2011_2 Cultivo de Tejidos I

7/27/2019 2011_2 Cultivo de Tejidos I

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Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

AgrobiotecnologaCurso 2011

Cultivo de tejidos vegetales IMara Mercedes Rivero


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Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

Micropropagacin vegetal

Consideraciones tcnicas de la propagacinclonal masiva de plantas

Etapas del cultivo in vitrode plantas superiores

Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis

Sistemas de micropropagacin vegetal.Proliferacin de yemas axilares o apicales

Sistemas de micropropagacin vegetal.Proliferacin de yemas axilares o apicales

Sistemas de micropropagacin vegetalCultivo de meristemas

Sistemas de micropropagacin vegetalLiberacin de patgenos

Sumario

Agrobiotecnologa

Cultivo de tejidosvegetales


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Referencias

Conservacin de germoplasma

Sumario

Semillas sintticas

Cultivo in vitrode clulas haploides y de embriones

-Cultivo de anteras-Cultivo de polen-Cultivo de vulos-Cultivo de embriones

Cultivo de protoplastos

Variacin somaclonal

Agrobiotecnologa



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Tcnicas del cultivo de clulas

y tejidos vegetales

Agrobiotecnologa



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Existen tres conceptos bsicos quefundamentan el cultivo in vitrode clulasy tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciacin / Rediferenciacin

- Balance de reguladores del crecimientovegetal

Principales

conceptosfisiolgicosaplicablesa los cultivos

in vitro

Agrobiotecnologa



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La teora de la totipotencialidad celular, enunciadapor Haberlandt a principios del siglo XX, postula que todaclula vegetal individual es capaz de regenerar una plantaentera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado dediferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones

especficas referidas al medio del cultivo, relacioneshormonales, temperatura, fotoperodo, etc.

La desdiferenciacin consiste en la transformacin yprdida de las caractersticas de especializacin de un tipocelular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico.El siguiente paso involucrado en la regeneracin de unaplanta es la redifereciacin de las clulas previamentedesdiferenciadas.

Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balanceentre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,fundamentalmente de auxinas y citocininas.

Fundamentos

tericos yprcticosdel cultivode tejidos

vegetales

Agrobiotecnologa



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Regeneracin de plantas(embriognesis y organognesis)

Cultivo de meristemas

Cultivo de suspensiones de clulas vegetales


Cultivo de anteras

Cultivo de vulos y embriones

Tcnicas

del cultivode clulasy tejidosvegetales

Agrobiotecnologa



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Agrobiotecnologa



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Propagacin vegetativa rpida y a gran escala

Uniformidad seleccionada del material clonado

Multiplicacin de plantas recalcitrantes

a las tcnicas convencionales

Reduccin en el tiempo de multiplicaciny en el espacio requerido para tal fin

Mayor control sobre la sanidad del materialpropagado

Introduccin rpida de nuevos cultivares


Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal

Agrobiotecnologa


Alcances

de la micro-propagacinvegetal


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Consideraciones tcnicas de la propagacin

clonal masiva de plantas

Agrobiotecnologa



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Laboratorio

- Area de preparacin de medios- Area de lavado y esterilizacin- Cuarto estril- Cmara de cultivo

- Area de rusticacin

Material vegetal

- Plantas madres seleccionadas

(preacondicionamiento)- Explantos (eleccin, diseccin,esterilizacin, etc.)

Condiciones de cultivo

- Asepsia- Recipientes- Temperatura- Luz y fotoperodo

La micro-

propagacinrequiere unainfraestructuramnima

especializaday condicionescontroladas

de cultivo

Agrobiotecnologa



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Compuestos inorgnicosMacronutrientes: NO4

- , PO43- , K+, Ca2+,

Mg2+, SO4

2-

Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+,Mo2+, Co2+, I-

CarbohidratosSacarosa, glucosa, mio-inositol

VitaminasTiamina (B1)

PiridoxinaAcido nicotnico (C)

Biotina

AminocidosGlicina

Reguladores del crecimientoAuxinas

CitocininasGiberelinas

Soporte inerte (medios semislidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite

pH5,6 5,8

Esterilizacin1 atmsfera, 15 a 20 min en autoclave

Medios de cultivo: composicin general


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Soluciones concentradas de macroelementos (100x)

Soluciones concentradas de microelementos (100x)

Vitaminas grupo B (500 1000x)

Mio-inositol (100 mg/L)

Azcares: sacarosa o glucosa en concentracionesde aproximadamente 30 g/L

Agar-agar: hidrato de carbono de alto pesomolecular extrado a partir de algas. Se usa entre

5 y 10 g/L

Formulacin

bsica deun mediode cultivopara tejidos

vegetales

Agrobiotecnologa



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El metabolismo de los tejidos puede modificarsedependiendo de las caractersticas del medio decultivo (lquido o semi-slido).

En el caso de un medio slido, la concentracin

y calidad del gar pueden tener importantes efectosen el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad,crecimiento lento, etc.)

El cultivo en medio lquido resulta imprescindible

cuando la propagacin in vitroes desarrolladaa travs de las siguientes vas:

- Induccin de embriognesis- Cultivo de protoplastos- Cultivo de suspensiones celulares

Consistenciadel medio

Semislido

Lquido

Propiedades

fsicas delos mediosde cultivo

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Intercambio gaseoso:

Los recipientes de cultivo se tapan con un film depolietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambiode gases. La organognesis puede verse modificadasi el intercambio de gases se ve dificultado.

- La induccin de yemas a partir de callos

de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno

- La acumulacin de etileno puede inhibir

la regeneracin de brotes

pH:

- Constituye un factor crtico- Se ajusta en el rango 5,5-5,8

- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos

Propiedades

fsicas delos mediosde cultivo

Agrobiotecnologa



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Composicin de medios de cultivo comnmente usados

8,6121-ZnSO4.7H20

--0,0250,2-CuSO4

6,2135-H3BO3

--1010-MnSO4.H2O

-600---NaNO31.900-3002.50081KNO3

----142Ca(NO3)2

--134--(NH4)2SO4

---300-NH4H2PO4

1.650----NH4NO3

-750--65KCl

44075150200-CaCl2.2H2O

37025050040074MgSO4.7H2O

22,30,1---MnSO4.4H

2O

-125150--NaH2PO4.H2O

170---12KH2PO4

Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto

-

0,03

0,01

Heller

0,250,250,1-NaMoO4.2H2O

0,025---CuSO4.5H2O

0,830,751-KI

Murashige ySkoog

Gamborg(B5

Schenk yHildebrandt

(SH)White

8,6121-ZnSO4.7H20

--0,0250,2-CuSO4

6,2135-H3BO3

--1010-MnSO4.H2O

-600---NaNO31.900-3002.50081KNO3

----142Ca(NO3)2

--134--(NH4)2SO4

---300-NH4H2PO4

1.650----NH4NO3

-750--65KCl

44075150200-CaCl2.2H2O

37025050040074MgSO4.7H2O

22,30,1---MnSO4.4H

2O

-125150--NaH2PO4.H2O

170---12KH2PO4

Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto

-

0,03

0,01

Heller

0,250,250,1-NaMoO4.2H2O

0,025---CuSO4.5H2O

0,830,751-KI

Murashige ySkoog

Gamborg(B5

Schenk yHildebrandt

(SH)White


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Reguladores del crecimiento comnmente usadosen medios de cultivos vegetales

10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina

(kinetina)

10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolbily no debera ser

autoclavada

Las citoquininasson normalmente

disueltas enNaOH diludas oen etanol acuoso

10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas

10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-actico

10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-

diclorofenoxiacticoEl AIA puede seroxidado por clulas

vegetales. Esfrecuentemente usadocomo nica fuente deauxinas en el medio

de cultivo

Las auxinas sonusualmentetituladas ensolucin con

NaOH

10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacticoAuxina

10-7-10-5202,2NOAAcido -naftoxiactico

10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoactico

10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutrico

10-7-5x10-6

10-7-10-5

Rango deconcentracin

(M)

Soluble en agua

Preparacin desolucin stock

Es termolbil, no debeser autoclavada. Es

comnmente necesariopara la iniciacin o elmantenimiento decallos y cultivos en

suspensin. Algunasveces necesario para la

regeneracin deplntulas.

364,4GA3Acido giberelicoGiberelina

219,2ZeaZeatina

ComentariosPeso

MolecularAbreviaturaNombreClase

10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina

(kinetina)

10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolbily no debera ser

autoclavada

Las citoquininasson normalmente

disueltas enNaOH diludas oen etanol acuoso

10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas

10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-actico

10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-

diclorofenoxiacticoEl AIA puede seroxidado por clulas

vegetales. Esfrecuentemente usadocomo nica fuente deauxinas en el medio

de cultivo

Las auxinas sonusualmentetituladas ensolucin con

NaOH

10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacticoAuxina

10-7-10-5202,2NOAAcido -naftoxiactico

10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoactico

10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutrico

10-7-5x10-6

10-7-10-5

Rango deconcentracin

(M)

Soluble en agua

Preparacin desolucin stock

Es termolbil, no debeser autoclavada. Es

comnmente necesariopara la iniciacin o elmantenimiento decallos y cultivos en

suspensin. Algunasveces necesario para la

regeneracin deplntulas.

364,4GA3Acido giberelicoGiberelina

219,2ZeaZeatina

ComentariosPeso

MolecularAbreviaturaNombreClase


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Grupos bsicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas- Citoquininas- Giberelinas- Acido abscsico- Etileno

Generalidades:

- Actan a bajas concentraciones

- Interactan unos con otros (los resultadosestn determinados por las concentracionesrelativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endgenos del crecimientoestn presentes en la planta durante todosu ciclo de vida pero su concentracin flucta.

Su concentracin relativa vara en funcindel estado fisiolgico de la planta y en cadauno de los rganos de sta.

- Estn involucrados en numerosos procesosfisiolgicos.

Reguladores

del crecimiento

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Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partirde bioensayos realizados para caracterizar el mensajero

responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpicadel coleoptile de gramneas.

- Alargamiento y divisin celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos- Formacin de races adventcias- Dominancia apical- Accin herbicida- Estimulacin de la produccin de etileno

Se sintetizan en las yemas, hojas jvenes, frutos y en elembrin. La concentracin endgena en la planta varaentre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

Su transporte es polar Auxinas sintticas:

- Acido indol butrico (IBA)- Acido naftalen actico (ANA)- 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)

NOH

O

Acido indol actico (AIA)

(auxina endgena)

Las auxinas se

emplean comopromotores dela proliferacincelular y la

induccin de lamorfognesis

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Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias

promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas:

- Promocin de la divisin celular

- Promocin de la organognesis (relacinauxinas/citoquininas)

- Retardo de la senescencia- Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

Citoquininas endgenas:

- Zeatina (Zea)

- Isopenteniladenina (2iP)

Citoquininas sintticas:

- Kinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)

Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentranen todos los tejidos. La concentracin endgena enplantas vara entre 0,1 y 500 g/Kg.

Su transporte es no polar.

Las citoquininas

determinandiferentesrespuestasmorfogenticas

en combinacincon las auxinas

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Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir deplantas de arroz infectadas. Estas plantas presentabanmarcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayosse llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.

El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada.

En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinasdiferentes.

Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos

o plantas bianuales

- Crecimiento de yemas latentes- Germinacin de semillas en dormicin- Floracin- Movilizacin de reservas en la semilla

Se sintetizan en hojas jvenes, en yemas y en el embrin.

Su transporte no es polar.

Las giberelinas

favorecenel crecimiento yel alargamientode los

entrenudosde los brotes

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O

HCH3 H COOH

H

HO OH

CH3

C O

Acido giberlico (GA3)


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Etapas del cultivo in vitro

de plantas superiores

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Eleccin de una plantamadre selecta

Explantos

Desinfeccin superficial

Establecimiento en mediode cultivo apropiado

Transferencia a unmedio de multiplicacin

Formacin debrotes o embrioides

Transferencia a un medio

para el enraizamiento delos brotes

Pasaje a maceta enun invernculo

ETAPA 1

ETAPA 2

ETAPA 3

ETAPA 4

El proceso

de micro-propagacinde especiesvegetales

consta devarias etapas

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Eleccin del explanto inicial

Escarificacin

Esterilizacin

Semillas estriles

Germinacin

% de germinacin?

Diseccin bajo lupa

EsterilidadMedio de Hoagland

Tritn X-100 3%, 10 min

Hipoclorito de Na 15%, 20 min

M. apical

Hoja

M. axilarTalloRaz

M. radicular

MS + 2,4-D


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Protocolo tipo de esterilizacin superficialde material vegetal:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.

- Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO)de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este pasopuede ser reemplazado por el uso desoluciones diludas de bicloruro de mercurio

(HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante H2O estril(4 5 veces).

- En el caso del HgCl2, el material se debeenjuagar sucesivas veces pues es difcilde eliminar.

Los explantos

deben seresterilizadosantes de serestablecidos

en condicionesde cultivo

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Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Explanto(asepsia)

Ambiente

Cultivo

Sin respuesta

Cultivo infectado

Regeneracin indirecta

Regeneracin directa

Respuesta

Explanto(asepsia)

Ambiente

Cultivo

Sin respuesta

Cultivo infectado

Regeneracin indirecta

Regeneracin directa

Respuesta


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Vas morfogenticas:

organognesis y embriognesis

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Posibles vas morfogenticas:

- Organognesis

- Embriognesis

Diferencias entre las dos posibles vas:

- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo oclusterde clulas del explanto inicial se desdiferenciainicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a unrgano vegetal. No se obtienen por esta va plantascompletas.

- La embriognesis se presupone de origen unicelular.

Una clula del explanto se asla y constituye el punto

de partida para la obtencin de un embrin somtico.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrin cigtico. El resultadoes una planta completa.

Existen dos

posibles vasmorfogenticaspara ladiferenciacin

de novodebrotes o plantascompletas

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EmbriognesisOrganognesis

Fotomicrografas de las dos vas morfogenticas

d

pfpf

av

arcv


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Propagacin vegetativa por embriognesis somtica

Explanto(disco de hoja)

Explanto

(clulasvegetales)

REGENERACIN

Suspensin celular

Embriones somticos

ENCAPSULACINGERMINACIN

GERMINACIN Semillaartificial

Callo


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Sistemas de micropropagacin vegetal

Proliferacin de yemas axilares o apicales

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Proliferacin de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicacin de plantas a partirde las yemas axilares preexistentes. Representa

la aceleracin in vitrodel crecimiento natural de

dichos meristemas.

- La tasa de multiplicacin (tm) se calcula en baseal nmero de brotes o vstagos obtenidos a partirde un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo.Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes,dependiendo de la especie en cuestin, entre otrasvariables.

- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podranobtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao

a partir de una nica yema inicial.

- El cultivo de meristemas es un caso especial deluso de esta tcnica.

Propagacin

vegetativa apartir de yemaspreexistentes

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Sistemas de micropropagacin vegetalProliferacin de tejidos desdiferenciados

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Consideraciones generales:

- Callo: masa de clulas desdiferenciadasobtenidas a partir de un explanto cultivado

in vitro(disco de hoja, meristema,clulas en suspensin, etc.)

- Es posible regenerar brotes o vstagos a partirde estos callos.

- Las plantas diferenciadas puedenno ser uniformes, debido al posible desarrollo

de variantes somaclonales. Esto debe tenerseen cuenta, especialmente cuando se trabaja enpropagacin clonal a gran escala.

Resulta posible

regenerar broteso yemas a partirde tejidosvegetales

desdiferenciadosin vitro

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Sistemas de propagacin vegetativa in vitroRegeneracin directa e indirecta

Explanto(disco de tejido)

Explanto(suspensin de clulas)

Regeneracindirecta

Regeneracinindirecta

CalloFormacin

directade brotes

Formacinindirectade brotes

Planta regenerada


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Sistemas de

propagacinvegetativain vitro

Propagacin vegetativa in vitroRegeneracin directa e indirecta

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Sistemas de micropropagacin vegetalCultivo de meristemas

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Cultivo de meristemasEl empleo demeristemascomo explantoses una posibleherramienta parael saneamientode plantasinfectadas

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Meristema apical

Meristema axilar

Domomeristemtico


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Posibilitan la micropropagacin de diferentes especiesvegetales.

Constituyen el explanto ideal para liberar de patgenosin vitroa plantas infectadas por virus, hongos o bacterias.

Son ampliamente utilizados como explantos para lacriopreservacin y conservacin de germoplasma.

Los meristemasson gruposde clulasindiferenciadasque retienenla capacidadde dividirsedurante todoel ciclo de vidade una planta

Los meristemas determinan el crecimiento de

la planta y dan origen a sus diferentes rganos

Agrobiotecnologa



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Aplicaciones del cultivo de tejidos:Liberacin de patgenos

Agrobiotecnologa



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- El domo meristemtico no est vascularizado(muchos patgenos se translocan por los tejidosde conduccin).

- El nmero de partculas virales es menoren los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema

es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivode meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin

entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa yDahlia.

El cultivo demeristemasfacilita laeliminacin depatgenos

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El l i d


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Mediante esta tcnica es posible sanear

plantas infectadas sistmicamente pordiferentes tipos de patgenos comobacterias, hongos, virus y viroides.

El cultivo detejidos posibilitael saneamientode las plantasmultiplicadas

vegetativamente Sntomas producidospor el Tomato mosaicvirus.

Partculas de Potatovirus Y

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El material vegetal infectado por virus,bacterias, hongos y/o micoplasmas puedeser tratado con diferentes tcnicas:

Termoterapia

Quimioterapia

Cultivo de meristemas

Estos tratamientos pueden usarse por

separado, pero incrementan su efectividadnotablemente cuando se los combina,trabajando in vivoe in vitro.

El tratamiento

de plantasmadres puedeefectuarsepor distintas

tcnicas

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C id i


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Termoterapia

El tratamiento por calor es un mtodo eficaz parainactivar algunos virus y viroides. Se debe elegiruna temperatura y tiempo de tratamiento tales quela planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita

la inactivacin del virus.

Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanumtuberosuma 8C durante 4 meses permiten obtener un

30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid(PSTV).

Consideraciones

prcticas para elsaneamiento deplantas madrespor termoterapia

Sintomasinducidospor PSTVentubrculosde papa

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L t d l


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Las plantas regeneradas in vitrodeben serevaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patgeno considerado.

Estas pruebas se denominan ensayos deindizacin (indexing) y difieren segn el sistemahuesped-patgeno de que se trate.

Se incluyen entre estas pruebas:

- Seleccin visual u observacin de sntomas

- Empleo de hospedantes indicadores

- Mtodos serolgicos

- Microscopa electrnica

La metodologa

de saneamientoempleada debeser evaluada

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Ob i


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Consiste en la observacin de sntomas.

Se trata de un mtodo impreciso. Resulta confiable en el caso de enfermedades

que inducen sntomas muy caractersticoso conspcuos.

PotatoVirus X

ColiflowerBlack Rot

Observacin

visual

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Enfermedades


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Mosaico clortico producido por Tomato mosaic virusen tomate

Sntomas de pie negro y podredumbre blanda causados porErwinia carotovoraen papa.

Enfermedadesbacterianasy/o viralescon sntomasdistintivos

Tubrculo inoculadocon E. carotovora

Tuberculo noinoculadoPie negro

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Antracnosis en Fragaria spp causada por ColletotrichumSntomas de


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Antracnosis en Fragariaspp. causada por Colletotrichum

Powdery MildewenSolanum tuberosumcausado por Erysiphe

spp.

Sntomas deenfermedades

causadas porhongos

Sntomas en estolones Sntomas en frutos

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Di i i d t d t d Sntomas de


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Disminucin de tamao causada por nematodes en maz

Micrografas de un nematode del gnero Trichodorus(tamao aproximado: 0,5 M de dimetro, 1 mm de largo).

Sntomas deenfermedadescausados pornematodes

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Empleo de


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Es una tcnica frecuentemente utilizadapara detectar virus que pueden transmitirsemediante el jugo infeccioso extrado deplantas enfermas.

Se usan como indicadoras variedadesmuy susceptibles de la especie estudiadau otras especies que desarrollan sntomascaractersticos en un corto tiempo.

Los sntomas inducidos en la planta

indicadora revelan la presenciadel patgeno y permiten identificarlo.

Empleo de

hospedantesindicadores

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Se basan en la alta especificidad de la reaccinMtodos


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Se basan en la alta especificidad de la reaccinantgeno-anticuerpo, por la cual un anticuerporeconoce y se combina slo con la porcin deantgeno que le dio origen.

- Pruebas inmunoenzimticas(DAS-ELISA)

- Floculacin de ltex sensibilizado(partculas de ltex recubiertas por

anticuerpos especficos, se observaagregacin de partculas con formacin

de precipitado)

- Microprecipitacin (gotas de antisuero

y antgeno, se observa formacin deprecipitado)

Mtodosserolgicos

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La metodologa


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Las plantas regeneradas in vitrodeben serevaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patgeno considerado.

Estas pruebas se denominan ensayos deindizacin (indexing) y difieren segn el sistemahuesped-patgeno de que se trate.

Se incluyen entre estas pruebas:

- Seleccin visual u observacin de sntomas

- Empleo de hospedantes indicadores

- Mtodos serolgicos

- Microscopa electrnica

La metodologade saneamientoempleada debeser evaluada

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Agrobiotecnologa



58/85

C l i i iExisten diferentes


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Colecciones in vitro

Bancos de semillas

Crioconservacin

mtodos parala conservacinde germoplasma

www.cgiar.org

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Bancos de


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La conservacin de germoplasma medianteel cultivo de tejidos se basa en la limitacindel crecimiento del material vegetal.

Implementacin:

- Medios de cultivo de composicin subptima

- Baja intensidad lumnica (


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semillas se mantienen viables durante un largo

perodo de almacenamiento.

El material debe mantenerse bajo condicionescontroladas en una cmara de mantenimiento:

- Bajas temperaturas- Bajo contenido de humedad

Este mtodo no puede aplicarse a la conservacin

de plantas cuyas semillas presentan longevidad

reducida, especies autoincompatibles o especiesde propagacin vegetativa obligada

semilla permitenla conservacinde especiesvegetales que

se propagansexualmente

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Consiste en el mantenimiento de materialCrioconservacin


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Consiste en el mantenimiento de materialvegetal a temperaturas ultrabajas (-196 C),por inmersin en nitrgeno lquido

Diferentes explantos (pices de yemas,meristemas, anteras, embriones inmaduros)

as como callos y suspensiones celularespueden ser crioconservados a-196 C.

de germoplasma

www.science.siu.edu

Agrobiotecnologa


Etapas del


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Crioproteccin

Congelamiento

Almacenamiento

Descongelamiento

Pruebas de viabilidad

Recultivo

proceso decrioconservacinde materialvegetal

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Cultivo in vitrode clulas haploidesy embriones

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Mejoramiento vegetalAplicacionesd l l i


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Mejoramiento vegetal.

Estudios de gentica cuantitativa.

Estudios de diferenciacin celular y alternanciade generaciones.

del cultivoin vitro

de clulashaploides

Ttradas demicrosporas

Sacos polnicos(con granos de polen)

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G ti d l l t d t

Condicionesf t


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- Genotipo de las plantas donantes

- Fisiologa de las plantas donantes

- Caracterizacin citolgica y bioqumica

de etapas muy tempranas del desarrollode los granos de polen

- Pretratamiento de las anteras con altas

o bajas temperaturas o con choqueosmtico

- Medios de cultivo con alto contenido enosmticos para la induccin de callos y

menores concentraciones de sacarosapara la regeneracin de plantas

que afectanel cultivode anteras

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- Permite la expresin e identificacinde alelos recesivos

El cultivo deanteras ofrece


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de alelos recesivos

- Constituye una fuente til para el mejoramientointravarietal

- Permite la rpida introduccin de caracteres

citoplasmticos en un fondo genticohomocigtico

- Crea y acrecienta las reservas citogenticasy citoplasmticas de los cultivos

- La obtencin de haploides duplicados resulta

til para el desarrollo de nuevas variedadescon el fin de distribuirlas en ambientes ecolgicosmuy diversos y para ensayarlas en ellos.

- Las microsporas o clulas haploides puedenusarse para la induccin de mutantes y parala seleccin de caracteres esporofticos.

numerosasventajas para elmejoramientode plantas deinters comercial

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Estudio de requerimientos nutricionalesd b i d ll

El cultivode embriones


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de embriones en desarrollo.

Rescate de embriones hbridos derivadosde cruzamientos interespecficos e intergenricos.

Producin de monoploides.

Superacin de la latencia de las semillas.

de embrionesinmadurospermiterealizar

diferentesaplicaciones

Embrin cigtico

Corte longitudinal de una semilla de Brassica

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Rescate de embriones (mediante polinizacinAplicacionesdel cultivo


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Embriones somticos (es) obtenidos a partirdel cultivo de vulos de Arabidopsis.

y fertilizacin in vitro)

Induccin de la embriognesis somticaa partir de nucelos de diferentes especiesvegetales.

del cultivode vulos

es

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Semillas sintticas

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Semillassintticas


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sintticas

Embriones somticos de Pinus sp

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Las semillasartificiales

Las semillasartificialesposeen una


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artificiales

reproducen laestructura deuna semilla de

origen sexual

poseen una

cubierta deproteccin,contienensustanciasde reserva yportan unembrin en

su interior.

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Procedimientopara


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para

encapsularembrionessomticos

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Los protoplastosson clulas Suspensin de protoplastos


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vegetalesdesprovistasde pared celular

de mesfilo de tabaco

Protoplasto de mesfilo de tabacoProtoplastos de la lnea celular By2

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Esquema general de la manipulacin gentica de

Los protoplastosconstituyen un


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Esquema general de la manipulacin gentica de

protoplastos in vitropara la realizacin de tcnicasde mutagnesis, fusin o transformacin.

y

explanto idealpara diferentesfines

biotecnolgicos

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Mtodos parael aislamiento


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Mtodo mecnico- Bajo rendimiento

- Procedimiento tedioso- Aplicabilidad limitada

Choque osmtico para producir plasmlisis celulary ruptura de la pared. Los protoplastos se liberande las clulas rotas mediante el restablecimiento

de su nivel osmtico.

Mtodo enzimtico

Consiste en la incubacin de las clulas en una mezclade enzimas que degradan la pared celular: celulasas,

hemicelulasas y pectinasas. Las preparacionescomerciales de dichas enzimas contienen ademsproteasas, nucleasas y lipasas.

de protoplastos

Protocolo para la obtencin de protoplastos. de mesfilo de hoja de tabaco:

Pasosimplicados en


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- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jvenesde tabaco).

- Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de

hoja. Disponer los explantos en un regulador

osmtico.

- Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri

conteniendo la solucin mezcla de enzimas y medionutritivo para el cultivo de protoplastos en una

proporcin 1:1.

- Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 hen oscuridad, a 22-25C, a 50 rpm.

Observar la liberacin de los protoplastos en unmicroscopio invertido.

- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizndolos

y centrifugndolos a 100 g. Usar las solucionesformuladas para tal fin.

- Remover el sobrenadante y resuspenderlos protoplastos en medio de cultivo.

el aislamientodeprotoplastosde mesfilode tabaco

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La variacinsomaclonal


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Entre otras causas:

Modificaciones genticas heredables porlas progenies de las plantas obtenidasmediante cultivo in vitro

Prevalencia del cariotipo especfico deplantas y tejidos quimricos y de mosaicos

Cambios en el cariotipo, debidos a unarespuesta diferencial a los procedimientosde cultivo (composicin del medio, etc.)

Aneuploides no separables en el cultivo

puede explicarla variacinfenotpica

de las plantasregeneradasin vitro

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Otra posiblescausas de la


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Cese mittico que lleva a lneas poliploides

Mutaciones del cariotipo

Amplificacin o disminucin de genes

Reordenamiento de mutaciones en genomasde organelas

Transposones

Inversiones, traslocaciones y otrosaccidentes cromosmicos

variabilidad delas plntulasregeneradas

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Caractersticasde la variacin


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Indeseable en la micropropagacin deplantas de inters comercial (diversidadgenotpica)

Potencial para el mejoramiento vegetal

cuando se trata de verdaderasmodificaciones del material gentico(variabilidad)

somaclonal

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2011_2 Cultivo de Tejidos I

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