2012 - Caracterización de actinomicetos con capacidad de biodegradación en edar del sector...

A R T Í C U L O S T É C N I C O S

TECNOLOGÍA DEL AGUA

76

344-

345

/ N

OVI

EMBR

E-DIC

IEM

BRE

/ 20

12

El sector petroquímico necesita gran-des cantidades de agua, para proceso y refrigeración, que se contaminan con productos derivados del petróleo. Normalmente, en las estaciones depu-radoras de aguas residuales (EDAR) de estas empresas se aplica el siste-ma de fangos activos, que biodegrada la materia orgánica hasta CO2, NH3 y H2O y, además, forma nueva biomasa celular. Para identificar correctamen-te los actinomicetos en las EDAR, se debe realizar lo que se denomina taxo-nomía polifásica, que consiste en ana-lizar las secuencias del gen 16S rDNA y determinar diversos marcadores qui-miotaxonómicos. Posteriormente, se estudia la capacidad de biodegradación de fenol y naftaleno de cada una de las especies aisladas e identificadas.

Palabras clave:Fangos activos, bacteria, actinomicetos, BLAST, PCR, biodegradación, fenol, naftaleno.

Resumen

Characterization of actinomycetes with the ability of biodegradation of petrochemical wastewater treatment plantsThe petrochemical sector consumes large amounts of water, either for processing or for cooling. This water is contaminated with petroleum pro-ducts. The activated sludge system is the main treatment system worldwi-de. This system consists of an aerobic treatment that oxidizes organic matter to CO2, NH3 and H2O and form new cell biomass. To identify actinomyce-tes, polyphasic taxonomy must be done which consists in the 16S rDNA gene sequences analysis and to determine severals chemotaxonomic markers. Then, the ability of phenol and na-phthalene biodegradation of each spe-cies has been studied.

Keywords:Activated sludge, bacterium, actino-mycetes, BLAST, PCR, biodegrada-tion, phenol, naphthalene.

Abstract

Caracterización de actinomicetos con capacidad de biodegradación en plantas depuradoras del sector petroquímicoPor: Albert Soler1; Gonzalo Cuesta1; José Luis Alonso2; Andrés Zornoza2

1 Universitat Politècnica de ValènciaDepartamento de Biotecnología, Área de Microbiología Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y Medio NaturalCamino de Vera, s/n - 46022 ValenciaTel.: 963 876 000 - www.upv.es

2 Universitat Politècnica de ValènciaCiudad Politécnica de la InnovaciónInstituto Universitario de Ingeniería del Agua y Medio Ambiental (IIAMA)Área de Química y Microbiología del AguaCamino de Vera, s/n - 46022 ValenciaTel.: 963 876 000 - www.upv.es

1. Introducciónl agua es fundamental en mu-chos procesos industriales, entre ellos del sector petro-

químico, ya que puede intervenir como materia de un proceso, como disolventeo diluyente, como medio de transporte de otras materias o como sistema auxiliar, ya sea de la-vado o limpieza general (Asociación Alemana de Saneamiento, 1986). Es por ello que es el sector que más agua gasta y, por tanto, el más sus-ceptible de contaminar.

En la industria petroquímica, los contaminantes básicos son la con-centración de materia orgánica, acei-tes, fenoles, amoníaco y sulfuros. Por tanto, debe disponer de buenos sistemas de tratamiento para elimi-nar los definidos como contaminan-tes, molestos o con efectos nocivos para el medio ambiente, y ajustar la calidad del agua vertida a las espe-cificaciones legales.

El sistema más utilizado es el de fangos activos. Este constituye una

Emezcla de microorganismos, en su mayoría bacterias heterótrofas, que transforman la materia orgánica bio-degradable hasta formas más sim-ples y estables. La biomasa celular obtenida forma flóculos que se en-cuentran formados por una pobla-ción muy heterogénea de microor-ganismos, partículas orgánicas e inorgánicas (Soddell y Seviour, 1990; Bitton, 1999).

2. ActinomicetosLos actinomicetos forman un gru-

po de microorganismos morfológi-camente muy heterogéneo, pertene-cientes al dominio Bacteria , formado por bacterias generalmente aerobias, Gram-positivas, con alto contenido en G+C. Dos de las pro-piedades más significativas de los actinomicetos son su capacidad para desarrollarse sobre sustratos muy diversos, que no pueden ser usados por otros microorganismos, como la quitina y celulosa y su aptitud para sintetizar numerosos metabolitos

_TA344_AT_caracterizacion_ch.indd 76 20/12/12 15:12



77

344-

345

/ N

OVI

EMBR

E-DIC

IEM

BRE

/ 20

12

bioactivos. Estas propiedades ponen de manifiesto la riqueza destacable del metabolismo celular de este gru-po microbiano (Goodfellow et al., 1997).

El interés por los actinomicetos comenzó a raíz del descubrimiento de la capacidad de estos microorga-nismos para producir antibióticos. Aunque la búsqueda de compuestos bioactivos continúa en auge, el inte-rés por los actinomicetos se ha di-versificado y actualmente ocupa áreas muy variadas. Pueden ser pa-tógenos de plantas, de animales, de humanos, descomponer productos del caucho, crecer en el combustible de los aviones. En las estaciones de-puradoras de aguas residuales cau-san espumas densas que llegan a obstruir las instalaciones. Por la di-versidad de hábitats que pueden co-lonizar, este grupo de microorganis-mos tiene un enorme interés ecológico (June et al., 1999).

2.1. Clasificación actualEn 1997 se propuso la clase Acti-

nobacteria (Stackebrandt et al.,

1997), compuesta por los actinomi-cetos y sus parientes filogenéticos con un alto contenido en G+C. La segunda edición del Bergey’s Ma-nual of Systematic Bacteriology (Bo-one et al., 2001) recoge la clasifica-ción actual, en la que la clase Actinobacteria se eleva al rango de Phylum. Dentro del phylum se reco-noce una única clase, Actinobacte-ria, que mantiene la estructura jerár-quica propuesta por Stackebrandt et al., (1997). Además, están incluidos en él 6 órdenes, 39 familias y más de 130 géneros (Garrity y Holt, 2001).

Dentro de esta clase se incluye el orden Actinomycetales, el cual en-globa los géneros estudiados en el presente trabajo. Estos géneros per-tenecen a los subórdenes Coryne-bacterineae, Pseudonocardineae y Micrococcineae. La Tabla 1 muestra la clasificación de las familias y los géneros estudiados en el estudio.

3. Material y métodosEn el presente trabajo se estudian

cuatro estaciones depuradoras per-

tenecientes al sector petroquímico de la región de Andalucía. De estas plantas, se eligieron los aislados más representativos, seleccionando aque-llos que presentaron una mayor di-versidad morfológica.

3.1. Toma de muestras y aislamiento

La toma de muestras se realizó durante el año 2008 por el propio personal de la planta. Se tomaron muestras de espumas del reactor bio-lógico en recipientes estériles y se enviaron al laboratorio donde se guardaron en refrigeración a 4 ºC y se procesaron dentro de las 48 horas siguientes. Para realizar el aisla-miento se utilizaron 4 medios de cultivo diferentes. Las muestras se procesaron realizando una serie de diluciones para rebajar la carga mi-crobiana.

3.2. Caracterización morfológica

Se realizó una observación ma-croscópica y una observación mi-croscópica. La observación macros-cópica se fundamenta en el aspecto de las colonias aisladas. En la obser-vación microscópica se realizó una tinción Gram para comprobar que tuvieran una morfología típicamen-te nocardioforme. Por último, se realizó la prueba de la catalasa.

3.3. Caracterización quimiotaxonómica

Para caracterizar quimiotaxonó-micamente las cepas aisladas, se estudiaron diferentes parámetros quimiotaxonómicos para poder de-finir de forma correcta los aislados dentro del grupo mycolata. Los pa-rámetros realizados fueron la pre-sencia de ácidos micólicos, la deter-minación de los isómeros del ácido diaminopimélico y el análisis de los azúcares predominantes de la pared celular.

Estas tres pruebas se basan en una digestión de células en diferen-tes reactivos para, posteriormente, realizar una cromatografía en capa fina.

Tabla 1

Suborden Familia Género

Corynebacteriaceae Corynebacterium

Dietziaceae Dietzia

Mycobacteriaceae Mycobacterium

Nocardia

Gordonia

Corynebacterineae Nocardiaceae Millisia

Rhodococcus

Skermania

Williamsia

Segniliparaceae Segniliparus

Tsukamurellaceae Tsukamurella

Pseudonocardineae Pseudonocardiaceae Pseudonocardia

Micrococcineae Microbacteriaceae Microbacterium

Tabla 1. Clasificación jerárquica del suborden Corynebacterineae, Pseudonocardineae y Micrococcineae basada en las secuencias de DNA y RNA ribosómico 16S (Zhi et al., 2009).




78

344-

345

/ N

OVI

EMBR

E-DIC

IEM

BRE

/ 20

12

3.4. Caracterización genotípica

A partir de un cultivo puro de cada una de las cepas, se procedió a la extracción del DNA utilizando un kit de extracción comercial (Sigma) si-

guiendo las instrucciones del fabri-cante. El DNA extraído de las mues-tras fue amplificado mediante PCR (reacción en cadena de la polimera-sa) utilizando los iniciadores especí-ficos (Lane, 1991) 27f y 1492 r. Fi-nalmente, los productos obtenidos de la PCR se purificaron y secuencia-ron, para posteriormente analizar la secuencia e identificar cada cepa a nivel de especie.

La secuencia de bases de cada fragmento, con una longitud aproxi-mada de 600 a 700 nucleótidos, se obtuvo en un archivo de texto elec-trónico desde el electroferograma mediante la aplicación científica Chromas (versión 1.43). Las secuen-cias del 16S rDNA fueron ensambla-das manualmente, utilizando el pro-grama informático Phydit, a partir de la combinación de fragmentos sepa-

rados generados con los iniciadores 27f y 1492r que amplifican el seg-mento 16S en sentidos opuestos. Los segmentos inicial y final (alrededor de 25 nucleótidos de longitud) de cada secuencia parcial, debido a que suelen presentar una baja fiabilidad, fueron eliminados antes de ensam-blar la secuencia completa. Las se-cuencias parcialmente alineadas se unieron para generar una secuencia completa del gen del 16S rDNA.

La probable identidad de cada una de las cepas secuenciadas se de-terminó mediante la herramienta informática BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponible en Internet a partir del NCBI (Natio-nal Center for Biotechnology Infor-mation) (Jones, 2006).

Para caracterizar a nivel de espe-cie cada cepa se realizaron los árbo-les filogenéticos y las matrices de similaridad de cada género utilizan-do los programas informáticos Phydit y Treconw.

3.5. BiodegradaciónEn estos ensayos se utilizaron tres

medios de cultivo, suplementados inicialmente con glucosa al 0,1% para, así, conseguir una aclimatación previa que mejore la siembra poste-

Figura 1. Placa de recuento donde se aisló la cepa PA3.

Figura 2. Rhodococcus ruber (54B).

Figura 3. Gordonia paraffinivorans (C2.2).

Figura 4. Cromatoplaca de ácidos micólicos.




79

344-

345

/ N

OVI

EMBR

E-DIC

IEM

BRE

/ 20

12

rior en los medios suplementados con los productos tóxicos.

Los compuestos tóxicos elegidos fueron el fenol y el naftaleno. Los medios elegidos se suplementaron con ellos al 0,1%. Se incubaron en estufa a 28 ºC durante 14 y 21 días. Como control positivo se utilizaron los medios suplementados con glu-cosa al 0,1%.

4. Resultados y discusión

4.1. AislamientoSe realizaron 13 muestreos, obte-

niéndose un total de 35 aislados, de los cuales se eligieron 23 por pre-sentar una mayor variabilidad mor-fológica. En la Figura 1 se observa una placa de recuento de donde se realizó algún aislamiento.

4.2. Caracterización morfológica

En la caracterización morfológica se realizó una observación macros-cópica directa en placa (Figuras 2 y 3) y, posteriormente, una observa-ción microscópica mediante tinción Gram, además de la prueba de la catalasa. Se pudo observar cómo to-dos los aislados estudiados eran ca-talasa positivos y Gram-positivos. Generalmente las colonias con as-pecto mucoso suelen presentar mor-fologías cocoides y las colonias ru-gosas o sin brillo suelen ser bacilos de tamaño variable en ocasiones con ramificaciones en ángulo recto bien desarrolladas.

4.3. Caracterización quimiotaxonómica

En primer lugar se realizó la ex-tracción y análisis de los ácidos mi-cólicos de la pared celular. Se obser-vó (Figura 4) que todos los aislados estudiados poseían ácidos micólicos, a excepción de 5 de ellos.

La segunda prueba realizada (Fi-gura 5) consistió en determinar los isómeros del ácido diaminopimélico (DAP). El suborden Corynebacteri-neae se caracteriza porque todas sus especies contienen la forma meso-DAP. Todos los aislados estudiados

en este trabajo poseían la forma meso-DAP, a excepción de uno de ellos.

Por último, se determinaron los azúcares predominantes de la pared celular. En nuestro caso se debe ob-tener una tipo de pared celular IV, siendo los constituyentes distintivos mayoritarios arabinosa y galactosa. Se observó que todos los aislados, menos uno, poseían esta forma.

4.4. Caracterización genotípica

Una vez realizada la extracción de DNA, se comprobó la cantidad y calidad del mismo antes de llevar a cabo la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. La detec-ción de los fragmentos amplificados obtenidos tras la PCR se realizó tam-bién mediante electroforesis (Figura 6) en gel de agarosa. Los productos de la PCR se purificaron y se envia-ron a secuenciar al Servicio de Se-cuenciación del Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP) de la UPV. Para la realiza-

ción de las reacciones de secuencia-ción se utilizó el kit ABbi Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction (versión 3.1).

Las secuencias completas, obte-nidas con ayuda de los programas informáticos Chromas y Phydit, se analizaron mediante el programa BLAST (NCBI). Con estos resulta-dos se obtiene una identificación a nivel de género al 100% y una posi-ble identificación a nivel de especie. De las 23 aislados seleccionados se obtuvieron cinco géneros distintos (Gordonia, Mycobacterium, Micro-bacterium, Rhodococcus y Pseudo-nocardia). En la Tabla 2 se puede ver el resultado del BLAST con el porcentaje de identificación de cada aislado.

4.5. BiodegradaciónPara realizar las pruebas de bio-

degradación se sembraron las espe-cies halladas anteriormente en tres medios de cultivo conteniendo cada uno de ellos fenol, naftaleno y glu-cosa, siendo este último el control

Figura 5. Cromatoplaca de isómeros del DAP.

Figura 6. Gel de PCR con los productos de amplificación del 16S rDNA.




80

344-

345

/ N

OVI

EMBR

E-DIC

IEM

BRE

/ 20

12

positivo. Todas las cepas se incuba-ron a una temperatura constante de 28 ºC.

Las cepas que se escogieron para realizar las pruebas de biodegrada-ción fueron las siguientes: PC4, C5.1a, C2.3, PA2, PB6, C4.5, 54B, RG.4a, C5.5a, R5, PB1, C2.2, LR4, RG.4b, C5.6, RG3 y CQG5.a. Todas ellas comprenden los géneros y las especies que se han caracterizado e identificado anteriormente.

Para las cepas PB1 (Figura 7) y PC4 se obtuvo un crecimiento máxi-

mo a los 14 y 21 días en los medios suplementados con naftaleno. Para el fenol el crecimiento fue medio a los 21 días en un solo medio, en los otros dos fue muy bajo o nulo.

Se observó que para las cepas 54B (Figura 8) y C5.5a el creci-miento en los medios suplementados con fenol fue máximo a los 14 y 21 días, para los tres medios de cultivo. Para el naftaleno el crecimiento fue bajo a los 21 días.

A los 14 días de incubación, para la cepa RG3 (Figura 9) se observó

un crecimiento máximo en dos de los medios suplementados con fenol. A los 21 días el crecimiento fue máximo en los tres medios de culti-vo. Para el naftaleno, el crecimiento fue nulo.

5. ConclusionesDe todos los cultivos aislados es-

tudiados en el presente trabajo, el 39,1% pertenece al género Myco-bacterium; el 30,4%, al género Gor-donia; el 17,4%, al género Pseudo-nocardia; el 8,7%, al género Rhodococcus; y, finalmente, el 4,3%, al género Microbacterium.

Las cepas más abundantes en el recuento en placa pertenecen al gé-nero Pseudonocardia, cuyas espe-cies degradan ambos compuestos tóxicos, y al género Microbacterium, cuya única especie no degrada nin-guno de los dos compuestos tóxicos.

La especie Pseudonocardia asac-charolytica degrada principalmente el naftaleno y en menor medida el fenol. Los filamentos de esta especie no son hidrofóbicos por lo tanto los problemas de espumas que puedan causar este especie quedan descar-tados. Además, hay que destacar que, pese a que las especies de Pseu-donocardia asaccharolytica son or-ganismos filamentosos, ocasionarían muy pocos problemas de bulking debido a que sus filamentos no pre-sentan ramificaciones muy comple-jas. Es por ello que para estudios posteriores en plantas piloto sería la especie idónea.

Los porcentajes de las especies Mycobacterium y Pseudonocardia se consideran especialmente altos en comparación con resultados obteni-dos en plantas depuradoras de aguas residuales domésticas, ya que en es-tas últimas no se suelen encontrar.

Se obtiene un porcentaje total de cepas degradadoras del 29,4%, sien-do las especies que degradan los dos compuestos tóxicos Rhodococcus ruber y Pseudonocardia asaccharo-lytica. La Gordonia amicalis solo degrada el fenol.

La técnica del análisis del 16S rDNA, que incluye la elaboración de

Tabla 2Cepas Identificación %

C5.1a Mycobacterium smegmatis 100%

C5.1b Mycobacterium smegmatis 100%

C2.3 Mycobacterium smegmatis 100%

C4.5 Mycobacterium smegmatis 100%

PA2 Mycobacterium smegmatis 100%

PB6 Mycobacterium smegmatis 100%

PB7 Mycobacterium smegmatis 100%

RG4.a Mycobacterium vaccae 99,48%

RG4.b Mycobacterium vaccae 99,25%

54B Rhodococcus ruber 100%

C5.5a Rhodococcus ruber 100%

PA3 Pseudonocardia asaccharolytica 97,48%

PB 1 Pseudonocardia asaccharolytica 97,47%

PB3 Pseudonocardia asaccharolytica 97,47%

PC4 Pseudonocardia asaccharolytica 97,47%

R1 Gordonia paraffinivorans 99,78%

R5 Gordonia paraffinivorans 99,78%

C2.1 Gordonia paraffinivorans 99,78%



LR4 Gordonia paraffinivorans 99,78%

RG3 Gordonia amicalis 100%

CQG5.a Microbacterium flavum 98,43%

Tabla 2. Identificación obtenida mediante BLAST de la secuencia del 16S rDNA.




81

344-

345

/ N

OVI

EMBR

E-DIC

IEM

BRE

/ 20

12

árboles fi logenéticos y matrices de similaridad nucleotídica, es el mé-todo más fi able para identifi car, a nivel de especie, actinomicetos ais-lados de muestras ambientales.

6. AgradecimientosLos autores agradecen la colabo-

ración de CEPSA por el envío de las

muestras de fango activo de las cua-les fueron aislados los organismos.

7. Bibliografía[1] Asociación Alemana de Sanea-

miento (1986). ‘Principios para el diseño de plantas de trata-miento de aguas residuales de refi nerías de petróleo. Reglas técnicas con respecto a la ges-tión de aguas residuales y dese-chos’. Instructivo A701.

[2] Bitton, G. (1999). ‘Wastewater microbiology’. 2nd Ed. Wiley-Liss, Inc., 2ª ed., New ork.

[3] Boone, D.R.; Castenholz, R.W.; Garrity, G.M. (2001). ‘Bergey’s manual of systematic bacteriol-ogy’. Springer-Verlag, 2ª ed., vol. 1.

[4] Garrity, G.H.; Holt, J.G. (2001). ‘The road map to the manual’. In: Bergey’s manual of system-atic bacteriology’. The Archaea and the deeply branching and

phototrophic bacteria. Garrity, G.M. (ed.-in-chief), Springer-Verlag, 2ª ed., vol. 1.

[5] Goodfellow, M.; Chun, J.; Blac-kall, L.; Kang, S.; Chil Hah, Y. (1997). ‘A proposal to reclassi-fy Nocardia pinensis Blackall et al. as Skermania piniformis gen’. Int. J. Syst. Bacteriol., núm. 47, págs. 127-131.

[6] Jones, A.M. (2006). ‘Towards an improved taxonomy of the genus Rhodococcus’. D. thesis. Division of Biology, Faculty of Science, Agriculture and Engi-neering, University of New-castle, núm. 3, págs. 108-110.

[7] Brown, J.M.; Mneil, M.M.; Desmond, E.P. (1999). ‘Nocar-dia, Rhodococcus, Gordonia, Actinomadura, Streptomyces, and other actinomycetes of medical importance’. Manual of Clinical Microbiology, núm. 7, págs. 370-392.

[8] Lane, D.J. (1991). ‘16S/23S rRNA sequencing’. En: Stack-ebrandt, E. and Goodfellow M. editors. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Inc., New York, págs. 115-148.

[9] Soddell, J.A.; Seviour, R.J. (1990). ‘A rewiew: microbiol-ogy of foaming in activated sludge plants’. J. Appl. Bacte-riol., núm. 69, págs. 145-176.

[10] Stackebrandt, E.; Rainey, F.A.; Ward-Raiey, N.L. (1997). ‘Pro-posal for a new hierarchic clas-sifi cation system, Actinobacteria classis nov’. Int. J. Syst. Bacte-riol., núm. 47, págs. 479-491.

[11] Zhi, X.Y.; Li, W.J.; Stacke-brandt, E. (2009). ‘And update of the structure and 16S rRNA gene sequence-based defi nition of higher ranks of the class Ac-tinobacteria, with the proposal of two new suborders and four new families and emended de-scriptions of the existing higher taxa’. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, núm. 59, págs. 589-608.

Figura 8. Control positivo glucosa medio MSM (A) y aislado 54B en medio MSM suplementado con fenol (B).

Figura 9. Control positivo glucosa medio BHM (A) y aislado RG3 en medio BHM suplementado con fenol (B).

Figura 7. Control positivo glucosa medio MSM (A) y aislado PB1 en medio MSM suplementado con naftaleno (B).

La técnica de análisis

del 16S rDNAes la más fi able para identifi car,

a nivel de especie, actinomicetos

aislados de muestras ambientales


2012 - Caracterización de actinomicetos con capacidad de biodegradación en edar del sector...

Education

Transcript of 2012 - Caracterización de actinomicetos con capacidad de biodegradación en edar del sector...