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CCOONNSSEERRVVAACCIIÓÓNN DDEE EESSPPEECCIIEESS PPEERRUUAANNAASS DDEE

OORRQQUUÍÍDDEEAASS UUTTIILLIIZZAANNDDOO TTÉÉCCNNIICCAASS DDEE

CCUULLTTIIVVOO DDEE TTEEJJIIDDOOSS IINN VVIITTRROO

Tesis para optar el Título de

BIÓLOGO

MARCO A. LEÓN MARTÍNEZ

LIMA - PERÚ

1995

“NULLIUS ADICTUS JURARE

IN VERBA MAGISTRI”

HORACIO

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Antonietta O. Gutiérrez Rosati, Jefa del Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Vegetales - Genética de la UNALM por haberme dado la oportunidad de trabajar en este

Laboratorio. Su trabajo y esfuerzo han sido siempre motivación y ejemplo para nosotros.

A los profesores: MSc. Blgo. Raúl Salinas Mondragón por su continuo estímulo y sus

sugerencias, que hicieron posible la culminación de este trabajo; Blga. Rosa Espejo por su

ayuda constante y sus consejos, y al Blgo. Juan Juscamaita.

A Reynaldo Alvarez Grillo por su ayuda en parte de la redacción y en la edición de este

trabajo, por sus sugerencias y el cuidado de las plantas en vivero e in vitro durante mis salidas

al campo; a Wenceslao Jorge V., con quien iniciamos los primeros trabajos de germinación de

semillas; a Carlos Canchaya S., Roberto Yoshida T, Ángel Borda S. y Ulises Luya E.; a todos

ellos agradezco su comprensión, paciencia y tolerancia en mis errores.

Un muy profundo y sincero agradecimiento al Blgo. Benjamín Collantes Meza por su

invalorable ayuda al encargarse de la parte fotográfica de este trabajo, por su amistad y

continua ayuda.

Al Centro de Investigación en Recursos Genéticos y Biotecnología Vegetal (CIRGEBV)

por financiar la edición y parte de la publicación de este trabajo.

A la Asociación Peruana de Orquideología (APOR) por financiar parte de la publicación

de este trabajo.

A los cultivadores de orquídeas que me proporcionaron material vegetal : Los Ings.

Manuel Morán y Carlos Bohórquez; a mis amigos Don José Macedo, Román Ramírez y

Manuel Camacho de Tarapoto, y a Angel Seminario de Ayabaca quienes me ayudaron en las

recolecciones de material vegetal y la toma de datos de colección en el campo.

A Cecilia Flores por su ayuda en las correcciones de este trabajo.

A todas las personas que hicieron posible la realización de este trabajo: A Moisés

Cavero; al Blgo. Ricardo Fernández por proporcionarme mucha de la información que poseo en

el tema; al Ing. Percy Rojas; al Ing. David Bennet por sus valiosos consejos; a Marilú Hoyos y

Teresa Dolorier por su constante amistad y apoyo.

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS

CCOONNSSEERRVVAACCIIÓÓNN DDEE EESSPPEECCIIEESS PPEERRUUAANNAASS DDEE OORRQQUUÍÍDDEEAASS

UUTTIILLIIZZAANNDDOO TTÉÉCCNNIICCAASS DDEE CCUULLTTIIVVOO DDEE TTEEJJIIDDOOSS IINN VVIITTRROO

TTeessiiss pprreesseennttaaddaa ppoorr::

MARCO A. LEÓN MARTÍNEZ

Para optar el Título de:

BIÓLOGO

Sustentada y aprobada ante el siguiente jurado:

__________________________ Blgo. Aldo Ceroni Stuva

PRESIDENTE

_____________________________ __________________________ M.Sc. Abelardo Calderón R. M.Sc. Raúl Salinas M.

MIEMBRO MIEMBRO

_____________________________ Dra. Antonietta Gutiérrez R.

PATROCINADORA

ÍNDICE GENERAL Pag.

ÍNDICE DE FIGURAS

ÍNDICE DE CUADROS

ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS

ABREVIATURAS UTILIZADAS

I. INTRODUCCIÓN 1

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 7

2.1 Aspectos Históricos

2.1.1 La Germinación Simbiótica De Semillas De Orquídeas 7

2.1.2 El Cultivo De Meristemas De Orquídeas 8

2.2 La Semilla 9

2.2.1 Germinación 10

2.2.2 Viabilidad De Semillas 11

2.2.3 Pruebas De Viabilidad De Semillas 12

2.3 Tipos De Propagación In Vitro 14

2.3.1 Propagación Por Semillas 14

a. Por Semilla Proveniente De Cápsula Dehiscente. 14

b. Por Semilla Proveniente De Cápsula No

Dehiscente (Cápsula Verde) 14

2.3.2 Propagación Vegetativa o Clonal 15

2.4 Condiciones De Cultivo 16

2.5 Sustancias Orgánicas Complejas Usadas en La Germinación

Asimbiótica De Semillas De Orquídeas 17

2.6 Soluciones Amortiguadoras o Buffer 18

2.7 Carbón Activado 19

III. MATERIALES Y MÉTODOS 21

3.1 Materiales 21

3.1.1 Material Vegetal 21

3.1.2 Reactivos y otros 21

3.1.3 Tinglado 22

3.1.4 Condiciones De Cultivo 23

3.1.5 Lugar de ejecución 23

3.2 Métodos 23

3.2.1 Propagación Por Semillas 23

a. Siembra De Semillas Provenientes De

Cápsula Dehiscente 24

b. Siembra De Semillas Provenientes De Cápsula No

Dehiscente (Cápsula Verde) 24

3.2.2 Propagación Por Yemas de Brote Vegetativo 32

3.2.3 Replante 45

3.2.4 Aclimatación 46

a. Preparación Del Sustrato 46

b. Preparación De Las Plántulas 46

c. Siembra 46

3.2.5 Diseños Estadísticos 48

a. Propagación Por Semillas 48

b. Propagación Por Yemas de Brote Vegetativo 48

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 49

4.1 Propagación Por Semillas 49

4.1.1 Siembra De Semillas Provenientes de cápsula

dehiscente 49

4.1.2 Siembra De Semillas Provenientes de cápsula no

Dehiscente (Cápsula Verde) 51

4.2 Propagación Por Yemas de Brote Vegetativo 54

4.3 Replantes 59

4.4 Aclimatación 61

V. CONCLUSIONES 63

VI. RECOMENDACIONES 64

VII. RESUMEN 65

VIII. BIBLIOGRAFÍA 68

IX. APÉNDICE 73

ÍNDICE DE FIGURAS

Nº Titulo Pag.

1. Semilla De Orquídea y Sus Partes. 9

2. Partes Del Protocormo. 10

3. Cortes A La Cápsula No Dehiscente y Siembra. 32

4. Corte Del Brote Vegetativo En Cattleya. 34

5. Cortes De La Yema. 38

6. Plántulas En Aclimatación. 47

7. Cámara De Aclimatación Con Macetas Comunitarias. 48

8. Siembra De La Yema Aislada. 55

INDICE DE CUADROS

Nº Titulo Pag.

1. Prueba De Viabilidad De Semillas De Orquídeas. 13

2. Preparación Del Buffer Fosfato . 18

3. Medios De Cultivo Utilizados En La Germinación De Semillas

De Orquídeas. 30

4. Tiempos De Cosecha De Cápsula Verde Para La Siembra De

Semillas De Orquídeas. 31

5. Medio Murashige & Skoog Modificado Para El Cultivo De

Yemas De Cattleya. 44

6. Medios De Cultivo Para El Replante De Protocormos y Plántulas

De Orquídeas. 45

7. Cuadro De Análisis De Variancia De la Germinación De Semillas

Provenientes De Cápsula Dehiscente. 50

8. Cuadro De Análisis De Variancia De La Germinación De Semillas

Provenientes De Cápsula No Dehiscente (Cápsula Verde). 52

9. Cuadro De Análisis De Variancia Para La Siembra De Yemas De

Cattleya rex y Cattleya maxima. 58

10. Respuesta De Las Plantulas y Protocormos a Los

Medios De Replante. 59

11. Influencia De Los Medios De Cultivo En El Crecimiento y

Desarrollo De Protocormos y Plántulas. 60

INDICE DE FOTOGRAFÍAS

Foto Nro. Título Pag.

1. Flor de Cattleya rex O’brien. 3

2. Flor de Cattleya maxima Lindley. var. semi-alba. 4

3. Flor de Cattleya maxima Lindley. 5

4. Flor de Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem 6

5. Esterilización de semillas. 25

6. Enjuague de las semillas. 26

7. Sobre exponiendo las semillas de orquídeas para su siembra. 27

8 Extracción y siembra de las semillas en el medio de cultivo. 28

9 Dispersión de las semillas en el medio de cultivo. 29

10 Corte del brote vegetativo de Cattleya maxima Lindley. 33

11 Materiales para la siembra aséptica de yemas de orquídeas. 35

12 Proceso de esterilización del Brote (1a esterilización). 36

13 Brote sin hojas envolventes. 37

14 Brote durante la 2a esterilización. 39

15 Brote luego de la 2a esterilización mostrando 3 yemas. 40

16 Vista Frontal de una Yema sin hojas envolventes. 41

17 Vista lateral de una yema sin hojas envolventes 42

18 Siembra de las yemas en el medio de cultivo líquido. 43

19. Germinación de semillas de Cattleya maxima Lindley 55

20. Protocormos formados a partir de una yema. 56

1

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I. INTRODUCCIÓN.

Los bosques tropicales de nuestro país sufren un progresivo proceso de degradación

como consecuencia de la extracción maderera, la agricultura migratoria y, últimamente, debido al

incremento en las áreas de cultivo de Coca. La deforestación causa una considerable pérdida de

germoplasma, patrimonio de incalculable valor científico, ya que muchas especies vegetales son

aún desconocidas para la botánica (Cavero, et. al. 1991).

La gran mayoría de especies de orquídeas que se comercializan en nuestro país son

producto de recolecciones ilegales e indiscriminadas en estos bosques tropicales.

Consecuentemente la tala del bosque, junto a la recolección no controlada con fines comerciales,

vienen produciendo una rápida disminución de las poblaciones naturales de orquídeas, algunas

de las cuales se encuentran en peligro de desaparecer. Es el caso de Cattleya rex O’brien en el

departamento de San Martín. Cientos de plantas de esta especie recolectadas anualmente son

enviadas a Lima, para ser exportadas, o donde generalmente mueren (León, 1993). Las

poblaciones de Cattleya maxima Lindley en Ayabaca (Dpto. de Piura), uno de los lugares más

importantes de recolección de esta especie, están retrocediendo año a año, y las poblaciones de

Huancabamba han sido diezmadas por la actividad de un solo conocido colector. Se ha registrado

que más de 4000 plantas de Cattleya maxima Lindley son recolectadas anualmente en Ayabaca.

Lo mismo ocurre con otras especies de los géneros Masdevallia, Phragmipedium, Mormodes,

Catasetum, Oncidium, Odontoglossum y muchos otros en diferentes lugares del país.

Nuestras especies nativas de orquídeas, amenazadas o en peligro de desaparecer,

pueden protegerse utilizando las técnicas de propagación masiva in vitro siempre y cuando se

asegure su reproducción en cantidades adecuadas (Ospina, 1968). Las plantas propagadas

podrían distribuirse a viveros comerciales, lo que produciría una disminución de la extracción

2

ilegal en sus hábitats naturales; asimismo, podrían ser reintroducidas a los hábitats en los que ha

desaparecido completamente.

Un adecuado programa de propagación permitiría obtener un beneficio económico que

luego podría ser utilizado para la propagación y cultivo de otras especies en peligro. Por otra

parte, permitiría mantener las reservas adecuadas y realizar una continua selección dentro de

cada especie, lo que las haría más valiosas para fines floriculturales (Ospina, 1968).

Desafortunadamente actualmente en nuestro país no se vienen desarrollando programas

de propagación masiva de orquídeas aplicando las técnicas de cultivo in vitro, aún en los viveros

dedicados al cultivo y exportación de las mismas.

En el presente trabajo se estudia la estandarización de las técnicas de propagación in

vitro en tres especies epífitas peruanas de orquídeas: Cattleya maxima Lindley, Cattleya rex O’brien

y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem (fotografías Nro. 1, 2, 3 y 4), teniendo como

objetivo brindar un método alternativo para la conservación de estas especies y proyectar su

utilización a otras especies peruanas de orquídeas amenazadas o en peligro de desaparecer.

3

FOTO Nro. 1: Flor de Cattleya rex O’brien.

4

FOTO Nro. 2: Flor de Cattleya maxima Lindley var. semi-alba.

5

FOTO Nro. 3: Flor de Cattleya maxima Lindley.

6

FOTO Nro. 4: Flor de Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem.

7

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. ASPECTOS HISTÓRICOS

2.1.1 LA GERMINACIÓN SIMBIÓTICA DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS

Los primeros intentos de germinación de semillas de orquídeas fueron realizados en

Europa por Moore (1849) al sembrarlas en compost o sustratos que habían sido utilizados para

cultivar plantas adultas, práctica que fue adoptada por los cultivadores comerciales de su

época (Arditti, 1984).

Posteriormente Noel Bernard realizó una serie de experimentos que le permitieron

explicar el rol del hongo micorrítico en la germinación de semillas de orquídeas (Bernard,

1909), demostrando la importancia de esta asociación simbiótica y germinando exitosamente

distintas especies e híbridos de orquídeas terrestres y epífitas. Otros investigadores (Hans

Burgeff; Doroty Downie y John Curtis) continuaron su trabajo (Arditti, 1990).

Las investigaciones de Bernard y Burgeff sugirieron a Lewis Knudson que la

germinación de las semillas de las orquídeas puede obtenerse mediante el uso de ciertos

azúcares, es decir que podían germinar sin la necesidad de su asociación con el hongo

micorrítico siempre que se asegurara que el embrión recibiera los nutrientes indispensables

para su desarrollo. Por ello entre 1918 y 1957 realizó un conjunto de experimentos que le

permitieron desarrollar una metodología para la germinación asimbiótica de semillas de

orquídeas (Knudson, 1921, 1922, 1924, 1925, 1927, 1946) .

Por varias razones este descubrimiento fue uno de los más importantes eventos para

la ciencia de las orquídeas hasta nuestros días. Las tasas de germinación se incrementaron

exponencialmente y se volvieron más predecibles; en consecuencia la cantidad de híbridos y

plantas de orquídeas en circulación aumento súbitamente, disminuyendo los precios y

reduciéndose la importación de plantas de los trópicos. Finalmente, esta metodología es el más

8

práctico procedimiento para la preservación de cultivares deseables y de especies de

orquídeas en peligro de extinción (Pridgeon, A., 1990)

2.1.2 EL CULTIVO DE MERISTEMAS DE ORQUÍDEAS

En 1946 Ball publica el primer trabajo de propagación de ápices vegetativos

(“meristemas”) en Lupinus y Tropaeolum, estableciendo que pueden usarse estos ápices

vegetativos para regenerar plantas, lo cual dio inicio a la actual técnica de propagación

vegetativa o micropropagación in vitro.

El primer trabajo exitoso de propagación vegetativa in vitro de orquídeas lo llevo a cabo

Gavino Rotor (Rotor, 1949), quien cultivó secciones de varas florales de Phalaenopsis hasta

obtener nuevas plantas. Posteriormente Thomale en 1957 (Arditti, 1993) obtuvo plántulas

usando como explantes secciones de tubérculo de Orchis maculata que contenían yemas,

describiendo el potencial del cultivo de tejidos como un medio de propagación clonal rápida de

orquídeas.

George Morel (1960) aplicó la técnica de cultivo de meristemas originalmente utilizada

para eliminar virus en ciertos cultivos de papa y Dahlia, para la eliminación de virus en

importantes cultivares e híbridos de orquídeas del genero Cymbidium. Posteriormente se

observó que esta técnica permitía a su vez la propagación masiva y rápida de estas plantas y

que podía ser aplicada con éxito a otras especies (Wimber, 1963; Morel, 1964).

Luego de su publicación, los trabajos de Morel fueron rápidamente acogidos por los

viveros dedicados al comercio y cultivo de orquídeas en América y Europa, pudiendo así

realizarse la propagación en gran escala, difundiéndose el cultivo de las orquídeas. Ello

condujo a la disminución del precio de híbridos originalmente caros y a la aparición de la

industria del cultivo de orquídeas para flor cortada.

9

2.2 LA SEMILLA

La semilla de las orquídeas es muy pequeña, entre 0.4 y 1.25 mm de longitud, consiste

de un embrión indiferenciado suspendido dentro de una estructura reticulada (la testa) y

rodeado de un gran volumen de aire, lo que le permite flotar por periodos largos (Fig. 1).

Algunas especies pueden producir 1300 semillas por cápsula, mientras que otras pueden

producir hasta 4 millones (Arditti, 1992).

Las semillas carecen de endosperma y de cotiledón, salvo algunas excepciones en las

que este último es rudimentario.

El embrión esta formado por células relativamente indiferenciadas con abundantes

cuerpos lipídicos y de proteínas que constituyen su única fuente de reservas. Existe una ligera

diferenciación de las células en el embrión: las células apicales, de la región meristemática,

son más pequeñas y densas, las basales son más grandes y vacuoladas (Harrison, 1977).

TESTA EMBRION SUSPENSO

FIG. 1

SEMILLA DE ORQUIDEA Y SUS

10

2.2.1 GERMINACIÓN

Durante la germinación el pequeño embrión se hincha, rompiendo eventualmente la

testa; luego se agranda para formar una estructura en forma de cono denominada protocormo

(Fig. 2). Bajo condiciones naturales el embrión permanece en este estado, consumiendo sus

reservas lipídicas, hasta ser infectado por el hongo micorrítico apropiado (Burgeff, 1932, citado

por Arditti, 1990). Después de la infección aparecen las primeras hojas en el ápice del

protocormo y luego aparecen las raíces.

RIZOIDE

SUSPENSOR

HOJAS

PARTES DEL

Fig.2

11

Cuando se cultivan asépticamente (in vitro) las semillas pasan por los mismos

estadíos, pero necesitan de una adecuada fuente externa de carbohidratos para que puedan

continuar su desarrollo pues las reservas que poseen no son suficientes (Harrison and Arditti,

1978). La incapacidad de la semilla para utilizar sus reservas lipídicas y convertirlas en

carbohidratos explica por que requiere de esta provisión exógena de carbohidratos durante la

germinación.

Varios cambios citologicos y fisiológicos ocurren durante la germinación de la semilla,

las células basales del embrión se hinchan, el numero de mitocondrias aumenta, los plastidios

se diferencian y los cuerpos de proteínas se vuelven menos densos. Hasta aproximadamente

20 días luego de la siembra el protocormo necesita de una fuente exógena de energía, sólo

posteriormente es capaz de realizar fotosíntesis y es propiamente autotrófica

2.2.2 VIABILIDAD DE SEMILLAS

La longevidad de las semillas de orquídeas depende de las condiciones de

almacenamiento de las mismas. Muchas pierden rápidamente su viabilidad si se mantienen a

temperatura ambiente (20-24°C). La viabilidad puede mantenerse por más tiempo si las

semillas se guardan con un desecante apropiado (cloruro de calcio o silicagel) y a bajas

temperaturas (0-10°C) (Arditti, 1979).

Una alternativa para la conservación de germoplasma de orquídeas ha sido el

almacenamiento de las semillas a temperaturas bajo cero, entre -40 y -10ºC,(Kopowitz, 1994).

La posibilidad de congelar y descongelar semillas de orquídeas sin que estas pierdan su

viabilidad ha sido repetidamente demostrada con muchas orquídeas, casi todos los estudios

demostraron que las semillas podían germinar luego del almacenamiento a temperaturas bajo

cero. Bowling and Thompson (1972) reportaron que se mantenía la viabilidad de semillas de 30

diferentes especies tropicales de orquídeas luego de un proceso de congelamiento a -10 ºC y

del subsecuente descongelamiento.

12

Existen varias posibles explicaciones a la perdida de viabilidad de semillas

almacenadas. El debilitamiento y la fractura de las membranas celulares del embrión ante un

muy rápido descongelamiento, para el caso de la preservación a bajas temperaturas; la

inadecuada deshidratación o la rehidratación durante el almacenamiento a consecuencia de la

ruptura de los sellos herméticos, la variación de la temperatura de congelamiento o el

congelamiento y descongelamiento continuos.

2.2.3 PRUEBAS DE VIABILIDAD DE SEMILLAS

George Lakon desarrolló una metodología para probar la viabilidad de semillas de

cereales como el trigo, el maíz y la cebada. Esta se fundamenta en la reducción del cloruro de

2,3,5-trifenil tetrazolium incoloro, a formazan de color rojo no difusible en las células vivas. La

coloración de una célula con el tetrazolium es una indicación definitiva de su viabilidad, pues

las células necróticas permanecen incoloras (Lakon, 1949).

Este procedimiento fue aplicado a orquídeas con buenos resultados (Singh, 1981). La

prueba consiste en la inmersión de las semillas en una solución de este reactivo al 1% por un

periodo que varia entre 24 a 72 horas dependiendo de la especie, cuidando de mantenerlas en

un frasco herméticamente cerrado y en completa oscuridad (Cuadro Nro. 1). La ventaja del

método de Lakon para probar la viabilidad de semillas de orquídeas radica en la rapidez y

facilidad con que se pueden realizar las pruebas (solamente se necesita un microscopio para el

conteo), no es el caso del método en el cual se emplea el acetato de fluoresceina, que requiere

de iluminación de las semillas con luz ultra-violeta y el uso de lentes protectores apropiados

(ARDITTI, 1993).

13

Cuadro Nro. 1

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA VIABILIDAD DE LAS SEMILLAS DE ORQUÍDEAS

1. Se prepara una solución acuosa de cloruro de 2,3,5-Trifenil-tetrazolium (TTZ) al

1%. Este reactivo es sensible a la luz, por ello al ser manipulado debe evitarse su

exposición a la luz directa o a luz difusa prolongada. Conservada en oscuridad

puede mantenerse activa por varios meses y para reaccionar adecuadamente

debe tener un pH de 6 a 7.

2. Se toma una muestra de las semillas asegurándose de que sea representativa y

se ubica en un frasco pequeño, de preferencia oscuro y de cierre hermético, al

que se le agrega previamente la solución de TTZ. Debe cuidarse que las semillas

se mantengan sumergidas en la solución, evitándose su prolongado contacto con

el aire. Con una fuerte agitación nos aseguramos que las semillas estén

completamente humedecidas. Se guarda el frasco en oscuridad por 24 a 72 horas

(el tiempo depende de la especie con la que se esta trabajando). Luego se extrae

con un gotero una muestra de semilla, se la ubica en una placa porta objeto, se

agrega una o dos gotas del colorante verde de malaquita y se procede al conteo.

Las semillas viables son aquellas cuyos embriones se tiñen de color rojo, lo que

es fácil de observar debido al efecto contrastante del colorante verde de

malaquita.

3. El crecimiento de bacterias en el frasco puede alterar los resultados al momento

del conteo pues también se colorean de rojo. Para evitar esto se transfieren las

semillas a una solución de cloruro mercúrico al 0.1%, pudiendo leerse la prueba

un tiempo después sin ningún problema.

14

2.3 TIPOS DE PROPAGACIÓN IN VITRO

Las técnicas de propagación in vitro de orquídeas pueden ser de dos tipos:

2.3.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLAS

a. Por Semilla Proveniente De Cápsula Dehiscente.

Se utilizan semillas de cápsulas dehiscentes. Las semillas son esterilizadas

con una solución de Hipoclorito de calcio o Hipoclorito de sodio (lejía comercial) en

concentraciones que varían entre 0,5 a 10 %, por 10-30 minutos, tiempo que depende del tipo

de semillas que se esta usando. Para favorecer la esterilización de las semillas es conveniente

usar un agente que rompa la tensión superficial de la solución esterilizante (Tween-20), este es

un agente que permite el mejor contacto del esterilizante con la semilla. Se utiliza Tween-20 a

razón de 2 gotas por cada 100 ml, pero este puede también ser reemplazado por detergente

líquido casero. Las soluciones de Hipoclorito de calcio o de sodio son los esterilizantes más

usados, aunque puede emplearse también peróxido de hidrogeno al 3% por 30 minutos (Snow,

1985).

Luego de la esterilización las semillas son enjuagadas tres veces en agua destilada

estéril, para posteriormente ser sembradas en los medios de cultivo.

b. Por Semilla Proveniente De Cápsula No Dehiscente (Cápsula Verde)

En este caso se siembran semillas provenientes de cápsulas no dehiscentes.

La cápsula es separada de la planta madre, se eliminan las partes que no serán necesarias o

que pueden ser una fuente de contaminación (restos de pétalos y de columna), se enjuaga con

agua y detergente y se sumerge por unos segundos en alcohol etílico al 75%. Luego se

esteriliza sumergiéndola en una solución de Hipoclorito de calcio al 2 o al 4% por 20 minutos.

15

La siembra se realiza directamente sin necesidad de enjuague. Para abrir la cápsula se

hacen dos cortes longitudinales a lo largo de la sutura de dehiscencia y dos cortes

transversales, se retira el pedazo de cápsula seccionado y se procede a la siembra (Fig. 3).

2.3.2 PROPAGACIÓN VEGETATIVA O CLONAL

Se han desarrollado distintos métodos de propagación por meristemas dependiendo

del tipo de explante y la especie a propagar (Arditti, 1977,1993).

En la propagación por meristemas de yemas de brotes vegetativos se utilizan como

fuente de explante brotes vegetativos en crecimiento, los cuales son esterilizados en

Hipoclorito de calcio o de sodio al 4% por 20-30 minutos. Luego se enjuagan en agua destilada

estéril y se procede al aislamiento y siembra de los meristemas o de las yemas.

Otro tipo de propagación vegetativa se lleva acabo utilizando las yemas de los brotes

de vara floral, esta técnica a sido aplicada con éxito en Cymbidium y Phalaenopsis (Intuwong et.

al., 1972). Consiste en el corte de los nudos que contienen yemas dormantes, su esterilización,

enjuague y siembra en medios de cultivo con hormonas que inducen la formación de nuevas

plántulas a partir de esas yemas.

Se han usado también ápices foliares jóvenes de plántulas cultivadas in vitro para la

obtención de protocormos en Cattleya con éxito solo en el caso de utilizar como explante hojas

muy jóvenes (Churchill, et. al., 1971) Los trabajos de propagación de orquídeas usando ápices

radiculares, inicialmente exitosos en la propagación de especies de poco valor comercial se

han ampliado incluyendo otras especies como Cattleya y Phalaenopsis, abriendo la posibilidad

de propagar especies horticulturalmente importantes sin afectar los órganos vegetativos de las

mismas.

16

2.4 CONDICIONES DE CULTIVO

Existe una gran diversidad de condiciones y de medios usados en el cultivo in vitro de

orquídeas. El estado del medio de cultivo (liquido o sólido) depende de la especie con la que se

este trabajando y debe ser determinado empíricamente. Generalmente la proliferación es

mayor y más rápida en medio liquido y la diferenciación se ve favorecida en substratos o

soportes sólidos.

Aun cuando es recomendable la agitación del medio liquido, se han obtenido éxitos con

cultivos estacionarios (Kako, 1973; citado por Arditti, 1993) y con medios líquidos agitados solo

ocasionalmente (Arditti, 1993). Las tasas de agitación rotatoria recomendadas varían desde

0.25 r.p.m. (Jasper, 1966) hasta 200 r.p.m. (Scully, 1966). las condiciones apropiadas deben

ser determinadas experimentalmente. La agitación del medio de cultivo favorece la

proliferación de protocormos debido a la eliminación de la polaridad, retardo o prevención del

desarrollo de raíces y brotes (Scully, 1967; Wimber, 1963,1965), mejor aireación y dilución

rápida de metabolitos tóxicos (Arditti, 1993).

Las intensidades de luz usadas tanto para cultivo de semillas como para cultivo de

meristemas o yemas van desde la oscuridad hasta los 3000 lux, generalmente obtenidos con

fluorescentes y algunas veces complementados con lamparas incandescentes. Los

fotoperiodos más adecuados para la mayoría de especies tropicales son aquellos de 12-18

horas luz. En general los fotoperiodos adecuados para germinación de semillas y cultivo de

plántulas son también adecuados para el cultivo de meristemas (Arditti, 1993).

Tanto para el cultivo de meristemas como para el cultivo de semillas el rango de pH

más adecuado para el cultivo in vitro de orquídeas es de 4.8 a 5.5. Cuando el pH del medio de

cultivo es muy ácido antes del autoclavado, puede ocurrir la hidrólisis de algunos componentes

del medio, lo que puede resultar en la formación de soluciones semisólidas y la producción de

algunos compuestos tóxicos para el explante (Arditti, 1993).

17

Las temperaturas apropiadas para el cultivo varían desde 24 a 26ºC. Aunque

temperaturas superiores también pueden ser toleradas por los cultivos, algunas especies

pueden tener una menor tolerancia o requerimientos específicos.

2.5 SUSTANCIAS ORGÁNICAS COMPLEJAS USADAS EN LA GERMINACIÓN

ASIMBIÓTICA DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS.

Un gran numero de aditivos se usan para favorecer la germinación asimbiótica de

semillas de orquídeas y el subsecuente desarrollo y diferenciación de los protocormos (Arditti,

1967). Los más frecuentemente usados son el endosperma líquido de coco, el jugo de tomate y

el fruto del plátano. Steward and Simmonds (1954) reportaron que las capas formativas del

fruto del plátano poseen sustancias que estimulan la división en células de zanahoria; con solo

esta evidencia disponible, Khalifah (1966 b) llegó a la conclusión de que estas sustancias

responsables de la división celular eran las citokininas.

Van Staden y Stewart (1975) encontraron que el fruto del plátano contiene pequeñas

cantidades de compuestos inductores de la división celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6-(Δ2-

isopentilamino) purina] pero que comparados con el endosperma líquido del coco su actividad

era extremadamente baja: 20 ml. de este aditivo daban una respuesta similar a 500 g de

plátano. Sin embargo, existen evidencias de que el efecto del plátano sobre el desarrollo de las

orquídeas puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a las citokininas, pues

se ha reportado la presencia de compuestos afines a giberelinas y auxinas en el mismo

(Khalifah, 1966a, 1966b).

Valmayor (1972) reportó que el endosperma líquido del coco solamente permite una

pobre diferenciación en protocormos de Dendrobium, Vanda y Cattleya, mientras que su

combinación con extractos de plátano resulta en un buen desarrollo de raíces y tallos.

18

2.6 SOLUCIONES AMORTIGUADORAS O BUFFER.

Arditti (1982) sugiere el uso de buffer fosfato para mantener estable el pH (Cuadro Nro.

2). Dado el tiempo que deben permanecer el protocormo y las plántulas en el medio de cultivo

(2-4 meses) son inevitables las variaciones de pH, a consecuencia de los metabolitos liberados

por estos.

Sin embargo el poder amortiguador (capacidad para soportar las variaciones de pH)

del buffer fosfato es muy limitado para valores de pH de 5.1 - 5.4, que son valores óptimos para

el cultivo de meristemas, yemas y semillas de orquídeas.

Cuadro Nro. 2

PREPARACIÓN DE BUFFER FOSFATO

El buffer fosfato se aplica al medio de cultivo para mantener estable el pH. 1. Preparar una solución 0.1M de KH2PO4 agregando 1.3 g de esta sustancia en

100 ml de agua destilada.

2. Preparar una solución 0.1M de K2HPO4 agregando 1.74 g de esta sustancia a

100 ml de agua destilada.

3. Mezclar 975 ml de la solución 1. con 25 ml de la solución 2. para preparar un

Stock de Buffer.

4. Usar 18 ml del Stock de Buffer por cada litro de medio de cultivo preparar.

NOTA:

El Stock de Buffer debe mantenerse siempre en refrigeración para evitar su

contaminación con hongos o bacterias

Fuente: Arditti (1982)

19

2.7 CARBÓN ACTIVADO

El carbón activado utilizado en cultivo de tejidos es el carbón resultante de la

combustión de tejidos vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina, etc). Actualmente

es incluido con frecuencia en la formulación de medios de cultivo In Vitro de orquídeas, tanto

para la siembra de plántulas como de protocormos obtenidos a partir de semillas o de

meristemas (Yam et. al., 1990).

Las propiedades de adsorción del carbón activado tienen una relación directa con el

diámetro y el área de sus partículas, encontrándose la forma comercial de este producto con

áreas especificas muy grandes que van desde 600 a 2000 m²/g (Clark G., 1957).

Algunos solutos de una solución son adsorbidos por el carbón activado cuando entran

en contacto con este; el grado de adsorción depende de la temperatura, el pH, y la

composición química de la sustancia adsorbida, siendo mayormente adsorbidos los

compuestos moderadamente polares y poco solubles, como fenoles, fito-hormonas y vitaminas,

en comparación con los muy polares o los apolares: azucares, sorbitol, manitol, inositol, etc.

que no son adsorbidos (Weatherhead et. al., 1979).

Las sales inorgánicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbón activado, pero

si lo son los de muy baja solubilidad como cationes di- o poli-valentes. Es por ello en estos

casos importante el uso de agentes quelantes (EDTA) que incrementan la solubilidad de los

mismos (Yam et. al., 1990).

Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benéfico del carbón

activado en el cultivo de orquídeas (Weatherhead et. al., 1978). En primer lugar la contribución

de minerales en forma de impurezas estaría enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la

capacidad para adsorber metabolitos fitotóxicos que estarían siendo liberados al medio de

cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, ácido para-hidro-

benzoico).Tercero la adsorción de sustancias producidas durante la esterilización en el medio

20

de cultivo, como el hidroximetil-furfural, resultado de la deshidratación de las hexosas que

afectan el crecimiento y desarrollo de las plántulas. Cuarto, la adsorción de etileno (Ernst,

1975) que inhibe el crecimiento y la diferenciación de las plántulas y protocormos.

Para el cultivo de orquídeas se utiliza carbón activado en medios de germinación de

semillas y en medios de desarrollo como para etapas posteriores (replante) a una

concentración de 2 g/l. Por su capacidad para adsorber hormonas vitaminas y nutrientes poco

solubles no debe ser usado en los medios de cultivo a excesivas concentraciones (Yam et. al.,

1990). Puesto que el carbón activado se asienta debe ser debe ser agitado antes que el medio

se solidifique.

21

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES.

3.1.1 MATERIAL VEGETAL

- Frutos inmaduros (cápsulas)

- Semillas provenientes de cápsulas dehiscentes

- Brotes vegetativos de 5-15 cm. de longitud

de las especies Cattleya maxima Lindley (recolectadas en el Dpto. de Piura), Cattleya rex

O’brien y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem (recolectadas en el Dpto. de San

Martín). Una parte del material vegetal utilizado en las pruebas de siembra de yemas de brote

vegetativo y de semillas fue gentilmente donado por Don José Macedo y Manuel Camacho en

Tarapoto, el Blgo. Benjamín Collantes, el Ing. Manuel Morán y el Ing. Carlos Bohorquez en Lima.

3.1.2 REACTIVOS Y OTROS:

- Sales Nutritivas Básicas del Medio de Cultivo Murashige & Skoog (1962)

- Medio Knudson C (1946)

- Agar

- Gel-Rite

- Sucrosa

- Tiamina

- mio-Inositol

- Carbón Activado

- Acido α-Naftalenacético

- Kinetina

- Alcohol etílico al 96%

- Hipoclorito de Calcio

22

- Hipoclorito de Sodio al 10% (Lejía comercial concentrada)

- Tween-20

- Trifenil tetrazolium

- Verde de Malaquita

- Gradillas inclinadas

- Tubos de ensayo (25x150mm.)

- Tapas de Tubos (25mm. diámetro)

- Magentas

- Frascos BBF

- Fertilizantes (Nitrofoska)

- Fungicidas (Benlate)

- Insecticidas (Lannate, Tamarón)

- Hormonas enraizadoras

- Baldes

- Aspersor

- Macetas plásticas

- Macetas de arcilla

- Musgo

- Carbón vegetal

- Polipropileno.

3.1.3 TINGLADO:

El tinglado consta de una estructura de madera protegida con malla antiáfidos. El

techo está cubierto con malla de rafia de color negro que proporciona 70-80 % de luz.

23

3.1.4 CONDICIONES DE CULTIVO.

Las semillas, protocormos, plántulas y los explantes fueron cultivados en un cuarto de

cultivo a una temperatura de 24 ± 2 ºC, con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad y

con una intensidad luminosa de 2500-3000 lux provista por fluorescentes de luz blanca.

3.1.5 LUGAR DE EJECUCIÓN

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales -

Genética de la UNALM, siendo financiado con recursos propios del Laboratorio.

La parte correspondiente al cultivo in vitro (siembra de semillas, de yemas de brote

vegetativo, replante y aclimatación) fue desarrollada en los ambientes del Laboratorio de

Cultivo de Tejidos y la parte correspondiente al cultivo en vivero y las etapas posteriores a la

aclimatación fueron llevadas a cabo en el tinglado del Campo Experimental del Laboratorio.

3.2 MÉTODOS.

Se aplicaron las técnicas de cultivo in vitro en la propagación de las especies nativas de

orquídeas, a partir de semillas (ARDITTI, 1982) y de yemas (MOREL, 1984), de la siguiente

manera

3.2.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLAS

Se realizó la propagación a partir de semillas de las especies:

- Cattleya rex O’brien

- Cattleya maxima Lindley

- Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem

24

De acuerdo al tipo de material recolectado, se siguieron los procedimientos para semilla

proveniente de cápsula dehiscente o para semilla proveniente de cápsula no dehiscente (cápsula

verde).

a. Siembra de semillas provenientes de cápsula dehiscente.

Las semillas maduras fueron extraídas del fruto (cápsula) luego de la dehiscencia

(cuando la cápsula recién está abriéndose). Para su esterilización las semillas fueron colocadas

en un pequeño sobre de papel filtro cuidando que este se encuentre bien cerrado, a fin de evitar

que se pierdan las semillas durante la esterilización o el enjuague (Foto Nro. 5). Se utilizó una

solución de Hipoclorito de Calcio o de Sodio al 2 %, (a la cual se agregaron 2 gotas de Tween-20

/ 100 ml de Hipoclorito), durante 15-25 minutos.

Pasado este tiempo el sobre se trasladó a agua destilada estéril para el enjuague (Foto

Nro. 6); se abrió luego el sobre (Foto Nro. 7) y se procedió a sembrar las semillas en condiciones

asépticas (Foto Nro. 8 y 9) en el medio basal de Murashige and Skoog (1962) suplementado con

0.4 ,mg/l de Tiamina, 0.5 mg/l de Ácido Nicotínico, 2 g/l de Carbón Activo, 2 g/l de Gel-Rite ó 8.0

g/l de Agar, y 20 g/l de Sucrosa (Cuadro Nro. 3); y en el medio Knudson C suplementado con 20

g/l de Sucrosa, 2 g/l de Carbón Activo y 2 g/l de Gel-Rite, ó 8.0 g/l de agar. Se evaluaron los

porcentajes de germinación de las tres especies en ambos medios de cultivo.

b. Siembra de Semillas provenientes de cápsula no dehiscente (Cápsula Verde)

Se colectaron los frutos (cápsulas) antes de la dehiscencia pero luego de la fertilización,

para lo cual se siguieron las recomendaciones planteadas en la literatura (Cuadro Nro. 4). El fruto

inmaduro (cápsula verde) fue limpiado, eliminando los pétalos secos o cualquier posible fuente de

contaminación. Luego fue lavado con una escobilla suave, agua y detergente.

25

FOTO Nro. 5: Esterilización de semillas provenientes de cápsula dehiscente en sobre de papel filtro.

26

FOTO Nro. 6: Enjuague de las semillas.

27

FOTO Nro. 7: Sobre exponiendo las semillas de orquídeas para su siembra.

28

FOTO Nro. 8: Extracción y siembra de las semillas en el medio de cultivo.

29

FOTO Nro. 9: Dispersión de las semillas en el medio de cultivo.

30

Cuadro Nro. 3

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS

CONSTITUYENTES MURASHIGE & SKOOG (1962) modificado para

germinación1

MURASHIGE & SKOOG (1962) modificado para

germinación2

MEDIO DE KNUDSON C

(1946)

SALES MACRO Y MICRO NUTRIENTES (mg/l)

Nitrato de Amonio NH4NO3 1650.000 1650.000

Nitrato de Potasio KNO3 1900.000 1900.000

Nitrato de Calcio CaNO3 1000.000

Sulfato de Amonio NH4SO4 500.000

Cloruro de Calcio CaCl2.2H2O 440.000 440.000

Sulfato de Magnesio MgSO4.7H2O 370.000 370.000 250.000

Fosfato de Potasio KH2PO4 170.000 170.000 250.000

Sulfato de Manganeso MnSO4.4H2O 16.000 16.000 7.500

Sulfato de Zinc ZnSO4.7H2O 8.600 8.600

Ácido Bórico H3BO3 6.200 6.200

Ioduro de Potasio KI 0.830 0.830

Ac Molibdico Na2MoO2.2H2O 0.250 0.250

Cloruro de Cobalto CoCl2.6H2O 0.025 0.025

HIERRO (mg/l):

Sulfato Ferroso FeSO4.7H2O 27.800 27.800 25.000

Agente quelante Na2-EDTA 37.300 37.300

VITAMINAS (mg/l):

Tiamina-HCl 0.400 0.400

Ac. Nicotínico 0.500 0.500

OTROS:

Sucrosa 20.00 g/l 20.00 g/l 20.00 g/l

Agar 8.00 g/l 8.00 g/l

Gel-Rite 2.00 g/l

Buffer Fosfato 13 ml/l 13 ml/l

Carbón Activo 2.00 g/l 2.00 g/l 2.00 g/l

1,2 Medios de Cultivo formulados en el presente trabajo.

31

Cuadro Nro. 4

TIEMPOS DE COSECHA DE CÁPSULAS VERDES PARA LA SIEMBRA DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS

Esta tabla muestra el intervalo de días entre la polinización y la cosecha de las cápsulas para el cultivo de semillas inmaduras de orquídeas mediante la técnica de siembra de cápsula verde. Los datos son solo referenciales (aproximados), las condiciones especificas de cultivo y las características de la planta madre afectan el tiempo de maduración de las semillas; cuanto más cerca este la cápsula al tiempo de maduración y dehiscencia mayor será el porcentaje de germinación de las semillas.

Anguloa clowesi 150 - 160 uniflora 260 Bollea violacea 220 Brassavola cucullata 75 - 80 nodosa 70 - 75 especies 120 - 150 Brassia especies 170 Cattleya amethystoglossa 220 bicolor 250 - 270 iricolor 220 labiata 200 - 300 maxima 240 - 270 skinneri 85 - 90 trianaei 250 violacea 80 - 85 unifoliadas 120 - 200 Chondrorhyncha wailesiana 160 Cirrhopetalum picturatum 140 Cochleanthes discolor 180 Comparettia macroplectron 200 Cymbidium especies 280 - 360 Cypripedium especies 30 Cyrtopodium especies 150 - 270 Dendrobium superbum 160 - 250 . 160 - 250 formosum 210 nobile 150 - 180 phalaenopsis 120 - 140 senile 110 stratiotes 150 - 200 tosarense 120 Doritis pulcherrima 65 - 70 especies 90 Encyclia especies 130 -180 cochleata 70 - 75 tampensis 70 - 75 Epidendrum ibaguense 100

pseudepidendrum 150 - 180Galeandra lacustris 135Gongora armeniaca 100 quinquenervis 45Keferstenia parvilabris 135 tolimensis 140Laelia anceps 120 - 150 cinnabarina 110 - 120 purpurata 120 - 180Lockartia especies 80 - 100Lycaste brevispatha 200 - 220Masdevallia amabilis 100 caudata 130 - 145 chaparensis 130 coccinea 135 decumana 140 instar 130 - 150 pandurilabia 120 strobellii 110 - 140 tovarensis 120 - 140 veitchiana 130 - 150 yungasensis 100Maxillaria rufescens 140 especies 120 - 140Miltonia especies 120 - 140Miltoniopsis roezlii 250 - 270 vexillaria 140Notylia barkeri 110Odontoglossum especies 80 - 90Oeceoclades saundersiana 160 - 170Oncidium ampliatum 45 - 50 baueri 110 - 140 cebolleta 110 - 130 lanceamun 180 - 240 luridum 100 - 180 papilio 90 - 120 sanderae 90 - 120 splendidum 130 - 170

Paphiopedilum callosum 230 concolor 235 druryi 450 venustum 220 especies 240 - 300Phalaenopsis especies 110 - 120Phragmipedium caudatum 230 wallisii 300 - 330Pleurothallis Palliolata 120 Phalangiphera 130 - 150 restrepioides 90 - 100Polycycnis barbata 125Polystachya galeata 200 pubescens 120Porroglossum meridionale 110 muscosum 95 portillae 95Renanthera especies 150 - 180Rhyncholaelia glauca 210 - 220 especies 120 - 180Rodriguezia especies 110 - 130Schomburgkia superbiens 380Scuticaria hadwenii 110Sophronitis brevipedunculata 170 - 200 coccinea 200 - 300Stanhopea wardii 185Stenia pallida 210Trichopilia marginata 135 suavis Vanda coerulea 290 tessellata 300 especies 150 - 250Zygopetalum intermedium 250 - 260

Fuentes: ARDITTI. J. (1982); RHODEHAMEL, W. (1994); SAULEDA, R. (1976).

32

La esterilización superficial se llevó a cabo con una solución de Hipoclorito de sodio (lejía

comercial concentrada) al 4% a la que se agregó Tween-20 (2 gotas / 100 ml). El tiempo de la

esterilización fue de 20-30 minutos. Pasado este tiempo la cápsula fue retirada del agente

esterilizante y ubicada en una placa petri estéril, se realizaron los cortes, se abrió la cápsula (Fig.

3) y se extrajeron las semillas que fueron sembradas asépticamente en el medio basal de

Murashige and Skoog (1962) suplementado con 0.4 mg/l de Tiamina, 0.5 ppm de Ac. Nicotínico, 2

g/l de Carbón Activo, 2 g/l de Gel-Rite (ó 8.0 g/l de Agar), y 20 g/l de Sucrosa; y en el medio

Knudson C suplementado con 20 g/l de Sucrosa, 2 g/l de Carbón Activo y 2 g/l de Gel-Rite (ó 8 g/l

de Agar) (Cuadro Nro. 3). A las 4 semanas de la siembra se evaluaron los porcentajes de

germinación de las tres especies en ambos medios de cultivo.

3.2.2 PROPAGACIÓN POR YEMAS DE BROTES VEGETATIVOS

Se realizó la propagación por yemas de brote vegetativo de las especies:

- Cattleya rex O’brien

- Cattleya maxima Lindley

Se colectaron brotes vegetativos de Cattleya maxima Lindley y Cattleya rex O’brien en

pleno crecimiento de 5 a 15 cm de longitud, mediante un corte en la parte basal de los mismos

(Foto Nro. 10 y Fig. 4). Los materiales necesarios para la obtención y la siembra de las yemas

(“meristemas”) se muestran en la Foto Nro. 11.

CORTES CÁPSULA ABIERTA SIEMBRA

FIG. 3

CORTES A LA CAPSULA NO DEHISCENTE Y SIEMBRA

33

FOTO Nro. 10: Corte del brote vegetativo de Cattleya maxima Lindley. El bisturí indica el lugar adecuado del corte.

34

FOTO Nro. 11: Materiales para la siembra aséptica de yemas de orquídeas.

35

Se eliminaron los restos de tejido muerto o necrótico que podían ser una fuente de

contaminación. Los brotes fueron lavados con una escobilla suave, agua y detergente, para luego

ser sumergidos por unos segundos en alcohol al 75%

FOTO Nro.12: Proceso de esterilización del brote. 1a esterilización.

36

Se hicieron dos esterilizaciones superficiales: En la primera esterilización los brotes

enteros fueron sumergidos por 20 minutos en una solución de Hipoclorito de sodio al 4% a la cual

se agregó Tween-20 (2 gotas / 100 ml).Ver Foto Nro. 12.

Pasado este tiempo el brote se ubicó en una placa petri estéril (no es necesario el

enjuague) y se eliminaron las hojas envolventes descubriendo las yemas (Foto Nro. 13).

Seguidamente se realizó la segunda esterilización de los brotes sumergiéndolos por 10 minutos

en una solución de Hipoclorito de sodio al 2% a la cual se agregó 2 gotas / 100 ml de Tween-20

(Ver Foto Nro. 14). Se enjuagaron en 100 ml de agua destilada estéril y se ubicaron en una placa

petri estéril.

BROTE

SEUDOBULBO

CORT

CORTE DEL BROTE EN Cattleya

37

FOTO Nro. 13: Brote sin hojas envolventes.

38

meristema yema

nudo

VISTA LATERAL Meristema apical

Tomado de Scully,1967

Cortes de la yema para extraer el meristema

FIG. 5

39

FOTO Nro. 14: Brote durante la 2a esterilización.

40

El aislamiento de las yemas de brote vegetativo se realizó mediante cortes laterales a las

yemas expuestas (Fig. 5 y Foto Nro. 15 , 16 y 17). Los explantes obtenidos se sembraron en

medio basal de Murashige and Skoog (1962) (Ver Foto Nro. 18) suplementado con 0.4 mg/l de

Tiamina, 100 mg/l de mio-Inositol, 1.0 y 2.0 mg/l de Ácido Naftalen-Acético (ANA) y 1.0 y 2.0 mg/l

de Kinetina (KIN) (Cuadro Nro. 5).

FOTO Nro. 15: Brote luego de la 2a esterilización mostrando 3 yemas.

41

FOTO Nro. 16: Vista Frontal de una Yema sin hojas envolventes.

42

FOTO Nro. 17: Vista lateral de una yema sin hojas envolventes.

43

FOTO Nro. 18: Siembra de las yemas en el medio de cultivo líquido.

44

Cuadro Nro. 5

MEDIO MURASHIGE & SKOOG (1962) MODIFICADO PARA EL CULTIVO DE YEMAS DE Cattleya

CONSTITUYENTES CANTIDAD / L

SALES (Macro- y Micro- Nutrientes) mg./l.

Nitrato de Amonio NH4NO3 1650.000

Nitrato de Potasio KNO3 1900.000

Cloruro de Calcio CaCl2.2H2O 440.000

Sulfato de Magnesio MgSO4.7H2O 370.000

Fosfato de Potasio KH2PO4 170.000

Sulfato de Manganeso MnSO4.4H2O 16.000

Sulfato de Zinc ZnSO4.7H2O 8.600

Acido Bórico H3BO3 6.200

Ioduro de Potasio KI 0.830

Ac. Molibdico Na2MoO2.2H2O 0.250

Cloruro de Cobalto CoCl2.6H2O 0.025

HIERRO:

Sulfato ferroso FeSO47H2O 27.800

Agente quelante Na2 -EDTA 37.300

VITAMINAS:

Tiamina-HCl 0.400

HORMONAS:

ANA [*] KIN [*] OTROS:

mio-Inositol 100.00

[*] Dosis hormonales utilizadas en los Tratamientos:

T1: ANA 1.0 mg/l , KIN 1.0 mg/l

T2: ANA 2.0 mg/l , KIN 2.0 mg/l

T3: ANA 2.0 mg/l ‘ KIN 1.0 mg/l

45

3.2.3 REPLANTE

Los protocormos y plántulas obtenidos a partir de yemas o de semillas fueron transferidos

al medio de desarrollo habiéndose utilizando el medio Murashige & Skoog (1962) suplementado

con 0.4 mg/l de Tiamina, 20 g/l de Sucrosa, 2 g/l de Carbón Activo, 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de

Agar, y 100 g/l de plátano homogenizado ó 100 ml/l de endosperma líquido de Coco (Cuadro Nro.

6).

Cuadro Nro. 6

MEDIOS DE CULTIVO PARA EL REPLANTE DE PROTOCORMOS Y PLANTULAS DE ORQUIDEAS

CONSTITUYENTES M & S + mio-I * M & S + P10 * M & S + C *

SALES (Macro- y Micro- Nutrientes) mg./l. mg./l. mg./l.

Nitrato de Amonio NH4NO3 1650.000 1650.000 1650.000

Nitrato de Potasio KNO3 1900.000 1900.000 1900.000

Cloruro de Calcio CaCl2.2H2O 440.000 440.000 440.000

Sulfato de Magnesio MgSO4.7H2O 370.000 370.000 370.000

Fosfato de Potasio KH2PO4 170.000 170.000 170.000

Sulfato de Manganeso MnSO4.4H2O 16.000 16.000 16.000

Sulfato de Zinc ZnSO4.7H2O 8.600 8.600 8.600

Acido Bórico H3BO3 6.200 6.200 6.200

Ioduro de Potasio KI 0.830 0.830 0.830

Ac. Molibdico Na2MoO2.2H2O 0.250 0.250 0.250

Cloruro de Cobalto CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025HIERRO:

Sulfato Ferroso FeSO47H2O 27.800 27.800 27.800

Agente quelante Na2 -EDTA 37.300 37.300 37.300VITAMINAS:

Tiamina-HCl 0.400 0.400 0.400SUSTANCIAS ORGANICAS COMPLEJAS

Plátano 100000.00

Agua de Coco 100 ml OTROS:

mio-Inositol 100.00

Gel-Rite 1 2000.00 2000.00 2000.00

Agar 2 8000.00 8000.00 8000.00

Buffer fosfato (stock de buffer) 13.00 ml 13.00 ml 13.00 ml

Carbón Activo 2000.00 2000.00 2000.00

Sucrosa 20 g/l 20 g/l 20 g/l * Medios de Cultivo: - M & S + mio-I : Usado para inducir proliferación de protocormos. - M & S + C : Para enraizamiento y desarrollo vegetativo. - M & S + P10 : Para enraizamiento y desarrollo vegetativo. 1,2 Agentes solidificantes : Usados por separado, nunca juntos en un mismo medio de cultivo.

46

3.2.4 ACLIMATACIÓN

Luego del segundo replante, cuando las plántulas desarrollaron varias hojas y un buen

sistema radicular, fueron extraídas de los frascos y sometidas al proceso de aclimatación.

a. Preparación del Sustrato

El sustrato en el que se sembraron las plántulas fue una mezcla de musgo y

pequeños trozos de carbón (3 partes de musgo: 1 parte de carbón) que permitía una buena

retención de humedad y a la vez una buena ventilación de las raices. Este sustrato fue

esterilizado previamente en una estufa a 80 ºC por 6 horas .

b. Preparación de las Plántulas.

Las plántulas fueron retiradas de los frascos, limpiadas y lavadas eliminando el

agar adherido a las raíces. Se eliminaron las raíces delgadas o muertas que podían ser una vía

de infección para la plántula. Se sumergieron en Benlate (Benomyl) 1.0 g/l por 30 minutos. Se

seleccionaron las plántulas por tamaños: Grandes, medianas y pequeñas, para luego ser

sembradas en el sustrato estéril.

c. Siembra

Se las sembró por grupos (grandes, medianas y pequeñas) en macetas

comunitarias cuyo tercio inferior fue llenado con pedazos pequeños de polypropileno y los dos

tercios superiores restantes con el sustrato estéril (Wright & Tippit, 1994). Ver Fig. 6.

47

Luego de ser sembradas las plántulas se transfirieron a la cámara de aclimatación (Fig.

7) que estaba acondicionada para proporcionarles una alta humedad y evitar su

deshidratación.

Se evaluó el porcentaje de plántulas sobrevivientes luego del procedimiento de

aclimatación. Las plántulas que sobrevivieron a la aclimatación fueron transferidas a un

Tinglado para ser cultivadas con un régimen intensivo de abonamiento, riego y control de

patógenos.

TECNOPO

PLANTULA

SUSTRAT

SIEMBRA DE PLANTULAS -

FIG. 6

48

3.2.5 DISEÑOS ESTADÍSTICOS

a. Propagación por semillas.

Se utilizó el Diseño de Bloques Completos al Azar considerando como

tratamientos los medios de cultivo de Murashige and Skoog y Knudson C, y como bloques las

especies Cattleya rex O’brien, Cattleya maxima Lindley y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel &

Braem. El parámetro que permitió evaluar la eficiencia de ambos medios de cultivo fue el

porcentaje de germinación.

b. Propagación por Yemas de Brote Vegetativo.

Las especies Cattleya rex O’brien y Cattleya maxima Lindley, se propagaron a

partir de brotes vegetativos, utilizándose el Diseño de Bloques Completos al Azar, considerando

como tratamientos las diferentes concentraciones de hormonas, y como bloques las dos especies

probadas.

PLÁSTIC

CÁMARA

TOALLA

CÁMARA DE ACLIMATACIÓN

FIG. 7

49

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLAS

4.1.1 SIEMBRA DE SEMILLA PROVENIENTES DE CÁPSULA DEHISCENTE

Las semillas tanto de Cattleya rex O’brien como de Cattleya maxima Lindley se

esterilizaron en soluciones de Hipoclorito de Calcio y de Sodio (lejía comercial) al 2%

obteniéndose una adecuada germinación en ambos casos. Por el contrario, las semillas de

Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem esterilizadas con Hipoclorito de sodio al 2% no

germinaron adecuadamente, utilizándose el Hipoclorito de calcio al 2% como esterilizante con

buenos resultados. Probablemente este fenómeno es consecuencia de el efecto inhibidor de

los iones sodio sobre el crecimiento y desarrollo del embrión (Arditti, 1982) y además del mayor

poder oxidante de este respecto al Hipoclorito de Calcio.

El método de esterilización, ideado en éste laboratorio (confeccionando bolsitas de

papel filtro) en las que las semillas son sumergidas en la solución esterilizante tiene la ventaja

de ser rápido y fácil de realizar en relación con otros métodos como el descrito en la literatura

por Courtis (1978)en el cual se emplea una jeringa hipodérmica y una aguja muy fina para la

esterilización y el enjuague de las semillas. El muy pequeño tamaño de las semillas de

orquídeas hace que se deban tomar precauciones para evitar que las semillas se pierdan

durante la esterilización y el enjuague.

El tiempo de esterilización fue de 20 minutos dependiendo del estado de la semilla.

Este tiempo fue variado de acuerdo al siguiente criterio: Las semillas de una cápsula recién

abierta están menos contaminadas que las semillas que se encuentran a la intemperie en una

cápsula con varios días de dehiscencia en un vivero,. Las semillas colectadas en el hábitat

deben ser esterilizadas con mayor cuidado y con más tiempo de exposición que las semillas

colectadas en viveros.

50

Se encontró evidencia estadística que demuestra la existencia de diferencias

significativas entre los medios de cultivo probados y las tres especies estudiadas (Cuadro Nºro.

7).

Cuadro Nro. 7

CUADRO DE ANALISIS DE VARIANCIA DE LA GERMINACION DE SEMILLAS PROVENIENTES DE CÁPSULA DEHISCENTE

FUENTES DE

VARIABILIDAD

GRADOS DE LIB.

SUMA DE

CUADRADOS

CUADR MEDIOS

F calc

BLOQUES

2

26.41

13.205

21.6783*

TRATAMIENTOS

1

323.547

323.547

531.159**

ERROR EXPERIM.

2

1.2182

0.609113

TOTAL

5

351.1752

Tratamientos:

T1: Medio M & S (1962) modificado (Cuadro Nro. 3); Y1 = 72.28 (a)*

T2: Medio KC (1946) (Cuadro Nro. 3); Y2 = 86.467 (b) * Letras diferentes indican diferencias significativas para la prueba de Duncan (α = 0.05)

Bloques:

- Cattleya maxima Lindley

- Cattleya rex O’brien

- Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem

Del análisis de variancia se puede observar que existen diferencias significativas en las

respuestas del genotipo, sin embargo es en los dos medios de cultivo probados M & S

modificado y KC donde se observan diferencias altamente significativas

La germinación de las semillas provenientes de frutos dehiscentes fue mayor en el

medio M & S modificado que permite también un mejor crecimiento de los protocormos.

51

Un hecho que cabe destacar es que las semillas de cápsulas dehiscentes pueden ser

almacenadas para siembras posteriores, lo que no puede hacerse con las semillas inmaduras,

que se secan y pierden su viabilidad muy rápidamente.

Sin embargo la siembra de semillas provenientes de cápsulas dehiscentes tiene la

desventaja de que es mayor el riesgo de contaminación de los medios de cultivo sembrados

debido a la presencia de microorganismos contaminantes dentro del embrión que no pueden

ser eliminados con esterilización superficial. Adicionalmente las semillas, al estar sometidas

directamente al esterilizante también son afectadas por este disminuyendo sus porcentajes de

germinación. Se conoce que un tiempo de exposición demasiado largo o una muy alta

concentración de esterilizante puede causar la muerte de todas las semillas.

4.1.2 SIEMBRA DE SEMILLA PROVENIENTES DE CÁPSULA NO DEHISCENTE

(CÁPSULA VERDE).

En este trabajo las cápsulas fueron separadas de la planta madre, lavadas con agua y

detergente, sumergidas unos segundos en alcohol al 75% y esterilizadas con Hipoclorito de

sodio (lejía comercial) al 4% por 25 minutos. Luego se corto la cápsula (Fig. 3) y se realizo la

siembra de las semillas en los medios de cultivo en condiciones asépticas (dentro de la cámara

estéril de flujo laminar).

Siempre que la cápsula esté sana (que no tenga dentro insectos u hongos) se puede

asegurar que las semillas que contiene están estériles y solo es necesaria su esterilización

superficial.

El procedimiento de cultivo utilizando cápsula verde es más sencillo, más rápido y más

seguro que el de siembra de semillas provenientes de cápsula dehiscente, hay menor riesgo

de infección, se pueden utilizar altas concentraciones de Hipoclorito de sodio sin que este

afecte a las semillas y no es necesario el enjuague con agua destilada estéril. Con esta

metodología el tiempo de cosecha de las semillas para la siembra (desde la polinización) se

52

reduce hasta a la mitad. Es el caso del genero Cattleya y sus híbridos, cuyas semillas tardan 12

meses en madurar completamente (desde la polinización hasta la dehiscencia del fruto),

pudiendo sembrarse las semillas de los frutos inmaduros a partir de los 6-7 meses de la

polinización germinando éstas normalmente. (Cuadro Nro. 4).

El análisis estadístico nos indica que hubieron diferencias significativas respecto a la

germinación en los medios de cultivo Knudson C y Murashige & Skoog para las tres especies

estudiadas. Se pudo observar una respuesta favorable en el medio M & S modificado, con un

mejor y más rápido crecimiento, desarrollo y diferenciación de los protocormos que en el medio

Knudson C (Cuadro Nro. 8; Foto Nro. 19).

Cuadro Nro. 8

CUADRO DE ANÁLISIS DE VARIANCIA DE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS PROVENIENTES DE CÁPSULA NO DEHISCENTE (CÁPSULA VERDE)

FUENTES DE VARIABILIDAD

GRADO

S DE

SUMA DE

CUADRADO

CUADR MEDIOS

F calc

BLOQUES

2

86.3145

43.1573

24.7197*

TRATAMIENTOS

1

102.6721

102.6721

58.8086*

ERROR EXPERIM.

2

3.4917

1.7459

TOTAL

5

192.4783

Tratamientos:

T1 : Medio M & S (1962) modificado; Y1 = 73.77 (a)*

T2 : Medio KC (1946) (Cuadro Nro. 3); Y2 = 82.043 (b)

* Letras diferentes indican diferencias significativas para la prueba de Duncan (α = 0.05)

Bloques:

- Cattleya maxima Lindley

- Cattleya rex O’brien

- Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem

53

FOTO Nro. 20: Protocormos formados a partir de una yema.

54

La razón de esta diferencia radica en el más adecuado balance de nutrientes minerales

del medio M & S modificado y por el contenido de tiamina (0.4 mg/l) y ac. nicotínico 0.5 mg/l,

(Cuadros Nro. 1, 2 y 3). vitaminas que favorecen la germinación de las semillas de orquídeas.

El medio M & S contenía además buffer fosfato (Cuadro Nro. 3), que contribuyó a mantener

estable el pH del medio de cultivo, y carbón activo que favoreció la germinación al adsorver

metabolitos y sustancias tóxicas producidas por el embrión

Se pudo notar que la germinación se ve favorecida al utilizar bajas concentraciones de

agente solidificante. Se probaron agar (8.0 gr/l) y 2.0 g/l de Gel-Rite, siendo este último el más

adecuado ya que se obtuvo un gel consistente pero no muy duro que permitió una rápida

germinación y un buen desarrollo de los protocormos. En los medios con concentraciones altas

de agentes solidificantes, el crecimiento y desarrollo de los protocormos y plántulas es lento

(Arditti, 1982) y las raices no crecen adecuadamente.

Tanto en la siembra de semillas provenientes de cápsula dehiscente como de semillas

provenientes de cápsula verde, el embrión pasa por los mismos estadíos. Luego de tres

semanas de la siembra, germina, se hincha y produce clorofila (de color amarillo verdoso).

Continua su desarrollo hasta dar lugar a una estructura demominada protocormo que

posteriormente forma pequeñas hojas y raices, dando lugar a la plántula.

4.2 PROPAGACIÓN POR YEMAS DE BROTE VEGETATIVO

En las especies estudiadas se observó que el tamaño optimo de los brotes donantes

de las yemas de brote vegetativo es de 10-15 cm. Los brotes fueron separados de la planta -

madre haciendo un corte transversal al rizoma, muy cerca de la base del seudobulbo más

próximo incluyendo en algunos casos las raíces nuevas, los cortes más arriba del punto

indicado pueden excluir algunas yemas útiles.

55

Las plantas provenientes de viveros o las colectadas en el campo contienen polvo y

otras fuentes de contaminación como hojas muertas, seudobulbos secos, líquenes y musgo,

por lo cual la limpieza previa del material permite una mejor esterilización del explante. Es

importante además elegir brotes sanos libres de daños por insectos o sin enfermedades

fungosas o bacterianas, puesto que la esterilización superficial no sería efectiva.El doble

proceso de esterilización superficial del brote asegura la eliminacion de microorganismos

contaminantes.

Previo a la esterilización es conveniente un enjuague del brote con alcohol al 75 % por

10 segundos, lo que contribuye a eliminar la capa cérea que dificulta la acción superficial del

Hipoclorito y la adición de Tween-20 permite un mejor contacto del esterilizante con la

superficie del brote.

Se encontró que los brotes de Cattleya maxima Lindley y de Cattleya rex O’brien poseen

dos o tres yemas basales y una yema apical. De ellas se aisló una región meristemática de

aproximadamente 2 mm, que incluye al meristema propiamente dicho con algunas hojas

envolventes y un cubo de tejido basal (Fig. Nro. 8)

SIEMBRA DE MERISTEMA

Medio de

FIG.

56

Es importante anotar que no se realiza el aislamiento y la siembra del meristema

propiamente dicho, sinó de una región meristemática que incluye varias hojas envolventes y

primordios foliares, puesto que en el género Cattleya los explantes muy pequeños tienen muy

bajos porcentajes de sobrevivencia.

Luego del aislamiento el explante fue sembrado en medio de cultivo liquido sin

agitación. Varios cambios fueron notorios luego de la siembra; el explante se hinchó poco a

poco hasta que a las 6-8 semanas aparecieron estructuras muy semejantes a protocormos

(Ver Foto Nro. 20), resultantes de regeneración o de embriogénesis somática. Este protocormo

somático pasa por los mismos estadíos que el protocormo sexual, tiene la misma apariencia,

posee rizoides y da lugar a una plántula semejante a las de semilla.

Se encontraron diferencias significativas en la respuesta de los explantes de las dos

especies incluidas en este experimento (Cattleya maxima Lindley y Cattleya rex O’brien) a las

distintas concentraciones hormonales utilizadas (Cuadro de Análisis de Variancias). Se

encontró que el medio que permitió una mayor obtención de protocormos fue el que contenía

1.0 mg/l de ANA y 1.0 mg/l de KIN (Cuadro Nro. 9).

57

58

Cuadro Nro. 9

CUADRO DE ANALISIS DE VARIANCIA PARA LA SIEMBRA DE Cattleya rex Y Cattleya maxima

FUENTES DE

VARIABILIDAD

GRADOS DE LIB.

SUMA DE

CUADRADOS

CUADR MEDIOS

F calc

BLOQUES

1

4.166

4.166

24.946 *

TRATAMIENTOS

2

73.0

36.5

218.56 *

ERROR EXPERIM.

2

0.334

0.167

TOTAL

5

77.5

Tratamientos:

T1: ANA 1.0 mg/l , KIN 1.0 mg/l; Y1 = 5.32 (a) *

T2: ANA 2.0 mg/l , KIN 2.0 mg/l; Y2 = 1,82 (b)

T3: ANA 2.0 mg/l , KIN 1.0 mg/l; Y3 = 2.91 (c)

* Letras diferentes indican diferencias significativas para la prueba de Duncan (α = 0.05)

Bloques:

- Cattleya maxima Lindley

- Cattleya rex O’brien

Con fines de producción en gran escala es recomendable utilizar un agitador rotatorio

(Arditti,1993). Los bajos porcentajes de formación de protocormos que se obtuvieron se deben

entre otros a la falta de agitación de los medios más que a la baja concentración de hormonas.

Una vez lograda la regeneración de protocormos estos se transfirieron a medio de

proliferación para luego ser tratados como protocormos obtenidos de semillas.

59

4.3 REPLANTES

A la décima semana y obtenidos los protocormos, sea por cultivo de semillas o por

cultivo de yemas, se transfirieron al medio de desarrollo que consistió de un medio M & S

modificado al cual se agregó plátano homogeneizado (M & S + P10, Cuadro Nro. 6), donde

crecieron vegetativamente y desarrollaron un buen sistema radicular. En la semana 20 se

transfirieron nuevamente las plántulas al último medio de cultivo (M & S + P10 ó M & S + C).

Este medio permitió un buen desarrollo de las raíces así como de la parte vegetativa de las

plántulas (Cuadro Nro. 10), preparándolas para el proceso de aclimatación subsiguiente.

Cuadro Nro. 10

RESPUESTA DE LAS PLANTULAS Y PROTOCORMOS A LOS MEDIOS DE REPLANTE

PROTOCORMOS PLANTULAS MEDIO PROLIFER

ACIÓN DIFERENCIA

CIÓN CRECIMIE

NTO VEGETATI

VO

ENRAIZAMIENTO

M & S + ++ + 0

M & S + mio-I +++ 0 +++ 0

M & S + P 10 0 +++ ++ +++

Crecimiento:

0 : Ninguno

+ : Pobre

++ : Bueno

+++ : Muy bueno

El plátano como aditivo fue aplicado a una concentración de 50-100 g/l , previa

homogeneización en una licuadora, es importante anotar que se utilizo plátano poco maduro, el

muy maduro contiene altos niveles de inhibidores del crecimiento tales como etileno.

El plátano y el coco como aditivos tienen un claro efecto promotor del desarrollo y

diferenciación de las plántulas y protocormos (Cuadro Nro. 11), pero no son adecuadas para la

60

germinación de semillas o para el cultivo de protocormos jóvenes, lo que concuerda con las

observaciones de Arditti (1982).

Se observó al igual que Valmayor (1972), que el agua de coco (100 ml/l), es un buen

promotor del crecimiento vegetativo y radicular en plántulas. Es por ello que su aplicación en el

medio del último replante permite una mayor sobrevivencia de las mismas durante el proceso

de aclimatación al favorecer el desarrollo de las raíces y tallos de las plántulas.

Cuadro Nro. 11

INFLUENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE PROTOCORMOS Y PLANTULAS

MEDIO DE CULTIVO*

ETAPA

RESPUESTA

M & S Modificado

Germinación

Germinación rápida

M & S + mio-I

Proliferación

Proliferación de protocormos indiferenciados, mediante formación de Protocormos

adventicios

M & S

Diferenciación Desarrollo y

diferenciación de los protocormos. Formación de plantulas

M & S + P10

Diferenciación

Protocormos indiferenciados o muy jóvenes mueren, solo sobreviven los protoc.

diferenciados

M & S + P10 M & S + C

Crecimiento Vegetativo

(plantulas)

Buen crecimiento radicular. Buen crecimiento vegetativo

M & S + mio-I

Desarrollo (plantulas)

Plantulas con buen crecimiento vegetativo pero sin raíces.

* Medios de Cultivo: - M & S Modificado : Medio Murashigue & Skoog (1962) modificado para cultivo de orquídeas - M & S : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal (sin Hormonas ni aditivos) - M & S + mio-I : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal + mio-Inositol 100 mg/l - M & S + C : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal + Agua de Coco 100 ml/l - M & S + P10 : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal + Platano 100 g/l Las formulaciones completas de Medio Murashigue & Skoog se encuentran en el Cuadro Nro. 3

61

Se pudo notar el efecto amortiguador (buffer) de los aditivos usados (plátano y agua de

coco), pues una vez aplicados mantienen el pH del medio de cultivo dentro de los valores

requeridos (pH 5.0 - 5.3), aunque la permanencia de este efecto amortiguador luego de la

esterilización en autoclave no ha sido estudiada.

Dos tipos de agentes solidificantes fueron utilizados para el replante de protocormos y

plántulas: El agar (8.0 g/l) y el Gel-Rite (0.2 g/l); de ellos el más adecuado resulto el Gel-Rite

pues es mucho más económico, con menor cantidad de impurezas que el agar y a las

concentraciones usadas tiene la consistencia adecuada permitiendo un buen desarrollo de

raíces y un rápido crecimiento de las plántulas. Concentraciones elevadas de agente

solidificante causan un crecimiento lento y un pobre desarrollo radicular y vegetativo.

4.4 ACLIMATACIÓN

A partir de la semana 32 de realizada la siembra y luego del segundo replante las

plántulas fueron transferidas a condiciones de “campo” (vivero) para lo cual pasaron por el

proceso de aclimatación. En este proceso las plántulas deben desarrollar un conjunto de

adaptaciones anatómicas y fisiológicas como la capacidad para responder a una baja humedad

ambiental mediante el oportuno cierre de sus estomas, el incremento de la epicuticula cérea

protectora, así como una más intensa actividad fotosintética y una eficiente absorción radicular

de los nutrientes (Fuchigami et. al.,1981; Brainerd, 1981; Grout, 1977).

Lss plántulas sembradas se ubicaron en la cámara de aclimatación (Figs. 6 y 7),

manteniendo una alta humedad los primeros días (cerrándola completamente). Poco a poco se

fue abriendo la cámara de aclimatación para hacer que la humedad disminuya gradualmente

hasta igualarse a la del medio ambiente. Este proceso toma varios días (el tiempo depende de

la planta y del sustrato en que fué sembrada)por lo que es muy importante la observación del

estado de las plántulas . Pasados los 10 días de la transferencia se inició el riego con una

solución de tiamina y ANA (0.01 y 0.04 mg/l respectivamente) para promover la formación de

raíces en las plántulas. Pruebas preliminares realizadas en este Laboratorio nos mostraron el

efecto favorable de la tiamina durante la aclimatación, y Goh (1983) demostró que el ANA

62

favorece el enraizamiento de las orquídeas. Se usa esta auxina sintética pues es mucho más

estable que la auxina natural AIA . Para todos los riegos realizados durante la aclimatación se

utilizó agua destilada. Los porcentajes de sobrevivencia logrados fueron en promedio 87 %

para Cattleya rex O’brien, 81 % para Cattleya maxima Lindley y 83 % para Psychopsis

versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem.

Una vez que las plántulas se adaptaron a la humedad ambiental y no mostraban signos

de deshidratación se transfirieron al vivero.

Cuando las plántulas fueron sembradas en sustrato sin esterilizar o sin aplicárseles

fungicida (Benlate) los porcentajes de mortalidad fueron muy altos, llegando hasta el 100 % en

algunos casos. Ademas de la esterilización del sustrato y la aplicación de fungicida fue

importante cuidar que la temperatura durante la aclimatación no sea muy alta pues deshidrata

a las plántulas y favorece el desarrollo de enfermedades causadas por hongos y bacterias.

Las orquídeas epífitas peruanas pueden propagarse fácilmente utilizando las técnicas

de cultivo in vitro en los medios de cultivo probados. Su introducción in vitro permitirá crear

Bancos de Germoplasma, así como iniciar programas de selección, mejoramiento y

conservación.

63

V. CONCLUSIONES

1. Se encontraron diferencias significativas entre los medios de cultivo Knudson C y M & S

modificado para la germinación de semillas de las especies Cattleya rex O’brien, Cattleya

maxima Lindley y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem. Siendo el más adecuado

el medio M & S modificado.

2. En la utilización de Gel-Rite (2.0 g/l) y agar (8.0 g/l) como agentes solidificantes, se encontró

una mejor respuesta en germinación y establecimiento de las plántulas en los medios

solidificados con Gel Rite, respuesta debida aparentemente a una mejor consistencia del

medio que se alcanza con dicho producto. Adicionalmente este medio tiene la ventaja de

ser más económico.

3. La utilización de sustancias orgánicas complejas como el plátano homogeneizado (100 g/l)

y endosperma líquido de coco (100 ml/l), en la composición de los medios, promueven una

rápida diferenciación del protocormo y el desarrollo vegetativo y radicular de las plántulas.

4. El procedimiento de siembra de semillas provenientes de cápsula no dehiscente (cápsula

verde) es el más recomendable por el menor riesgo de infección de las semillas, por su

rapidez y simplicidad..

5. El tamaño óptimo del brote para realizar el aislamiento y la siembra de la región

meristemática en Cattleya es de 10 a 15 cm.

64

VI. RECOMENDACIONES

1. Se recomienda probar la utilización de nuevos buffers orgánicos con mayor poder

amortiguador, es decir cuyo pKa sea igual o muy cercano al pH requerido, como es el caso

del buffer citrato, para el cultivo de semillas y yemas de orquídeas.

2. Probar la eficiencia de la agitación rotatoria en la propagación de meristemas y yemas,

utilizando el método de siembra descrito.

3. Desarrollar nuevas metodologías de propagación in vitro como la propagación a partir de

ápices radiculares o varas florales, para estas y otras especies peruanas de orquídeas.

4. Reemplazar el Hipoclorito de Sodio por Hipoclorito de Calcio como agente esterilizante,

debido a los efectos fitotóxicos observados en la utilización del Hipoclorito de sodio cuando

es necesaria su utilización a relativamente altas concentraciones o durante tiempos

prolongados de esterilización.

5. Aplicar las técnicas de propagación masiva in vitro de las especies peruanas de orquídeas,

con fines comerciales, de investigación o de conservación, poniendo énfasis en aquellas en

peligro de extinción.

6. Ampliar las técnicas descritas en el presente estudio para la propagación de orquídeas

terrestres peruanas.

7. La aclimatación se llevo a cabo luego del segundo replante, siendo importante en este

estado el adecuado control de las enfermedades fungosas y bacterianas y el control de la

humedad ambiental.

88.. Crear un banco de Germoplasma in vitro y en vivero de nuestras especies nativas de

orquídeas

65

VII. RESUMEN

En el presente estudio se plantea la propagación in vitro como una alternativa para la

conservación, propagación y distribución de germoplasma de orquídeas peruanas frente a los

factores que ponen en peligro su preservación.

Se estandarizaron técnicas de propagación in vitro para 3 especies de orquídeas peruanas:

Cattleya rex O’brien, Cattleya maxima Lindley, y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem

como método alternativo para su conservación, probándose tres alternativas de propagación:

por semillas de cápsula dehiscente (semilla seca), por semillas de cápsula no dehiscente

(cápsula verde), y por cultivo de yemas (esta última solo para las especies del género Cattleya).

Las semillas secas fueron esterilizadas dentro de un pequeño sobre de papel filtro cerrado, con

Hipoclorito de Calcio o de Sodio al 2% con 2 gotas de Tween-20, durante 15-25 minutos. Para las

semillas de cápsula verde se tomaron cápsulas antes de la dehiscencia, a las cuales se

extrajeron los pétalos secos o cualquier posible fuente de contaminación, inmediatamente se

procedió a lavarla con una escobilla suave, agua y detergente. La esterilización superficial se llevó

a cabo con una solución de Hipoclorito de Sodio (lejía comercial concentrada) al 4% con 2 gotas

de Tween-20, el tiempo de esterilización fue de 20-30 minutos.

Para la siembra de yemas se colectaron brotes vegetativos de Cattleya maxima y Cattleya rex de 5

a 15 cm de longitud. Se eliminaron los restos de tejido muerto o necrótico. Los brotes fueron

lavados con una escobilla suave, agua y detergente, para luego ser sumergidos por unos

segundos en alcohol al 75%. Se hicieron dos esterilizaciones superficiales: en la primera los

brotes fueron sumergidos por 20 minutos en Hipoclorito de Sodio al 4%, con 2 gotas de Tween-

20. Luego el brote se ubicó en una placa petri estéril y se eliminaron las hojas envolventes,

poniendo al descubierto las yemas. En la segunda esterilización los brotes se sumergieron por 10

minutos en Hipoclorito de Sodio al 2% con 2 gotas de Tween-20, luego se enjuagaron en 100 ml

de agua destilada estéril y se ubicaron en una placa petri estéril listo para la disección y siembra

de las yemas. En todos los casos, el análisis estadístico de los resultados se hizo utilizando el

Diseño en Bloque Completo al Azar con los medios como tratamientos y las especies de

orquídeas como bloques.

66

Tanto para la siembra de semilla seca como de cápsula verde se probó el medio de Murashige

& Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 0.5 mg/l de Ácido Nicotínico + 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l

de Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar; y el medio de Knudson C (1946) + 2 g/l

de Sucrosa + 2 g/l Carbón Activado y + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar.

Para la siembra de yemas se probó el medio de Murashige & Skoog (1962) + 0.4 mg/l de

Tiamina + 100 mg/l de mio-Inositol + los siguientes tratamientos hormonales: ANA 1.0 mg/l +

Kinetina 1.0 mg/l; ANA 2.0 mg/l + Kinetina 2.0 mg/l; y ANA 2.0 mg/l + Kinetina 1.0 mg/l.

Para el replante de los protocormos y su posterior proliferación se usó el medio de Murashige &

Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 100 mg/l de mio-Inositol + 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l de

Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar.

Para el replante de plántulas y su posterior desarrollo vegetativo y/o enraizamiento se probó el

medio de Murashige & Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 100 g/l de plátano homogenizado

+ 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l de Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar y el medio de

Murashige & Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 100 ml/l de endosperma líquido de coco

(agua de coco) + 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l de Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de

Agar. Los tres medios de replante citados fueron luego suplementados con 13 ml/l de Buffer

Fosfato.

Se obtuvo buen resultado en la desinfección de las semillas secas con Hipoclorito de Calcio y

con Hipoclorito de Sodio al 2% para Cattleya rex y Cattleya maxima, pero no para Psychopsis

versteegianum con el Hipoclorito de Sodio.

En la germinación de las semillas secas se encontraron diferencias altamente significativas

entre los medios probados y diferencias significativas en las respuestas de los genotipos.

La siembra de semillas de cápsula verde tuvo mejores resultados que los de semilla seca por

el menor riesgo a la contaminación, y por la reducción del tiempo de cosecha de las semillas.

En la germinación de éstas semillas hubieron diferencias significativas en los medios probados

para las tres especies.

Para las semillas, el medio de Murashige & Skoog (1962) modificado dio mejor resultado que el

de Knudson C. La inclusión de Tiamina y Ácido Nicotínico en el medio favorecieron la

germinación de las semillas, el buffer fosfato ayudó a mantener el pH requerido, y el carbón

67

activado favoreció la germinación al adsorber los metabolitos y sustancias tóxicas producidas

por el embrión. El Gel-Rite fue el mejor gelificante al dar una adecuada consistencia al medio.

El tamaño óptimo de los brotes donantes de las yemas estuvo entre 10 y 15 cm,

encontrándose de 2 a 3 yemas basales y una yema apical en ambas especies de Cattleya.

Hubieron diferencias significativas en la respuesta de las yemas de las especies probadas a las

diferentes concentraciones hormonales (tratamientos), siendo el medio que dio mayor

producción de protocormos el suplementado con 1.0 mg/l de ANA + 1 mg/l de Kinetina. Luego

que pasaron a medio de proliferación fueron tratados como protocormos de semillas.

Los replantes se realizaron a la 10ma y 20va semana en el medio de desarrollo. La aclimatación

se realizó luego del 2do replante (32va semana de siembra) con varias hojas y buen sistema

radicular. El sustrato fue elaborado usando 3 partes de Musgo por 1 de Carbón (trozos

pequeños) esterilizados en estufa a 80°C por 6 horas. Las plantas fueron extraídas de los

frascos in vitro, lavadas, eliminándose las raíces secas. Luego fueron lavadas con Benlate

(Benomyl 1g/l) durante 30 minutos. La siembra se hizo en macetas comunitarias en cuyo tercio

inferior se colocaron trozos de polipropileno y los dos tercios superiores con el sustrato. El

ambiente fue una cámara húmeda para luego pasar al Tinglado. A diez días de la transferencia

el riego fue con agua destilada más Tiamina (0.01 mg/l) y ANA (0.04 mg/l) para promover la

formación de raíces. Se obtuvieron los siguientes porcentajes de sobrevivencia en cámara

húmeda: Cattleya rex 87%, Cattleya maxima 81% y Psychopsis versteegianum 83%. Luego, los que

no mostraron signos de deshidratación se transfirieron a vivero. La sobrevivencia es muy baja

cuando el sustrato no se esteriliza o no se aplica fungicida a las plántulas.

La utilización de sustancias orgánicas complejas como el plátano homogenizado (100 g/l) y

endosperma líquido de coco (100 ml/l), en la composición de los medios, promueven una

rápida diferenciación del protocormo así como del desarrollo vegetativo y radicular de las

plántulas.

Se recomienda: probar la utilización de nuevos buffers orgánicos con mayor poder

amortiguador; probar la eficiencia de la agitación rotatoria en la propagación de meristemas y

yemas, utilizando el método de siembra descrito; crear un banco de Germoplasma in vitro y en

vivero de nuestras especies nativas de orquídeas.

68

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73

APÉNDICES

74

PRUEBA DE GERMINACION UTILIZANDO SEMILLA PROVENIENTE DE CAPSULA DEHISCENTE

Porcentajes de germinación por tubo (unidad experimental)

BLOQUE Cattleya maxima Cattleya rex Psychopsis versteegianum

84.5 67.4 64.5 75.3 75.9 68.4 87.6 70.0 62.0 85.4 76.3 65.6

Trat. 1: Knudson C 76.9 71.4 59.2 80.8 68.1 51.4 74.1 73.5 67.5 85.1 77.6 52.1 86.3 72.0 63.9 88.7 69.1 57.8 87.6 80.8 72.9 79.9 78.4 68.8 86.7 75.4 73.4 92.6 78.9 58.6

Trat. 2: M & S 84.7 74.0 59.6 91.3 70.6 64.5 89.7 69.4 63.8 84.6 83.6 67.4 92.7 82.4 69.8 80.7 73.9 60.2

PRUEBA DE GERMINACION

UTILIZANDO SEMILLA PROVENIENTE DE CAPSULA NO DEHISCENTE Porcentajes de germinación por tubo (unidad experimental)

BLOQUE Cattleya maxima Cattleya rex Psychopsis versteegianum

85.2 72.9 73.5 83.5 66.6 65.8 82.6 78.3 60.3 80.5 77.7 67.7

Trat. 1: Knudson C 75.9 70.4 61.5 79.4 69.6 57.0 76.3 68.2 58.9 73.2 74.1 55.1 78.3 75.5 64.2 81.6 76.9 52.4 89.6 71.8 60.9 83.2 83.9 71.9 88.2 69.3 69.7 79.7 78.4 70.8

Trat. 2: M & S 90.8 86.7 62.5 84.4 76.5 55.3 92.4 79.5 68.4 87.3 72.8 63.2 81.7 81.2 66.2 80.6 80.6 73.7

75

PROPAGACION DE BROTES VEGETATIVOS (POR YEMAS) Numero de protocormos formados a las 10 semanas

BLOQUE Cattleya maxima Cattleya rex

7 6 5 5

Trat. 1 6 6 6 4 5 6 3 3 2 2

Trat. 2 3 1 1 2 2 2 1 0

Trat. 3 2 0 1