Rectangular NO SI NO NO SI - - + NO

CP-13(Gibraltar)

Recto, torcido, lig. curvado

Extendiéndose desde el floc., libre

Aprox. 1 < 200 Cuadrada,rectangular

NO SI NO NO SI - + - SI

CP-14(Gibraltar)

Recto, torcido, lig. curvado

Extendiéndose desde el flóculo

Aprox. 1 < 200 Bacilar Si(falsa)

SI SI NO SI + - + NO

CP-15(Gibraltar)

Torcido, curvado, enrollado

Libre, interior > 1 < 200 Oval, esférica

SI SI SI NO SI - - - SI

CP-16(Gibraltar)

Recto, lig. curvado

Extendiéndose desde el flóculo

> 1 < 200 Rectangular NO SI(difícil ver)

NO SI SI - variable - NO

CP-17(Gibraltar)

Torcido, curvado, enrollado

Extendiéndose desde el floc., libre

> 1 < 200 discoidal NO SI SI NO SI - - - NO

CP-18(Gibraltar)

Micelial Extendiéndose desde el floc., libre

> 1 < 200 No se observa

SI NO NO NO NO + (fuerte)

- + (fuerte)

NO

CP-19(Gibraltar)

Recto, curvado Extendiéndose desde el flóculo

< 1 < 200 Rectangular(difícil ver)

NO SI(difícil ver)

NO SI SI - - - NO

CP-20(Gibraltar)

Torcido, curvado Extendiéndose desde el floc., libre

< 0,5 < 200 No se observa

NO NO NO NO SI + - - NO

CP-03CP-01 CP-02 CP-04 CP-05

CP-06 CP-07 CP-08 CP-09 CP-10

CP-11 CP-12 CP-13 CP-14 CP-15

CP-16 CP-17 CP-18 CP-19 CP-20

FISH: CP-07Sonda: ALF1b, 1.000x