2.. PNaancE.

I . PRESENTACIÓN

2. ÍNDICE

3. RESUMEN

4. MARCO TEÓRICO

2.1. BIOGÉNESIS DE LA PRODUCCIÓN DE RIFAMICINA

2.2. EL BARBITAL COMO REGULADOR EN LA BIOSINTESIS DE

RIFAMICINA.

5. ANTECEDENTES

6 . JUSTIFICACIÓN

7. OBJETIVOS

7.1. HIPÓTESIS

7.2. OBJETIVO GENERAL

8. MATERIAL Y MÉTODOS

8.1. DIAGRAMA DE FLUJO DE LA METODOLOGIA

8.2. MlCROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVOS

8.3. AMORTJGUADORES Y REACTIVOS

8.4. DETALLE DE LAS TÉCNICAS LJTILIZADAS

8.5. SELECCIÓN DE TRANSFORMANTES

9. RESULTADOS

10. DISCUSIONES

1 1 . PERSPECTIVAS

12. REFERENCIAS

Los resultados parciales alcanradns en la realización de este proyecto. contiriiian. In presencia de los genes que codifican para citncronios P450 en Amycolnfupsis metiiferrLinei. E s ~ o se fundamenta con la amplificación de estas secuencias génicas por la Reacción en Cadena de la DNA Polimerasa (I'C'R). sin embargo, aún no se ha comprobado por la digestión con las endonucleasas correspnndienies.

Con la confirmación definiíiva de estos resultados. se dispondrá de una amplia iiifcxmación para la manipulación gciiéiica de estos genes, y con ello obtener cepas sobreproductoras de rifamiciiia B. supcr sensibles, cepas con muchas copias del gen o genes indiicibles por barbital, etc.. de igual iiianera se tendrá iin gran impacto cn la industrial conllevando a una reducciOn económica en dicha producción obteniéndose casi cxclusivamente rifamicina B.

De igual forma, los resultadns obtenidos permitirán un estudio más profiiiido de csios genes amplificados y sobre iodo serán u n paso fundamental para estudios como dc expresión, conllcvando a poder hacer mniiipiilaci»iies génicas.

4. MARCO TEÓRICO

Los actinomicetos son un amplio grupo de microorganismos que tienen la capacidad para producir un gran número de metabolitos secundarios como pigmentos, antibióticos, agentes antitumorales, ionóforos, coccidiostaticos, antiheimínticos, inmunosupresores, inhibidores, fungicidas agrícolas, insecticidas y herbicidas, así como diversas proteínas extracelulares, lo cual contribuye ampliamente a la salud y economía humana (Demaiq 1997).

Uno de los actinomicetos más importantes es Amycolatopsis mediterranei, debido a su capacidad de formar, durante el metabolismo secundario, un compuesto con actividad antimicrobiana, denominado rifamicina. La rifamicina fue aislada por primera vez en 1957 en el laboratorio "Lepetit" en Milan, (Italia) por Sensi y colaboradores (La1 y col., 1995).

Las rifamicinas son un grupo de antibióticos que en bajas concentraciones, inhiben al ARN polimerasa bacteriana provocando que solo se formen cadenas cortas y sin sentido de AFWm (Hartmann y col., 1967). Este tipo de antibióticos se utiliza principalmente para combatir la tuberculosis y la lepra producidas por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae respectivamente (La1 y col., 1995). Además se ha encontrado efectividad contra Mycobacterium avium, el cual se encuentra presente frecuentemente en enfermos de SIDA (La1 y col., 1995).

4.1. Biogénesis de la producción de rifamicina.

La rifamicina B está constituida por dos partes básicas, una de ellas es un grupo aromático con un anillo nafialeno conocida como cromóforo y la otra es una cadena alifática conocida como cadena ansa (Lancini y Grand, 1981) (Fig. I).

Oxígeno atmosférico

3-Aminc-5hidroxi. benzoic0

Algún derivado del glicerol Oxigeno

atmosférico

1974 White. y col. 1973 b; White y

Metionina

Fig. I . Biogénesis de la nfamicina B. (Andenon, y col. 1989; Recker. y col. 1983; Karlsson, y col Martinelli, 1974; White, y col. 1974).

4

Para la biosíntesis de la rifamicina B participan varias rutas metabólicas primarias: ciclo de las pentosas, glucólisis, biosíiitesis de aininoácidos aromáticos y ciclo de los ácidos tricarhoxilicos

La biosíiitesis se inicia con cl ciclo de las pcntosas (ciclo de la liexosa inonofosfato (IIMP)) (Fig. 2). En esta ruta metahólica, por cada dos moléculas de glucosa se producen una eritrosa-4-fosfato y una fructosa-6-fosfato. [':Sta última puede ser incorporada a la glucólisis o vía EMP (Embden-Meyeriioff-Parnas) para producir fosfoenolpiruvato, el que posteriormente es condensado con eritrosa 4-fosfato para formar 3-desoxi-D- arabinohcptulosonato (DAH). En este paso el DAH puede tomar dos rutas: una hacia la biosíiitesis de aminoácidos aromáticos. a traves de l a vía del sikiiiiato. y la otra hacia el inetabolisiiio secundario. para la biosíiitesis del croinóforo o núcleo central de la rifaniiciiia ((;-fax y col.. 1990).

. _ _ _ ~ I - ----

üdo ddaspentcsas ' Fructoca6P

~- .........................................................................................................

............................................. . . . . 3deo~-

................................................ sikirr€lto , ,

Fig. 2 . Biosiniesis de rifainicina por A. iiieditci-i-;iiici y $11 miiexióii coli el inetabolisnio priinario ( G ) g a x > C O I . . 1990: Laiicini y Bgraiidi. 198 I )

En este último caso, el DAH es convcrtido en 3-amino-5-hidroxi-benziI-CoA (Becker y col.. 1983; Gygax y col.. i900), por transferencia del grupo amino de la glutaniina.

La síntesis de la cadena ansa se logra mediante la incorporación sucesiva de dos moléculas de nialonato y ocho de iiietilmalonatn a través de malonil-CoA y nietil-malnnil- COA. generadas por isonierización cnziiiiáticn del succinil-CoA (Karlsson y col., 1974: Wciu-cn y Kuistien, 1996).

La etapa terminal de la biosiiitesis de rifamicina puede ser considerada como una ruta que procede de la proansaniiciiia R (considerada hipotéticamente el precursor de todas las ansamiciiias naftalénicasj via secuencia¡ de oxidación del C-34a, C-6 y C-8 a protorifamicina SV. con la finalidad de producii- rifamicina B (fig. 2). La rifamicina B y varios derivados de modificaciones químicas como rifampicina y 3-morfolinorifaiiiicitia SV, son agentes particularmente activos contra las bacterias Gram' (La1 y col., 1995).

4.2. El barbital como regulador en la biosíntesis de rifamicina.

Desde el descubrimiento de este antibiótico. se ha buscado l a manera de incrementar su producción, desde el punto de vista cuantitativo (aumentando los nivclcs de producción) como cualitativo (persiguiéiidose la producción selectiva de rifamicina R respecto de la compleja mezcla de rifaiiiiciiias chienidas de forma natural). A este respecto. Sciisi y col. (I961 j reportaron que eii el medio de producción, un número de rifamicinas son producidas. usualmente A, B, C - D y E; pero B. la cual es la más estable. estuvo presente solo en pequeñas cantidades. Posteriormente Margalith y Pagani en 1961. trabajando con la cepa silvestre, reportarnti que en presencia de barbiturato de sodio en el medio dc fermentación resultó en la producción exclusiva de rifamicina B. Sin embargo aun nn se tiene una explicación del coin« o a que nivel actúa el barbital. Una hipótesis plantcada para explicar el efecto dcl barbital es que este actúa a nivel de cadena respiratoria. Esta posible inhibición provocaría una disminución en el consumo de oxígeno en la cadena respiratoria, generando con ello una mayor disponibilidad del mismo en l a forinación del grupo éter vinilico de la iniolécLila de ansamicina, y evitando con ello la acuniulación de intermediarios. Si la hipótesis planteada es correcta. la inhibición actuaría en el complejo 1 de la cadena respiratoria. bloqueando la oxidación del NADH+H y de.iando libre la oxidación del FADH+H a nivel de complejo 11. Esto favoreccria el metabolismo de los lipidos y la forrnxióii de iiialonil-CoA requeridos para la condensación subsecuente de unidades de acetato y propinnato respectivamente para dar lugar a la molEcula dc rilamicina, de tal forma q ~ t c el NADI-l+H t i n se acumularía ya q~ ic isle es rcoxidado cn cl paso de rifamicinn S a i-iliiiiiciiia SV (fig. 3 j . Sin embargo ¿clui&i caíaliraria la reacción de incorporación de este oxígeno atmosférica para en la Eorniaci6n dcl grupo éter vinilico de la molécula de ansamicina?.

P r o a n s a m i c i n a B P r o t o r i f a m ic ina I

O X , d a C , O " 1

R i f a m i c i n a W R i f a m i c i n a C

T kr y:::"

R i f a m i c i n a S V R i f a m i c i n a B

Fig. 3. Etapa tiiial de la hiosintesis de i - i í i i i i i c i i i a I3 sin i-aiiiificaciones (White y col.. 1973; Mart inel l i > col.. 1974: White y Martinell i. 1974: Gliisalha y cnl.. 1978; Ciliisalha > col.. 1980; Ghisalha y col.. 1982: Mqiiay col., 1990)

La enzima más idónea para catalizar l a reacción antes mencionada es la de la familia de la monooxigenasas, especííicainente el citocromo p450. Por ello se prosigui0 a buscar en la literatura el reporte dc la presencia de esta enzima en los actinomicetos. particularmente en Amycolntopsis /~iet/i/errunei. encontrándose positivo dicho dato (O'Keefe y Harder. 1991).

La utilización del barbiturato se debe posiblemente a la publicación hecha por Fcrguson y col. en 1957, los cuales mostraron que la producción de estreptomicina por LS/rc~p/omyces griseus, en medio sintético. es grandemente estimulado en presencia de b, aibital. . ' ¡,a figura 4 muestra la molécula dc este compuesto químico.

P C H3-C Hi. ,, C NH

\, / \

CH3-CHz Ti NH

O

Fig. 4. Moléciila qiiiiiiica del bai-bital.

En un traba.jo reciente. Mejía y col. [ 1097) reportaron la obtencicin de mutanies dc Ai?zycoluilopsi.s niediierranei tanto sensibles (BAK') como resistentes (BAR") al barbital. encontrando que las sensibles tenían tina producción del 200% respecto a la producción de la cepa parental.

8

5. ANTECEDENTES

I.as enziinas que intervienen en la ruta de biosíntesis de rifamicina se encuentran codificadas en genes agrupados en un cli/.s/cr o conjunto génico (fig. 5). El cluster de genes i’!f coiiiprendc cuatro regiones distintos (Floss y Yu. 1999). 1,a región más amplia (I-egión 11) codifica un policétido sintasa tipo I (I’KS), inmediatamente corriente arriba del dominio PKS (región I) están dos genes, rrfT y rif.S. que codifican, posiblemente; enzimas que cierran el anillo naftoquinona. La secuencia quc aparece posteriormente corriente arriba parece no estar relacionado en la biosintesis de rifamicina, sugiriendo el final del clusler. Corriente abajo del dominio PKS aparece u n grupo de siete genes (región III), requerido para la síntesis del ácido 3-amino-~-liidroxibenzoico (AHBA); un gen que sintetiza 8 AkiB.4 (rii.I) está localizado a 26 k b corriente abajo. cerca del extremo terminal del clu.slei’. La última región (región IV) coinprtiide nn número sustancial de genes reguladores que prcsumibleniente codifican para enzimas modificadoras post-sintéticas. Dentro del clusler. rif se han encontrado cinco secuencias de AIIN con similitud con secuencias caracterizadas como pertenecientes al citocromo p450. Se Iia reportado que el citocromo p450 es inducible por barbituratos (O’Keefe y Harder, 1991: Black. 1994).

Fig. 5. Cluster de zener para la biosíntesis de i-ilaiiiiciiia (rit) en .4. mediicrronei. Comprende cuatro resiones. Toinado de Floss v Yii. 1999

En años recientes, se ha demostrado en los actinomicetos, particularmente en el género Sírepíomyces (conocido por tcner importancia biológica y económica debido a la producción de una gran cantidad dc cnzinias y irictabolitos secundarios), la presencia de ciiocr«nios p450 con actividad xenobi¿itica (O’tieefe y Harder, 1991) así como también jugando un papel en la biosintesis de otros antibióticos en estos organismos (Stassi y col.. 1993: Rodriguez y col., 1995).

4

En la reacción de la monooxigeiiasa. dos equivalentes reductores reducen un átomo dc oxígeno a agua. mientras que el átomo de oxígeno permanecieiite es incorporado a un substi-ato. típicamente como un grupo hidroxilo (fig. 6)

p450

NAD(P)H

R-HO + TI20

Fig. 6. tr grncl:

El NAD(P)H es la fuente fisiológica iistial de los equivalentes reductores. los cuales son transferidos secuencialmeiite por iiicdio di: dos proteínas adicionales: una reductasa y una fcrredoxiiia, llegando finalmente al 1’450.

6. JUSTIFICACION

Este estudio dará respuesta a una iiic0gnita planteada desde hace mucho tiempo atrris. desde que se empezó a iitilizai. el barbital en la producción de rifamicina B. (en 1957 por Ferguson y col.. en 1960 por Setisi y posteriormente por Margalith y Pagani eii 1961): ;,qué provoca el barbital en el microorganismo para que se forme solamente rifamicina B y cómo lo Iiace'?.

El estudio del gen r(finducib1c por barbital permitirá obtener cepas con una calidad geiiética mejor en la producción de estc antibicitico. cs decir, cepas que presenten una n iay i r cantidad de copias de este gen (o genes) o cepas que no requieran barbital para la produccicin exclusiva de rifamicina 13. De igual b r m a estudio, el del gen responsable del efecto provocado por el barbital en la biosíntesis dc rifainicina B permitirá profundizar en cl mecanismo de acción, aún más. la clonación de éste gen o genes permitirá la determinación exacta de los pasos implicados en esta inducción.

La presencia de cinco secuencias en e1 duster ?If relacionadas con el citocroino p450 nos hace suponer un papel importante de este citocromo en la biosíiitesis de rifamicina (posiblemente un uno de las pasos oxidativos). Es por esto que el estudio del citocromo p450 en este microorganismo explicai-;i tanto aspectos regulatorios mediados por cI barbital. como mecanismos biosiiititicos en cuanto a la participación de átomos de oxígeno atmosféricos a la molécula. A nivel industrial. el beneficio redituará en el costo de la producción de este antibiótico.

7.1. HIPOTESIS: Los genes del citocronio p450 cii Am,vcolatqxi.s medilerranei iiiducible por barbital tienen iiifltieiicia sobre la biosintesis de rifamicina B.

7.2. OBJETIVO GENERAL: Estudiar el efectc) de Ins genes del citocromo p450 sobre la biosintesis de rifamiciiia í 3 cii iIn7yolatopsis meúiiervanei.

OBJETIVO PARTICULAR: Cloiiar los genes de p450 que se utilizarán comn sondas en experimentos posteriores de expresión

PALABRAS CLA L’ES: Barbital, citocromo p450. Rifumirina. A. mediteuranei

8. MATERlAL METODOS

8.1. DIAGRAMA DE FLUJO DE LA METODOLOGIA

DISEÑO DE PRIMERS +

PARA CADA UNO DE LOS GENES.

SITIO DE RESTRICCI~N EXTRACCIÓN DE DNA DE

A . meditevranei

I I

i

i PCK.

EXTRACCIÓN DEL DNA A PARTIR

DEL GEL

VECTOR DE CLONACIÓN.

DIGESTIÓN DE LOS GENES CON LAS

ENZIMAS

CIÓN DE E. coli.

I

- 1 RECUPERACIÓN DEL DNA

PLASMIDICOY DIGESTIÓN CON

ENZIMAS DE RESTRICC IÓN

CORREPONDIENTES.

Fig. 7. Diagrama de tlujo de la inetodología

8.2. MICKOOKGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVOS

Microorganisinns utilizados: Amj~colcrtopsis mrdilerrnnei M 18 (cepa parental),

Medio de cultivo para Amycoluropsis mctli/er/wnei. .Cletlio Benne/ ( Margalith y Pagaiii. 1061).

gil. Glucosa I O Extracto de carne 1 NZ -ainina A 2 Extracto de levadura 1 Se ajusta el pH a 7.0. Para SLI titiliziiciíiii como medio sólido se añade 20g/L dc agar bacteriológico

Medio semilla (Kluepfel y co1..1965) <g/l.) Glucosa 20 Harina de Soya 20 C a c o ? 2.5 MgS017Hz0 0.01 LiiS047 H20 0.05 C0Clz6 1420 0.003 p H 7.5 con NaOH 5N pH después de esterilizar 7.0

Medio TB (Maniatis y col., 1982): Mcdio utilizado para el crecimiento de E. coli. con el fin de obtener el ADN plasmídico.

Extracto de levadura 24 g Bacto-triptona 12 & ülicernl 4 Ill1

Se añadió agua destilada hasta 900 in1 y. después de esterilizar en autoclave, se aiiadieron 100 ml de una solución estéril de K H ~ P O J 170 mM y K2HP04 720 niM.

Medio LA: Medio de cultivo para E. c .d i . Back-triptona I O g NaC'I I O g Extracto de levadura S g Agar bacteriológico 20 g

8.3. AMORTIGUADORES Y REAC'TIVOS

I . Amortiguador de rotura I. EDT!Z 100 mM pl l 8.0. SDS al 1 % (pi\) y Tris-flCl 0.2 M. Se ajusta el p1-I a 8.2 con HCI.

2. Amortiguador de reacción lox para la Taq polimerasa: KCI 0.5 M y Tris-HCI O. 1 M pfl 8.3.

3. Mezcla de nucleótidos I: Mezcla dc diZrP. dC'I.1'. d W P y dT'I'I', en una concentraciim de 1 0niM cada uno de ellos.

4. Amortiguador de rotura I t : Se disuelven cn icnol equilibrado con TLE los siguientes compuestos: EDTA 4.5 mM, isotiocianato de giianidina 4 M, I.iC1 0.1 M, SDS al I% ( p h ) y Tris-HC1 0.2 M. El pH final es de 7.0 y se conserva a 4°C en un recipiente opaco.

Agarosa. Brnmuro de etidio. CIA: Se prepara mezclando 24 Fenol Neutro (preparación) volúmenes de cloroformo con tin Isopropanol. volumen de alcohol isoaniílico. TE.

Etanol al 70% (viv).

A partir del crecimiento de Aniycohlop.si.s rnedilerranei MI 8 en uti tubo inclinado con agar Bennet. se homogeneiza en .?nil, de solución salina al 0.9%. Con esta suspensión sc inoculan niatraces de 250mL con SOiiiL de medio líquido Bennet. Se incuba a 25°C y a 1 50 r.p.ni. y a las 96 se proseguirá a obtciier cl ADN. El inicelio obtcnido sc cosecha y l aw por centrifugaci6n a 4000 r.p.iii. durante 15 minutos con soluci6n salina (NaCI) al 0.9% u 4°C. Se obtiene el botón desechando el sobrenadante.

8.1. DETALLE D E LAS TÉCNICAS UTILIZADAS

t üiseño de primers.

El diseño de los primers se fundamentó en facilitar la clonación de los genes al vector. Para ello se observó la secuencia de cada gen y se prosiguió a diseñar el primer de acuerdo a los paráinetros siguientes: tamaño del primer: 17-30 nucleótidos; pares de G-C: más del 50%; buffer de reacción: la misma para las dos enzimas: temp. de reacción: la misma para las dos y que no sean compatibles entrc ellos.

Como resultado de lo anterior los sitios de restricción para cada gen fueron los siguientes: gen O r f - O los sitios de restricción fucron para las enzimas BamH I y EcoR I; Orf' 13 para EcoR I y Kpn I y Oyf I 6 para Xhtr I y RamH I; para el gen O r f 4 los sitios de restricción fueron para las enzimas EUJR I y Xhtr 1. finalmente para el gen Oyfj los sitios de resíricción fueron para las enzimas Ecoll I y K p I .

t Extracción del ADN

Método utilizado para extraer ADN adecuado para hibridación con sondas especificas o técnicas de reacción en cadena de la poliinerasa (PCR) (Fernández.1997)

Extracción de DNA total a pequeña escala en A. rneo'iterrrrnei

I . Inocular en un matraz de 250 1111 con 50 ml de medio Bennett con A. rnediterronei procedente de agar Bennett e incubar a 25°C 4 I50 r.p.m. en un agitador orbital durante 72 horas.

2. El medio resultante del crecimiento dc la bacteria se recogerá por centrifiigación (4000 r.p.m. por 15 minutos) con solución salina al 0.9%.

3. Congelar la muestra a -40°C

4. Liotilizar la muestra a 4 O " C y vacío de 25 Microns por toda la noche

5 . Machacar un gramo de biomasa liofilizada con ayuda de un mortero y se recoge parte del polvo obtenido en un tubo Eppendorf(sin que se superen los 0.5 ml de volumen por tubo). A continuación se añaden 0.5 in1 de amortiguador de rotura I ' , se homogeneiza la mezcla y se añaden 0.5 ml de fcnol y 0.5 in1 de CIA. Se mezcla bien, pero con suavidad, y se incuba a 50°C dui-ante 20 iuiniitos (a los diez minutos de incuhación debe mezclarse de nuevo).

6. Transcurrido este tiempo. se ceiiírifuga la iiiezcla a 14000 r.p.m. a temperatura ambiente y durante 5 minutos y se recupera la fase acuosa. La mezcla se desproteiniza mediante extracciones sucesivas con fenol-CIA por 5 minutos y 14000 r.p.m. hasta que

I6

se obtiene una interfase limpia (son necesarias 6 6 7 extracciones). A continuación sc hace una nueva extracción con un volumen de CIA y se precipita el ADN a 4°C durante 2-4 h con 0.7 volúmenes de isopropanol y un décimo de volumen de acetato de sodio. Se ceiitrifuga a 4°C y 14000 r.p.ni. durante 20 minutos; se desecha el sobrenadante y se lava el precipitado con lml de etmol al 70Yn (vív). Finalmente el precipitado se seca y se resuspende en 20 1-11 de TE o a g ~ i a

La cantidad de ADN obtenida es dc 30-50 pg. y permite realizar varios experimentos de hibridación. así como también varias reacciones de PCR.

Extracción de ADN plasmídico de E. coli.

El inétodn seguido para obiencr ,4DN plasmidico a peqtieíía escala fue tina modificación del descrito por Holmes y Quigley ( 1981) (citado en Fernández, j.. 1997)

I . En primer lugar se pica una colonia con un palillo estéril y se inocula en un Eppendnrf estéril con 1 in1 de medio TH al que se le añade el antibiótico adecuado para el mantenimiento del plásmido dentro de la bacteria. Se incuba el tubo a 37°C con agitación (250 r.p.m.) durante tin mínimo de 6 horas, con el fin de permitir el crecimiento de la bacteria. Este tiempo será mayor (al menos diez horas) cuando se usa cloranfenicol como marcador de seleccióii.

2. 'Tras este iiempo se recogen las cilulas mediante ceiitrifuugacióii a 5.000 r.p.ni. e11 un

rotor Sorvall GSA. durante 3 minutos. El precipitado obtenido se resuspende cn 350 kit-

de SlXT y se añaden 10 pi2 de una solución de lisozima preparada a una concentracióii de 1 O ing/ml en agua.

3. Se mezcla durante 60 segundos y se hierve durante 45 segundos. Las proteínas, restos celulares y el ADN crnniosóinico bacteriano se precipitan por centrifugación a 14.000 r.p.ni. durante 10 minutos y se eliiiiiiiaii con la ayuda de un palillo esléril. El AUN plasmídico se precipita tras añadir 40 pL tie acetato sódico 3M pkl 5.2 y 600 pL dc isopropanol, mezclar y mantener a teniperatiira ambiente durante I 5 minutos.

4. El ADY plasmídico se centrifuga 14.000 c.p.ni. durante 5 minutos y el precipitado se lava con etanol al 70% (v/v). Posteriormente se seca y se resuspende en 30 pL de TE o en agua.

5 . F1I ADN obtenido se trata con ARNasa ( a una coiicciitración final de 100 pgiiiiiJ. iiicubáiidose a 37°C durante 90 minutos.

6. Una vez transcurrido este tiempn se anade un volumen de fenol neutro, mezclándose bien y centrifugándose a temperatura ambiente y 14.000 r.p.m. durante 5 minutos.

7. Sc recoge la fase acuosa (superioi-) y se lioniogeneiza con un vnlumen de fenol-CIA. ceiitrifiigindose en las mismas condiciones ciladas en el paso antcrior. Se rcpite este

17

paso hasta obtener una fase limpin. Nornialniente para este procedimiento es suficiente una soia extracción.

8. Llegado a este paso se hace un último tratamiento con un volumen dc CIA y se precipita a una temperatura de --2O"C con 1/10 del volumen de acetato sódico 3 M p1-I 5.2 2.5 volúmenes de etanoi absoluto frío. Dos inicroiitroc de esta solución son suficientcs para llevar a cabo cada uno de los ensayos de digestión con endonucleasas de restricción necesarios para el análisis de i«s plásniidos recuperados.

Extracción del ADN amplificado a partir del gel de agarosa (Método QULAEX 11). I . Cortar la banda de ADN del gel de agrtrosa.

2. Pesar la banda de gel. Adicionar 3 \olúiiiencs de amortiguador QXl a I volumen de gel para fragnientos de ADN comprendidos cntre I O0 ph y 4 kpb.

3. Resuspender QUIAEX I1 con el vortex por 30 segundos. Adicionar 10 pL de QUIAEX 11 a la muestra.

4. Incubar a 50°C por 10 minutos para solubilizar la agarosa y separar el ADN. Mezclar con el vortex cada 2 minutos para resuspender el QUIAEX 11. Checar que el color dc la mezcla sea amarilla. Si no es así adicionar 10 ILL de acetato de sodio 3M.

5. CeiitriIugar la muestra por 30 segiiiidos y remover el sobrenadante

6. Lavar el precipitado con 500 pL de amortiguador QXI. Resuspendiendo bien con el vortex. Posteriormente centrifugar por 30 segundos a 14.000 r.p.m. y retirar el sobrenadantc.

7. I.avar el precipitado 2 veces con 500 111. dc amortiguador PE. Resuspendiendo CI precipitado con el vortex seguido de centrifugacióii por 30 segundos a 14.000 r.p.111.. Postcriormerite se retira el sobrenadante.

8. Secar el precipitado hasta que el botón se torne de color blando

O. Eludir el ADN con 20 pL de agua esíéril incubándose por 5 minutos a 50°C'. I'ostericmicnte cenírifugar a 14.000 r.p.iii. por 30 segundos.

I O. Recuperar la fase líquida con muclio cuidado con una pipeta y depositarla en un tubo F.ppendorf estéril.

I I . Nucvainente se elude la muestra restante del paso 9 con 15 pI- de agua estéril y se repite la incubación y la centrifugación.

1 I . Se recupera la fase acuosa del paso anterior y se adiciona con la muestra obtenida en el

I .3. Congelar la muestra a -.20"C para su LISO posíerior. paso 1 o.

I X

Clonación de los genes.

1. Se toniaron 20 pL de ADN de los genes amplificados extraídos del gel de agarosa y se depositaron en un tubo Eppendorf estéril

2. Se adicionaron 5 pL de cada uno de los amortiguadores para cada una de las dos ciiziiiias a utilizar.

-3. Sc adicionó agua hasta completar 50 111~ de solución total.

4. Se incubó a 37°C por 3 horas

Transformación de E. coli.

1. I'repíirar placas con medio LA inis aniibiótico.

2. Descongelar 100 pL células coinpcicntes a 4°C. 5 minutos.

3 . Colocar las células competentes a 4°C por 20 minutos

4. Agregar 1 0 pL de ADN ligado al vcctor

5. Colocar la muestra de las células competentes más la ligación en baño María a 42°C' por 45 scglindos.

6. I'reincubar la muestra en 500 pL dc 1-B sin antibiótico por 30 a 45 minutos a 37 Y' y 200 r.p.m.

7. Plaquear por extensión en superficie

8. Incubar a 30°C toda la noche ( I 8 11)

Reacción en cadena de la ADN polimerasa

Esta técnica es, conceptualmente. un método muy simple para la amplificación de ácidos iiucleicos. Se fundamenta en el proceso natural de la replicación del ADN. En esencia se parte de una molécula de "ADN blanco'' para amplificar una secuencia especifica contenida en ella, mediante la utilizaciOn de unos oligonucleGtidos o cebadores diseñados al efecto. Este proceso consiste en la rcpetición de tres pasos principales que a continuación se describen:

I . Desnaturalizacióii. Las dos cadcnas utilizadas como blanco son separadas mediantc iiicubación a una temperatura elevada de (92-96°C). Las hebras disociadas perinaiiecerán en esta forma en la solución hasta que la temperatura baje lo suficiente coni« para permitir la hibridación dc los cebadores o "primers".

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2. Hibridación de los cebadores. 1.0s ccbadores utilizados son un par de oligonucleótidos sintéticos capaces de unirse a secuciicias de ADN que limitan físicamente con la región quc sc pretende amplificar. Cada L i n o de ellos es una réplica de una de las dos cadenas del ADN y su diseño es tal que qucdan enfrentados por sus extremos 3'tras la unión a la molécula de "ADN blanco". La distancia entre ellos en el conjunto de ADN-cebadores determinará la longitud de la sccuciicia de ,4DN amplificada. La asociación de los cebadores a la cadena de "ADN blanco" se ve favorecida sobre la renaturalización de la dohlc cadena de ADN en el niomciito del descciiso de la temperatura por la mucho mayor concciitración de los oligoii~icle~itid«s. IDicho proceso se liará a 55°C.

3. Eiongación a partir de los cebadores. La elongación de los cebadores en el conjunto ADN-cebadores se logra a través dc la acción de una ADN polimerasa . la Taq AUN polimerasa de Thermus aquaficus u unii teniperatiira de 72°C ( Saiki y col., 1988).

Procedimiento experimental:

tubo dc hielo y agua: I . Se prepara en un tubo Eppeiidorf de 500 pI la siguiente mezcla de reacción, cn un

H2Od estéril 21.75 111. Tampón 1 Ox para la

5 pI. Taq polimerasa . Mezcla de nucleótidos 1' 8 1-11 Cehador 1 (20 pM) 2.5 p1

DNA molde (1 :200) 5 111

Polimerasa (5 Uípl) 0.25 111. Magnesio (3mM) 5111.

2

Cebador 2 (20 pM) 23pI

Anipli~laq'rM ADN

2. Sc introduce en un ciclador iiriiiico DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer).

3. A continuación se aplican 30 ciclos como el que se describe a continuación: I . Desnaturalizacióii: 94°C. 1 minuto. 11. Hibridación: 55"C, I iiiinuio. 111. Elongación: 7 2 T , 1 niinuio"

"Depende de la loiigiiud del,frugmentu a oii ipl i / ic~ir.

La temperatura a la que se realiza el paso de la hibridación de los cebadores y la duración del paso de la eloiigacióii. así como la adición de determinados compuestos químicos a la mezcla de reacción. son parámetros modificables en función de la especificidad de los cebadores y pcriniteii la ainplificacióii de inoléciilas de "ADN blanco" que no comparten una identidad del I OO%i con las secuencias de los cebadores.

incuhándose a 94°C. durante 10 minutos.

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S.S. S E L E C C I ~ N DE TRANSFORMANTES

L a selección de las bacterias translorinadas se hizo a través de dos marcadores de selecci6n. una a través del color y otra a travcs de la resistencia a ampicilina.

Cabe hacer mención que, el vectnr utilizado para la cloiiacióii y posteriormentc para la tnlnslorinación de E, coli fue cI pI~í,Ui~SC'I<lPT (KS). el cual tiene un tamaiio aproxiiiiado de 3 kpb, tiene un l'ragniento del gen IucZ (subunidad a) capaz de coinplciiientar la mutación presenta cn la 0-galactosidasa de algunas cepas de E. coli ( la denominada a-complementaciónj clue permite la selección de los transforinantes que se ha integrado el plásmido por la aparicibii de cnlor azul al incubarlos en presencia de IPTG (fuerte inductor del gen laca y de X-gal (responsable de la aparición del color al ser utilizado como sustrato por la @-galaciosidasa codificada por dicho gen). La inserción de till

fragmento de ADN dentro de la regií'ii dc inúltiple clona.je provoca la desaparición de la coloraciciii azul. es decir, las células recnnibiiiaiites no tendrán color (serán blancas) y csto permitirá la selección. Por otro lad«. el vectnr también posee un gen de resistencia a aiiipicilina (up , Ha), contiene el origen de replicación colEl para E. coli del plásmido pBR3 22.

I<

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Los oligonucleótidos fueron diseñados de acuerdo al gen a amplificar, adicionándoles un sitio de restricción para diferente endonucleasa: para el gen Orf U los sitios de restricción fueron para las enzimas RtrmH I y EcoR I; O r f l 3 para EcoR 1 y Kpn I >) Orf 16 para X'ha 1 y BumH I; para el gen O r f ' i los sitins de restricción fueron para las cnzimas EcoR I y Xhu 1: finalmente para el gen O r f j Ins sitios de restricción fueron para las enzitnas EcoR 1 y Kpn I. Una vez diseñados se mandaron hacer a la compañia GIB( 'O Biii. 'u.siom Pritners.

Por otro lado, se extrajo el ADN total de 11. ineditevranei, se comprobó su integridad a través de un corrimiento electroforCtico para usarlo en la amplificación de dichos genes por PCR. La amplificación se visualizó en una electroforesis en gel de agarosa al 0.8%. El corrimiento se muestra en la siguiente figlira (scilo para dos genes):

La figura muestra en el primer carril (de izquierda a derecha) el corrimiento electroforético de un marcador de tamaño (ADN del fago h digerido con Hind 111) los tamaños de las bandas son las siguientes: 23.130, 9.416, 6.557. 4.361, 2.322, 2.027. 564 y 125 pb. En el carril 2, se muestra el gen Orf 16 (la banda no corresponde al tamaño del gen). eii el carril 3 está el corrimiento electroforético de la amplificación por PCR del gen Orf O (tamaño correspondiente al del gen) y en el último carril se muestra el corrimiento de un marcador de tamaño (ADN del fago digerido cnn P.s/ I ) y los tamaños son los siguientes: 11.509. 5.080. 4.649. 4.505. 2.840, 2.577, 2.454. 2.443.

Fig 8. Se tnuestra el corriinieiiio 2.140, 1.980, 1.700, 805, 516. 467. 448, 339. 265,247 y 210 pb. electroforetico de la amplificacióii

por PCR de los genes Orf 0 y 0i.f 16.

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Una vez hecha la electroforesis de la muestra del gen digerido se extrajo la banda iiicdiante el uso de Quiaex. La figura del esquema que muestra la banda extraída es la figura 9. Cabe hacer mención que sólo se inuestrd la extracción de un solo gen. ya que con

similar. En esta gráfica se muestra la

extracción de la banda del gen Orf O en el carril 3 (de izquierda a derecha). Este gel cs el mismo del la figura 6, salvo con la banda extraída.

Fis. 7. Gel con la banda extraída del ceri OrfO.

Hasta el momento se ha logrado amplificar los genes OrfO. Oyf-l, OrfS y O r f ' l 6 . Con I « que respecta al gen Ovf13, se ha tenido pioblenias en este punto. ya que después de analizar el corrimiento electroforético se aprecian dos bandas y no corrcsponden al tarnaño del mismo. Dichas amplificaciones se lograron con la enzima Toq poi de la compañia BioSelec en una dilución del D N 4 inoldc de 1:5O ba.jo las siguientes condiciones: temperatura de desnaturalización 9 4 T , temperatura de hibridación 55°C y temperatura de elongación 74°C.

Después de amplificar los gencs se prosiguió a digerirlos con las endonucleasas correspondientes, para el gen Orf O con Ins enziiiias BumH I y EUJR I ; para el gen O y f 16 con las enzimas Xhu I y BumH I (figura 8): para el geii Orf? con las enzimas ECYJR 1 y Xhu I y finalmente el gen O f 5 con las eiizimiis EcoX 1 y Kpn I . El corrimiento electroforético se muestra a continuación:

,. * 1 -? o -

w

o 1

1227ob

Fig. I O . Se muestra el corrimiento electrofortitico de la digestión de los genes ainplificados. Carril I : inai-cador de tamaño (:::/Hind I l l ) , carril 2: inarcador de tamaño ( A I P s i I). carril 3: inarcador de iainaño (hIKpn I), carril 6: geii O r r 5: carril 7: gen Orf 4; carril 8: gen Orf O y carril I O : corriiiiiento del gen Orf I6 digerido coil las eiizitiiiis correspondientes (de izquierda a derecha).

Por otro lado, con respecto al vector de clonación se digirieron alícuotas por separado con las enzimas que correspondientes a los genes. El corrimiento electroforético se muestra en el gráfico 1 1.

La figura muesíra el corrimiento electroforético del vector digerido con diferentes enzimas para clonar los genes iiinpliiicados. En el carril 1 se muestra el inarcador de tamaño hiHind 111; carril 2: digestión con %a I y BamH I; carril 3 : Xba I y BamH I ; carril 4: Xbu I y EcoR I; carril 5: BnmH I y EcoR I; carril 6: EcoR I y Kpn I ; y carril 7: marcador de tamaño i,MP,Si 1 (de izquierda a derecha).

I:ig. I I . Corrimiento electroforético del vector digerido con diferentes eiiziinas (ver texto).

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Después de clonar los genes en el vector, se transformó E. coli y se seleccionaron las transformantes de acuerdo al método de selección mencionado en el apartado correspondiente.

Una vez obtenidas las transformantes, se prosiguió a obtener el ADN plasmídico y confirmar la clonación de los genes. Para la obtención del ADN plasmídico se hizo a través de minipreparaciones, que es una modificación para la obtención de ADN plasmídico a pequeña escala hecha por Holmes y Quigley (1981) (citado en Fernández, J., 1997). El corrimiento electroforético de las muestras de ADN plasmídico de cada una de las colonias se puede apreciar en la siguiente figura:

Fig. 12. Corrimiento electroforético del ADN plasmídico de las colonias transformadas obtenidas. De izquierda a derecha. Carril 1: marcador de tamaño (UHind 111); carril 2: marcador de tamaño (UPst I); carriles 3-13 muestras de las colonias transformadas con el gen Orf 16 (del 1 al 11 respectivamente); carriles 16-32 muestras de las colonias transformadas con el gen Orf O (del 1 al 17 respectivamente); carril 33: Vector digerido con EcoR 1 y r@n I; y carril 34 Marcador de tamaño ((UHindIII).

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10. DISCUCIONES.

Los resultados alcanzados confiriiiaii la presencia de secuencias ghicas que codifican pax nioiiooxigenasas. particularmente p450. ( ' o m p~iede apreciarse en la figura 6, las bandas corresponden al tamaño del gen más la secuencia de restricción adicionada. Como puede apreciarse. las bandas encontradas sólo fue una. esto indica que la hibridación del oligonueleótidos fue específica de la secuencia, esto confirma de alguna manera que, los primers utilizados fueron diseñados adecuadamente.

Posteriormente a la amplificación de cuatro de los cinco genes reportados (ligura I O ) . sc prosigiiiCi a la obtención de estas bandas. Conin piicdc apreciarse en la tigura 7, las bandas extraídas ;I

partir del gel si corresponden al tamaño de los genes correspondientes. ya que para ello se utili/ó dc igual manera que en las electroforesis rcalizadas, u n marcador de tamaño que permitiera manipular sól« la banda deseada, sin embargo, no en todas las bandas se obtuvo sólo el gen, esto se debe posiblemente a que al momento de cortar el gel. el bisturí pudo arrastrar gel con tamaños menores a la esperado conlo puede apreciarse en la figura que inucstra el corrimiento electroforético de la digesti6ii de los genes (fig. 1 O).

Por otro lado. la manipulación del wctor de clonación se visualiza en la figura 11. Una vez amplificado dicho vector en E. coli se extrajo el plásiiiido y se hizo la digestión. Dicha digestión sc IlevO a cabo en diferente solución de reacción. ya que se utilizaron diferentes enzimas para obtener extremos con diferentes cortes compatiblcs con los sitios de restricción adicionados a los genes. Para ello se hicieron 4 reacciones separadas. es decir en cada reacción se hizo una digestión con dos enzimas diferentes, ya que como se menciona en nialerial y métodos cada gen amplificado tuvo dos sitios de restricción diferentes presentes en el vector, esto de alguna forma evitó la recircularización del vector y sobrc todo facilitó la clonación de dichos genes. Después de la digestión del vector con las enzimas pertinentes se hizo una electroforesis para coinprobar dicha digestión. Esto se iiiuestra en la tigura I 1

Después de la manipulación del vector y la amplificación de sólo cuatro de los genes, sc prosiguió a la clonación y posteriormente a l a transformación de E. coli y obtener después de 24 horas el plásinido amplificado con el gen insertado. Esto puede apreciarse en la figura 12; las bandas indicar que sí se amplificó el plásmido con el inserto. ya que el tamaño del vector sin el inserto corresponde a 3000 pb aproximadamente y las bandas están por arriba de este tamaño indicando.

Por otro lado, la posible explicación de q ~ i e n« se haya podido amplificar el gen Orf 13 sea quc la cepa que se está utilizando para el experimento nn lo presente. Esto se confirmará en experimentos posteriores.

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Dcspués de la donación de los cinco genes que codifican para el citocroino p450, se tendrán sondas pard hacer estudios posteriores de expresión dc dichos genes. Ya que en estudios previos rcalizados por Mejia y col. (1997) se lit llegado 21 tina hipótesis que explique la posible acción del barbital. Dicha hipótesis contempla la inducciOn de tino o varios citocromos p450 por este coinp~ieiio quiiiiico y e permite la incorporación de oxigcno aímosférico a la molécula precursora de la rifainicina B conllevando a la formación casi exclusiva de este ultimo compuesto y sobre todo esto lmce que aumente la producción de dicho antibiótico, por ello, estos resultados son base para comprobar dicha hipótesis.

1 I . REFERENCIRS

*:* Alwiiie, J . C., Keinp: D. J. y Stark, G . I<. (1977). .Method for the detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. 1'. A M / . A ~ r d ,Sei. U S A . 74: 5350-5354.

*:* Anderson M.G.. Monyponny D. Rickards.1i.W. y Kothschild J.M.(1989). Biosynthetic origins of oxigen atoms in the ansamycin antibiotics rifamycin B, O and S. .J. ('hem. Soc.C'hem.('ommiin. 5:311-313.

*:* Becl~er A. M.. Herlt A. J.. Hilioii G.I... Kibhy .I. J . y Rickards R.W.(19X3). 3-Amino-5- hydroxibenzoic acid in antibiotic biosynthesis. VI. Directed biosynthesis studies with aiisamyciii antibiotics. .I .4ntiobiot 36 : 1323-1328.

*3 Black S. I). (1994). O n the domain structure of cytochrome p450 102(BM-3): Isolation and properties of a 45-kDa FADh'ADP domain. Biophys. Res. Comm. 203: 162-168.

*:* Clionicrynski. P. y Sacclii, N. (19X7). Single-step method of RNA isolation by acid gnanidinium thyocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochern. 162: 156-~ 1 SO.

*3 Deinaiii A. L. (1997). Healt, Bidugy uf'Achnomyceles. May 27-30. Ik i j in China.

*:* Fergusoii JI~I., Huang HT. y Davisson JW. (1957). Stimulation of streptomycin production by a series of sinthetic organic compounds. .1pp1. I.lrcr-obi«l. 5: 339.

*:* Feriiaiidez. Josl:. (1997). Caracterización de la expresión de los genes implicados en la biosintesis de penicilina: Reacción enzimática catalizada por el producto del último gcri (penDE) de la ruta de biosíntesis de penicilina. Tesis Doctoral. Universidad de i,etiii. Departamento de Ecología, Genética y Microbiología. España.

*:* Floss G y Yu T. W. (1999). Lessons from the rifamycin biosynthetic gen cluster. ('7irren/ Opinion in ('heniical Biology 3: 592-597.

*:* Gygax U.. Ghisalba O, Treichler 11. y UCiescli J . (1990). Study to the biosynthesis of thc rifamycin-chromophore in Nocnrdin mediterrnwi. ,I Anlihiolic. 43 : 324-326.

wealth and actinomycetes. Xlh In/cwnu/ionu/ LSympo.siurii o i l

*:* Hartmann. G.. Honkel, K., Knusei. I:.. y Nuesch. J. (1967). The specific inhibition of DNA directed RNA synthesis by rifamycin B. Biochern. Biophys. Aclu, 145: X43.

78

*:* Karlssori A,, Sartori G. y White R. .l. 1974. Rifamycin biosynthesis: further studies on origin of the ansa chain and chromophore. Erci-../. Rioc/wwi. 47:25 1-256.

e:* [.al. R.. M.Khana. Hardeep Kaur, N.Srivaíaw. Tripathi y LA S.( 1995). Kifamycins:Strain improvement Program. C?rific. Rev. ik'icrohioí. 21 : 19-30.

*:* 1,aiiciiii G, y Grand M. (1981). Biosynthesis of ansamycins. Antibiotic. Vo1.4. Biosynthesis. Corcoraii. J.W. Ed., Springer-Verlag. Berlin. E'.R.<i. pp.12-40.

*:* Margalitli P. y Pagani H. (1961). Rifaniycin: XIV. Production of rifamycin B. A~/ni>l.X/ic.,.r,hiiJ/. 9; -3 2-.i .> 2. - 111

*:* Me.jía-A.. Barrios,J. y Viniegra, G. (1997). Overproduction of Rifamycin B by Amycolntopsis mediterranei and its Relationship with the Toxic Effect of Barbital on Growth.. .J. Anlihiofic. 51 : 58-64.

*:* (I'Keefe DP. y Harder PA. (1991). Ocurrence and biological function of cytochrome p450 monooxygenases in the actinomycetes. Mo/. .\-/ii.r,ohio/. 5: 2099-21 05.

*:* Iiodríguer AM, Olano C, Méndez C, I-lutcliinson CR y Salas JA. (1995). A cytochrome p450-like gene possibly involved in oleandomycin biosynthesis by Streptomyces antibioticus. FEMS Microhiol. Lett. 127 : 117-120.

*:* Saiki. R. K.. Gelfand, D. H., Stoffel. S.. Scliarí'. S. J.. Higuchi, R.. IHorn. G ' I . . Mullis. I<. B. ! Erlicli. I I . A. (1 988). Primer-diercted enzimatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487--391

*:e Stassi D.. Donaldo S., Staver MJ. y Katr L. (1993). Identification of a Sacchnropolysporcr rrythraecr gene required for the final hydroxylation step in erythromycin biosynthesis. .I Btrcrerid. 175 : 182-189.

+:* Semi P., Ballotta R., Greco A. M. y Gal lo G. G. (1961). Ryfamycin, XV-Activation of rifamycin B and rifamycin O. Production and properties of rifamycin SV. Fuvmuco .U<,. .Sei. 14: 146.147.

*:* Tliomas. 1'. S. (1980). Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. P. Nut/. Acad, Sci. U.S.,-l. .77: 5202-5205.

*E* Weiweii L.y Ruishen J. (1996). Purification and characterization of methylmalonyl-Coi\ mutase and methylmalonyl-COA racemase from a rifamycin SV-producing Amyco/ntopsis mediterrnnei U32. Weishongwu Xzrehoo 36: 199-207.

*:* Wliite RJ.. Maiiiiielli E., Gallo GG. aiid Lancini G. (1973a). Rifamycin biosynthesis studied with I3C enriched precursors and carbon magnetic resonance. Nulure 234: 273-277.

*:* Wliitc RJ.. Martinelli E. and Lanciiii Ci. ii973b). Ansamycin biosynthesis: Studies on a novel rifamycin isolated from a mutant strain of Nocnrdin mediterranei. Proc. ,Vu/. Actid. Sci. OK4 71 : 3260.3764.

*:* Wliik Itl.. Martineiii E. (1974). Ansamycin biogenesis: Incorporation of el-I3C i glucose and eI-I3C i glycerate into the chromophore of rifamycin S. FE5SLeil. 49: 233-236.

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