2013-REMCB-V34-no1-no2

REVISTA ECUATORIANA DE

MEDICINA YCIENCIAS BIOLGICAS

VOLUMEN XXXIV - N 1 y 2 - OCTUBRE 2013

ISSN 0034-9313

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias BiolgicasVolumen XXXIV Nmeros 1 y 2 - octubre 2013ISSN 0034-9313

Impresin:Centro de Publicaciones

Pontificia Universidad Catlica del EcuadorAv. 12 de Octubre 1076 y Roca, Quito, Ecuador

Correccin de estilo: Alfonso Snchez

QualityPrint Ca. Ltda., Quito, EcuadorDiseo y diagramacin: Claudia Hernndez Mora

Fotografa portada (Noche en la Estacin Cientfica Yasun): Rubn D. Jarrn E.Fotografa contraportada: (Hongo ramificado de Yasun): Lucas M. Bustamante

3REVISTA ECUATORIANADE MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS

Pontificia Universidad Catlica del Ecuador

Rector: Dr. Manuel Corrales Pascual, S.J.

Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin

Presidente: Sr. Ral Prez Torres

Sociedad Ecuatoriana de Ciencias Biolgicas, Ncleo de Pichincha

Presidente: Dr. Jaime Costales Cordero

Editores:

Dr. Carlos A. Soria Proao1 (Ciencias Naturales)1Pontificia Universidad Catlica del Ecuador

Dr. Sergio Barba 1,2,3 (Medicina)1Sociedad Ecuatoriana de Alergologa, Inmunologa y Ciencias Afines

2Universidad Central del Ecuador; 3Centro mdico AXXIS, Quito

La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas (REMCB) (ISSN 0034-9313) es un rgano de difusin cientfica auspiciada por la Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin, la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador y la Sociedad Ecuatoriana de Biologa, ncleo de Pichincha. La REMCB se encuentra incluida en el Citation Index Expanded, se publica anualmente y est dirigida a cientficos nacionales e internacionales as como a estudiantes de las Ciencias de la Vida. Para solicitud de sobretiros o cualquier correspondencia relacionada con la revista, favor dirigirse a: Dr. Carlos A. Soria, Quito-Ecuador. E-mail: [email protected] o en la seccin de contacto en la pgina web http://www.puce.edu.ec/revistaciencia.El contenido de los artculos cientficos y de las publicaciones que aparecen en la revista son responsabilidad exclusiva de sus autores o de los auspiciantes y no representan necesariamente el sentir de los editores de la REMCB, quienes no se responsabilizan por errores o por las consecuencias surgidas por el uso del material que aparece publicado en la misma.

5EDITORIAL

TRABAJOS CIENTFICOSEvaluacin de la variabilidad gentica del capul(Prunus serotina subsp. capul) en tres provincias del EcuadorDmaris P. Intriago-Balden, Mara de Lourdes Torres, Venancio Arahana y Jos Tobar

Estudio de gentica poblacional de Polylepis pauta y Polylepis sericea en Pichincha mediante la utilizacin de marcadores moleculares SSRsRosa Andrade, Mnica Jadn y Claudia Segovia-Salcedo

Estructuracin gentica de muestras del hongo Batrachochytrium dendrobatidis en EcuadorMara del Carmen Vizcano, Charles W. Barnes y Mara Eugenia Ordez

Obtencin de embriones en fase cotiledonar de Caf Robusta (Coffea canephora) con el empleo de un sistema de inmersin temporal, mediante la tcnica de embriognesis somtica a partir de segmentos foliaresGabriela Paredes, Cristian Pea y Mnica Jadn

Inhibicin de enterobacterias portadoras de carbapenemasas con secreciones peptdicas de anfibios nativos ecuatorianosCamila Cilveti, Myrian Rivera, Mercedes Rodrguez Riglos e Iliana Alcocer

Desarrollo neural, somitognesis y morfologa interna de los embriones de Hyloxalus vertebrales y Dendrobates auratus (Anura: Dendrobatidae)Francisca Hervas Sotomayor y Eugenia M. del Pino

Caracterizacin de la actividad amilsica presente en extractos larvarios de dos polillas plagas de la papa: Tecia solanivora y Symmetrischema tangoliasPatricia Mora-Criollo, Andrea Rodrguez-Guerra y Carlos A. Soria

Diversidad de microalgas y cianobacteria en muestras provenientes de diferentes provincias del Ecuador destinadas a una coleccin de cultivosEver Morales, Vernica Luna, Luca Navarro, Vismeli Santana, Ana Gordillo y Andrs Arvalo

Diversidad del gnero Drosophila (Diptera, Drosophilidae) en el pramo de Papallacta, Pichincha, EcuadorMara Luna Figuero y Violeta Rafael

07

11

27

47

63

85

99

113

129

151

NDICE

6REVISIN DE TRABAJOS CIENTFICOSIntegrones: plataformas bacterianas de recombinacin gentica y su influencia en la resistencia bacterianaDavid Ortega-Paredes y Jeannete Zurita

Gestin e inventario de la coleccin faunstica de los Centros de Tenencia y Manejo de Fauna Silvestre de la provincia de PastazaKaren Noboa

NOTAS CIENTFICAS

Asociacin entre los polimorfismos -308 y -238 del gen TNF-a y la artritis reumatoide (datos preliminares)Carlos Mestanza, Camilo Zurita-Salinas, Estefana Espn,David Ortega-Paredes, Marcelo Mora, Carlos Vallejo, Rmulo Villacs yMaril Mestanza-Peralta

Diversidad del gnero Drosophila (Diptera, Drosophilidae) en la Quebrada de Cruz Loma, Pichincha, EcuadorDiego Cspedes y Violeta Rafael

INSTRUCTIVO PARA AUTORESInstructivo para autoresRevista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas

167

187

205

215

223

7El editor cientfico de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas quien se ha responsabilizado por su publicacin durante los ltimos cinco aos y con el fin de

rescatar trabajos anteriores, coordin tambin la digitalizacin de todos los volmenes

disponibles. Si algn lector tiene acceso a los materiales faltantes, le agradeceramos que nos comunique para completar la recuperacin electrnica de nuestra revista, disponible en el sitio www.puce.edu.ec/revistaciencia.

El volumen actual XXXIV 2013 incluye materiales relacionados con la caracterizacin de embriones cotilednicos de caf mediante embriognesis somtica; la evaluacin con

marcadores microsatelitales heterlogos sobre la diversidad y variabilidad gentica del

capul; o cmo analizar regiones de ADN ribosomal en hongos quitridiomicsicos para determinar haplotipos. Otros marcadores moleculares vegetales fueron usados para estudiar gentica de poblaciones mientras que la diversidad del gnero Drosophila ha sido utilizada como indicadores de la conservacin de ecosistemas. Se analiz tambin el

manejo de fauna silvestre en centros de tenencia provisionales.

El estudio de la artritis reumatoide asocia ciertos polimorfismos genticos con la

enfermedad, mientras que a los integrones bacterianos nos presentan como plataformas para incorporar y expresar genes casete de resistencia. Otros autores reportaron el uso de secreciones peptdicas anricas para inhibir carbapenemasas.

La informacin comparativa sobre el desarrollo embrionario temprano de algunos anuros fue estudiada en uno de los trabajos, al igual que el aislamiento de protenas

y amilasas larvarias para explicar diferencias infectivas entre estadios y especies de plagas. Otras metodologas de estudio se utilizaron para distinguir diferentes especies de microalgas y cianobacterias.

La portada de este nuevo volumen XXXIV 2013, muestra un extraordinario paisaje

nocturno fotografiado desde la Estacin Cientfica Yasun. La va lctea brilla con

esplendor sobre este paraje ecuatoriano nico y privilegiado.

La UNESCO declar al Yasun reserva de la bisfera terrestre, debido a la inigualable

diversidad de sus recursos naturales, que han evolucionado, seguramente desde el pleistoceno en la poca cuaternaria. Comprende casi un milln de hectreas de la regin

nororiental del pas y es la cuna de la cultura ancestral Tagaeri Taromenane, y donde se

EDITORIAL 2013

8encuentran al menos 2244 especies de rboles y arbustos, 567 especies de aves, 205 especies de mamferos, 105 especies de anfibios, 83 especies de reptiles, 382 especies de peces de

agua dulce, 100.000 especies de insectos, microflora, microfauna, macromolculas an

inidentificadas, adems de reservas hidrocarburferas de importancia.

El pas ofreci al mundo el proyecto innovador sostenible Yasun ITT, para solicitar

que se invirtiera en su conservacin, con la finalidad que se mantuviera libre de modelos

hidrocarburferos extractivistas que perturbaran la secuencia de millones de aos de evolucin y que adems pondra en peligro su papel como controlador de emisiones de dixido de carbono y guardin de importantes fuentes de agua dulce. Se present a la comunidad cientfica y a los pases del mundo a Yasun como uno de los lugares de

mayor biodiversidad del planeta y se enfatiz la importancia de preservarla. Por diversas razones no se obtuvo la respuesta esperada.

Frente a esta disyuntiva, nuestro gobierno decidi proceder con la explotacin de los hidrocarburos de ciertos sectores del Yasun. Esta decisin nos obliga a meditar sobre los

peligros de una economa extractivista, especialmente en una zona tan preciosa y nica como es esta. Nuestra comunidad cientfica debera reflexionar sobre temas vitales como

son la extraccin, reposicin, conservacin, equilibrio, manejo de recursos, obligaciones,

responsabilidades y veeduras, bajo impacto, inversin, certificacin de reservas y otros.

Si las exigencias econmicas de la sociedad imponen la explotacin de estos recursos debemos meditar sobre las consecuencias irreversibles de una decisin de la cual no se podr echar pie atrs.

Entre las consecuencias inevitables de la extraccin de petrleo se encuentran los derrames, piscinas abiertas o lodos superficiales, que al no permitir la aireacin ni el

intercambio inico, afectan a los seres vivos del entorno. Las molculas poliaromticas

son carcingenos liposolubles que se absorben a travs del tracto gastrointestinal y

algunos derivados como las naftalinas y mercaptanos, conocidos contaminantes del agua, son agresivos inhibidores de la respiracin mitocondrial. La misma mezcla de gases del proceso de extraccin son txicos citoplasmticos y mitocondriales. A esto se sumaran los millones de litros de aguas de formacin salinizadas, azufradas y poliaromatizadas, que igualmente son contaminantes. Esto y ms ocurrir en mayor o menor grado, aunque se usen modernas y sofisticadas tcnicas de perforacin y extraccin.

La naturaleza es sabia al seleccionar bacterias y hongos capaces de procesar hidrocarburos. El antagonismo o las atracciones biolgicas que seguramente se habrn desarrollado durante millones de aos en el Yasun, en medio de presiones moleculares

abundantes y estrechas, una vez perdidos o alterados, sern irrepetibles e irrecuperables.

9Mientras tanto, los mecanismos de resistencia se desarrollan tan rpidamente en bacterias, hasta el extremo que los ms recientes antibiticos de ltima generacin ya no logran controlar microorganismos que se han vuelto apocalpticamente patognicos, con el

riesgo de amenazar hasta la propia supervivencia de nuestra especie.

Qu nos podr ensear el Yasun, donde el pool gentico se ha amasado, repartido, evolucionado y diversificado con tanta abundancia durante cientos de miles de aos?

La lgica nos dice que dentro de su flora y fauna, de su suelo y de sus fuentes de agua,

se encuentran los grmenes de nuevas especies de vida. Lo ms probable es que existan

o se estn formando mecanismos desconocidos en organismos capaces de controlar la

multiplicacin de otros, o que haya antibiticos y principios activos a la espera de ser descubiertos. Somos los depositarios de esta incalculable y enorme riqueza a punto de ponerse en riesgo, presionados por la necesidad econmica emergente que es imperante evaluar frente a la responsabilidad de conservarla y entregarla a las generaciones siguientes.

Este ao, igual que los anteriores la investigacin ha dado sus frutos; les presento el nuevo volumen XXXIV 2013 de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas. Que lo disfruten!

Dr. Carlos A. Soria, PhD

Editor Cientfico REMCB

11

TRABAJOS CIENTFICOS

Evaluacin de la variabilidad gentica del capul

(Prunus serotina subsp. capul) en tres provincias del Ecuador

Dmaris P. Intriago-Balden, Mara de Lourdes Torres,

Venancio Arahana y Jos Tobar

Universidad San Francisco de Quito, Colegio de Ciencias Biolgicas y Ambientales, Laboratorio de

Biotecnologa Vegetal. Calle Diego de Robles y Va Interocenica, Campus Cumbay, Edif. Charles

Darwin. Casilla Postal 17-1200-841, Quito, Ecuador

[email protected]

Recibido: 24, 06, 2013; aceptado: 19, 09, 2013

RESUMEN.- Prunus serotina subsp. capul es una especie arbrea, silvestre y tetraploide que se distribuye a lo largo del continente americano y est presente en el callejn interandino

ecuatoriano. A pesar de su potencial econmico en las industrias alimenticia, maderera y mdica, existe poca informacin acerca de la historia y el cultivo del capul en el pas.

Este estudio evalu la diversidad gentica de P.serotina en tres provincias de la sierra ecuatoriana. Se analizaron 88 individuos de capul provenientes de Pichincha, Caar y

Azuay, mediante el uso de ocho marcadores microsatlites heterlogos. Se gener un

dendrograma con su respectivo bootstrap, un anlisis de coordenadas principales (PCoA), un anlisis de Mantel y valores del ndice de distancia gentica (Fst). Los resultados muestran un grado moderado de variabilidad gentica entre los individuos de capul

analizados, junto con un cierto nivel de diferenciacin gentica entre individuos siguiendo

una distribucin norte-sur que no est relacionado con la distancia geogrfica entre las

muestras analizadas. Se discuten varias hiptesis que tratan de explicar estos resultados.

PALABRAS CLAVES: Capul, Prunus serotina subsp. capul, microsatlites, variabilidad gentica

ABSTRACT.- Prunus serotina subsp. capul is a wild arboreal tetraploid species widely distributed throughout America and can be found in the Ecuadorian highlands. Capuli has a high economic potential for food, timber, and medicine; however, there is little information available concerning the history and development of this crop in Ecuador.

12

Revista Ecuatoriana deMEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS

This study evaluated the genetic diversity of capul in three provinces in the Ecuadorian highlands. A total of 88 capul individuals from Pichincha, Caar, and Azuay provinces

were analyzed using eight heterologous microsatellite (SSR) markers. A dendrogram

with its respective bootstrap analyses, a principal coordinate analysis (PCoA), a Mantel

test, and Fst genetic distance index values were generated. The results show a moderate degree of genetic variability among capul individuals analyzed and some level of genetic differentiation between individuals following a north-south distribution which is not related to the geographical distance among the evaluated samples. Various hypotheses that attempt to explain these results are discussed.

KEywORDS: Capul, Prunus serotina subsp. capul, SSR markers, genetic variability

INTRODUCCINEl capul, Prunus serotina subsp. capul

(McVaugh), es una especie frutal arbrea,

silvestre y de rpido crecimiento que pertenece a la familia Rosaceae (Fresnedo-Ramrez et al., 2011; Pairon et al., 2008; Downey e Iezzoni, 2000; Ulloa y Moller Jorgensen, 1995). Es tetraploide (2n = 32) y

se considera que se gener a travs de un

proceso de alopoliploidizacin espontnea (Pairon et al., 2008; Downey e Iezzoni, 2000). Tiene flores blancas dispuestas en

racimos delgados, las cuales poseen cliz lobulado semejante a un cono invertido

y cinco ptalos redondos. Los frutos son

drupas globosas, lampias, carnosas, de corteza fina, que poseen una semilla dura.

Al inicio de su fase de maduracin, el fruto es de color rojo oscuro; luego, adquiere una

tonalidad negra rojiza (CONABIO, 2012;

Mille, 1942; Popenoe y Pachano, 1922).

Entre los polinizadores principales de P. serotina se incluyen varias especies

de moscas (Orden Diptera), una especie

de escarabajo (Orden Coleoptera) y

algunas especies de abejas con inclusin

de la abeja productora de miel (Orden

Hymenoptera). Las semillas de capul se

dispersan por aves y mamferos pequeos; su tasa de germinacin aumenta luego de la regurgitacin o defecacin de estos animales (Mulligan y Munro, 1981).

Se considera que P. serotina es originaria de Norteamrica y que desde

all se ha distribuido al resto del continente americano desde el sur de Canad hasta el sur de Bolivia (Fresnedo-Ramrez et al., 2011; McVaugh, 1951; Popenoe y Pachano, 1922). De hecho, los registros histricos

indican que el capul fue trasladado desde Mxico a diferentes lugares de Amrica

Latina luego de la conquista espaola (Mille, 1942). Sin embargo, los frutos de P. serotina de Amrica del Norte son pequeos con un

dimetro entre 6 a 10 mm, poco carnosos y carecen de valor comercial; mientras

13

Dmaris P. Intriago-Balden, Mara de Lourdes Torres, Venancio Arahana y Jos TobarEVALUACIN DE LA VARIABILIDAD GENTICA DEL CAPUL

(Prunus serotina subsp. capul) EN TRES PROVINCIAS DEL ECUADOR

que las variedades cultivadas en Amrica

Central y Sudamrica se caracterizan por

producir frutos grandes con un dimetro de entre 2 a 3.5 cm, carnosos y de agradable sabor. Una hiptesis que explicara este hecho es que las variedades de capul con frutos grandes fueron el resultado de procesos de domesticacin y seleccin de individuos por tamao, sabor y calidad del fruto (Downey e Iezzoni, 2000). P. serotina tambin fue introducida en el continente

europeo donde ha constituido una opcin viable para lograr la forestacin de zonas abiertas y el enriquecimiento del suelo (Pairon et al., 2008; Auclair y Cottam, 1971).

En Ecuador, el capul est presente a lo largo del callejn interandino, entre los

1800 a 3400 m.s.n.m, desde la provincia

del Carchi localizada cerca del lmite norte hasta la provincia de Loja ubicada al sur. Se

concentra principalmente en las provincias centrales desde Cotopaxi hasta Azuay (Mille, 1942).

P. serotina tiene un ptimo crecimiento en suelos arenosos y de marga aluvial, terrenos altamente arcillosos, laderas secas y rocosas, y reas sueltas de arenas volcnicas. Estos sitios son comunes en las altiplanicies de la sierra ecuatoriana (Popenoe y Pachano, 1922). Adicionalmente,

el capul es intolerante a la sombra por lo cual se desarrolla mejor en claros. Los

rboles de capul son entes dominantes durante la sucesin secundaria ya que proliferan en terrenos donde recientemente se han producido alteraciones o desastres naturales (CONABIO, 2012).

P. serotina tiene un potencial econmico importante. Su madera se caracteriza por su dureza, facilidad de manejo, capacidad de adquirir un atractivo

pulimento y podra ser incorporada a la industria maderera. El extracto etanlico del fruto posee propiedades antioxidantes y antimicrobianas por lo cual podra ser empleado como aditivo para alimentos. Adems, las infusiones elaboradas a base de sus hojas y corteza tienen propiedades

medicinales (Jimnez et al., 2011; Mille, 1942; Popenoe y Pachano, 1922).

En el Ecuador no existen cultivos comerciales de capul y solo crece en jardines, parcelas familiares y en los bordes

de carreteras. Tambin, se lo planta en los

bordes de terrenos donde cumple la funcin de cortina rompevientos. Los campesinos nativos de la regin interandina cosechan los frutos de capul para consumo familiar y comercializacin a nivel local (diario El Comercio, 2012; Palacios, 2011; Downey e Iezzoni, 2000; Popenoe y Pachano, 1922).

No existe investigacin sobre este frutal en el pas que permita aprovechar su potencial.

La determinacin de la diversidad gentica de P. serotina subsp. capul podra constituir el primer paso para conocer sobre esta especie con un uso agrcola-econmico potencial en el Ecuador y emprender programas de mejoramiento gentico

que puedan generar variedades de capul altamente rentables y competitivas a nivel comercial (Moose y Mumm, 2008; Budak

et al., 2004).

14


Los microsatlites o Short Tandem Repeats (SSR) son marcadores moleculares utilizados para realizar anlisis de diversidad gentica, identificacin de

cultivares y ejecucin de programas de

seleccin asistida por marcadores (Wang et al., 2009). Los SSR se caracterizan por ser abundantes en el genoma, altamente polimrficos, reproducibles e informativos;

poseen herencia codominante y son fciles de analizar mediante PCR (Reaccin en cadena de la Polimerasa) (Mondini et al., 2009; Wang et al., 2009). A pesar de sus mltiples ventajas, el desarrollo de

primers SSR puede ser un proceso costoso y laborioso. Este involucra el escaneo de bibliotecas genmicas con sondas marcadas y la secuenciacin de los clones hibridados con el fin de poder determinar

las secuencias de las regiones flanqueantes

del microsatlite. Sin embargo, es posible

transferir primers SSR entre especies filogenticamente relacionadas dentro del

mismo gnero o entre especies de diferentes

gneros dentro de una misma familia

(Wang et al., 2009). Este hecho es altamente beneficioso ya que reduce substancialmente

el tiempo y costos invertidos. Esto se ha comprobado en varios estudios previos realizados en distintas especies vegetales, con inclusin de P. serotina (Mondini et al., 2009; Wang et al., 2009; Pairon et al., 2008).

El presente estudio evala la variabilidad gentica de Prunus serotina subsp. capul en tres provincias del territorio ecuatoriano, mediante marcadores microsatlites heterlogos

provenientes de especies emparentadas filogenticamente con el capul.

MATERIALES Y MTODOSrea de estudio y recoleccin de

muestras.- Se recolectaron muestras de hojas de P. serotina subsp. capul en las provincias de Pichincha, Azuay y Caar. Estas provincias forman parte del piso temperado o regin de los valles interandinos, que se extiende a lo largo de la cordillera de Los Andes y se caracteriza por una topografa irregular con amplios valles y hoyas separadas por nudos. Se extiende entre los 1 800 a los 3 000 m.s.n.m.

(Vargas, 2002; Guevara, 1979).

En general, la temperatura promedio en la regin oscila entre los 12 a los 18 C

con un nivel de precipitacin entre los 500 a los 2 000 mm. En la provincia de Pichincha, las temperaturas oscilan entre 3 y 26 C; en

Azuay, entre 0 y 27 C; y en Caar, entre

3 y 23 C (INAMHI, 2013; Guevara, 1979).

En cada una de las provincias, se identificaron reas donde haba presencia

de rboles de capul en base a la informacin de campo obtenida de los pobladores de cada lugar. Cabe recalcar que no existen cultivos agrcolas de capul sino grupos de rboles dispersos dentro de las tres provincias. De cada rea identificada, se

tom al azar una muestra de un individuo de capul. La distancia entre reas fue de entre 3 a 5 km. En Pichincha, el rango

altitudinal de las zonas donde se colectaron las muestras fue de 2 777 a 3 028 m.s.n.m;

en Azuay, de 2 252 a 2 700 m.s.n.m: y en Caar de 2 440 y 3 181 m.s.n.m.

15



A cada muestra se le asign un cdigo especfico formado por el prefijo

de la provincia de origen y el nmero de coleccin (e.g. PIC 001= Pichincha 001).

Se tomaron datos como lugar, provincia, fecha de coleccin, altitud y coordenadas geogrficas. Las muestras fueron

guardadas en fundas ziploc y rotuladas apropiadamente. Durante la fase de campo, las muestras se almacenaron dentro de un cooler con hielo para promover su preservacin a corto plazo. A su llegada al laboratorio, las muestras de capul fueron trasladadas a un congelador a -20 C para

su conservacin a largo plazo. En total, se colectaron 88 muestras de capul en las tres

provincias: 33 en Pichincha, 25 en Caar y 30 en Azuay.

Extraccin de ADN.- Se extrajo ADN

a partir de las hojas de capul mediante un

protocolo basado en el detergente CTAB (Kieleczawa, 2006). Luego de la extraccin,

se determin la concentracin y calidad del ADN mediante un espectrofotmetro NANODROP 1000 (Thermo Scientific)

y electroforesis en geles de agarosa al 1 %. Previo a la ejecucin de los anlisis

moleculares, se realizaron diluciones de las muestras stock de ADN hasta alcanzar una concentracin de 20 ng/l.

Amplificacin de ADN y

electroforesis.- Se evalu la eficiencia de

transferibilidad de 12 pares de primers SSR

originalmente diseados para genomas de especies filogenticamente relacionadas

con P. serotina subsp. capul como el durazno (Prunus persica L. (Batsch)), la cereza dulce (sweet cherry-Prunus avium (L.) L.) y la cereza agria (sour cherry-Prunus cerasus L.) (Dirlewanger et al., 2002; Downey e Iezzoni, 2000; Testolin et al., 2000). Los pares de primers que generaron productos de amplificacin en capul fueron utilizados

para evaluar las 88 muestras.

Las reacciones de PCR tuvieron un volumen final de 10 l y consistieron

en 2040 ng/l de ADN, buffer PCR 1X (Invitrogen), 1.5 mM de MgCl2 (Invitrogen),

0.2 U de Taq polimerasa (Invitrogen), 0.5 mM de dNTPs y 0.2 mM de cada primer (F y R) (Downey e Iezzoni, 2000). El programa de amplificacin se efectu en

un termociclador T-Personal (Biometra)

y consisti de una desnaturalizacin inicial de 95 C por 5 minutos, 35 ciclos de

desnaturalizacin a 94 C por 45 segundos,

annealing de 48-63 C (segn el primero) por 1 minuto, extensin de 45 segundos a 72 C y una extensin final de 8 minutos a

72 C (Cipriani et al., 1999). Las secuencias de cada uno de los pares de primers y sus temperaturas de annealing se describen en la Tabla 1. Los productos de PCR fueron resueltos en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6 % y visualizados mediante tincin con nitrato de plata (Benbouza et al., 2006).

16


Anlisis de datos.- Los alelos de los loci evaluados fueron visualizados como fragmentos de apariencia doble y documentados como (0) para ausencia y (1)

para presencia. Se elabor una matriz binaria con los datos moleculares de los individuos de las tres provincias. Se emple el software NTSYS-pc 2.11 (Rohlf, 2008) para generar

un dendrograma mediante matrices de similitud y el mtodo UPGMA con el fin

de poder determinar agrupamientos entre individuos. Para el anlisis de Bootstrap, se emple el programa WINBOOT (Yap y

Nelson, 1996) con el propsito de evaluar el

nivel de confiabilidad de los agrupamientos

mostrados por el dendrograma. El software DARwin 5.0.158 (Dissimilarity Analysis and Representation for Windows) (Perrier y Jacquemoud-Collet, 2006) fue utilizado

para realizar un anlisis de coordenadas

principales (PCoA) que permite ver la

dispersin de los individuos en un eje

de coordenadas. Adems, se emple el programa ARLEQUIN (Schneider et al., 1997) para calcular el ndice Fst que indica los niveles de diferenciacin gentica

entre los individuos de las tres provincias estudiadas. Finalmente, se utiliz el paquete estadstico GenAlEx 6.5 (Peakall y Smouse,

2012) para realizar un anlisis de Mantel

que permite evaluar la correlacin entre la distancia geogrfica y la distancia gentica

presente entre los individuos colectados.

RESULTADOSOcho de los doce (66.7 %) pares

de primers SSR heterlogos probados mostraron amplificacin exitosa en los 88

individuos colectados.

Cdigo del Primer Secuencia (5-3) Especie de origen Nmero de alelos* Temperatura de y referencia annealing (C)

PceGA34 F:GAACATGTGGTGTGCTGGTT Cereza agria 10 60(Downey e Iezzoni, 2000) R:TCCACTAGGAGGTGAAATG ("Sour Cherry")

PS12A02 F: GCCACCAATGGTTCTTC Cereza dulce 4 62

(Downey e Iezzoni, 2000) R:AGCACCAGATGCACCTGA ("Sweet Cherry")pchpgms3 F:ACGCTATGTCCGTACCATCTCCATG Durazno 8 60

(Downey e Iezzoni, 2000) R:CAACCTGTGATTGCTCCTATTAAACpchgms2 F:GTCAATGAGTTCAGTGTCTACACTC Durazno 5 52

(Downey e Iezzoni, 2000) R:AATCATAACATCATTCAGCCACTGCUDP98-410 F:AATTTACCTATCAGCCTCAAA Durazno 4 49

(Testolin et al., 2000) R:TTTATGCAGTTTACAGACCGUDP96-001 F:AGTTTGATTTTCTGATGCATCC Durazno 7 56,3

(Testolin et al., 2000) R:TGCCATAAGGACCGGGATGTBBPCT-017 F:TTA AGA GTT TGT GAT GGG AAC C Durazno 4 53,2

(Dirlewanger et al., 2002) R:AAG CAT AAT TTA GCA TAA CCA AGCUDP98-416 F:TTT TCT CAG CAG CCA AAC AA Durazno 7 56

(Testolin et al., 2000) R:ATG TTT CGT GCT TCT GCT CC

Tabla 1 Primers SSR heterlogos seleccionados para evaluar la diversidad gentica en individuos de Prunus

serotina subsp. capul de Pichincha, Caar y Azuay

*Este nmero se refiere a los alelos encontrados en este estudio

17



En los 88 individuos, provenientes

de las tres provincias, se encontr un total de 49 alelos. El nmero de alelos por locus oscil entre 4 y 10 y es el par de primers PceGA34 proveniente de P. cerasus L., el ms informativo con 10 alelos y los pares de primers PS12A02, UDP98-410, y BBPCT-017, provenientes de P. avium (L.) L. y P. persica L. (Batsch), los menos informativos con

cuatro alelos cada uno. El promedio de alelos para los ocho loci SSR fue de 6.13 alelos por locus (Tabla 1).

El dendrograma UPGMA de similitud (Figura 1) muestra que los individuos no

se agrupan de forma estricta de acuerdo con su provincia de origen. De los 11 clsteres encontrados, solo dos incluyen individuos provenientes de una misma provincia. El resto de clsteres estn formados por mezclas de individuos provenientes de dos o tres provincias. El ndice de similitud es de 0.694. Los valores de bootstrap indican que solo dos de los agrupamientos presentes en el dendrograma (uno formado por dos individuos de Pichincha y el otro formado por dos individuos de Caar) son

confiables (>70 %) (Baldauf, 2003).

1

3

4

5

67

8

9

2*

10

11

*

0,60 0,67 0,75 0,82 0,90Coefficient

Figura 1. Dendrograma de similitud UPGMA que muestra el agrupamiento de los individuos de P. serotina subsp. capul de Pichincha, Caar y Azuay. El coeficiente de similitud global aproximado fue de 0.694. Se identificaron 11 grupos y las provincias que los conforman se detallan al lado derecho del grfico. Se us el software NTSYS-pc 2.11. PIC = Pichincha, CAN = Caar, y AZU = Azuay. *Agrupamientos con Bootstrap significativo.

18


El anlisis de coordenadas principales (PCoA) (Figura 2) muestra una dispersin

amplia de los individuos a lo largo de los dos ejes (X: -0.25 a 0.25 y Y-:0.25 a 0.25).

Se visualiza una tendencia de agrupacin de individuos provenientes de Caar y Azuay en los cuadrantes superior e inferior izquierdos del grfico, mientras que la

mayora de los individuos de Pichincha ocupan los cuadrantes superior e inferior derechos del grfico. Estos resultados

podran sugerir una posible diferenciacin de los individuos de las tres provincias en dos grupos de acuerdo con su distribucin geogrfica norte-sur.

Figura 2. Anlisis de coordenadas principales (PCoA) que muestra el grado de dispersin de los individuos de P. serotina subsp. capul provenientes de Pichincha (PIC), Caar (CAN), y Azuay (AZU) en un eje de coordenadas XY. Se us el software DARwin 5.0.158.

19



Segn los parmetros de interpretacin propuestos por Balloux y Lugon-Moulin, (2002), los valores del ndice Fst de diferenciacin gentica entre los individuos

de las tres provincias (a = 0.05) indican que no existe un nivel significativo de

diferenciacin gentica entre los capules

de Caar y Azuay (Fst = 0.053, p = 0.144) mientras que hay un alto nivel de

diferenciacin gentica entre los capules

de Pichincha y Caar (Fst = 0.218, p = 0.000) y un moderado nivel de diferenciacin gentica entre Pichincha y Azuay (Fst = 0.081, p = 0.000).

Finalmente, el anlisis de Mantel mostr una ausencia de correlacin (R2 = 0.064, p = 0.001) entre las variables distancia

geogrfica y distancia gentica de los

capules provenientes de las tres provincias estudiadas.

DISCUSINEstudios previos han constatado la

alta eficiencia de transferibilidad de primers SSR dentro de las especies del gnero

Prunus. Tambin se ha observado que el nivel de transferibilidad se reduce en cierta proporcin si se emplean estos primers para analizar especies pertenecientes a otros gneros dentro de la familia Rosaceae

(Wang et al., 2012; Mnejja et al., 2010). El grado de transferibilidad de los primers SSR heterlogos seleccionados para este estudio (66.7 %) se acerca a los niveles registrados

por investigaciones previas realizadas con este mismo propsito dentro del gnero

Prunus (Wang et al., 2012; Mnejja et al., 2010; Downey e Iezzoni, 2000).

En seis de los ocho pares de primers SSR utilizados en este estudio (Tabla 1), el nmero de alelos es menor que el

documentado para estos mismos seis pares de primers en tres estudios previos que analizaron individuos de P. serotina, P. prsica L. (Batsch) y P. persica var. nucipersica (Dippel). As, cuatro de los ocho pares de

primers empleados en esta investigacin fueron utilizados tambin por Downey e

Iezzoni (2000) para evaluar 66 individuos

de P. serotina provenientes del Estado de Michigan (Estados Unidos) (6), Mxico (50),

y Ecuador (10) y encontraron un nmero

mayor de alelos (primer PceGA34, 14 alelos; primer PS12A02, 12 alelos; primer pchpgms3, 19 alelos; y primer pchgms2, nueve alelos). Otros tres pares de primers fueron evaluados tambin por Dirlewanger et al. (2002), en 27 cultivares de P. persica L. (Batsch) originarias de Estados Unidos (15), Francia (11) e Italia

(1) y en el caso del par de primers BBPCT-017 encontraron un mayor nmero de alelos (5).

El par de primers UDP98-410 fue utilizado tambin por Testolin et al. (2000) para evaluar 50 cultivares de importancia en los mercados occidentales de P. persica L. (Batsch) y P. persica var. nucipersica (Dippel), y encontraron ocho alelos. Solo dos pares de primers (UDP96-001 y UDP98-416) dieron un nmero de alelos mayor en la presente investigacin que en el estudio realizado por Testolin et al. (2000). Para el primer UDP96-001, ese estudio report seis alelos, mientras que para el primer UDP98-416 se reportaron cuatro alelos.

Esto podra indicar que el pool gentico de P. serotina en las tres provincias de la

20


sierra ecuatoriana posee una base gentica

ms estrecha que la reportada para otras latitudes y especies.

La informacin allica obtenida

durante este estudio sugiere que existe un grado moderado de variabilidad gentica

en el capul en las tres provincias analizadas. Sin embargo, se requiere ampliar este estudio preliminar con inclusin de individuos de las otras provincias que tambin conforman el callejn interandino

con el fin de adquirir una visin ms

acertada sobre la diversidad gentica de P. serotina en la sierra ecuatoriana.

El dendrograma de similitud UPGMA (Figura 1) no muestra una tendencia

general de agrupamiento de individuos por su lugar de origen. Solo dos clsteres estn conformados por individuos de una misma provincia. Este patrn tambin ha

sido observado en estudios moleculares realizados en otras especies del gnero

Prunus como P. mume Sieb. et. Succ. (conocido como albaricoque japons o ciruela china),

P. armeniaca (Lam.) Koch (albaricoque) y P. davidiana (Carr.) Franch (Cheng et al., 2011; Gao et al., 2004; Zhebentyayeva et al., 2003), en los cuales siguiendo una lgica similar a la del presente estudio, se incluyeron individuos procedentes de distintas reas geogrficas que fueron analizados

con primers SSR y no se pudo identificar agrupamientos por rea de origen.

Cheng et al. (2011) evalu 192 accesiones de P. davidiana (Carr.) Franch, provenientes de siete poblaciones distintas,

originarias de cuatro provincias de China. Adems, Gao et al. (2004) analiz diecinueve cultivares de P. mume Sieb. et. Succ. provenientes de China y cinco originarios de Japn. Finalmente, Zhebentyayeva

et al. (2003) evalu 74 accesiones de P. armeniaca (Lam.) Koch provenientes de cuatro regiones geogrficas: Europa (15),

la zona Irano-Caucsica (10), China (11)

y Asia Central (32). Los autores de los

estudios mencionados, concluyeron que los resultados obtenidos sugeran que las progenies del mismo lugar provenan de diferentes progenitores y que habra entrecruzamiento entre poblaciones.

En esta investigacin se encontr solo dos grupos con valores de bootstrap superiores al 70 %, por lo cual la inclusin de otros marcadores moleculares para analizar ms loci dentro del genoma del capul podra contribuir a obtener dendrogramas que posean un mayor nmero de agrupamientos con altos valores de confiabilidad (Koskinen et al., 2004).

En el anlisis de coordenadas principales (PCoA) (Figura 2), se observa

una gradiente de diversidad con tendencia a la formacin de dos grupos. Un grupo que incluye a individuos de Pichincha y otro con individuos de Caar y Azuay. Cabe recalcar que estos no son grupos discretos ya que pocos individuos de Pichincha estn presentes en el grupo de Caar y Azuay, mientras que algunos individuos de Caar y Azuay forman parte del grupo de Pichincha. Esto reflejara un cierto grado de

diferenciacin gentica entre la provincia

21



del norte (Pichincha) y las del sur (Caar

y Azuay). Los valores Fst encontrados en este estudio respaldan este patrn de distribucin. El anlisis de Mantel no encontr una correlacin estadsticamente significativa entre las distancias geogrficas

y genticas existentes entre los individuos

de capul analizados.

Al interpretar los resultados obtenidos en este estudio, se puede sugerir un cierto grado de diferenciacin gentica entre

individuos pertenecientes a la provincia del norte (Pichincha) con los de las provincias

del sur (Caar y Azuay). No obstante, la

distancia geogrfica no es el factor que

explica la distancia gentica encontrada

entre ambas zonas. Este anlisis tendra que corroborarse con un estudio ms amplio que abarque individuos del capul del resto de las provincias de la sierra ecuatoriana.

Las formas de dispersin de las semillas de capul donde intervienen factores biolgicos y antropognicos podran explicar

parcialmente los resultados obtenidos en esta investigacin. Un factor biolgico a considerar es la dispersin de semillas de P. serotina a travs de las aves o pequeos mamferos. Esta dinmica ecolgica ya ha sido descrita en investigaciones previas realizadas en Amrica del Norte (Morden-

Moore y Willson, 1982; Mulligan y Munro,

1981). Sin embargo, no hay estudios que

hayan documentado estas interacciones biolgicas en el Ecuador.

Entre los factores antropognicos

que podran estar involucrados en la

dispersin de semillas de capul en la sierra ecuatoriana, se puede mencionar al comercio regional de frutos de capul. Se ha reportado que los campesinos de la regin interandina recogen frutos de P. serotina que crecen en sus parcelas o en campos abiertos y luego los llevan a los mercados. Adems, algunas personas conservan semillas de individuos de capul que provienen de otras provincias y que producen frutos de buena calidad para sembrarlas en los jardines de

sus casas. Finalmente, los consumidores de esta fruta compran los frutos de P. serotina provenientes de diferentes provincias y botan las semillas en distintos terrenos (J. Tobar, comunicacin personal, 22 abril 2013; diario El Comercio, 2012; Downey e Iezzoni, 2000; Mille, 1942; Popenoe y Pachano, 1922).

Se requieren estudios ecolgicos, datos econmicos y reportes antropolgicos sobre el uso y manejo del capul en la sierra

ecuatoriana para corroborar las ideas propuestas en este estudio.

La informacin de este estudio debera ampliarse al anlisis de individuos de P. serotina provenientes del resto de provincias del callejn interandino. De

esta forma, se podra tener un panorama completo acerca de la diversidad gentica

del capul en Ecuador. Los resultados de estas investigaciones podran ser empleados posteriormente para determinar la factibilidad de programas de mejoramiento gentico de este frutal que

posee un interesante potencial agrcola y econmico para el pas.

22


CONCLUSIONESEn esta investigacin, se comprob

la eficiencia de amplificacin de regiones

microsatlites en Prunus serotina subsp. capul, con el empleo de primers SSR provenientes de especies filogenticamente

relacionadas con el capul.

Se encontr un nivel moderado de variabilidad gentica en las 88 muestras

de individuos de capul provenientes de Pichincha, Caar y Azuay y un cierto grado de diferenciacin gentica entre

los individuos de capul de la provincia del norte (Pichincha) y las provincias del

sur (Caar y Azuay) los cuales no estn

relacionados con la distancia geogrfica.

Factores biolgicos como la dispersin de semillas entre provincias por medio de aves y pequeos mamferos junto con factores antropognicos como la

movilizacin de semillas por el comercio regional de frutos de capul y los sembros espordicos de P. serotina en jardines de casas y otros terrenos podran explicar los resultados obtenidos.

Se requieren investigaciones acerca de la ecologa y dinmicas humanas que giran en torno al capul en Ecuador para poder corroborar las ideas propuestas en este estudio.

Un anlisis de diversidad gentica que abarque individuos de todas las provincias de la sierra ecuatoriana contribuira a entender mejor la distribucin

de P. serotina en el Ecuador.

AGRADECIMIENTOSEsta investigacin fue financiada por

la IFS, International Foundation For Science (Suecia), y por la Universidad San Francisco

de Quito USFQ (Ecuador) (Chancellor Grant 2012). Agradecemos a Juan Jos Guadalupe

por su valioso apoyo y contribuciones durante la ejecucin de este proyecto. A

Bernardo Gutirrez y Jennifer Fiallos por

sus comentarios a este manuscrito.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Auclair A y Cottam G. 1971. Dynamics of black cherry (Prunus serotina Erhr.) in Southern Wisconsin oak

forests. Ecological Monographs, 41 (2): 153177.

Baldauf SL. 2003. Phylogeny for the faint of heart: a tutorial. TRENDS in Genetics, 19: 345-351.

Balloux F y Lugon-Moulin N. 2002. The estimation of population differen-tiation with microsatellite markers.

Molecular Ecology, 11: 155165.

Benbouza H, Jacquemin J-M, Baudoin J-P

y Mergeai G. 2006. Optimization of a reliable, fast, cheap, and sensitive silver staining method to detect SSR markers in polyacrylamide gels.

Biotechnology, Agronomy, Society and Environment, 2: 7781.

Budak H, Bolek Y, Dokuyucu T y Akkaya

A. 2004. Potential Uses of Molecular Markers in Crop Improvement. KSU

23



Journal of Science and Engineering, 7: 7579.

Cheng Z, Gasic K, Wang Z y Chen X.

2011. Genetic diversity and genetic structure in natural populations of Prunus davidiana germplasm by SSR markers. Journal of Agricultural Science, 3: 114125.

Cipriani G, Lot G, Huang W-G, Marrazzo MT, Peterlunger E y Testolin R. 1999. AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach (Prunus persica (L) Batsch): isolation, characterization

and cross-species amplification

in Prunus. Theoretical and Applied Genetics, 99: 6572.

Comisin Nacional para el conocimiento y el uso de la biodiversidad (CONABIO). 2012. Prunus serotina. Pgina de Internet: www.conabio.g o b . m x / c o n o c i m i e n t o / i n f o _especies/arbolesdoctos/60rosac6m.pdf. Consultada 24-febrero-2013.

Diario El Comercio. 2012. El capul es un fruto andino que se desarrolla y de-gusta en la serrana. Pgina de inter-net www.elcomercio.com/agromar/capuli-andino-desarrolla-degusta-Serrania_0_652134912.html. Consul-tada 21-agosto-2013.

Dirlewanger E, Cosson P, Tavaud M, Aranzana, MJ, Poizat C, Zanetto A,

Arus P y Laigret F. 2002. Development

of microsatellite markers in peach

(Prunus persica (L.) Batsch) and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry (Prunus avium L.). Theoretical and Applied Genetics, 105: 127138.

Downey SL, y Iezzoni AF. 2000. Polymor-phic DNA Markers in Black Cherry

(Prunus serotina) Are Identified Using Sequences from Sweet Cherry, Peach, and Sour Cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science, 125: 7680.

Fresnedo-Ramrez J, Segura S y Muratalla-

Lua A. 2011. Morphovariability of capuln (Prunus serotina Ehrh.) in

the central-western region of Mexico from a plant genetic resources perspective. Genetic Resources and Crop Evolution, 58: 481495.

Gao Z-H, Shen Z-J, Han Z-H, Fang J-G,

Zhang Y-M y Zhang Z. 2004.

Microsatellite markers and genetic

diversity in Japanese Apricot (Prunus mume). HortScience, 39: 15711574.

Guevara, RD. 1979. Capitulo Sptimo-

Regin de los Valles Interandinos. En: Principios Fundamentales de Ecologa Ecuatoriana: 57-70. Grficas MediaVilla HNOS. Quito.

Instituto Nacional de Meteorologa e Hidrologa (INAMHI). 2013. Ma-pas Climticos del Ecuador. Pgina

24


de Internet: www.inamhi.gob.ec/index.php/tiempo/mapas. Consul-tada: 30-agosto-2013.

Jimnez M, Castillo I, Azuara E y Beristain

CI. 2011. Antioxidant and antimi-crobial activity of capulin (Prunus serotina subsp. capul) extracts. Revista Mexicana de Ingeniera Qu-mica, 10: 2937.

Kieleczawa J. 2006. DNA Sequencing

II Optimizing Preparation and Cleanup. Jones and Bartlett Publi-

shers. Ontario. 362 pp.

Koskinen MT, Hirvonen H, Landry P-A

y Primmer CR. 2004. The benefits

of increasing the number of microsatellites utilized in genetic population studies: an empirical perspective. Hereditas, 141: 6167.

McVaugh R. 1951. A revision of the North American Black Cherries (Prunus serotina Ehrh. and Relatives). Brittonia, 7: 279315.

Mnejja M, Garcia-Mas J, Audergon J-M, y

Arus P. 2010. Prunus microsatellite marker transferability across

rosaceous crops. Tree Genetics & Genomes, 6: 689700.

Morden-Moore AL y Willson MF. 1982. On

the ecological significance of fruit

color in Prunus serotina and Rubus occidentalis: field experiments. Canadian Journal of Botany, 60: 15541560.

Mille L. 1942. El Capul. En: FLORA, 2:50-51. Instituto de Ciencias Naturales del Ecuador. Quito.

Mondini L, Noorani A y Pagnotta M. 2009. Assessing Plant Genetic Diversity by Molecular Tools. Diversity, 1: 1935.

Moose S y Mumm R. 2008. Molecular Plant

Breeding as the Foundation for 21st century crop improvement. Plant Physiology, 147: 969977.

Mulligan GA y Munro DB. 1981. The

biology of Canadian weeds. 51. Prunus virginiana L. and P. serotina Ehrh. Canadian Journal of Plant Science, 6l: 911-992.

Pairon M., Jacquemart A y Potter D. 2008.

Detection and Characterization of genome specific Microsatellite

markers in Allotetraploid Prunus serotina. Journal of the American Society for Horticultural Science, 133: 390395.

Palacios W. 2011. rboles del Ecuador-Ministerio del Ambiente del Gobierno Nacional de la Repblica del Ecuador. Primera edicin. Grupo Comunicacional Efigie. Quito. 923 pp.

Peakall R y Smouse P E. 2012. GenAlEx

6.5: genetic analysis in Excel. Pgina de Internet: www.biology.anu.edu.au/GenAlEx/Welcome.html. Consultada 28-agosto-2013.

25



Perrier X, Jacquemoud-Collet, JP. 2006.

Darwin software. Pgina de Internet: www.darwin.cirad.fr. Consultada 21-febrero-2013.

Popenoe W y Pachano A. 1922. The capulin cherry. Journal of Heredity, 13: 5062.

Rohlf, FJ. 2008. NTSYSpc: Numerical Taxonomy System, ver. 2.20. Exeter Publishing. Ltd. Setauket.

Schneider S, Kueffer J-M, Roessli D y Ex-coffier L. 1997. ARLEQUIN ver. 1.1.

A software for population genetics data analysis. Pgina de Internet: www.anthropologie.unige.ch/arle-quin. Consultada 4-Marzo-2013.

Testolin R, Marrazzo T, Cipriani G, Quarta R, Verde I, Dettori MT, Pancaldi M y Sansavini S. 2000. Microsatellite DNA in peach and its use in fingerprinting and testing the

genetic origin of cultivars. Genome, 43: 512520.

Ulloa Ulloa C y Moller Jorgensen P. 1995.

rboles y arbustos de Los Andes del Ecuador. Segunda edicin. Ediciones Abya Yala. Quito. 329 pp.

Vargas M. 2002. Ecologa y Biodiversidad del Ecuador. Primera edicin. E. P. Centro de Impresin. Quito. 232 pp.

Wang H, Walla JA, Zhong S, Huang D

y Dai W. 2012. Development and cross-species/genera transferability of microsatellite markers discovered

using 454 genome sequencing in chokecherry (Prunus virginiana L.). Plant Cell Reports, 31: 20472055.

Wang M, Barkley N y Jenkins T. 2009.

Microsatellite Markers in Plants

and Insects. Part I: Applications of Biotechnology. Genes, Genomes, and Genomics, 3: x-y.

Yap VI y Nelson RJ. 1996. WINBOOT: A Program for Performing Bootstrap Analysis of Binary Data to Determine the Confidence Limits of UPGMA-

Based Dendrograms. International Rice Research Institute. Manila.

Zhebentyayeva TN, Reighard GL, Gorina

VM y Abbott AG. 2003. Simple sequence repeats (SSR) analysis for

assessment of genetic variability in apricot germplasm. Theoretical and Applied Genetics, 106: 435444.

27

Estudio de gentica poblacional de Polylepis pauta y Polylepis sericeaen Pichincha mediante la utilizacin de marcadores moleculares SSRs

Rosa Andrade1, Mnica Jadn1 y Claudia Segovia-Salcedo1, 21 Grupo de Conservacin de Bosques de Polylepis. Facultad de Biotecnologa, ESPE,

Sangolqu, Ecuador [email protected]

2 Deparment of Biology. University of Florida. Gainesville, Florida. EEUU

[email protected]

Recibido: 10, 01, 2013; aceptado: 01, 10, 2013

RESUMEN.- Los bosques de Polylepis son centros de biodiversidad con alto impacto antropognico. En nuestro pas no existen estudios de estructura gentica en el gnero,

informacin indispensable para su conservacin gentica. El presente estudio se centra

en dos especies con conflicto taxonmico: P. pauta y P. sericea en la provincia de Pichincha (Yanacocha, Mojanda y Cayambe-Coca). En total se analizaron 142 individuos de las

tres poblaciones. El ADN se extrajo mediante el mtodo CTAB para luego amplificarlo

con cinco microsatlites diseados para este gnero. Se detectaron 18 alelos compartidos

entre las dos especies. El anlisis mediante Structure revel la existencia de dos grupos. El primero conformado por Cayambe-Coca y Mojanda y el otro por Yanacocha. Los

valores de heterocigocidad observada (Ho) en Cayambe-Coca, Mojanda y Yanacocha

fueron de 0.576 y 0.299. Mientras que la esperada (He) fue de 0.605 y 0.524. La mayor

diferencia corresponde a Yanacocha y se puede atribuir a la seleccin a favor de un alelo

o endogamia. Mediante anlisis de diferenciacin se comprob que ambos grupos son diferentes con p=0.00072 (a=0.05). AMOVA mostr que la mayor variacin corresponde a dentro de las poblaciones (88 %). El anlisis de agrupamiento detect dos grupos:

el primero conformado por Cayambe-Coca y Mojanda, y el segundo por Yanacocha.

Sin embargo, se detect un agrupamiento diferente para la subpoblacin Mojanda

1 (P. pauta x P. incana). No se encontr correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica. En este estudio se pudo diferenciar a ambas especies molecularmente, por lo

cual se demuestra que los SSRs diseados fueron marcadores poderosos en anlisis de diversidad, diferenciacin y estructura en este gnero.

PALABRAS CLAVES: conservacin, gentica poblacional, Polylepis, SSRs

28


ABSTRACT.- Polylepis forests are one of the most vulnerable centers of Andean diversity that have been affected by anthropogenic impacts. In Ecuador there are no studies of genetic structure in this genus, which is fundamental information for genetic conservation. This study analyzed two species with taxonomic uncertainty, P. pauta and P. sericea, in three populations: Yanacocha, Mojanda, and Cayambe-Coca National Park. Each

population consisted of three subpopulations with a total of 142 individuals. DNA was extracted using the CTAB method and was amplified with 5 SSR primers designed for

this genus. Eighteen alleles were detected between the two species. Analysis for genetic structure detected two groups. The first one contained the Cayambe-Coca and Mojanda

populations and Yanacocha was in the second group. The observed heterogeneity (Ho)

for the Cayambe-Coca and Mojanda population was 0.576, and 0.299 for the Yanacocha

population. In contrast, the expected heterogeneity (He) was 0.605 and 0.524 for the

populations in Cayambe-Coca and Mojanda and Yanacocha. The biggest difference

between these statistics was in the Yanacocha population. This could be attributable to

one allele selection or inbreeding. Through differentiation analysis it was probed that both population established are different p=0.00072 (a=0.05). The largest source of variation corresponds to within populations differences (AMOVA). Clustering analysis

detected a significant clustering in a subpopulation from Mojanda (Moj1). This may

be due to a hybrid origin (P.pauta x P. incana) of this population. Correlation between genetic and geographic distance was not detected. Through this study it was possible to differentiate both species; therefore, SSRs were powerful markers to detect genetic

diversity, differentiation, and population structure in this genus.

KEywORDS: conservation, Polylepis, population genetics, SSRs

INTRODUCCINA nivel mundial durante el perodo de

1990 al 2012, se han reportado las mayores reducciones de reas de bosques en los trpicos en pases en vas de desarrollo (White et al., 2007). Es ms, se estima que ms del 98 % del bosque primario en el

mundo se ha perdido debido a actividades humanas en los ltimos 1000 aos. Los Andes no son la excepcin, en los cuales los bosques de Polylepis entre los ecosistemas

ms amenazados en el Neotrpico (Gareca et al., 2013). Se estima que la tasa de deforestacin en el Ecuador es del 3 % anual; est dentro de los pases con el porcentaje ms alto de deforestacin en

Latinoamrica, con prdidas entre 60 000 a

200 000 hectreas de bosques nativos, que son resultado de cortes ilegales, expansin de los cultivos, presin por compaas mineras y petroleras (Mecham, 2001).

29

Rosa Andrade, Mnica Jadn y Claudia Segovia-SalcedoESTUDIO DE GENTICA POBLACIONAL DE Polylepis pauta Y Polylepis sericea

EN PICHINCHA MEDIANTE LA UTILIZACIN DE MARCADORES MOLECULARES SSRs

La fragmentacin de estos bosques genera varios cambios, entre ellos la alteracin de los patrones de flujo gnico,

con aumento de la diferenciacin entre las poblaciones y por ende una disminucin en el xito reproductivo de los individuos,

debido a la endogamia (White et al., 2007; Fjeldsa y Kessler, 1996). En nuestro pas

se han identificado 7 especies nativas

pertenecientes al gnero Polylepis, entre las cuales se encuentran P. weberbaueri, P. pauta, P. sericea, P. incana, P. microphylla, P. reticulata y P. lanuginosa; las dos ltimas son endmicas de nuestro pas (Romoleroux y Pitman, 2004). Los bosques de Poylepis proveen numerosos servicios ecolgicos que han sido subestimados durante siglos por una falta de conocimiento. Las hojas agrupadas al final de

las ramas colectan agua de la neblina tpica de los ecosistemas altoandinos. Su fuerte relacin con musgos y lquenes ayudan a controlar el flujo del agua. Estos bosques proveen refugio

de cientos de plantas y animales muchos de ellos endmicos. A pesar de la importancia

de Polylepis, en los ecosistemas altoandinos no existen estudios suficientes sobre la

estructura gentica de sus especies (Gareca

et al., 2013). Con la informacin obtenida en este estudio ser posible elaborar proyectos de restauracin y de reforestacin exitosos que contribuyan a un manejo adecuado y

conservacin de los bosques de Polylepis en el Ecuador.

En este trabajo se pretende examinar

la estructura gentica de P. pauta y P. sericea, ambas especies con caractersticas morfolgicas similares (Segovia-Salcedo et al., 2010; Romoleroux, 1996). Mediante este estudio ser posible diferenciarlas molecularmente con el propsito de resolver el conflicto taxonmico de las

mismas. Este es el primer trabajo realizado

en este gnero con la utilizacin de los

marcadores microsatlites diseados para

este grupo taxonmico, por lo cual los resultados obtenidos son promisorios para investigaciones futuras.

MATERIALES Y MTODOS Recoleccin y conservacin del mate-

rial vegetal.- En la presente investigacin, se utilizaron hojas frescas recolectadas en

las salidas de campo, as como muestras bo-tnicas. Las hojas fueron colectadas en bol-sas plsticas e inmediatamente colocadas en neveras porttiles para evitar la oxidacin del material. Se recolectaron muestras de tres poblaciones: Cayambe-Coca, Mojanda

y Yanacocha, con un total de 142 individuos

en la provincia de Pichincha. Cada poblacin const de tres subpoblaciones, con un pro-medio de 15.7 individuos por subpoblacin. Ejemplares colectados en cada una de las

poblaciones se encuentran depositados en el Herbario Nacional (QCNE) (Tabla 1).

30


Los individuos (rboles) en los

muestreos fueron seleccionados al azar, adems se tom una distancia mnima de 10 m entre individuos para asegurar que se estaban recolectando individuos diferentes. En todas las salidas de campo se georeferenciaron los puntos de coleccin

(GPS), con los cuales se elaboraron mapas

de distribucin mediante el programa MapSource 6.13.7 y GPS Visualizer 2012. Las poblaciones muestreadas corresponden a tres sectores: Cayambe-Coca, Mojanda

y Yanacocha de la provincia de Pichincha

(Figura 1).

Poblacin Especie Ubicacin Geogrfica (UTM) y elevacinNmero deIndividuosColectados

Tabla 1Descripcin de las muestras de Polylepis pauta y Polylepis sericea recolectados para el

presente estudio

31



La distancia en lnea recta entre las poblaciones de Yanacocha y Mojanda es

de 44.4 km, la distancia entre Mojanda

y Cayambe-Coca es de 47.9 km y entre

Cayambe-Coca y Yanacocha es de 51 km.

Las poblaciones de Yanacocha se encuentran

en la cordillera Occidental, mientras que las de Cayambe-Coca y de Mojanda se

encuentran en la cordillera Oriental.

Extraccin y cuantificacin de

ADN genmico.- La extraccin de ADN genmico en tejidos vegetales implica:

remocin de las membranas que cubren el ADN, separacin del ADN de otros componentes celulares y el mantenimiento de la integridad del ADN durante el proceso. Para la extraccin de ADN se probaron 4 protocolos: Doyle y Doyle,

Figura 1. Gentica poblacional Polylepis pauta y Polylepis sericea en Pichincha mediante SSRs. Mapa de distribucin de las muestras recolectadas de P. pauta y P. sericea. Reserva Cayambe Coca (crculos rojos), Fundacin Conservacin Jocotoco, Yanacocha (crculos verdes), Mojanda (crculos azules). Mapa elaborado mediante MapSource y GPS Visualizer.

32


1987; Porebski et al., 1997; Khanuja et al., 1999 y un protocolo modificado de CTAB.

De acuerdo con los resultados obtenidos la extraccin de ADN con mayor cantidad

y calidad en estas muestras de Polylepis se llev a cabo mediante el protocolo de CTAB modificado (Figura 2).

Para este protocolo, primero se congelaron tanto los morteros como los pistilos a -20 C. Despus se coloc en

ellos la muestra (5 g) y se la macer con

nitrgeno lquido, hasta obtener una muestra pulverizada. Este macerado se lo almacen en tubos Falcon de 15 ml en el congelador de -80 C hasta su posterior

uso. Para la extraccin de ADN se pesaron aproximadamente 200 mg del macerado anterior en microtubos de 2 ml y se los mantuvo en nitrgeno hasta colocar el

tampn de extraccin. Al momento de la extraccin se aadi en el tampn de extraccin (CTAB 2 %, EDTA 0.25 M, NaCl 5 M y Tris-HCl 1 M (pH 8) los antioxidantes

(PVP 2 % y 15 l -Mercaptoetanol). En cada microtubo de 2 ml se colocaron 800 l de

este tampn y fueron mezclados mediante pistilos y con vrtex hasta obtener una solucin homognea. Luego, se colocaron

400 l ms de tampn hasta que se obtuvo una muestra completamente disuelta en el tampn de extraccin. A esta solucin se

Figura 2. Electroforesis en geles de agarosa al 0.8 % teido con Sybr Safe (0.035 ng/ml de gel) para la verificacin de la calidad de ADN de las poblaciones de Polylepis. A) Cayambe Coca, B) Mojanda C) Yanacocha. High: Marcador de alto peso molecular.

A

B

C

33



la incub a 65 C durante una hora. Una

vez enfriados los tubos, se aadieron en la sorbona 800 l de CIA (24:1). Despus,

se agit vigorosamente en el vrtex, hasta obtener una emulsin blanquecina. A esta emulsin se la centrifug a 14500 rpm por 10 minutos. Y se traspas el sobrenadante

a un tubo de 1.5 ml sin topar la interfase presente. Luego, se aadieron 700 l de isopropanol a -20 C y se guardaron los

tubos a -20 C durante 2 horas. En caso

de no visualizarse el precipitado de ADN se incub por 1-2 horas ms en -20 C.

Despus, se centrifugaron los tubos por 15

minutos a 14 500 rpm y el sobrenadante obtenido se lo descart. Luego, se realizaron dos lavados del precipitado con 300 l de etanol al 70 % a -20 C. Una vez realizados

estos dos lavados se realiz un lavado final con 200 l de etanol puro. Todos los

lavados se los realiz en un termobloque a 300 rpm por 5 minutos, seguido de 3 min de centrifugacin rpida. Una vez concluidos los lavados se evaporaron los restos del alcohol presente, de preferencia esto se lo realiz en una sorbona por unos 30 minutos. Despus, se resuspendi este

pellet, para incubarlo a 37 C con 100 l de tampn TE y 3 l de RNAasa por una hora o hasta que se observ la completa disolucin del mismo. Una vez disuelto el ADN se lo almacen durante una media hora a 4 C y

despus se realizaron alcuotas a 20 ng/l.

Estas alcuotas se almacenaron a 4 C y el

resto en el congelador de -80 C.

La calidad y cantidad de ADN extrado se la evalu mediante fluorometra

con el uso de Quant-iT dsDNA BR Assay,

INVITROGEN y con geles de agarosa al 0.8 % teidos con Sybr Safe (0.035 l/ml de

gel). En la corrida se incluyeron 2 l de un

marcador de peso, High DNA Mass Ladder INVITROGEN, a un voltaje constante

de 120 V por una hora. La visualizacin de esta corrida electrofortica se la realiz

mediante un transiluminador de luz UV, VILBER LOURMAT TFX- 20.M y el almacenamiento se lo realiz en el equipo Bio-DocIT System.

Amplificacin de secuencias micro-

satlites.- Los primers especficos para la amplificacin de los microsatlites utiliza-dos en este estudio, fueron diseados en el laboratorio de Sistemtica Molecular y Gentica Evolutiva de la Universidad de

Florida a partir de una biblioteca genmica de P. racemosa (datos no publicados). Se analizaron 32 primers para microsatlites. Para la validacin de estos primers se pro-cedi primero con una TD-PCR (Touchdown PCR), para verificar la amplificacin. Las

condiciones de temperatura y de tiempo para la amplificacin fueron: 3 minutos a

94 C, 35 ciclos (30 segundos a 94 C, 45 se-gundos en (46, 48, 50 y 52 C), 30 segundos

a 72 C), finalmente una extensin de 20

minutos a 72 C. El volumen de reaccin fi-nal fue de 10 l, mediante concentraciones 1X Tampn, 1.5 mM MgCl2, 0.05 mM de dNTPs, 0.45 M de primer Forward, 0,45 M de primer Reverse, 1.8 U/l de Taq

polimerasa y para completar la reaccin 6.24 l de agua PCR.

Se utilizaron cinco sets de primers: 2F-2Ra, 2F-2Rb, 13F-13R, 17F-17Ra y

34


20F-20R (Tabla 2), que fueron seleccionados

por brindar los datos ms polimrficos en

cada poblacin.

El primer paso fue la bsqueda de controles positivos adecuados en base a los alelos presentes en la poblacin.

Despus con estos controles se realizaron

dupletas de todas las muestras. En todas las validaciones se incluyeron controles negativos y el marcador de peso molecular Track-It 100 bp DNA Ladder de

INVITROGEN. Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 3 % a 100 V por una

hora. Los geles fueron visualizados bajo luz

UV y se fotodocumentaron para seleccionar los mejores patrones de los alelos en las

poblaciones de estudio.

Anlisis de datos.- Los datos fueron registrados en una matriz de Microsoft Office Excel 2007, en base al ingreso de

Primer Secuencia del primer T alineamiento

Tabla 2Sets de Primers empleados con su respectiva secuencia

35



informacin de marcadores codominantes exigido por GenAlEx v6.4. En el presente estudio se analizaron la diversidad, diferenciacin y estructura gentica para

cada grupo de muestras con los 5 sets de primers microsatlites seleccionados.

La asignacin de los individuos a grupos, se la realiz mediante Structure v6.4 (Pritchard et al., 2000), si se toma en cuenta el modelo de admixture junto con frecuencias correlacionadas como lo sugieren Falush et al., 2007 en casos de una sutil es-tructura poblacional. Se determinaron va-lores de burning lenght de 10 000 y un lar-go de cadena de 100 000 con un valor de a=0.0607. Luego se defini al valor K segn la tcnica de Evanno et al., 2005, con lo cual se obtuvo una probabilidad de la existencia de tres poblaciones. Con este valor, se cal-cul Q (proporcin de cada individuo en k

poblaciones) y estos datos se transfirieron

a Distruct para su visualizacin y posterior anlisis.

Una vez establecido el nmero de poblaciones de acuerdo con la estructura gentica, se prosigui con los anlisis

de diversidad y diferenciacin gentica.

Se calcularon frecuencia de alelos, heterocigosidad esperada y observada (He-Ho), coeficiente de endogamia, equilibrio de

Hardy-Weinberg, distancia gentica de Nei

y anlisis de agrupamientos. Los valores de He y Ho se los obtuvo a partir de la inferencia del equilibrio de Hardy-Weinberg mediante el programa ARLEQUIN 3.5 con 1 000 000 de iteraciones para la cadena de Markov y

con 1 000 pasos de dememorization. Una

vez analizados los valores de He y Ho, para cada una de las poblaciones, se realiz la prueba de X2 con el objetivo de probar si los genotipos observados son consistentes con los esperados bajo apareamiento al azar

con a=0.05 %.

La diferenciacin gentica se la

calcul mediante la comparacin de pares de poblaciones, a travs de la estadstica

F de Wrights. Este anlisis se lo realiz en Arlequin 3.5, ya que este programa permite evaluar la hiptesis nula mediante los valores p. Para ello se utiliz la funcin de Compute Pairwise Differences mediante la opcin de Compute a distance matrix. Despus se realiz el anlisis de varianza

molecular (AMOVA), para conocer en

donde se encuentra la mayor variabilidad. La matriz de distancia gentica se la elabor

mediante GenAlEx v6.4 a travs de la opcin

de Codom Genotypic, que proporciona una matriz de distancias genticas individuo

por individuo (NxN) (Peakall y Smouse,

2006). Una vez elaborada la matriz de

distancia gentica se procedi a calcular la

distancia gentica de Nei.

Los anlisis de agrupamiento se los realiz mediante el programa Mega v5.0 de Tamura et al., 2011. Se especific el tipo de dato DataType=distance y la forma de la matriz triangular de las distancias genticas DataFormat=lowerleft. Para determinar si exista o no correlacin entre la composicin gentica y la localizacin

geogrfica se aplic el test de Mantel. Para

ello se utilizaron los datos obtenidos del GPS y la matriz de distancia gentica de

36


Nei elaborada mediante GenAlEx v6.4. Las distancias geogrficas se las realiz

con log (1+x), esto para poder visualizar

mejor la correlacin entre ambas matrices.

La relacin entre ambas matrices para el test de Mantel se la elabor con XLSTAT 2012, mediante la opcin de pruebas de correlacin/asociacin.

RESULTADOSMediante anlisis en Structure v6.4, se

pudo determinar una estructura gentica

de dos poblaciones. Los resultados indican que tanto las poblaciones de Cayambe-Coca como las de Mojanda comparten un

mismo patrn, mientras que la poblacin de Yanacocha muestra otro (Figura 3).

En la Figura 4 se muestran los 18 alelos

registrados con sus respectivas frecuencias para los 142 individuos con los 5 loci.

Figura 3. Representacin de Q mediante grfico de barras en Distruct. Cada individuo se representa en una lnea vertical, divida en los tres conglomerados definidos. La poblacin Cayambe-Coca es prpura, Mojanda es verde y Yanacocha es azulado.

Figura 4. Frecuencia de alelos en los cinco loci para las tres poblaciones. A=Cayambe-Coca y Mojanda, B=Yanacocha.

Cayam

beCoc

a

Yanacoc

ha

Mojand

a

Frecuencia de alelos

Frec

uenc

ia

Locus

37



Los valores obtenidos de heterocigo-sidad esperada (He), heterocigosidad obser-vada (Ho) e ndices de fijacin para las tres

poblaciones se resumen en la Tabla 3.

Los resultados muestran que la

mayor diferencia entre He y Ho se da en la poblacin de Yanacocha. Igualmente, la

mayor diferencia en el ndice de fijacin es

atribuible a Yanacocha, lo cual indica que

existe la probabilidad de endogamia en esta poblacin.

Poblacin Ho He F

Tabla 3Valores de Heterocigosidad observada (Ho), Heterocigosidad esperada (He) e ndice de fijacin (F) para

las dos poblaciones

Tabla 4 Anlisis de varianza molecular (AMOVA). Considerando 2 poblaciones (Yanacocha y Cayambe Coca-

Mojanda) y 3 subpoblaciones por poblacin

El anlisis de diferenciacin FST en los pares de poblaciones a travs de valores

p, con 100 000 permutaciones y un nivel de significancia (a=0,05) mostr que las dos

poblaciones son significativamente diferentes

(p=0.00072). El anlisis de AMOVA mostr

que la mayor variacin se atribuye a nivel individual con casi el 90 % (Tabla 4).

Fuente devariacin

Grado delibertad

Suma decuadrados Varianza % de variacin

38


El dendograma mediante UPGMA (elaborado con el uso de la distancia gentica

de Nei), mostr dos grupos principales:

primero Cayambe-Coca, Mojanda y en

otro extremo a Yanacocha. Sin embargo, se

muestra separada la subpoblacin Mojanda

1 (Figura 5).

Esta poblacin, debido a indicios de variaciones morfolgicas ha sido reportada ya como hbrida (P. pauta x P. incana) (Romoleroux, 1996).

Tambin dentro de los anlisis de

estructura gentica se incluy el Test de

Mantel. El valor calculado en esta prueba es mayor que el nivel de significancia a=0.05 (0.233), por lo tanto no se puede rechazar

la hiptesis nula. Es decir, que no existe correlacin entre la matriz de distancia gentica de Nei y la de distancia geogrfica,

donde R2= 0.0199 (Figura 6).

Figura 5. Dendograma derivado de anlisis de 5 SSR polimrficos mediante UPGMA, basado en la distancia gentica de Nei.

Figura 6. Representacin grfica del test de Mantel, distancia geogrfica versus distancia gentica de Nei.

39



DISCUSINAl ser esta una primera investigacin

en el gnero Polylepis con microsatlites, los resultados son bastante promisorios. Los resultados indican que Cayambe-Coca y Mojanda (a excepcin de Mojanda 1)

corresponderan a una poblacin, de acuerdo con estudios previos taxonmicos y revisin de muestras de herbario, pertenecen a la especie P. pauta, mientras que la poblacin de Yanacocha correspondera a otra (P. sericea). Por lo cual el objetivo principal de poder

discriminar dos especies morfolgicamente ambiguas, se cumpli a cabalidad.

En cuanto a la metodologa empleada, en primer lugar, el mtodo de extraccin

de ADN descrito fue apropiado para la amplificacin de secuencias microsatlites.

En este gnero se han reportado varios

mtodos de extraccin de ADN mediante

kits comerciales (Julio et al., 2011; Schmidt-Lebuhn et al., 2006; Kerr, 2004). Adems, en el 2011, Hensen et al. reportan un protocolo de extraccin en base a CTAB modificado

para el estudio de AFLPs. El presente trabajo

prob todos estos mtodos; sin embargo,

dado el nmero de muestras a tratarse y la cantidad de reactivos a emplear, se opt por utilizar el protocolo de CTAB al 2 % con las modificaciones descritas en materiales y

mtodos. Este protocolo mostr los mejores

resultados tanto en calidad como en costo. Las altas concentraciones de ADN obtenidas mediante este protocolo se atribuyen a varios factores como: alta concentracin de antioxidantes (PVP y -mercaptoetanol), amplia superficie de contacto entre la

muestra y tampn de extraccin (mezcla

mediante pistilos), precipitacin mediante

isopropanol y los lavados con etanol, por lo cual se sugiere que en ensayos con muchos individuos ( 100), se use este protocolo ya

que es una forma rpida y econmica de extraer ADN de alta concentracin a partir de material vegetal fresco.

En este gnero se ha reportado el uso

de marcadores del tipo ITS y marcadores cloroplastdicos (Kerr, 2004), AFLPs

(Hensen et al., 2011; Schmidt-Lebuhn et al., 2006), RAPD e ISSR (Julio et al., 2008; Ochoa et al., 2008) y marcadores bioqumicos como las aloenzimas (Aragundi et al., 2011). Este es el primer estudio en Polylepis en el cual se utilizan microsatlites para

estudios de diversidad gentica y estructura

poblacional. Al trabajar con un marcador

de tipo codominante, se tiene la ventaja

de poder usar menos microsatlites; se

conoce que para tener inferencias similares, se debe emplear al menos cuatro veces ms individuos por locus en un marcador dominante que con un codominante. Es ms, cuando las tasas de migracin son altas y la heterogeneidad en el genoma es baja, se sugiere incluso el uso de 10

veces ms individuos por locus (Lynch y Milligan, 1994). Por lo tanto, el uso de

SSRs en Polylepis puede brindar estimados genticos similares con menor nmero

de secuencias. Los cinco sets de primers aqu utilizados (2F-2Ra, 2F-2Rb, 13F-13R, 17F-17Ra y 20F-20R) fueron seleccionados

de acuerdo con el nmero de productos amplificados, calidad en los perfiles de

amplificacin, nivel de polimorfismo

y reproducibilidad. Sin embargo, es

40


importante notar que este es un ensayo piloto. Se logra diferenciar estas dos especies, pero estimaciones genticas ms

finas debern realizarse con un mayor

nmero de muestras y ms secuencias microsatlites.

En el presente estudio se detect que solamente las poblaciones de Yanacocha

presentaron una diferencia significativa

entre la heterocigosidad observada y esperada. Segn el equilibrio de Hardy-Weinberg, se espera una mayor cantidad de heterocigotos de los observados. Este dficit de heterocigotos se puede explicar

por la seleccin a favor o en contra de un alelo, mediante la endogamia o por la falla de amplificacin (Selkoe y Toonen, 2006;

Nybom, 2004). En las poblaciones de P. sericea de la localidad Yanacocha, se detect una heterocigosidad observada de 0.3. Este valor es cercano al reportado por Julio

et al., 2008 (Ho=0.258), en donde explica que este dato es comn en plantas con caractersticas similares de vida a Polylepis (polinizacin cruzada, anemfilas y un

alto nmero de cromosomas). En el caso

de la heterocigosidad esperada se detect el valor de 0.576 en la poblacin Cayambe-Coca, Mojanda. Este valor discrepa con los

estudios de Hensen et al. 2011 realizado mediante AFLPs en especies ecuatorianas de P. pauta (He = 0.164-0.273).

Estas diferencias se pueden deber al tipo de marcador molecular empleado. En los SSR (codominante) se espera un valor

mayor de diversidad ya que los errores en la replicacin son ms frecuentes que las

mutaciones de un solo nucletido o eventos de insercin o deleccin, que generan los polimorfismos detectables mediante otros

marcadores como los AFLPs (dominantes)

(Powell et al., 1996).

La diversidad gentica presente

dentro y entre las poblaciones surge, de un balance entre la deriva gnica, la endogamia,

la recombinacin, el flujo gnico, la

mutacin y la seleccin. Este balance es afectado tanto por factores naturales como antropognicos (Loveless y Hamrick,

1984). En el presente estudio, luego de

calcular las heterocigosidades observada y esperada dentro de las poblaciones de Yanacocha (Ho=0.3, He=0.52), Cayambe-

Coca, Mojanda (Ho=0.58, He=0.61) se

determin que la mayor diferencia en base a X2 corresponde a Yanacocha.

Por lo tanto, se puede considerar que las poblaciones de Cayambe-Coca y Mojanda tienen un comportamiento de

reproduccin al azar, mientras que las poblaciones de Yanacocha no lo tienen. En

la presente investigacin se observ que la poblacin de Yanacocha se limita un

solo bosque continuo. Por el contrario, las poblaciones de Mojanda y Cayambe-Coca

tienen una mayor rea geogrfica, que a

pesar de mostrar fragmentacin de hbitat, puede darse flujo gnico entre sus diversos

parches. Por lo tanto, la falta de variabilidad de Yanacocha se puede atribuir a un proceso

de endogamia dentro de esta poblacin. Es necesario evaluar en otras regiones del pas, la gentica de P. sericea para plantear acciones de conservacin en esta especie.

41



Los valores de diferenciacin gentica

reportados en el presente estudio se obtuvieron mediante Fst calculados a partir de AMOVA, prueba con la cual se obtiene una matriz de distancias euclideanas. Esta medida es la ms apropiada para determinar la influencia de los procesos

demogrficos como deriva gentica

y migracin en la estructura gentica

poblacional (Meirmans y Hedrick, 2011). Sin embargo, es importante considerar que las tasas de migracin calculadas mediante Fst, presentan problemas de equilibrio. Esto se debe al modelo usado (isla), que

implica supuestos tales como: migracin no espacial, tamaos de poblaciones iguales y ausencia de seleccin. En este trabajo las

dos poblaciones descritas (Cayambe-Coca y Mojanda, Yanacocha) son diferentes entre

s. Cayambe-Coca, Mojanda y Yanacocha,

se encuentran en lados diferentes de la Coordillera de Los Andes lo cual evitara el flujo gnico a travs de polen entre ellas.

La mayor variabilidad detectada se atribuy a los individuos dentro de cada una de las poblaciones (cerca 90 %) de

toda la variacin. Una alta variabilidad en los individuos es consistente con una fragmentacin reciente de hbitat que adems es comn en especies ampliamente dispersas, perennes, con polinizacin cruzada, anemfilas y un alto nmero

de cromosomas (Hamrick et al., 1979). Por lo cual se podra hipotetizar que la visualizacin en parches de estos bosques no es su estado natural, sino ms bien a efectos de tipo antropognico. Este

porcentaje de variabilidad en los individuos

ha sido reportado tambin por Aragundi

et al., (2011) en poblaciones de P. pauta, en estudios de P. australis por Hensen et al., (2011) y en estudios mediante AFLPs en P. besseri (Gareca et al., 2013).

El anlisis de agrupamiento mediante UPGMA, muestra dos poblaciones. Estn claramente diferenciadas las poblaciones Cayambe-Coca y Mojanda de Yanacocha.

Adems, se logra observar que Mojanda

1 (poblacin hbrida) se agrupa en otro

conjunto. Los resultados de este anlisis

permiten considerar a los individuos exclusivos de Yanacocha como P. sericea. En cambio, a P. pauta como exclusivo de Cayambe-Coca y Mojanda. Sin embargo,

se necesita extender esta investigacin a poblaciones ms distantes en el Ecuador, para confirmar estos resultados.

En este estudio no se detect correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica,

lo cual sugiere que las poblaciones de estudio (Cayambe-Coca, Yanacocha y Mojanda) no

se conforman con un patrn de aislamiento por distancia. Estos resultados son comunes en el gnero Polylepis, donde individuos de diferentes poblaciones tienen mayor similitud que los individuos en la misma poblacin (Aragundi et al., 2011; Ochoa et al., 2008). Los resultados en este estudio indican que al menos en las poblaciones estudiadas no existe evidencia de aislamiento por distancia, lo cual se explica por un alto flujo gnico entre las

poblaciones. En especial, en las poblaciones de Cayambe-Coca y Mojanda. Finalmente, al

analizar los resultados de esta investigacin se puede concluir que los marcadores

42


moleculares SSRs fueron tiles para detectar diversidad, diferenciacin y estructura gnica

en el gnero Polylepis. Se determin que las muestras del Parque Nacional Cayambe-Coca y Mojanda son consistentes con una sola

especie: P. pauta. Mientras que las muestras de Yanacocha pertenecen a P. sericea. Sin embargo, se necesitan estudios ms amplios para poder realizar planes de restauracin y conservacin en estos bosques.

CONCLUSIONESEl mtodo de extraccin empleado

(CTAB al 2 % modificado) fue ptimo para

la extraccin de ADN de Polylepis, ya que permiti la obtencin de una concentracin de ADN superior a 50 ng/l. Es importante mencionar que la extraccin debe realizarse en muestra fresca y recin colectada debido

a que las muestras tienden a oxidarse fcilmente, por lo cual, mantener la cadena de fro hasta la incubacin de las muestras es muy importante.

Se lograron seleccionar 5 sets de primers para microsatlites a partir de tcnicas de PCR tales como TD-PCR y

PCR en gradiente, los cuales brindaron gran cantidad de informacin, buena calidad de datos y disminucin de errores de puntuacin para los anlisis de diversidad, diferenciacin y estructura para las poblaciones de Polylepis reportadas. Se sugiere que se incluyan, en futuros estudios, ensayos de secuenciacin para poder verificar los resultados obtenidos,

as como comprobar la ausencia de efectos homoplsicos.

Los anlisis de diversidad gentica muestran que las poblaciones de Cayambe-Coca y Mojanda tienen un comportamiento

de reproduccin al azar, as como una poca diferenciacin gentica. Por el contrario, las

poblaciones de Yanacocha no presentaron

este tipo de reproduccin. Para poder conocer el impacto de la fragmentacin y degradacin del hbitat en este gnero,

se sugiere comparar las diferentes subpoblaciones dentro de bosques continuos y remanentes de Polylepis con rboles de diferentes edades para poder caracterizar directamente la paternidad, patrones de cruces y eventos de flujo gnico.

Finalmente, los microsatlites SSRs fueron tiles para anlisis previos de diversidad, diferenciacin y estructura gnica en el gnero Polylepis, ya que se pudo determinar dos grupos altamente diferenciados. El primero conformado por las poblaciones de Cayambe-Coca y Mojanda, donde se considera a la especie

P. pauta como individuos exclusivos y el segundo por las poblaciones de Yanacocha

con P. sericea. Se recomienda correlacionar los anlisis genticos aqu reportados con los

citogenticos en las poblaciones analizadas,

para afinar los resultados de diversidad

obtenidos. Tambin sera adecuado

extender el estudio con otras especies dentro del gnero de Polylepis y otros marcadores codominantes para realizar anlisis de filogenia y de filogeografa ms

completos de este gnero.

43



AGRADECIMIENTOSUn agradecimiento a los laboratorios

de Biotecnologa vegetal y Cultivo de Tejidos

de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa y a los profesionales colaboradores: Dra. Karina Proao e Ing. Paola Prraga (Escuela Politcnica del Ejrcito - Departamento

de Ciencias de la Vida). As mismo un

agradecimiento al Ministerio del Ambiente, Direccin Nacional de Pichincha, por el permiso de investigacin otorgado para el Parque Nacional Cayambe-Coca (N 048-2011-IC-FLO-DPAP-MA) y a la

Fundacin Jocotoco por la autorizacin para

colectar muestras en su reserva Yanacocha.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Aragundi S, Hamrick J y Parker K. 2011.

Genetic insights into the historical distribution of Polylepis pauta (Rosaceae) in the northeastern

Cordillera Oriental of Ecuador. Conservation Genetics, 12: 607-618.

D

2013-REMCB-V34-no1-no2

Documents

Transcript of 2013-REMCB-V34-no1-no2