© VI Jornadas de Transferencia de Tecnología sobre Microbiología del Fango Activo (2009), Sevilla. Spain. Asociación Científica Grupo Bioindicación de Sevilla

Parámetros biológicos relacionados con la eliminación de nitrógeno en fangos activos. Análisis multivariante en el desarrollo de un índice biológico en estos sistemas. B. PÉREZ-UZ*1, L. ARREGUI*1, P. CALVO*, H. SALVADÓ**, N. FERNÁNDEZ°, E. RODRIGUEZ°, A. ZORNOZA°°, AND S. SERRANO* 1 figuran ambas como primer autor. Presenta B. Pérez-Uz * Dept. Microbiología III. Facultad CC. Biologicas. Universidad Complutense de Madrid. ** Dept. Biologia Animal, Facultat Biologia. Universitat de Barcelona. ° Grupo de Bioindicación de Sevilla (GBS). °° Grupo aguas de Valencia. EDAR Quart-Benager, EPSAR. Valencia. 1. INTRODUCCIÓN La evaluación de la eficiencia y el estado en los sistemas biológicos de tratamiento de aguas residuales, utilizando protistas como indicadores, ha sido un instrumento explorado por muchos autores (Curds & Cockburn, 1970b; Kinner et al., 1989; Madoni, 1991; Madoni, 1994a; Luna- Pabello et al., 1990; Esteban et al. 1990; Al-Shahwani & Horan, 1991; Salvadó et al., 1995; Martín-Cerceda et al., 2002; Lee et al., 2004). Las condiciones ambientales en los reactores biológicos determinan las especies capaces de sobrevivir en ellos. Por esta razón, los protistas y secundariamente las bacterias filamentosas dominantes, son buenos bioindicadores tanto de la calidad del efluente como del estado biológico de los tanques de aireación (Poole, 1984; Luna-Pabello et al., 1996; Chen et al., 2004; Zhou et al. 2006).

Se ha asumido que las poblaciones microbianas en diferentes sistemas biológicos de tratamiento deberían de ser similares; sin embargo, el hecho es que éstas varían en función del tipo de tratamiento biológico a evaluar. Las comunidades microbianas en sistemas convencionales de fangos activos (Curds & Cockburn, 1970a; Esteban et al., 1991; Madoni 1994b; Martín-Cereceda et al., 1996) son distintas de aquellas descritas en biopelículas (Kinner et al., 1988; Pérez-Uz et al., 1998; Martín-Cerceda et al., 2001) o en sistemas avanzados para la eliminación de nutrientes (Pérez-Uz et al., 2007; Serrano et al., 2008; resultados no publicados). Los estudios previos de plantas convencionales no son, por tanto, extrapolables a otros tipos de tratamientos.

Las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) con sistemas avanzados para la eliminación de nutrientes son, en la actualidad, la alternativa utilizada en la implementación de la directiva Marco del Agua (EU Water Framework Directive / 2000/60/EC) para evitar un mayor deterioro de los ecosistemas acuáticos.

En este trabajo se exponen los resultados del estudio de las comunidades biológicas en este tipo de tratamientos avanzados para la eliminación de compuestos nitrogenados en tres plantas de fangos activos, con diferentes diseños,

mediante una colaboración Universidad–Empresa. Los resultados se han analizado buscando posibles correlaciones o asociaciones entre las distintas variables (biológicas, biológicas/físico-químicas), con el fin de encontrar posibles bioindicadores en estos sistemas biológicos. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales Se realizaron muestreos periódicos en tres EDAR de fangos activos (Sevilla, Valencia y Barcelona) con distintos sistemas avanzados para la eliminación de nutrientes. Estas depuradoras están diseñadas para el desarrollo de poblaciones bacterianas implicadas en procesos de nitrificación/desnitrificación, alternando zonas óxicas y anóxicas, aunque una de las plantas presentaba también zona anaerobia para la eliminación de otros nutrientes. Las diferencias en la configuración del sistema biológico permitieron obtener muestras con eficiencias variables (Tabla 1) en la eliminación de nitrógeno.

Tabla 1. Eficiencias medias en DBO5, DQO y eliminación de N en los reactores biológicos de las EDAR. Diseños de los tanques de aireación EDAR Barcelona Sevilla Valencia

DBO5 (mg/L) 79-99 % 80-98 % 93-97 %

DQO (mg/L) 85-100 % 89-98 % 91-94 %

N-total (mg/L) 90 % 70 % 50 %

DISEÑO A2O Carrusel AO

2.2. Muestras de fangos activos de las EDAR Los muestreos se llevaron a cabo una vez al mes durante un año (desde Mayo 2007 hasta Julio 2008). Las muestras se tomaron a la salida de la zona aeróbica del reactor biológico, sumergiendo un frasco de plástico unos 30 cm y recogiendo un volumen de muestra que ocupara

2 Parámetros biológicos relacionados con la eliminación de nitrógeno en fangos activos

aproximadamente la mitad del volumen total del contenedor. 2.3. Enumeración y caracterización microscópica de Protistas Las muestras se mantuvieron en agitación y se procesaron durante las tres horas siguientes al muestreo. Los recuentos se realizaron tomando dos replicas de 25 µl, a 100 aumentos en el microscopio de contraste de fases. La identificación se llevó a cabo realizando observaciones “in situ” (fotografías y vídeos), así como tinciones argénticas o con Flutax. 2.4. Análisis físico-quimicos Los parámetros físico-químicos (DBO5, DQO, N-NH4

+, N-NO2

-, N-NO3- y N-total/N-Kjeldahl) se analizaron siguiendo

los métodos estandar (APHA, 1998) sobre muestras recogidas a la entrada y la salida del tratamiento biológico. 2.5. Análisis estadístico Los análisis estadísticos univariantes y multivariantes se llevaron a cabo con los paquetes estadísticos Statgraphic Plus v.5.1 y SPAD v.7.0. Se emplearon las abundancias relativas (porcentaje de protistas totales presentes) (Parker & Arnold, 1999). El análisis multivariante sólo se llevó a cabo sobre aquellos recuentos de protistas que mostraron una frecuencia de aparición en los muestreos superior al 20%. Se utilizó un análisis de componentes principales (PCA) para la ordenación de los muestreos considerando únicamente las variables biológicas. Los factores de este análisis que explicaban entre un 80-90% de porcentaje acumulativo se seleccionaron para realizar un posterior análisis cluster jerárquico (protocolo del vecino más cercano, módulo RECIP en SPAD v.7.0), utilizando entonces las variables físico-químicas como variables continuas suplementarias.

Los grupos obtenidos se evaluaron con un t-test para definir las variables biológicas y/o físico-químicas que se asociaban significativamente a estos.

El número total de taxones, individuos e índices de diversidad de Shannon–Weaver (Shannon and Weaver, 1963) se calcularon para cada uno de los sitios de muestreo, y para cada grupo de protistas considerados (flagelados, amebas y ciliados). Las relaciones entre estas variables se establecieron utilizando análisis de regresión simple

.

3. RESULTADOS Los datos obtenidos mostraron que la comunidad de protistas asociada a la zona óxica del reactor biológico, donde se produce el proceso de nitrificación, tiene una composición diferente a la de una planta de fangos activos convencional. 3.1. Flagelados Estos tratamientos avanzados mostraron que los flagelados representan una población estable en el reactor biológico (87% del total de la población), y que su densidad decrecía drásticamente cuando la eficiencia en eliminación de nitrógeno era moderada o baja. Por el contrario, su porcentaje de aparición, en cuanto a número de taxones, se incrementó cuando la eficiencia en la eliminación de nitrógeno aumentó (p=0.01).

Los bodónidos fueron el grupo de flagelados más representativo (Fig. 1a): estuvieron presentes en más del 50% de las muestras cuando la eficiencia en la nitrificación era mayor del 85% (los datos de frecuencia absoluta confirmaron la presencia significativa de bodónidos en la población total de protistas). Los bodónidos, de hecho, estuvieron significativamente asociados (p<0.0001) a una eficiencia elevada en la eliminación de nitrógeno (tanto de N-NH4

+ como de N-Total/NKjeldahl) y de DBO5, lo cual fue muy frecuente en las muestras de Barcelona y en algunas de las muestras de Sevilla. Una reducción en la eficiencia de eliminación de nitrógeno también disminuyó significativamente tanto la presencia como la densidad de la población de flagelados (p=0.0159). 3.2. Amebas Las amebas de vida libre, tanto desnudas como testáceas (Fig 1b-d), constituyeron un grupo representativo y su porcentaje de aparición (11%) decreció a medida que la eficiencia en la eliminación de nitrógeno disminuía, especialmente la aparición de especies del género Arcella. Los porcentajes de aparición en las muestras de los dos tipos de amebas desnudas (mayores y menores de 50 µm) fueron similares. Sin embargo, las amebas pequeñas fueron las poblaciones más abundantes (ind/ml). Estas amebas pequeñas y especialmente aquellas menores de 50 µm (Fig 1c), mostraron una asociación significativa (p<0.01) con una elevada eficiencia en eliminación de nitrógeno (tanto N-NH4

+ como N-Total/N-Kjeldahl) y DBO5, como ocurrió con los bodónidos. La aparición y abundancia de amebas decreció significativamente a medida que la eficiencia en la eliminación de nitrógeno se redujo (p=0.0101).

PÉREZ-UZ et al. 3

Figura 1. (a) pequeños flagelados (b) Arcella sp., (c-d) amebas desnudas(>50, <50 µm), (e) Opercularia articulata, (f) Acineria uncinata, (g) Gastronauta membranaceus, (h) Epistylis balatónica, (i) Uronema nigricans. 3.3. Ciliados Los ciliados fueron el grupo de protistas con la mayor diversidad de especies (Fig 1e-i), aunque su abundancia total fue menor en comparación con la de otros tratamientos biológicos. Se observó que los ciliados mostraban una baja abundancia (5 %) en las muestras con una buena eficiencia en la nitrificación y la tendencia, en este grupo, fue disminuir a medida que aumentaba la eficiencia en la eliminación de N-NH4

+ (p=0,011). La diversidad de este grupo también decrecía cuando se incrementaba la eficiencia en la eliminación de la DBO5 (p=0.005).

El grupo más representativo, en términos de porcentaje de aparición y abundancia, fueron los peritricos, pero únicamente las especies Pseudovorticella elongata y Opercularia articulata aparecieron asociadas a elevadas eficiencias en eliminación de nitrógeno, aunque estas relaciones no fueron estadísticamente significativas.

La comunidad de ciliados reptantes estuvo compuesta por pocas especies de listostomados y cirtofóridos (pertenecientes a los filofaríngeos), especialmente Acineria sp. y Trochilia minuta, aunque éstas no mostraron relaciones significativas con la eliminación de nitrógeno. Se observó, sin embargo, que las muestras con una deficiente eliminación de nitrógeno (<50%) presentaban un bajo número de especies y los oligohymenóforos, principalmente escuticociliados (Fig 1i), alcanzaron porcentajes de aparición no observados en situaciones de alta eficiencia. En esta situación los cirtoforidos filofaringeos fueron sustituidos por los clásicos hipotricos reptantes (Aspidisca sp. y Euplotes sp.).

El ciliado prostomátido libre nadador, Plagiocampa rouxi, también parecía mostrar una asociación con elevada

eliminación de nitrógeno, aunque tampoco en este caso se obtuvo una significación estadística. 3.4. Análisis de la comunidad Los resultados obtenidos del análisis multivariante indicaron dos grupos claramente definidos. Un primer grupo de muestras con elevada eficiencia en la eliminación de nitrógeno y DBO5 agrupó todas aquellas muestras procedentes de las EDAR de Barcelona y algunas de la planta de Sevilla, mientras que el segundo agrupó todas las muestras de Valencia y otras de Sevilla. Entre aquellas muestras con buena eficiencia, las principales asociaciones estadísticamente significativas fueron aquellas de los bodónidos y las amebas pequeñas (<20 µm) con la existencia de nitrificación. Como ya se ha mencionado, aunque los resultados PCA mostraron también que los ciliados como Pseudovorticella elongata y Opercularia articulata parecían estar asociados a eficiencias elevadas en la eliminación de N, estos resultados no fueron estadísticamente significativos. Sin embargo, los resultados aquí indicaron que Uronema nigricans, Gastronauta membranaceus, y los peritricos Vorticella aquadulcis y Epistylis balatonica, estaban asociados a elevados valores de eliminación de DQO, que se producían característicamente cuando había bajas eficiencias en la nitrificación.

El segundo grupo confirmó los resultados obtenidos en el primero, ya que aquellas poblaciones de ciliados, flagelados o amebas asociadas al segundo factor con DQO fueron más abundantes en las muestras con los peores resultados en eficiencia de nitrificación (donde bodónidos y pequeñas amebas (<20 µm) estuvieron prácticamente ausentes).

a l

a c b d

e f g h i

4 Parámetros biológicos relacionados con la eliminación de nitrógeno en fangos activos

4. DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en sistemas diseñados para la eliminación de N muestran que las comunidades de protistas son diferentes de aquellas que se pueden encontrar en otros sistemas convencionales con fangos activos (Curds & Cockburn, 1970a; Esteban et al., 1991; Madoni, 1994a; Serrano et al., 2008).

En primer lugar, estas observaciones indican que los principales componentes de las poblaciones de protistas en tratamientos avanzados no son únicamente ciliados, dado que las amebas y los flagelados son también representativos de las poblaciones estables. Este resultado difiere claramente de lo observado en sistemas convencionales (Curds & Cockburn, 1970a; Esteban et al.,1991; Madoni 1994b; Martín-Cereceda et al., 1996). Los flagelados y las amebas en sistemas convencionales de fangos activos se han citado como inusuales, excepto en aquellas plantas con elevada sobrecarga o durante los estadios iniciales de la planta. Estos protistas han sido, por lo tanto, asociados normalmente a sistemas con deficiencias en el funcionamiento del sistema (Curds & Hawkes, 1975). Sin embargo, las amebas y flagelados en sistemas avanzados para eliminación de nutrientes parecen jugar un papel diferente, convirtiéndose en miembros representativos de las poblaciones estables, y están claramente asociadas a una buena eficiencia en la eliminación de nitrógeno. Por lo tanto, son candidatos apropiados a tener en cuenta en el desarrollo de un índice de eficiencia en estos sistemas. Los flagelados, específicamente bodónidos y pequeñas amebas (<20 µm) son depredadores de bacterias y pueden mantener otras poblaciones bacterianas en niveles bajos, permitiendo una mejor eficiencia en la actividad de bacterias nitrificantes en el flóculo (Mitchel et al., 1988). Este hecho se ha observado también en otros ecosistemas (Verhagen et al.,1994), y parece que la bacterivoría puede incrementar la mineralización de nitrógeno que queda así inmovilizado. Aunque las bacterias nitrificantes pueden también disminuir en presencia de flagelados a través de la depredación selectiva (Pernthaler et al., 1996, Verhagen, 1992, Mitchel et al., 1988), nuestros resultados indican indirectamente que su actividad se ve incrementada.

Las poblaciones de ciliados, en estos tratamientos avanzados, fueron los componentes principales de las comunidades de protistas, aunque con abundancias y diversidad más bajas que en otros sistemas biológicos de tratamiento de aguas residuales (Curds & Cockburn, 1970a; Esteban et al., 1991; Madoni 1994b; Martín-Cereceda et al., 1996; Kinner et al., 1988; Pérez-Uz et al., 1998; Martín-Cerceda et al., 2001). La menor abundancia encontrada en las muestras con una buena eficiencia en el proceso de nitrificación y en la eliminación de DBO5, comparada con otras poblaciones de protistas, fue sorprendente inicialmente y los resultados obtenidos en

este caso indican que algunos ciliados podrían utilizarse como indicadores de baja eficiencia en el sistema.

Estos resultados son obviamente una característica que también podría utilizarse como parte del diseño de un índice biológico. Con respecto a su relación con bacterias nitrificantes, algunos estudios han encontrado que los ciliados no parecen tener una influencia ni en la abundancia ni en el crecimiento de las bacterias nitrificantes ni, por lo tanto, en la nitrificación (Neubacher et al., 2008); y nuestros resultados iniciales parecen corroborar estas observaciones.

Por otro lado, se ha observado también que algunos de los ciliados libre nadadores, que fueron considerados anteriormente como indicadores de un mal funcionamiento en EDAR (como ocurría con los flagelados y las amebas) según este estudio podrían estar asociados a una buena eficiencia en la nitrificación. Este fue el caso del depredador Plagiocampa rouxi, ciliado prostómido que depreda sobre partículas grandes. Es interesante indicar que otros prostómidos como especies del género Coleps se han considerado como buenos indicadores de eliminación de nitrógeno (Poole, 1984; Madoni et al., 1993). 5. CONCLUSIONES Los bodónidos y amebas pequeñas (<20 µm) son importantes miembros de las poblaciones biológicas en los sistemas avanzados para la eliminación de nitrógeno, indican buenas tasas de nitrificación en estos sistemas. Aunque algunos ciliados también parecen estar relacionados con eficiente eliminación de nitrógeno, no hemos obtenido hasta ahora resultados significativos, por lo que un muestreo más exhaustivo permitirá alcanzar una mejor comprensión de estas relaciones y en consecuencia la propuesta de índices biológicos más fiables. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen la ayuda financiera proporcionada por la UCM a través de los proyectos PR1A/07-15396 y PR1/08-15930-A y al Ministerio de Ciencia e Innovación por el proyecto PR: 10.0811-16182. Gracias especialmente a Santiago Cano, del Grupo de Apoyo a la Investigación (UCM), por su inestimable ayuda y discusión con el trabajo estadístico. REFERENCIAS Al-Shahwani, S.M. and Horan, N.J. (1991) The use of

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