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Estudio y modelizacindel efecto de procesos de

descontaminacin ydesinfeccin sobremicroorganismos

patgenos en productos

vegetalesGUIOMAR DENISSE POSADA IZQUIERDO

Tesis presentada por la Ingeniera Da. Guiomar Denisse Posada Izquierdo para

obtener el ttulo de Doctora por la Universidad de Crdoba. Julio 2013

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TITULO: Estudio y modelizacin del efecto de procesos de descontaminacin ydesinfeccin sobre microorganismos patgenos en productosvegetales.

AUTOR: Guioma Denisse Posada Izquierdo

Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Crdoba. 2013Campus de RabanalesCtra. Nacional IV, Km. 396 A14071 Crdoba

www.uco.es/publicaciones

publicaciones@uco.es

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A papi, mami, too y mi Fer

El verdadero amor no es otra cosa que el deseo inevitable de ayudar al otro

para que sea quien es

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La realizacin de la Tesis Doctoral ha sido posible gracias a una beca Pre-Doctoral del Ministerio de Ciencia e Innovacion del Gobierno de Espaa ydel Proyecto de Excelencia AGL2008-03298concedido al Grupo HIBRO dela Universidad de Crdoba.

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Studying and modeling ofthe effect of

decontamination anddisinfection of pathogenicmicroorganisms in

minimally processed

vegetable products

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DIRECTORES TESIS:

Dr. Fernando Perez Rodriguez

Profesor de la Universidad de Cordoba

Dr. Gonzalo Zurera Cosano

Catedratico de la Universidad de Cordoba

DIRECTORES DE ESTANCIAS DE INVESTIGACION

Prof. Dr. Gil, Maria Isabel CEBAS-CSIC

Prof. Dr. Allende, Ana CEBAS-CSIC

Prof. Dr. Devlieghere, Frank Univerdad de Gante

Dr. Lpez Glvez, Francisco Univerdad de Gante

Prof. Dr. Ryser, Elliot Universidad Estatal de Michigan

Esta Investigacin se desarrollo en el Departamento De Bromatologa y Tecnologa De Los

Alimentos, de la Facultad De Veterinaria. Universidad de Crdoba.

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GUIOMAR DENISSE POSADA IZQUIERDO

Tesis presentada por la Ingeniera Da. Guiomar Denisse Posada Izquierdo para obtener el ttulo

de Doctora por la Universidad de Crdoba. Julio 2013

Estudio y modelizacindel efecto de procesos de

descontaminacin ydesinfeccin sobremicroorganismos

patgenos en productosvegetales

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Autor: Guiomar Denisse Posada Izquierdo

Ttulo: Estudio y Modelizacin del efecto de procesos de descontaminacin y desinfeccin sobre

Microorganismos patgenos en productos vegetales

Ao de Publicacin: 2013

ISBN:

Tesis Doctoral mencin Internacional dentro del programa de calidad del doctorado de la

Universidad de Crdoba, Crdoba, Espaa. Con los artculos cientficos en ingls y resumen y

conclusiones

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Listado de abreviaturas y smbolos

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Abreviaturas Significado

ABS AbsorbanciaAEW Acidic electrolysed waterADN cido desoxirribonucleicoAE Agua electrolizadaAEM Microorganismos Aerobios MesfilosAESAN Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria y Nutricin

AFHORLAAsociacin Espaola de Frutas y Hortalizas Lavadas, Listaspara el consumo, nueva AFHORFES

AFHORFESAsociacin Espaola que agrupa a los fabricantes de Frutasy Hortalizas Lavadas Listas para su empleo, IV Gama,integrada en FEPEX. AFHORFES (antigua AFHORLA)

AHAs cidos haloacticosAEW Agua Electrolizada Alcalina

AINIACentro Tecnologico de la Industria Agroalimentaria,Valencia

ANICE Asociacin Nacional de Industrias de la Carne de EspaaANOVA Anlisis de la varianza

Anova Analisis de varianzaAPHA

American Public Health Association (AsociacinAmericana de salud pblica)

APPCC Anlisis de Peligros y Puntos de Control CrticosARM Anlisis del Riesgo Microbiolgico

ATCCAmerican Type Culture Collection (Coleccin Americanade Cultivos Tipo)

atm AtmosphereATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registryaw Activity water (Actividad de agua)BAL Bacterias cido-lcticasBHI Brain Heart Infusion (Caldo Infusin Cerebro Corazn)BOE Boletn Oficial del EstadoBPA Buenas Prcticas agrcolasBPH Buenas prcticas de higieneBPM Buenas prcticas de manufacturaC/NC Probabilidad de Crecimiento/No Crecimeinto

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Ca(ClO)2 Hipoclorito de CalcioCa2+ In calcioCCA Comisin del Codex AlimentariusCCFRA Campden and Chorleywood Food Research AssociationCDC Centers for Disease Control and Prevention (Centros para el

control y la Prevencin de Enfermedades, Estados Unidos)CEBAS Centro de Edafologa y Biologa Aplicada del SeguraCECT Coleccin Espaola de Cultivos TipoCF Coliformes fecales

CFSAN Center for Food Safety and Applied Nutrition (Centro deSeguridad Alimentaria y Nutricin Aplicada; EstadosUnidos)

cfu Colony forming units (Unidades formadoras de colonias)CH3CO2H cido ActicoCH3CO3H cido peroxiacticoCl- In cloruroCl2 Cloro molecularClO- In hipocloritoClO2 Dixido de CloroClO2

- In clorito

ClO3- In cloratocm Centmetrocm2 Centmetro cuadradoCO2 Dixido de CarbonoCOT Comittee on ToxicityCSA Clorito de sodio acidificadoCSIC Consejo Superior de Investigaciones CientficasCT Coliformes totales

DISALDiseo en el sector alimentario, del Centro TecnolgicoAINIA

DQO Demanda Qumica de OxgenoE. coli Escherichia coli

ECDCEuropean Centre for Disease Prevention and Control(Centro Europeo para la Prevencin y Control deEnfermedades)

ECEH Escherichia coliEnterohemorrgicaECRM Evaluacin Cuantitativa de Riesgo Microbiolgico

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ECVT Escherichia coliVerotoxignicaEEUU Estados Unidos

EFFATEuropean Federation of trade unions in the Food,Agriculture and Tourism (Federacin Europea deSindicatos de Alimentos, Agricultura y Turismo)

EFSAEuropean Food Safety Authority (Agencia Europea deSeguridad Alimentaria)

EMAP Equilibrium modified atmosphere packaging

FAOFood and Agriculture Organisation of the United Nations(Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentaciny la Agricultura)

FDA Food and Drug Administration (Agencia de Alimentos yMedicamentos;Estados Unidos)

FEPEX Federacin Espaola de Asociaciones de Productores yExportadores de Frutas, Hortalizas, Flores y Plantas

FNFalsos negativos (%) (Indice de bondad de ajuste de modelode Probabilidad de crecimiento)

FP Falsos positivos (%) (Indice de bondad de ajuste de modelode Probabilidad de crecimiento)

FSAFood Standart Agency (Agencia de Estndares de

Alimentos; Reino Unido)g Gramoh HoraH+ In hidrgenoH2O AguaH2O2 Perxido de hidrgenoHANs HaloacetonitrilosHCl cido clorhdricoHClO cido hipoclorosoHClO2 cido clorosoHOSCN cido hipotiocianoso

HPAHealth Protection Agency (Agencia de Proteccin para laSalud)

Hz Hercio, pulses per second

IARCInternational Agency for Research on Cancer (agenciainternacional del studio del cancer)

ICMSF International Comission on Microbiological Specification in

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Foods (Comisin Internacional de EspecificacionesMicrobiolgicas en Alimentos)

IFPAInternational Fresh-cut Produce Association (asociacioninternacional de productos frescos cortados)

IFR Institute of Food Research, UK (Instituto de Investigacinde Alimentos, Reino Unido)

IFTInstitute of Food Technologists (institute de tecnologia delos alimentos)

IL Inoculum level (nivel de inculo, log ufc/ml)INE Instituto Nacional de EstadsticaISO International Organisation for Standardization

(Organizacin Internacional para la Estandarizacin)kg KilogramoL LitroLAB Lactic acid bacteria (Bacterias Acido Lacticas)lag o Tiempo de adaptacin microbiana o de latencia (h)LMG Laboratorium Microbiologie, Universiteit Gent, Belgiumlog log10logdiff Diferencia logartmica

m

Valor umbral del nmero de bacterias. El resultado se

considerar satisfactorio si todas las unidades quecomponen la muestra tienen un nmero de bacterias igual omenor que m.

M

Valor lmite del nmero de bacterias. El resultado seconsiderar no satisfactorio si una o varias unidades quecomponen la muestra tienen un nmero de bacterias igual omayor que M.

MAGRAMA Ministerio de Agricultura, Alimentacin y Medio Ambiente

MAPModified atmosphere packaging( Envasado en atmosferamodificada)

mg Miligramomin Minutoml MililitroMP Microbiologa PredictivaMRS De Man, Rogosa y SharpeMSE Mean Square Error (Error Cuadrtico Medio)n Nmero de muestras/rplicas

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N Numero de microorganismos despus del tratamientoN0 Concentracin de inculo inicialN.A. Datos no adecuados para el ajusteNa+ In sodioNaCl Cloruro sdicoNaClO Hipoclorito de sodioNaClO2 Clorito de sodioND No hay datosNEW Neutral electrolysed oxidizing water

nm NanmetroNo Number of microorganisms before treatmentO2 OxgenoO3 OzonoOCM Organizacin Comn de Mercados AgrcolasOD Optical Density (Densidad ptica)OH- In hidroxiloOMS Organizacin Mundial de la SaludOSCN- In hipotiocianitoOVQ Overall visual quality

P Probabilidad de crecimientop Probabilidad de significacin estadsticaPAL Fenilalanina-amonio-liasaPCA Plate Count Agar (Agar de recuento en placa)PCC Punto Crtico de ControlPCR Reaccin en cadena de la polimerasa

PERSEOPrograma piloto Escolar de Referencia para la Salud y elEjercicio, contra la Obesidad

pH Potencial de HidrgenoP3ARRT Herramienta para calificar el riesgo Patgeno-ProductoPOA Procesos de oxidacin avanzados

POD Peroxidasappm Partes por milln (mg/L)PPO Polifenol-oxidasaPSS Physiological saline solution (solusion salina)r Coeficiente de correlacin de Pearson

R2 Coeficiente de determinacin

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HR Porcentaje de humedad relativaRTE Listo para el consumo (VI Gama)s SegundosS.D. Standard deviation (desviacin estantar)SEA Staphylococcal enterotoxin A (enterotoxina staphylococica)T Temperatura (C)t tiempo (h)TBX Tryptone Bile-X Glucoronide (Agar Bilis Triptona)td Tiempo de deteccin (h)

Teff Temperatura Esttica Efectiva (C)THMs Trihalometanostinc Tiempo de incremento (h)TiO2 Dixido de titanioTSB Tryptone Soja Broth (Caldo de Triptona Soya)t-test Student t-test( test- estadstico)UE Unin Europeaufc Unidades formadoras de coloniasufc/g ml Unidades formadoras de colonias/gramo mililitroUK United KingdomUSA United States of AmericaUSDA United States Department of Agriculture (Departamento de

Agricultura de Estados Unidos)USDA-ARS United States Department of Agriculture-Agricultural

Research Service Departamento de Agricultura de EstadosUnidos-Servicio de InvestigacinAgrcola

UV Luz ultravioleta

UV-CPart of the electromagnetic spectrum with wavelengths inthe range 200-280 nm

v/v Volume/volumeVolts Voltage

VTEC Verotoxigenic Escherichia coli (Escherichia coliverocitoxignico)W Wattsw/v Weight/volumen (peso/volumn)

absTiempo de latencia, h (Parmetro de crecimiento deAbsorbancia)

g Microgram

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absTasa de absorbancia, h-1(Parmetro de crecimiento deabsorbancia)

% Porcentajeg Microgramol microlitrom micrometromax Tasa mxima de crecimiento, h-1C Grado CelsiusA Amperes

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Abstract/Resumen

The present thesis is aimed at quantifying the effect of different foodprocess on fate of enteric pathogenic bacteria, Escherichia coli O157:H7and Salmonellaspp. in vegetables (Introduction). The main contribution ofthis thesis lies in providing quantitative tools based on predictive models to

support microbial risk management systems in the Vegetable Industry. Infirst instance, a mathematical model describing cross contamination of E.coli O157:H7 during processing of fresh-cut vegetable was developed andsimulated in silico (Chapter I ). Three different scenarios, named S1, S2,and S3, were considered to represent the initial concentration on thecontaminated batch entering the processing line which corresponded to 0.01,1 and 100 cfu/g, respectively. Given the low initial levels, differencesbetween scenarios were only observed in prevalence and not inconcentration (p< 0.001). The model evidenced that cross contaminationwas possible in all simulated scenarios. Given the importance of quantifyingthe effect of new disinfection treatments as means of avoiding cross

contamination during washing step, the efficacy of an electrochemicaltreatment in water disinfection, using boron-doped diamond electrodes, wasstudied together with its suitability for the fresh-cut produce industry(Chapter II). Tap water (TW), and TW supplemented with NaCl (NaClW)containing different levels of organic matter around 60, 300, 55050 and75050 mg/L; combined and total chlorine, pH, oxidation-reductionpotential, COD and temperature were monitored during the treatments andobtained in this optimum conditions reductions of 5 log units of E. coliO157:H7. Results provided suitable base to develop predictive modelsdescribing reduction as a function of time at the different studied conditions,the Weibull model obtaining a good performance. The effect of disinfection

treatment on subsequent growth of E. coli O157:H7 in fresh-cut leafyvegetables was studied considering traditional and alternative treatments,based on chlorine and electrolyzed water, respectively (Chapter III and IV).In the first case, fresh-cut iceberg lettuce inoculated with E. coli O157:H7was submitted to chlorine washing (150 mg/mL) and modified atmospherepackaging on laboratory/pilot scale. Potential growth of the pathogen was

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assessed at 4, 8, 13 and 16 C with multiple replicates. The pathogen wasable to grow at temperatures 8 C, although at lower temperatures, growthdata presented a high variability between replicates. For neutral electrolyzedwater treatment, the experimental set-up was the same as that used in studydealing with chlorine. Results indicated that growth in lettuce treated withEW was lower than that observed when treated with chlorinated water. Inboth experiments, a Ratkowsky-type model was proposed to account for therelationship between temperature and growth rate. The survival capacity of

E. coliO157:H7 and Salmonellaspp. were assessed in stainless steel soiledwith different sterile vegetable juices simulating soiling conditions in the IV

gamma produce factories (Chapter V). Results indicated that both pathogenscould be recovered until 192 and 168 h, respectively from surfaces soiledwith chard, red cabbage, iceberg lettuce and romaine lettuce. However, inspinach and parsley juice substrates, microorganisms were not detected after48 h. This survival time was much lower than that obtained in salinesolution (120 h) used to simulate cleaning conditions, suggesting thepresence of antimicrobial substances. Furthermore, based on generated data,survival models were proposed to simulate survival on equipment surface.In general, the Weibull model and the biphasic models were the ones withthe best performance. These models could be used in risk assessmentstudies to represent cross contamination scenarios simulating the number ofviable cells on surfaces available to be transferred to vegetables. Finally, anattempt to simulate growth ofE. coliO157:H7 in broth was made based onthe use of sterile vegetable juices (iceberg lettuce, chard, spinach, parsleyand romaine lettuce) (Chapter VI). This study is based on the hypothesisthat pathogenic bacteria could be often found in injuries of vegetable tissue,thereby they would be exposed to vegetable cell content. The experimentswere carried out in Bioscreen C equipment and growth rates were estimatedon inoculated vegetable juices based on absorbance measurements overtime. Finally, secondary models describing the dependence betweentemperature and kinetic parameters were derived. The results indicated the

capacity of growth depended on type of vegetable juice and temperature.Moreover, some vegetable juices did not support growth suggesting, in thesecases, the presence of inhibitory substances such as a high content inpolyphenolic compounds.

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La presente tesis tiene como objetivo principal cuantificar el efecto dediferentes procesos alimentarios sobre el comportamiento de las bacterias

patgenas, Escherichia coli O157: H7 y Salmonella spp., en vegetales(Introduccin). Por tanto, la principal contribucin de esta tesis consiste enproporcionar herramientas cuantitativas basadas en modelos predictivoscomo apoyo a los sistemas de gestin de riesgos microbiolgicos en laindustria de vegetales. En primera lugar, se desarroll un modelomatemtico de contaminacin cruzada de E. coli O157:H7 durante elprocesamiento de vegetales IV gama que fue simulado en in-silico(Captulo

I). Tres escenarios diferentes fueron contemplados, denominados S1, S2, yS3, y que correspondieron a diferentes concentraciones iniciales en un lotecontaminado a la entrada en la lnea de procesos, esto es 0,01, 1 y 100 ufc /g, respectivamente. Dado los bajos niveles simulados, las diferencias entre

escenarios slo se observaron para los valores de prevalencia resultantes, yno para concentracin (p

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Salmonella spp., fue evaluada en acero inoxidable impregnado condiferentes estractos estriles de vegetales, simulando condiciones desuciedad en las industrias de IV gama (captulo V). Los resultados indicaronque ambos patgenos podra ser recuperados hasta 192 y 168 h despus deinocularlos en las superficies con extracto de acelga, col lombarda, lechuga

iceberg y lechuga romana. Sin embargo, en las superficies con los extractosde espinacas y perejil no se detectaron microorganismos despus de 48 h.Este tiempo de supervivencia, fue mucho menor que el obtenido en solucinsalina (120 h), utilizada para simular las condiciones de limpieza, lo quesugerira la presencia de sustancias antimicrobianas en los extractos deespinaca y perejil. Adems, basados en los datos generados, se propusieronmodelos de supervivencia para simular la capacidad de supervivencia ensuperficies de acero. En general, el modelo de Weibull y el modelo bifsicofueron los que representaron mejor los datos observados. Estos modelospodran utilizarse en estudios cuantitativos de evaluacin de riesgos y en elanlisis de escenarios de contaminacin cruzada, ya que permiten estimar el

nmero de clulas viables en las superficies que se encuentran disponiblespara ser transferidas a los vegetales. Por ltimo se simul el crecimiento de

E. coli O157: H7 en caldo utilizando extractos estriles de vegetales(lechuga, acelga, espinaca, perejil y la lechuga romana) (Captulo VI). Esteestudio se basa en la hiptesis de que las bacterias patgenas podranencontrarse en lesiones de tejidos vegetales, con lo que estaran expuestas alcontenido celular del vegetal. Los experimentos se llevaron a cabo en unequipo Bioscreen C a partir de los extractos vegetales inoculados. Las tasasde crecimiento se estimaron a travs de la medicion de la absorbancia a lolargo del tiempo. Finalmente, los modelos secundarios propuestosdescribieron la relacin matemtica entre la temperatura y parmetroscinticos. Los resultados indicaron que la capacidad de crecimiento fuedependiente del tipo de extracto vegetal y de la temperatura. Por otra parte,algunos extractos vegetales no permitieron crecimiento, lo que sugiere, enestos casos, la presencia de sustancias inhibidoras como podra ser un altocontenido en compuestos polifenlicos.

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Introduccin

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Figura 1: Diagrama de flujo general de una planta de procesado de vegetales de hoja IV Gama (Adaptadode Gil y Gorny, 2003).

hortalizas en las fbricas. La limpieza, que no es ms, que la seleccin de la parteptima (puede suponer una prdida del 20 al 70% del producto), operacin que serealiza de manera manual. El cortado consiste en trocear el material vegetal hasta eltamao comercial del producto. La fase de lavadose realiza en dos fases intensivas, conel fin de eliminar la suciedad del campo. El secado superficial es fundamental para laconservacin del producto y se efecta mediante la eliminacin del exceso de agua quehabitualmente se realiza a travs del uso de centrifugas industriales. El pesado yenvasado de los productos troceados es la fase final del proceso; (en funcin delproducto, se busca el envase ms adecuado, que incluye desde bolsas a barquetas,

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tarrinas o bandejas; siempre son envases transparentes para que el consumidor puedapercibir la frescura y calidad del producto). El almacenamiento se realiza encondiciones de refrigeracin hasta su consumo. La temperatura recomendada en todo elproceso, desde que se recolecta la materia prima hasta la colocacin en el punto deventa debe oscilar entre 1 y 4 C. Los productos de IV Gama deben encontrarse

refrigerados para conservarlos en sus ptimas condiciones, hasta el momento delconsumo (AFHORFES, 2013). De las materias primas ms utilizadas en la elaboracinde productos IV Gama destacan las lechugas, para ensaladas, con produccionesimportantes a nivel mundial.

Tendencias

En los ltimos aos el grado de aceptacin y demanda de los vegetales IV Gama, ha idoincrementndose progresivamente, hasta el punto de ser alimentos frecuentes en lascompras bsicas; ya que como es ms que conocido: el consumo de frutas y hortalizasforma parte de los elementos claves en la dieta mediterrnea (OMS y FAO, 2003). Eneste sentido, las recomendaciones de la OMS y FAO (2003), sita el consumo mnimoaconsejable de frutas y vegetales entorno a los 400g/da, as como tambin el MinisterioAgricultura, Alimentacin y Medio Ambiente Espaol, a travs de la promocin de lacampaa de: 5 al da, (de la asociacin para el consumo de frutas y hortalizas frescas)promueven al consumo de estos productos, en la bsqueda de un estilo de vida mssano, (MAGRAMA, 2007)

Sector

El sector de vegetales de IV Gama es uno de los mercados ms prometedores de laalimentacin como consecuencia de diferentes factores: sus beneficios nutricionales, ala carencia de tiempo para preparacin, y a la necesidad de hacer las comidas fuera del

hogar siendo el 33 % de la alimentacin de los espaoles fue Extradomstica en el ao2012, (MAGRAMA, 2012). Segn los datos aportados por FEPEX, el sector de la IVGama supone un volumen de negocio en torno a los 180-200 millones de euros. En el2010, en productos IV Gama en Espaa se comercializaron 70,6 mil toneladas entrefrutas y hortalizas listas para su consumo, de las cuales, 69,1 mil toneladas fueron devegetales IV Gama (segn AFHORFES integrada en FEPEX). La produccin agrcoladestinada como materia prima para vegetales IV Gama ocupa el 10% de la zonahortofrutcola espaola y se encuentra repartida en los siguientes productos: 60%lechugas (varias), 17% Ensaladas (mezclas de varias hortalizas), 7% espinaca, 3%brotes, 3% zanahoria, y el restante porcentaje en otros productos IV Gama (AINIA,2007).

Produccin y Comercio del Sector

Segn AFHORFES, la produccin nacional de vegetales IV Gama ha ido en aumento deforma constante en los ltimos aos, impulsada principalmente por: 1) la crecienteinnovacin del sector, 2) la mejora en la integracin de todos los componentes de lacadena productiva, 3) incremento en el rendimiento productivo, 4) un aumento en lacalidad del producto, 5) as como tambin un incremento en su vida til (Annimo,2013). El balance comercial se ha visto afectado por la crisis econmica mundial. Y porla eficiencia del sector, que origina ms oferta que demanda en Espaa. Por ello, losdatos que se conocen sitan en el 2012, una cada con respecto al 2011 del 76,47 % en

las importaciones y en las exportaciones la disminucin ha sido de 20,17% (siendoprincipalmente en Frutas IV Gama) (MERCASA, 2012). Cabe destacar que el comercio

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Figura 3: Evolucin de consumo de vegetales en Espaa 2009-2011 (MERCASA, 2012)

Seguridad Microbiolgica de los Vegetales IV Gama

Fundamentos

Los alimentos pueden ser portadores de enfermedades tanto en su estado fresco o crudocomo una vez procesados. Los peligros transmitidos por los alimentos pueden ser:fsicos, qumicos y biolgicos (FAO, 2003). Los peligros biolgicos en vegetales los

constituyen bacterias, hongos, virus y otros parsitos microscpicos (Doyle y Erickson,2008; FAO/OMS, 2008a; Harris y col., 2003; OMS, 1998; Sivapalasingam y col.,2004). A este respecto existe la percepcin actual que los casos de toxiinfeccionesasociados con el consumo de frutas y hortalizas ha aumentado en los ltimos aos(Doyle y Erickson, 2008). Aunque esta percepcin puede deberse a otros factores y noen si a un incremento del nmero de casos se indica como una posible explicacin paraeste fenmeno (Doyle y Erickson, 2008; FAO, 2008c; EFSA, 2007b):

Mayores controles de vigilancia de los productos frescos y de las enfermedadestransmitidas por los alimentos.

Incremento de casos por la ampliacin del comercio mundial gracias a laglobalizacin.

A las continuas mejoras tecnolgicas en el sector productivo que aumentan la vidatil de los alimentos procesados.

Aumento de la demanda de alimentos y la aparicin de estilos de vida dinmicosque requieren alimentos listos para ser consumidos.

En contraposicin a la afirmacin anterior, hay estudios que indican una escasapresencia de microorganismos patgenos en frutas y hortalizas frescas en diferentespuntos de la cadena alimentaria (Johannessen y col., 2002; FDA, 2003; EFSA, 2006;Johnston y col., 2006; Arthur y col., 2007; EFSA, 2007a). A pesar de estos datos, lasautoridades han recomendado que no se puede dejar de controlar la presenciabacteriana, puesto que, hasta la actualidad no existe un proceso para vegetales IV Gama

capaz de eliminar completamente la carga microbiana (Abadias y col., 2008a; EFSA2009)

2007=100

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Requerimientos de la seguridad microbiana en vegetales IV Gama

La seguridad microbiolgica de los vegetales IV Gama radica en la calidad de la materiaprima, en la eficiencia de la desinfeccin y control de la contaminacin cruzada durantetoda la cadena productiva. Por tanto, es necesario la implantacin de programas dehigienizacin que permitan reducir la flora natural procedentes de la produccinagrcola. La actividad microbiana se puede mantener bajo control gracias a los procesosde higienizacin (mecnico o qumico o antimicrobianos naturales) aplicadas de maneraestricta durante las etapas de produccin y una adecuada conservacin en atmsferamodificada en condiciones de refrigeracin durante el almacenamiento (Gil y Gorny,2003). Para cumplir con estas condiciones de salubridad; se debe dar inicio con elcumplimiento de los requisitos relativos a las Buenas Prcticas Agrcolas (BPA), BuenasPrcticas de Fabricacin (BPF) y Buenas Prcticas de Distribucin (BPD); ya que todosestos procedimiento tienen como objetivo minimizar el riesgo de contaminacin de lamateria prima y los productos de IV Gama y a su vez garantizar su calidad. En estesentido, la Comisin del Codex Alimentarius public un cdigo de Buenas Prcticas de

Higiene (BPH) para las frutas y hortalizas frescas (CAC, 2003).Brotes de toxiinfecciones alimentarias asociados a vegetales

El ltimo informe de EFSA (2012) refleja un total de 5262 brotes de origen alimentarioen la UE para el ao 2010, con 43473 casos humanos, 4695 hospitalizaciones; 25muertes; siendo estos similares a los reportados en el 2009. Este informe resalta queSalmonella es el microorganismo con mayor incidencia, en torno al 30.5% de todos loscasos en vegetales y que han ido incrementndose a lo largo de los ltimos aos (EFSA,2012). Los vegetales de hojas se han visto involucrados en nmerosos brotes durante losltimos aos. Un resumen de los datos ms importantes sobre brotes asociadas avegetales ha sido recogido en la Tabla 1. Basada en esta tabla y en los datos aportados

por EFSA (2012), los patgenos ms frecuentes asociados a toxiinfecciones porvegetales fueron Salmonella y Escherichia coli verotoxignico. Por ello, lapreocupacin sobre la seguridad alimentaria de estos productos toma cada vez mayorrelevancia. As, la FAO/OMS (2008 a,b,c) realiz un informe sobre los riesgosmicrobiolgicos en frutas, hortalizas, especias y hierbas medicinales, incluyendo endicho informe guas sobre las opciones de mitigacin.

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2005 Salmonella typhimuriumDT104

Ensalada IV Gama 96 Reino Unido Heal

2005 Salmonella typhimuriumDT104

Ensalada IV Gama >60 Suecia, Finlandia Takk

2004 Salmonella thompson Ensalada IV Gama 100 Dinamarca,Noruega, Suecia

Nyga

2004 Salmonella newport Ensalada IV Gama 375 Reino Unido HPA

2004 Yersinia Lechuga Iceberg 47 Finlandia Nuor

2003 Salmonella Ensalada IV Gama 40 Reino Unido HPA

2002 Clysclospora cayetanensis Ensalada IV Gama concondimentos frescos

34 Alemania Dlle

2002 Escherichia coli O157 PT34VT2 Ensalada de pepinos 21 Reino Unido,Francia Duff

2001 Virus HepatitisA Ensalada IV Gama 54 Suecia Nyga

2001 Salmonella newport PT33 Ensalada IV Gama 19 Reino Unido Ward

2001 Salmonella typhimuriumDT104

Ensalada IV Gama 361 Reino Unido Horb

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Efectos econmicos de los brotes de toxicoinfecciones alimentarias

Cuando ocurre un brote de toxiinfecciones alimentarias, el mercado se ve seriamenteafectado y en productos como los vegetales IV Gama, las consecuencias sonincalculables porque no slo se habla de prdidas econmicas, sino tambin de prdida

de confianza en el sector y por tanto resultando en una cada en el consumo. Un ejemplofue el brote ocurrido en EE.UU. en el 2006, donde las ventas de ensaladas se redujeronhasta el 70% a lo largo del tiempo en el que el brote estuvo presente en la opininpblica (Todd y otros 2009). Adems se requiri un largo periodo de tiempo pararecuperar la confianza del consumidor, sin alcanzarse en ningn momento los nivelesobtenidos antes de la aparicin del brote.

Fuentes de contaminacin

En los vegetales IV Gama, la contaminacin bacteria puede darse en diversas etapas dela cadena productiva; segn factores pre-cosecha, cosecha, pos-cosecha, y consumo,(Beuchat y Ryu, 1997; Delaquis y col., 2007; Doyle y Erickson, 2008; FAO/OMS,

2008b; Hutchison y col., 2008; Izumi y col., 2008; Selma y col., 2007). Segn Beuchat(2006) y Mandrell (2009), se han identificado como las causas ms frecuentes decontaminacin microbiana durante precosecha y cosecha, las siguientes:

El agua de irrigacin contaminada con residuos procedentes de granjas de animales. La aplicacin de fertilizantes orgnicos de origen animal o humano. El contacto directo de animales (salvajes o domsticos) con el producto vegetal fresco

cuando est creciendo en el cultivo. Las inundaciones por lluvias o aguas de escorrentas. Tambin puede ser una ruta de

contaminacin potencial si las granjas ganaderas estn cerca de los campos deproduccin de hortalizas.

La etapa de recoleccin en el campo, a travs del contacto directo con humanos, si no

cumplen buenas prcticas agronmicas.

En la etapa de transformacin, comercializacin y preparacin culinaria (poscosecha yconsumo), responsabilizan como las causantes de la contaminacin del producto a lassiguientes prcticas (Gelting y col., 2011; Sderstrm y col., 2005; Tyrrel y col., 2006):

El uso de agua de lavado contaminada. El uso utensilios no desinfectados Deficientes prcticas de manejo higinico de frutas y hortalizas Rotura de la cadena de frio, con elevacin dramtica de la temperatura

Microorganismos presentes en vegetales IV Gama

Los vegetales de hojas frescos, pueden albergar potenciales patgenos humanos como:Salmonella,Listeria monocytogenes, Shigella, Clostridium botulinum,Escherichia coli,Campylobacter, Yersinia, Vibrio y Staphylococcus aureus (FAO/OMS, 2008a; 2008b;OMS 1998), Cryptosporidium y Virus de hepatitis A, (indicadores de contaminacinfecal); que son transmitidos a travs de la ingesta de alimentos, (Doyle y Erickson2006). La contaminacin del vegetal puede ocurrir a nivel superficial o en los tejidosinternos, que se conoce como la internalizacin de las bacterias (Ibarra-Snchez y col.,2004; Moyne y col., 2011). Estos microorganismos una vez en el vegetal son capaces desobrevivir en diversas superficies, y superar condiciones de estrs y mantenerse latenteshasta conseguir unas condiciones ms adecuadas para su crecimiento y colonizacin delmedio. Por ello muchos estudios han enfocado su inters en el comportamiento de losmicroorganismos en el compost, agua, plantas y su potencial como agente patgenoresponsable de comprometer la seguridad microbiolgica de los alimentos (Beuchat,

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1996; Beuchat y col., 2004; Gleeson y O'Beirne 2005; Harris y otros, 2003). Laprincipal razn de la capacidad de supervivencia observada es que los microorganismosson capaces de adaptarse a condiciones desfavorables, provocando que los mtodos decontrol convencionales dejen de ser efectivos para inhibir la carga microbiana.(Behrsing y col., 2003; Mretr y col., 2012).

En el desarrollo de esta tesis, nos enfocamos especficamente en Salmonella yEscherichia coliO157:H7 debido a que en los ltimos aos han sido las responsablesprincipales de la mayora de las toxiinfecciones asociadas a vegetales frescos de hojascomo puede observarse en la Tabla 1. Por ello, a continuacin nicamente se describenestos dos patgenos.

Salmonella spp.

Las bacterias del Gnero Salmonella son Gram negativas y anaerobias facultativas, locual les habilita para crecer con bajas concentraciones de oxgeno, como las que seemplean en la conservacin de los productos de IV Gama. Su crecimiento se ve

reducido por debajo de 15 C, y por debajo 7 C la mayora no son capaces de crecer(Carrasco y col., 2012; Francis y col., 1999; Chang y Fang, 2007). Adems de estasconcidiones de resistencia, Salmonellaha sido detectada en muchos tipos de productosvegetales (lechuga, espinacas, etc.) y ha sido asociada a brotes relacionados con elconsumo de estos productos (OMS, 1998). Se han identificado como los que afectancon mayor frecuencia al humanos a S. typhimurium y S. enteritidis (Prendergast y col.,2008; Fashae y col., 2010; Hendriksen y col., 2011). Produciendo toxiinfeccionesalimentarias, debido a la ingestin de alimentos contaminados. Adems, Salmonella,esreconocida en todo el mundo como uno de los patgenos ms comunes causantes degastroenteritis (Wegener y col., 2003; Forshell y Wierup, 2006). La enfermedad secaracteriza por un cuadro agudo de fiebre, dolor abdominal, nauseas y vmitos. Las

principales vas de trasmisin son a travs del consumo de carne de pollo y las carnesrojas contaminadas, leche y sus derivados, frutas, vegetales, huevos, etc. (Caballero-Torres, 2008).

En la Unin Europea, se notificaron 99,020 casos en humanos en el ao 2010 (EFSA,2012). En los Estados Unidos, se estima que cada ao enfermen por salmonelosisalrededor de 1,4 millones de personas (CAC, 2005) y segn Majowicz y col. (2010), enAsia son responsables de alrededor de 37,600 muertes anuales.

Segn los ltimos informe de la EFSA, Salmonella fue detectada en una bajaproporcin de muestras de frutas y hortalizas en pases de la Unin Europea en 2005,2006 y 2007 (EFSA, 2006, 2007, 2009). Los productos estudiados fueron en su mayor

parte productos pre-cortados listos para usar. En Espaa solo el 0,3 % de las muestrasdieron positivo en 2006 (n=896), mientras que no se encontraron muestras positivas en2007 (n=212). Sin embargo, a pesar de la escasa presencia detectada en los muestreosrealizados, en diferentes pases de la Unin Europea se han producido brotes causadospor Salmonella y el consumo de productos vegetales frescos (EFSA, 2007, 2009,Mukhopadhyay y Ramaswany, 2012). Quizs la capacidad de supervivencia envegetales de hasta 4 semanas observada por algunos estudios (Dawson y col., 2005), esun elemento que debera ser considerado para explicar la aparicin de brotes a pesar desu baja incidencia.

Escherichia coli

El microorganismoEscherichia colies Gram negativos y anaerobio facultativo, lo cual

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En el ao 2010, el serotipo O157:H7 fue responsable de 4,000 casos de toxiinfeccionesalimentarias en la Unin Europea, lo cual represent un 12% ms de las producidas enel ao 2009; donde los nios de 04 aos (1,161 casos) y de 514 aos (>40 casos)fueron los ms afectados (EFSA, 2012).

Si bien, la mayora de las cepas de E. coli no son consideradas agentes patgenos,algunas s actan como patgenos oportunistas causando considerables daos sobretodo en personas inmunodeprimidas, nios o ancianos (Gassama y col., 2001).

Ademas, la presencia deE. colien alimentos crudos es considerado un indicador directo(aquella que se produce durante el procesado) o indirecto (aquella que ocurre a travsdel agua de lavado o las aguas residuales) de contaminacin fecal (Renata, 2010);tambin, la presencia de E. coli en los alimentos y el agua fue aceptada como signomanifiesto de la posible presencia de patgenos oportunistas.

En el mbito de la Unin Europea se han atribuido brotes recientes causados por EHECdel serotipo O157:H7 al consumo de productos vegetales frescos contaminados(Sderstrm et l., 2005; Takkinen et l., 2005; Friesema et l., 2007), sin embargo, lapresencia de EHEC en estos productos dentro de la Unin Europea parece ser muy baja,ya que no se encontraron muestras positivas en 2005 (n=493), 2006 (n=1126), ni en2007 (n=2083) (EFSA, 2006, 2007a, 2009).

Tratamientos de Higienizacin en vegetales IV Gama

Mayoritariamente el proceso de higienizacin en los vegetales IV Gama se realiza atravs del lavado de la materia prima fresca con productos de diversos orgenes, perotambin se puede dar la higienizacin a travs de la aplicacin de tcnicas fsicas omecnicas; que incrementan la eliminacin de la suciedad, de la materia orgnica y dela flora bacteriana.

En la Tabla 2, se encuentra recogidos los mtodos ms utilizados en la higienizacin devegetales, los cuales hemos clasificado en: fsicos, qumicos y aquellos basados enantimicrobianos naturales. El tratamiento de higienizacin en vegetales IV Gama msestudiado es, en primer lugar, el cloro, seguido por el ozono y el agua electrolizada. Enesta tesis algunos de estos mtodos fueron objeto de estudio.

La formacin de subproductos potencialmente peligrosos, la falta de eficacia y ladependencia de factores externos sobre la accin del cloro, son los motivos que hanllevado a la bsqueda de alternativas al uso del cloro. Sin embargo los resultadosobtenidos hasta la fecha con los mtodos alternativos no han sido muy alentadores encomparacin a los obtenidos con el cloro. Estos mtodos alternativos incluyen: el

ozono, agua electrolizada, cidos, cidos orgnicos, peroxiactico, compuestosfenlicos, bacteriocinas, perxido de Hidrgeno, permeado de suero lcteo,ultrasonidos, aceites esenciales, etc. (Tabla 2). Asimismo, se ha propuesto el usocombinado de diferentes higienizantes para aumentar su capacidad desinfectanterespecto a su uso individual (McWatters y col., 2002; Beltrn y col., 2005b). Entre ellospodemos destacar el uso de: ozono + cloro (Garcia y col., 2003), luz ultravioleta +perxido de hidrgeno (Xie y col., 2008), perxido de hidrgeno + cido lctico (Lin ycol., 2002), ozono + cido peroxiactico (Beltrn y col., 2005b.)

Cloro

El Cloro es el higienizante o desinfectante ms usado por la industria de IV Gama, ensus diversas formas y presentaciones, como: hipoclorito de sodio (NaClO), hipoclorito

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de calcio (Ca(ClO)2), cloro gas (Cl2) cido hipocloroso (HClO-), El dixido de cloro

(ClO2) gas y lquido, (Cantwell y Suslow, 2002; Sapers, 2001; Suslow, 1997;Varoquaux y Mazollier, 2002). El hipoclorito de sodio (NaClO), por su facilidad de uso,su bajo coste, y su relativa eficacia (Luo y col., 2012), es el ms utilizado en lasindustrias de frutas y hortalizas (Al-Haq y col., 2005) en concentraciones de 50-100

mg/L, con un tiempo de contacto de 1-2 minutos (FAO/OMS, 2008b). No obstante, enalgunos casos las concentraciones utilizadas de cloro pueden alcanzar hasta 200 mg / L,utilizndose tiempos similares de contacto a los indicados anteriormente (Adams y col.,1989; Beuchat, 1998). El efecto antimicrobiano de hipoclorito de sodio depende de lacantidad de cloro libre (en forma de cido hipocloroso, HClO-) presente en el agua queentra en contacto con las clulas microbianas (Bartz y col., 2001). Su efecto radica en lainterrupcin de la sntesis de protenas, la oxidacin de la glucosa y de ciertas enzimasen el metabolismo de carbohidratos, reacciones con cidos nucleicos, purinas,pirimidinas, la descarboxilacin oxidativa de los aminocidos, las lesiones en laestructura del ADN, y en general un desequilibro celular que desencadena en problemasde absorcin de oxgeno (Dukan y col., 1999; Hricova y col., 2008; Mariott y Gravani,

2006; McDonnell y Russell, 1999).El cloro libre se consume en contacto con la materia orgnica y residuos de alimentos, yla eficacia del mismo depende de la disociacion de HClO- con el pH (Beuchat, 1998;Delaquis y col., 2004; Fatemi y Frank, 1999; Gonzalez y col., 2004; Hilgren y col.,2007; Klaiber y col., 2004; Ruiz-Cruz y col., 2007a,b). Adems, se pierde su actividadcon la exposicin al aire, a la luz y a los metales. Existen factores adicionales queinfluyen sobre la eficacia del tratamiento con hipoclorito como son la duracin ytemperatura de tratamiento y los componentes de tejidos vegetales (Beuchat, 1998;Hilgren y col., 2007). Por medio de una metodologa de superficie de respuesta, Lu ycol., (2007) concluyeron que la eficacia de lavado de hipoclorito en la reduccin de

bacterias aerobias mesfilas presentes en lechuga fresca cortada fue influenciada engran medida por la concentracin utilizada, moderadamente por la duracin deltratamiento y en menor medida por la relacin agua-lechuga.

El pH recomendado en la desinfeccin de cloro es 6,5 a 7,5, para evitar corrosin ymantener la eficacia. En estas condiciones encontramos entre un 50 y un 95 % del cloroen forma de HClO-que posee mayor eficacia antimicrobiana que la forma ClO-. Si el pHse reduce a niveles inferiores a los recomendados, se pierde cloro al liberarse en formaCl2. Cuando se trabaja a temperaturas altas, tambin se pierde cloro ya que aumenta lavolatilidad del Cl2, aun cuando se aumenta la eficacia del cloro. Para un controladecuado de la desinfeccin con cloro, hay dos opciones, por un lado est la posibilidadde controlar el pH y la concentracin de HClO y ClO-, y por otro el control delpotencial oxido-reduccin. Aunque este ltima opcin no es aceptada por unanimidadcomo un indicador del cloro disponible. A todos estos parmetros que determinan laeficacia se aade, como un aspecto negativo del uso del cloro, la preocupacin por susefectos nocivos sobre la salud, como es irritacin en la piel y en el tracto respiratorioque se producen como consecuencia de una exposicin prolongada al vapor de clorogenerado en la desinfeccin (Abadias y col., 2008).

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Tabla 2. Agentes higienizantes utilizados en vegetales de hojas durante el procesamiento de alimentos IV Gama.

Fsicos

Intensos pulsos de luz Gmez-Lpez y col., (2005 a y b)

Irradiacin ionizante Fan y Sokorai (2008); Mintier y Foley (2006); Maas y Pagn (2005)

La alta presin hidrosttica Maas y Pagn (2005)

Luz UV-C Allende y col., (2006); Artes (2009); Cho y col., (2010); Guerrero-Be(2008);

Pulsos Elctricos Maas y Pagn (2005)

Tratamientos trmicos suaves Alegria y col., (2010); Alegria y col., (2009); Baur y col., (2005); (2008).

Ultrasonido Guerrero y col., (2005); Huang y col., (2006); Joyce y col., (2003); Pi(2002).

Vapor Martn-Diana y col., (2007)Vapor sobrecalentado Cenkowski y col., (2007)

Mecnico (agua de grifo) Caldwell y col., (2003); Singh y col., (2002 a y b); Workneh y col., (20

Qumicos

cido actico Huang y col., (2012); Chang y Fang (2007); Nascimento y col., (2003)

cido ascrbico Akbas y lmez (2007); Arts y col., (2009); Francis y OBeirne (200

cido ctrico Akbas y lmez (2007); Allende y col., (2009); Arts y col., (2009);(2003); Rahman y col., (2011); Samara y Koutsoumanis (2009).

cido lctico Akbas y lmez (2007); Allende y col., (2008b); Huang y col., (2012

col., (2009); Samara y Koutsoumanis (2009); Smigic y col., (2009); Vcido octanoico Hilgren y Salverda (2000)

cido organico Akbas y lmez (2007); Huang y Chen (2011); Lopez-Galvez y col., (

cido peroxiactico Allende y col., (2008b); Allwood y col., (2004);Beuchat y col., (2004

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El uso de hipoclorito de sodio tambin se ha asociado con la formacin de carcingenosa partir de subproductos clorados tales como cloraminas y trihalometanos, cidoshaloacticos (AHAs) y haloacetonitrilos (HANs) (Alegria y col., 2009; OMS, 2000;Richardson y col., 2002 y 2007; kitis y col., 2010). No obstante se ha demostrado queel lavado de productos de IV Gama con cloro no supone un riesgo de exposicin a estos

subproductos potencialmente peligrosos por parte de los consumidores segn estudiosrealizados segn la ingesta de alimentos desinfectados con productos a base de cloro(FAO/OMS, 2009).

El hipoclorito de sodio ha sido extensamente estudiado por su eficacia para inactivar lospatgenos bacterianos en las frutas y verduras, incluyendo L. monocytogenes,Salmonellatyphimurium,Escherichia coliO157: H7; en: lechuga, pimientos, melones,manzanas, tomates, zanahorias cortadas frescas, zanahoria rallada (Alvarado-Casillas ycol., 2007; Beuchat y col., 1998; Beuchat y col., 2004; Gonzlez y col., 2004; Ruiz-Cruz y col., 2007a; Weissinger y col., 2000; Zhuang y col., 1995.) Aunque, en menorproporcin existen estudios del higienizante sobre la flora natural (Nascimento y col.,

2003) y sobre la posterior recuperacin de los patgenos, durante el almacenamiento,distribucin y consumo (Akbas y lmez, 2007; Delaquis y col., 2004).

El cloro adems es el desinfectante ms frecuentemente usado como referencia paraevaluar y comparar la eficiencia de otros productos o procesos de higienizacin. Porejemplo, Adams y col. (1989) compararon el uso del cloro en lechuga lavada con 0-300mg / L de cloro libre sin ajuste de pH y el producto sin lavar, donde obtuvo que concloro (100-200 mg / L) caus un aproximado de 0,9 a 1,2 log disminucin en elrecuento de aerobios en placa de lechuga fresca cortada. En todo caso, lascomparaciones entre estudios son difciles ya que numerosos factores varan de unosensayos a otros (Beuchat y col., 2003; FAO/OMS, 2008b).

Hasta la actualidad en el mejor de los casos la eficacia del cloro no es capaz de superarlos 3 log de reduccin, independientemente del producto. (Doyle y Erickson, 2008;Garca y col., 2003; Klaiber y col., 2005; Ruiz-Cruz y col., 2007b). Adems, ladesinfeccin de los productos de IV Gama con cloro a las concentraciones y tiempos decontacto indicados no han demostrado ser mucho ms efectiva en el lavado con agua sindesinfectantes, donde acta una eliminacin mecnica por arrastre.

Agua electrolizada

El agua electrolizada (AE) es el producto de la electrlisis del agua de grifo o unasolucin diluida de NaCl o KCl MgCl2

en una clula de electrlisis. En otras palabras,AE se obtiene al hacer pasar una corriente elctrica por agua a la que se ha aadido

cloruro sdico. El agua se electroliza, obtenindose dos tipos de agua que puedenpermanecer separados por una membrana, o mezclarse si no hay separacin. En elctodo se forma agua electrolizada bsica con alto poder reductor, y en el nodo aguaelectrolizada cida, con poder oxidante y mayor capacidad bactericida. Es consideradacomo una de las alternativas ms prometedoras para sustituir al cloro ya que es una delas tecnologas ms innovadoras de descontaminacin a la vez que respetuosa con elmedio ambiente en sus tres presentaciones: oxidante, neutra y cida (Abadias y col.,2008; Huang y col., 2008).

El AE cida tiene efecto antimicrobiano debido a que contiene cloro gas, inhipoclorito, cido hipocloroso, ozono y radicales (O-, OH-, y Cl-), presentando un

elevado potencial de oxido-reduccin. A pH bajo, la forma mayoritaria y ms efectiva esel HClO- (Al-Haq y col., 2005). La desventaja del AE cida es su bajo pH (

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puede ser corrosivo para el equipamiento, peligroso para los operarios por la liberacinde Cl2, y daino para el producto vegetal (Guentzel y col., 2008). El agua electrolizadabsica se usa normalmente como limpiador o como pre-tratamiento antes del lavado conagua electrolizada cida (Hricova y col., 2008). El AE neutra se obtiene mezclando AEcida con iones OH-, o generando el agua electrolizada sin separacin mediante

membrana (Hricova y col., 2008). El AE neutra con pH 6,5 contiene HClO (95 %), ClO-

(5 %) y trazas de Cl2 (Guentzel y col., 2008). El AE cida y neutra ha dado buenosresultados en productos de IV Gama (Abadias y col., 2008b; Gmez-Lpez y col., 2008;Hricova y col., 2008; Huang y col., 2008), as como para el mantenimiento de la calidadmicrobiolgica del agua de proceso evitando as la contaminacin cruzada (Ongeng ycol., 2006). Una de las ventajas del agua electrolizada es que slo requiere de NaCl yagua para su generacin, por lo que tras la inversin inicial, el gasto que conlleva su usoes mnimo (Al-Haq y col., 2005; Hricova y col., 2008). Adems, su eficacia es mayorque la del hipoclorito a igual concentracin de cloro libre (Abadas y col., 2008b). Lasdesventajas la necesidad de generar constantemente agua electrolizada de formacontinua debido a que su estabilidad no est muy estudiada a lo largo del tiempo.

Tambin presenta la formacin de subproductos y la baja eficacia en presencia demateria orgnica similar a lo que ocurre en el cloro (Kiura y col., 2002; Park y col.,2008; 2009). Otra desventaja es que su almacenamiento reduce su poder bacteriocidaalo largo del tiempo ya que no est estabilizada como ocurre con las soluciones dehipoclorito (Huang y col., 2008).

Ozono

El ozono (O3) se genera al someter las molculas de oxgeno a descarga elctrica de altovoltaje (Khadre y col., 2001), en consecuencia se convierte en un potente oxidante, ymuy eficaz en la desinfeccin de agua (Parish y col., 2003). La capacidad higienizante

es similar al cloro, siendo capaz de reducir significativamente flora natural y patgena ymanteniendo la calidad del producto, siendo esta caracterstica muy importante en laindustria de vegetales de hoja (Rodgers y col., 2004; Koseki e Isobe, 2006; Hassenber ycol., 2007; Selma y col., 2007a; Martnez-Snchez y col., 2008; lmez y Akbas,2009b). En este sentido, Beltrn y col. (2005a) aseguran que el ozono puede prolongaran ms la vida til respecto al cloro. En general, esta tecnologa no resulta ensubproductos peligrosos para la salud, excepto en presencia de bromuro (Richardson ycol., 2000; Hua y Reckhow, 2007; lmez y Kretzschmar, 2009a). Entre las desventajasms importantes destacamos: elevada inversin inicial, alto poder de corrosin, formagrandes cantidades de espuma y elevada dificultad para controlar la concentracinactiva en el agua de lavado (Suslow, 1997; Parish y col., 2003; Selma y col., 2007a).

cido peroxiactico

El cido peroxiactico (CH3CO3H) es un oxidante fuerte, generado tras reaccionar elcido actico con perxido de hidrgeno (Wagner y col., 2002; Dell'Erba y col.,2007).Presenta mayor potencial de oxidacin que el cloro pero menor que el ozono y sumecanismo de accin se basa en la oxidacin de componentes celulares (lpidos,protenas y cidos nucleicos) (McDonnell y Russell, 1999).

Entre las ventajas se encuentran, que no requiere grandes inversiones econmicas, eseficaz en presencia de materia orgnica, no resulta en subproductos peligrosos, escasadependencia del pH, rapidez de actuacin y es efectivo en el agua de lavado (Beuchat y

col., 2004; Kitis, 2004; Wang y col., 2006; Ruiz-Cruz y col., 2007a). El efecto sobre lacalidad del producto depende de la concentracin usada y del tipo de producto

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(Vandekinderen y col., 2008). En las desventajas se destaca el incremento en la carga demateria orgnica del agua y la necesidad de aadir un agente estabilizante ya que esinestable (Kitis, M., 2004).

cidos orgnicos

Los cidos orgnicos han sido ampliamente aplicados como conservantes en diferentesalimentos; sin embargo su aplicacin como higienizante ha sido ms reciente (Parish ycol., 2003). Como conservante, acta alterando la permeabilidad y el transporte en lamembrana celular, a la vez que reduce el pH intracelular lo que afecta al metabolismode la clula (Kreske, 2008). En las ventajas destaca que permite reducir la cargamicrobiana sin necesidad de implantacin de equipamiento especifico. Comodesventajas, necesita un prolongado tiempo de contacto y su adicin incrementa la cargaorgnica en el agua de proceso (lmez y Kretzschmar, 2009). Por otro lado, su efectosobre la calidad del producto no es concluyente, ya que existen trabajos que handetectado deterioro evidente en la calidad del producto (Wu y col., 2000; Vijayakumar yWolf-Hall, 2002; Chang y Fang, 2007), en contraposicin a otras investigaciones quehan obtenido una mejora en la calidad del producto (Kim y Klieber, 1997; Aguayo ycol., 2003; Akbas y lmez, 2007).

Microbiologia Predictiva

La microbiologa predictiva es una rama especializada de la microbiologa de losalimentos, dedicada a estudiar y predecir el comportamiento microbiano frente afactores ambientales e intrnsecos al microorganismo, haciendo uso para tal fin, defunciones matemticas (McMeekin y col., 1993). Estas funciones representan larespuesta de los microorganismos como resultado de la interaccin de diferentes

factores (temperatura, pH, actividad de agua etc.). El proceso por el cual se obtienenestas funciones es conocido como modelizacin (Ratkowsky y col., 1982; Roberts andJarvis, 1983). La modelizacion es el uso de ecuaciones matemticas que emplean leyesfsicas y qumicas para describir, en trminos matemticos, el comportamiento de unsistema real (Dym, 2004).

Dentro de los modelos existen diferentes clasificaciones: segn el tipo de respuestabacteriana, segn el origen modelo, segn el nivel de descripcin y desarrollo y porltimo, segn el tipo de ecuacin matemtica utilizada como base en su construccin.Una clasificacin ms general de los diferentes modelos existentes es aquella que losdivide en modelos mecanicistas y empricos (Buchanan y col., 1997). Los modelos

mecanicistas son aquellos modelos que han sido desarrollados sobre la base de variashiptesis tericas y que estn relacionados con el conocimiento de los procesosimplicados en la cintica del comportamiento de los bacteriano o conocido tambin,como el mecanismo de accin (McLauchlin y col., 2004). Mientras que los modelosempricos son aquellos desarrollados experimentalmente y sin considerar previamente elmicanismo de accin: fsicos, fisiolgico y bioqumico. Las funciones log-logstica o laecuacin modificada de Gompertz son ejemplos de modelos de crecimiento de carcteremprico (Haas y col., 1999; Buchanan y col., 1997). Debido a la dificultad dedesarrollar modelos mecanicistas como consecuencia del conocimiento limitado que setiene sobre los procesos celulares y bioqumicos, la mayora de los modelos tienden aser de carcter cuasi-mecanicistas, donde se introducen parmetros con significacin

biolgica como es el caso del modelo de Baranyi y Roberts (1994) donde el tiempo delatencia es definido sobre la base de la concentracin de una sustancia X que es

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limitante para el comienzo del crecimiento (Baranyi y Roberts, 1994)

Dependiendo del nivel de descripcin y desarrollo los modelos cinticos pueden serclasificados como primarios, secundarios o terciarios. A continuacin realizaremos unadescripcin de los modelos ms usados en microbiologa predictivos basado sobre estaclasificacin.

Modelos primarios

Los modelos primarios son aquellos que describen a travs de una ecuacin matemticael cambio de concentracin microbiana con respecto al tiempo (Whiting y Buchanan,1994). Estos son mayoritariamente modelos cinticos donde se describe los fenmenosde crecimiento y muerte celular. A continuacin presentamos una clasificacin de losmodelos cinticos primarios que han tenido un mayor desarrollo en los ltimos aos(McKellar y Lu, 2004):

1. Modelos de Crecimiento.2. Modelos de Inactivacin.

3. Modelos de Supervivencia.4. Modelos de Crecimiento/no crecimiento y de probabilidad.

Tambin se pueden considerar en este grupo de modelos primarios, modelos nocinticos, relacionados con fenmenos de transferencia o contaminacin cruzada. Estosrepresentan procesos fsicos en contraste a los modelos cinticos donde los mecanismosimplicados son principalmente de ndole biocintica (Perez-Rodriguez y col., 2008).

Los modelos de crecimiento se generan en un rango de condiciones ambientales quepermiten el crecimiento microbiano, el cual, se identifica con el incremento en lapoblacin bacteriana en el transcurso del tiempo. Los microorganismos cuando crecenen un sistema cerrado donde los nutrientes estn limitados desarrollan curvassigmoidales (Peleg, 2006a) del tipo representado en Figura 4. Cada una de las fasesobservadas en la curva de crecimiento se define a travs de un parmetro matemtico, ya los cuales llamamos parmetros cinticos (Zwietering, 1990):

El tiempo de latencia o adaptacin (A). La tasa de crecimiento (B). Densidad mxima de poblacin (C). Fase de muerte o decaimiento (D)

Figura 4. Representacin esquemtica de las fases sufridas por las bacterias en un sistema cerrado donde

existe un agotamiento de los recursos. El eje L representa concentracin de la bacteria y T el tiempo,ambos en unidades relativas.

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En los modelos de crecimiento primarios, las funciones matemticas ms utilizadasson la ecuacin modificada de Gompertz, Baranyi y Roberts y logstica (Gibson y col.,1988; McMeekin y col., 1993b; Baranyi y Roberts, 1994) (Table 3). Las dos primerasecuaciones describen un perfil sigmoidal sobre valores en la escala logartmica (Gibson,1987). En cambio, la ecuacin logstica presenta un perfil no sigmoidal dado que es el

resultado del desarrollo de la ecuacin diferencial que describe la fase (B) (Zwitering ycol., 1990).

Tabla 3. Modelos de crecimiento primarios

Modelo Funcin matemtica

Exponencial 0 maxlog( ) log( )n n t=

Baranyi y Roberts max0 max

max 0

exp( ( ) 1)1( ) ( ) ln 1+

exp( )

m A tn t n A t

m mn n

= +

Ecuacin modificada de Gompertz ( )log( ) exp exp ( )n A C B t M = +

Lag+exponencial 0 maxlog( ) log( ) ( )n n t =

Donde:

Para el modelo exponencial n= ufc/g a tiempo t; np= ufc/g a tiempo t=0; t = tiempo (h); max = tasamxima de crecimiento (h-1)

Para el modelo Baranyi y Roberts m =representa la curvatura existente entre la fase exponencial y laestacionaria; nmax= poblacin mxima (ufc/g);

( )( )

max max - 1

max - 1

1( )

1max

e e1( ) ln1 + e

t

A t t

+ = +

Para el modelo de Gompertz B = tasa mxima de crecimiento (h-1); M= el tiempo al cual ocurre la tasamxima de crecimiento (h); A = mxima asntota de log10 ufc/g; C = la diferencia entre A y la asntotainferior de log10 ufc/g

Para el modelo Lag+exponencial = tiempo de latencia lag (h)

Los modelos de inactivacin son aquellos modelos matemticos que describen lareduccin de la poblacin microbiana en funcin del tiempo. A travs de ellos se estimala tasa de muerte microbiana. Normalmente son aplicados para describir el efecto dediferentes tratamientos fsicos: trmicos, irradiacin, altas presiones (Peleg, 2006b;McKellar y Lu, 2004). Las curvas de inactivacin pueden presentar el perfil mostradoen Figura 5, con tres fases principales, hombro, muerte, y cola o asntota. No obstante,dependiendo de las condiciones, ambientales, experimentales, tipo de microorganismo yalimento, ciertas fases pueden estar ausentes.

Fase de adaptacin Hombro (A).

Fase de Inactivacin o muerte (B).

Fase asinttica cola (C)

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Figura 5. Representacin esquemtica de las fases sufridas por las bacterias en un sistema cerrado dondeexiste un proceso de reduccin-muerte de la concentracin bacteriana. El eje L representa concentracinde la bacteria y T el tiempo, ambos en unidades relativas.

Los modelos de inactivacin pueden clasificarse en: Modelos lineales, que representan destruccin de la poblacin microbianasiguiendo una cintica de primer orden (fase B en Figura 5). Este modelo ha sidoconsiderado hasta la actualidad como la base para el desarrollo y aplicacin delos tratamientos trmicos en alimentos, dando lugar a los conceptos D y z(Bigelow y Esty, 1920; Mazzota, 2001; Murphy y col., 2002; Van Asselt yZwietering, 2006) (Tabla 4).

Modelos no lineales, que representan la heterogeneidad de la poblacinmicrobiana en cuanto a su sensibilidad a los tratamientos de inactivacin. Se hanpropuesto diferentes funciones matemticas entre las que destacamos losmodelos bifsicos (Cerf, 1977), que representan dos fases, una inicial de muerte

lineal (fase B en Figura 5) y una fase de resistencia representada por una lneaasinttica en el modelo (fase C en Figura 5). Estos modelos tambin puedencontemplar la existencia de un hombro (fase A en Figura 5), que representa unafase inicial de resistencia la tratamiento o simplemente un fase donde el efectodel tratamiento no es completo. En los ltimos aos se ha propuesto la funcinde Weibull definida por los parmetros a y b para representar diferentespatrones de inactivacin, siendo una alternativa plausible a la cintica clsica deinactivacin (Peleg, 2006a,b). Tambin las funciones logstica y de Gompertz;pueden ser aplicadas para describir modelos primarios de inactivacin nolineales (Legan y col., 2002) (Tabla 4).

Los modelos de supervivencia describen ms especficamente la inactivacin notrmica en condiciones no extremas y que se encuentran cerca de los lmites decrecimiento. En cuanto a los tratamientos trmicos, los procesos de supervivencia sonobservados en un rango de 50-60 C. Otros fenmenos que dan lugar a curvas desupervivencia son la desecacin en superficies y la exposicin a sustancias inhibidoras,txicas y conservantes alimentarios. En relacin al tratamiento de los datos, estossiguen procesos similares a los aplicados a los modelos de inactivacin. Losmicroorganismos en estos casos suelen presentar fases tipo hombro y cola, que nopueden ser descritas convenientemente por el modelo clsico de inactivacin de primerorden (i.e. log-lineal) (Bigelow y Esty, 1920). Por tanto son ms propicios los modelosbifsico o trifsicos o bien las diferentes variantes a la funcin de Weibull. La aplicacin

de los modelos de supervivencia en la ECRM es clave ya que es capaz de explicar mejorlo que podra ocurrir en una posible recontaminacion, ya que el nmero de clulas

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transferibles depende en gran medida de la cantidad de clulas capaces de sobrevivirfrente al estrs ambiental (Perez-Rodriguez y col. 2008; Baker, 1993; Jay, 1992, Doyle,2001; Legan y col., 2002).

Tabla 4. Modelos de inactivacin primarios

Donde:

Para el modelo linealn= recuento/g a tiempo t; t= tiempo; k= una constante de tasa; Tambin: 1/k= D=tiempo necesario para alcanzar una reduccin decimal ufc/g.

Para el modelo logstico n= recuento/g; n0= recuento/g cuando t= cero; t = tiempo (horas); a, by c son losparmetros de ajuste; t = tiempo (horas).

Para el modelo de Weibull s= fraccin de supervivencia (n/n0) a tiempo t; b = parmetro de escala; n =parmetro de forma

Para el modelo lag+exponencial L(t) = log10recuento bacteriano a tiempo t; B = tasa relativa de muertemxima(h-1); M= el tiempo al cual ocurre la tasa de muerte (h); A = mxima asntota de log10recuentobacteriano C = la diferencia entre A y la asuntota inferior de log10recuento bacteriano.

Los Modelos de crecimiento y no crecimiento son aquellos modelos que definen loslmites que permiten o no el crecimiento del microorganismo en relacin a ciertosfactores externos como pH, aw, cido ctrico, etc., siendo el ms significativo latemperatura. Existen variantes de estos modelos que permiten estimar el tiemponecesario para que se produzca crecimiento. Para ello, utilizan datos cualitativos decrecimiento/no crecimiento en diferentes intervalos de tiempo, aplicando tcnicas deregresin en la generacin de la funcin matemtica (Leistner y col., 1985, Gorris,2000). Los modelos de probabilidad son modelos que proporcionan la probabilidad decrecimiento a unas condiciones dadas. La utilizacin de probabilidades requiere eldesarrollado de mltiples repeticiones (> 8) para cada una de las combinaciones defactores ambientales estudiados. Este tipo de modelos pueden utilizarse en la ECRM

como complemento a los modelos de crecimiento con el objetivo de predecir laexistencia de crecimiento o no en cada escenario simulado en el umbral de crecimiento(Genigeorgis, 1981; Gibson y col., 1987, Zhao y col., 2000).

Los Modelos de transferencia son aquellos modelos que describen la contaminacincruzada entre el entorno y el alimento, adems este tipo de modelos son los ltimospropuestos en la microbiologa predictiva (Perez-Rodriguez y col. 2008; Van Asselt ycol., 2006). La contaminacin cruzada siempre han sido una causa importante decontaminacin de alimentos, pero slo en los ltimos aos se han estudiado en mayorprofundidad. Con estos estudios se pretenden identificar rutas y factores de riesgoasociados a la contaminacin cruzada utilizando para ello un enfoque cuantitativobasado en modelos (den Aantrekker y col., 2003; Reij y col. 2004). Los escasos

modelos que se encuentran en la bibliografa se basan en la aplicacin de tasas detransferencia (TR), en porcentajes que describen la proporcin de bacterias que pasan de

Modelo Funcin matemtica

Exponencial (modelo lineal) 0log( ) log( )n n kt =

Logstico0log( ) log( )

1 exp( )

an n

b ct= +

+

Modelo de Weibull = = exp( ) log( )n ns bt o s bt

Lag+exponencial ( )( ) exp exp ( )L t A C B t M = +

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una superficie contaminada a otra debido al contacto entre ellas (Zhao y col., 2000):

TR (%) = ufc en la superficie donadora X 100

ufc en la superficie receptora

Modelos secundarios

Los modelos secundarios son ecuaciones matemticas ms complejas, ya que relacionanlos parmetros de cinticos de los modelos primarios con factores ambientales tantointrnsecos como extrnsecos, tales como: pH, temperatura, actividad de agua, etc.Entre los modelos secundarios ms utilizados, encontramos (Ross y Dalgaard, 2004):

1. Modelos polinomiales2. Modelos de raz cuadrada3. Modelos gamma4. Modelos de redes neuronales artificiales

Los modelos de mayor utilizacin son los modelos polinomiales o tambin conocidoscomo: modelos de superficie de respuesta (MSR) (Baranyi y col., 1996). Estospresentan interesantes ventajas que lo hacen preferibles:

Presentan un buen ajuste con datos obtenidos experimentalmente. Son de fcil desarrollo matemtico.

Sin embargo, estos modelos poseen importantes limitaciones que deben considerarseantes de su utilizacin. En primer lugar no permiten extrapolacin y deben aplicarsedentro del dominio de desarrollo del modelo (regin de interpolacin). A diferencia delo que ocurre en otros modelos como el Modelo gamma, los MRS no pueden serfcilmente extendidos a nuevos factores o rangos y requeriran un nuevo tratamiento de

datos. Finalmente, estos modelos pueden presentar problemas de sobreajuste adems deno permitir una interpretacin de sus trminos dado su carcter puramente emprico(Baranyi y col., 1996).

El modelo de raz cuadrada se presenta como una alternativa a los MSR, en este tipo demodelos se encuentran los tipo Ratkowsky o Bleradek que como base matemticatienen la siguiente funcin (Ratkowsky y col., 1982; McMeekin y col., 1993; Bernaertsy col., 2004):

( )max minb T T =

donde max es la tasa mxima especfica de crecimiento (h-1), b es una constante y T es la

temperatura y Tmines la temperatura mnima terica a partir de la cual se detecta crecimiento.Esta funcin puede extenderse para comprender el rango biocintico completo,incluyendo como parmetro la temperatura mxima terica (Tmax), valor por encima delcual no existe crecimiento (Ratkowsky y col., 1983)

max min ( - ) [1 - exp( ( - max)) ] b T T c T T = +

Esta ecualizacin tambin ha sido ampliada para incluir otros factores ambientales talescomo aw, pH, CO2, etc. (Ross et al. 2003)

En el caso de los modelos gamma, cabe destacar que fue Zwietering (1992), quienintrodujo este concepto fundamentndolo en dos principios generales:

1. Los factores ambientales afectan el crecimiento bacteriano de maneraindependiente; y por tanto su efecto total es igual a la multiplicacin de los

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efectos individuales de cada factor.2. La tasa mxima de crecimiento (max) es igual a una fraccin de la tasa mxima

de crecimiento ptima (opt) la cual resulta de multiplicar el efecto inhibitorio decada factor ambiental por la tasa mxima ptima de crecimiento.

El efecto inhibitorio viene dado para cada factor por una funcin llamada Gama (). Eltermino gamma es adimensional y se encuentra entre 0 y 1, donde el valor 1corresponde a ausencia de inhibicin. Cuando los valores de los factores son ptimospara el crecimiento, las funciones toman un valor de 1, siendo por tanto la tasa decrecimiento estimada igual a la tasa de crecimiento ptima. Este modelo secundario esde gran aplicabilidad en la ECRM y permite ser extendido con nuevos factoresambientales (Wijtzes, 2001, Zwietering, 1996).

( ) ( ) ( )max wopt T pH a =

Los modelos de redes neuronales artificiales presentan un excelente ajuste y

sofisticacin. La arquitectura de una red neuronal consiste en la organizacin deneuronas en red formando diferentes capas o agregaciones como se muestra en losejemplos de la Figura 6. El desarrollo de modelos de redes neuronales presenta unaelevada complejidad. Esta hace difcil su aplicacin en hojas de clculo, de lasecuaciones o funciones y sus parmetros (Garca-Gimeno y col., 2002, Schepers y col.2000; Valero y col. 2007; Oscar 2009).

Figure 6. Ejemplos de modelos de redes neuronales

Los modelos secundarios ms frecuentes son aplicados a la tasa de crecimiento mximo.Tambin existen modelos secundarios aplicados al tiempo de latencia pero son msinexactos e imprecisos debido a que el tiempo de adaptacin se encuentra relacionadocon las condiciones pre-cultivo (historia celular), mostrando estos una gran variabilidad(Swinnen y col. 2004, Baty y col. 2004). Por ello, en el caso del lag, los modelosmatemticos que mejor se adaptan son los modelos estocsticos. Los modelosestocsticos estn basados en el uso de distribucin de probabilidad, describiendo lafrecuencia de aparicin de los distintos valores de tiempo de latencia (Robinson, 1998;Swinnen y col. 2004; Olofsson y col. 2011).

Los modelos secundarios basados en la densidad mxima son otro conjunto de modelos

secundarios no muy desarrollados especialmente para microorganismos patgenos dadoque hay otros parmetros de mayor importancia en el riesgo como son el tiempo de

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latencia y tasa de crecimiento. Sin embargo, en el caso de los microorganismosalterantes estos modelos si cobran mayor importancia dado que su capacidad dealteracin se encuentra muy relacionada con los niveles mximos de poblacin; si bien,a pesar de su aplicabilidad, existen pocos modelos para este tipo de microorganismos(Zurera-Cosano y col. 2006).

Los modelos primarios tradicionalmente se han desarrollado en condiciones estticaspara los factores ambientales en estudio. No obstante, en la prctica, difcilmente, lascondiciones ambientales se mantienen constantes en el tiempo. De ah que la utilizacinde modelos que consideren el comportamiento microbiano en condiciones dinmicassea de gran importancia para obtener predicciones ms exactas. A pesar de su relevanciason an pocos los modelos desarrollados en condiciones dinmicas (Bernaerts y col.,2004). Hay diferentes modelos primarios que pueden ser utilizados para reflejarcondiciones cambiantes (Baranyi y col. 1993; Hills y Mackey 1995; McKellar yDelaquis, 2011). El modelo de Baranyi y Roberts (Baranyi y Roberts, 1994) es quizs elmodelo que ms se ha aplicado a condiciones dinmicas ya que permite ser adaptado

desde su funcin diferencial para reflejar la variacin de los parmetros cinticos conrespecto al tiempo. Este se ha utilizado tanto para predecir el crecimiento como muertemicrobiana en diferentes alimentos como han demostrado Pin y col. (2011) o Psomas ycol. (2011).

Modelos terciarios

Los modelos terciarios son aplicaciones informticas que integran los modelosprimarios y secundarios que permiten a los usuarios finales aplicar los modelospredictivos en diferentes contextos para obtener predicciones del comportamientomicrobiano en los alimentos (crecimiento o muerte).

MicroHibro ha sido creado en 2012 por el grupo de investigacin HIBRO de laUniversidad de Crdoba, nueva herramienta de prediccin on-line para productosvegetales y crnicos. Es una base de datos de modelos de crecimiento y supervivenciade los microorganismos que permite hacer predicciones en condiciones ambientalesespecficas. Asimismo incorpora funcionalidades para la inclusin de modelos porusuarios expertos en microbiologa predictiva. Tambin incorpora un mdulo devalidacin para evaluar los modelos disponibles con sus propios datos. En un segundomdulo la aplicacin incorpora un enfoque estocstico destinado a la evaluacin deriesgo.

Pathogen Modeling Program PMP, fue creado por USDA en Eastern RegionalResearch Center, Microbial Food Safety Research Unit; y proporciona informacin de

estimaciones de patgenos en procesos de inactivacin y crecimiento en funcin dediferentes factores ambientales.

Combase fue desarrollado por el Instituto de Investigacin Alimentaria del Reino Unido(IFR, UK) y est integrado al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos yCentro de Seguridad Alimentaria de la Universidad de Tasmania y Australia (Baranyi yTamplin 2004). Es una base de datos que contiene una recopilacin de modelospredictivos relevantes en una amplia variedad de ambientes (caldos de cultivo yalimento) lo que proporciona informacion de crecimiento, inactivacin y supervivenciamicrobiana. Est compuesto por diferentes herramientas:

ComBase Browser: Es la base de datos de crecimiento e inactivacin, recopiladas en los

centros de investigacin y de las Publicaciones cientficas. ComBase Predictor: predece el comportamiento de microorganismos patgenos y

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alterantes frente a los factores ambientales. Perfringens Predictor: Es una aplicacin especialmente que predece el crecimiento de

Cl. perfringensdurante la refrigeracin de carne sometida a proceso de coccin.

Tambien existen otros modelos terciarios de cierta relevancia en diferentes mbitos:Seafood Spoilage And Safety Predictor (SSSP), Microbial Responses Viewer (MRV)

(Koseki, 2009), SYMPrevius (Leporq y col.2005).

Elaboracin de modelos predictivos

El desarrollo de modelos predictivos comprende multitud de mtodos y enfoques segnmicroorganismo, matriz, y fines del modelo. Existen numerosas revisiones cientficassobre cmo abordar el desarrollo de modelos, para una mejor comprensin de lametodologa recomendamos su lectura detallada (Devlieghere y 2000; Rash, 2004;McMeekin et al. 1993). No obstante, a continuacin presentamos un pequeo resumensobre los elementos y fases principales para el desarrollo de modelos predictivos. Losmodelos predictivos pueden construirse con datos ya existentes o de nueva generacin,

en el propio alimento o en caldo artificial. En caldo de cultivo artificial o extracto sepueden generar mayor nmero de experimentos, adems de posibilitar un mejor controlde las condiciones y un menor uso de recursos tanto humanos, materiales y de tiempo.En contraposicin estos modelos se van a producir predicciones que pueden serdiferentes a las observadas en condiciones reales, por tanto requerirn una validacinpara su aplicacin. Los modelos generados en el alimento proporcionaran estimacionesms exactas por el hecho de haber sido desarrollados en matrices reales. A pesar de ello,estos modelos suelen estar limitados en el dominio de aplicacin dado que desarrollanen un rango estrecho de condiciones ya que requieren un mayor gasto en recursos, unainoculacin compleja y generan una elevada variabilidad de los resultados.

Los datos necesarios para la construccin de los modelos pueden ser generados a travsdel recuento de placa, observaciones al microscopio, impedancia o densidad ptica (estemtodo por turbidez es el ms utilizado). La obtencin de los modelos matemticos serealizan mediante mtodos de ajuste a travs de la regresin; lineal, no lineal y redesneuronales. La validacin es una fase necesaria previa a la aplicacin de los modelosdesarrollados que permite evaluar si el modelo desarrollado es adecuado para suaplicacin en los diferentes contextos alimentarios. Existen dos tipos de validaciones,interna y externa. La validacin interna es aquella que evala la capacidad del modelopara reproducir observaciones generadas en el mismo experimento. Para ello esnecesario generar dos conjuntos de datos, el primer conjunto se destina para generar losmodelos y el segundo conjunto de datos es utilizado para realizar la validacin. En el

caso de la validacin externa se realiza con las observaciones obtenidas en el alimentocon el fin de evaluar la exactitud de la prediccin del modelo.

Aplicaciones de los modelos predictivos

El uso de modelos de microbiologa predictiva es muy diverso pero en general podemosresumirlo segn el planteamiento de Membr y Lambert (2008), en tres aplicaciones:asistencia en alertas alimentarias, innovacin de alimentos y/o procesos, toma dedecisiones. En el caso de asistencia en alertas alimentarias nos referimos a la estimacinque se puede realizar en cuanto a las consecuencias y repercusiones sobre la seguridaddel consumidor, si se presentara algn problema durante la cadena de produccin y enespecial durante la comercializacin y almacenamiento de los alimentos. Asimismo, en

el momento de tomar decisiones permite ayudarla declinarse por una de las opcionesplanteadas gracias al conocimiento de los posibles panoramas bajo esas condiciones;

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esta aplicacin es de mucha ayuda a la hora de llevar a cabo medidas de seguridadalimentaria, como establecimiento de los PCC, en los sistemas APPCC, en cambios enel diseo del proceso. por ltimo, y no menos atractivo para la industria se encuentra lainnovacin de alimentos, ya que la microbiologa permite predecir y esto a su vezfacilita la evaluacin de los productos en cuanto a un posible crecimiento bacteriano, a

el tiempo necesario para que superen concentraciones de riesgo y la velocidad de losmicroorganismos para colonizar un producto, toda esta informacin es clave a la hora dedisear, desarrollar, reformular, optimizar los procesos de produccin y a su vez losproductos. Otra aplicacin de la microbiologa Predictiva es que forma parte de una delas piezas claves en la ECRM, Evaluacin de la Exposicin (ver siguiente apartado).

Evaluacin Cuantitativa del Riesgo Microbiolgico (ECRM)

El concepto de Evaluacin de Riesgo Microbiolgico ERM forma parte de un conceptoo temtica ms amplio, esto es Anlisis del Riesgo (FAO/WHO, 1995). El Reglamento(CE) N 178/2002 del parlamento europeo y del consejo de 28 de enero del 2002 afirmaque: Anlisis del riesgo es el proceso formado por tres elementos interrelacionados:Evaluacin del riesgo, Gestin del riesgo y comunicacin del riesgo.

El anlisis de riesgo se fundamente en bases cientficas que justifican y sustentan lasdecisiones y acciones a tomar, en cuanto a un determinado peligro o riesgo alimentario(FAO/WHO, 1995). El objetivo fundamental del Anlisis del Riesgo es lograr un nivelelevado de proteccin de la salud de los consumidores. La evaluacin del riesgo y lagestin del riesgo deben estar integradas con la comunicacin del riesgo como as quedareflejado en la Figura 7.

Figura 7. Representacin de la interaccin entre los diferentes componentes del Anlisis del Riesgo(FAO/WHO, 1995).

Las directrices generales que se deben seguir para realizar una Evaluacin del RiesgoMicrobiolgico (ERM) vienen reflejadas en el documento de la Comisin del CodexAlimentarius CAC (1999). En este documento se definen las fases de las que debeconstar un proceso de ERM y que definimos a continuacin

1. Identificacin del Peligro (IP). Identificacin de agentes biolgicos, qumicos o

fsicos capaces de causar un potencial efecto adverso sobre la salud y que pueden estarpresentes un determinado alimento o grupo de alimentos.

Evaluacin del Ries o

Comunicacin del Ries o

Evaluacin de gestin Eleccin e implantacin de las

opciones ms apropiadas

Intercambio de opinion e informacin

Identificacin del Riesgo Caracterizacin del Peligro Evaluacin de Exposicin Caracterizacin del Riesgo

Gestin del Ries o

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2. Caracterizacin del Peligro (CP).La evaluacin cuantitativa o cualitativa de lanaturaleza de los efectos nocivos para la salud asociados con el peligro en cuestin. Paralos fines de la evaluacin de riesgos microbiolgicos, son objeto de inters losmicroorganismos y/o sus toxinas.

3. Evaluacin de la Exposicin (EE). Evaluacin cuantitativa y/o cualitativa delgrado de ingesta de un microorganismos y/o sus toxinas a travs de alimentos o de otrasfuentes si son relevantes.

4. Caracterizacin del Riesgo (CR). El proceso de determinacin de la estimacincualitativa y/o cuantitativa, incluidas las incertidumbres que conlleva, de la probabilidadde aparicin y gravedad de efectos adversos conocidos o potenciales para la salud deuna poblacin dada, sobre la base de la identificacin del peligro, la caracterizacin delmismo y la evaluacin de la exposicin.

En el desarrollo de un estudio de ECRM se deben comenzar por definir el objeto de la

misma (Morgan y Henrion 1990) y establecer las estrategias a llevar a cabo a lo largodel estudio y en especial sobre las poblacionales de riesgo (que pudieran requerir untratamiento especfico en la ECRM). En cuanto a otros aspectos, tambin se puedeindicar el tipo de anlisis de los datos, tratamiento de la incertidumbre, escenarios amodelar, etc. La ERM se fundamenta en la aplicacin de modelos, esencialmente en lasetapas de Evaluacin de la Exposicin (EE) y Caracterizacin del Riesgo (CR)(Lammerding y Paoli, 1997).

Objetivo de Seguridad Alimentaria (FSO)

En 1998 la International Commission of Microbial Specifications in Foods (ICMSF)

propone el uso del concepto Food Safety Objetive (FSO) como un puente de uninentre objetivos y polticas de Salud Pblica y la gestin del riesgo a lo largo de lacadena alimentaria (ICMSF, 1997 y 1998). Este concepto se define ms tarde como lafrecuencia y/o concentracin mxima de un peligro microbiano en un alimentos en elmomento de consumo que proporciona un Nivel adecuado de proteccin (ALOP)(ICMSF, 2002). Por tanto, el FSO se propone como elemento clave en el desarrollo delos sistemas de gestin de riesgos microbiolgicos, proporcionando una basecuantitativa para el desarrollo de medidas de control, y diseo e implantacin desistemas de autocontrol (Zwietering, 2005).

Siguiendo los pasos de la ICMSF, la FAO ha desarrollado su propio marco de gestinbasado en el FSO (FAO/WHO, 2004). Segn esta ltima, el FSO puede ser establecidobien en base a datos epidemiolgicos que describen el estatus de salud pblica actual encuanto a un peligro o bien mediante la aplicacin de una curva de caracterizacin delriesgo. En este ltimo caso, existe una base cuantitativa para relacionar el FSO y elALOP, base indiscutiblemente vinculada a una ERM de indole cuantitativa, dondevariables tanto de salida o entrada pueden relacionarse con el FSO.

Para facilitar su aplicacin por los operadores alimentarios, la ICMSF (2002) propone lasiguiente inecuacin que considera de forma resumida el efecto de los distintos procesosy subprocesos (crecimiento, recontaminacin y reduccin) y la sumatoria de todo ellospermiten o no alcanzar un FSO:

0

H I R FSO + +

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Ho es la poblacin inicial de microorganismos, I es un factor de incremento y R es un factor dereduccin. Todos los trminos de la inecuacin son expresados en log10

La presente inecuacin es una valiosa herramienta para la validacin de medidaspreventivas o medidas de control, proporcionando una base cuantitativa para ello(Zwietering y col., 2010). Recordamos que Validacin, segn el Codex Alimentarius,es el proceso a travs del cual se garantiza que una medida de control definida escapaz de mantener bajo control un peligro concreto en un alimento especfico (CAC,2001). Los modelos predictivos son herramientas, implcitas en la inecuacin, quepueden aplicarse tambin a tal efecto, sin menos cabo de la utilizacin de informacincientfica, pruebas experimentales, datos histricos etc. como se recoge en diversosdocumentos (CAC, 2001). Este sistema puede aplicarse a lo largo de las diferentesetapas de la cadena alimentaria mediante la utilizacin de objetivos o estndares deseguridad alimentaria especficos (FAO/WHO, 2004):

Objetivo de Rendimiento (OR): la mxima frecuencia y/o concentracin de un peligroen un alimento, en un fase especfica de la cadena alimentaria antes del momento de

consumo, que proporcione o contribuya al logro de un FSO o un ALOP, segncorresponda.

Criterio de Rendimiento (CR): el efecto que debe ser logrado en la frecuencia y/oconcentracin de un peligro en un alimento por medio de la aplicacin de una o msmedidas de control para lograr o contribuir a lograr un OR o un FSO.

Cuantificacin y modelizacin de procesos microbiolgicos en

la Industria de Vegetales IV Gama: Un enfoque para la

gestinLa seguridad alimentaria en el sector de los productos IV Gama esta marcada por dosaspectos importante. Estos hacen referencia, por un lado a que los tratamientos dehigienizacin aplicados en la industria no son completamente efectivos eliminando lacarga microbiana presente, y por otro lado, al hecho de que los productos sonconsumidos crudos (Francis y col., 1999). Por ello, la inocuidad microbiolgica deestos productos depende en gran medida de la aplicacin de la teora de obstculos,donde diferentes factores y tecnologas de conservacin son combinadas con el fin dereducir la contaminacin y/o inhibir el posible crecimiento microbiano a lo largo detoda la cadena alimentaria (Lee, 2004). Entre los factores clave en el control de los

patgenos en vegetales mnimamente procesados se sealan, como los ms importantes,los procesos de higienizacin y la temperatura de almacenamiento y distribucin, puestoque se ha demostrado que los microorganismos patgenos pueden sobrevivir a unaexposicin al cloro y posteriormente crecer si las condicione