23. Replicacion

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UNIDAD N° 3: UNIDAD N° 3: Tema 2: REPLICACIÓN DEL ADN Tema 2: REPLICACIÓN DEL ADN Blgo. Ms. Pablo Chuna Mogollón Profesor Auxilar T.C. Area Biología Departamento Académico de Ciencias - UPAO

Transcript of 23. Replicacion

UNIDAD N° 3: UNIDAD N° 3:

Tema 2: REPLICACIÓN DEL ADNTema 2: REPLICACIÓN DEL ADN

Blgo. Ms. Pablo Chuna Mogollón

Profesor Auxilar T.C. Area Biología

Departamento Académico de Ciencias - UPAO

REPLICACION DEL DNA

CARACTERISTICAS

Semiconservativa Bidireccional Semidiscontínua Asimétrica Asincrónica Es multifocal en eucariotas Requiere de Cebadores Ocurre en el período S.

La replicación es el proceso mediante el cual, a partir de una molécula de DNA doble hélice, se sintetizan dos moléculas idénticas. Tiene lugar cada vez que se divide una célula, ya que las dos células hijas han de tener exactamente, la misma dotación genética que la progenitora.

Es semiconservativa

A partir de la doble hélice de una molécula de DNA se originan dos moléculas de DNA, ambas compuestas por una cadena original (preexistente) y una cadena nueva (recién sintetizada).

Es decir, que las dos cadenas de la molécula progenitora se separan y sirven cada una de molde para la síntesis de una nueva cadena hija complementaria, siguiendo la regla normal de apareamiento.

A

A

Nucleótidos

Molécula parentalde DNA

Ambas cadenas parentales Sirven como molde

Dos moléculas de DNAhijas idénticas

Origen dereplicación

Origen dereplicación

Origen dereplicación

Cadena parental

Cadena hija

Burbuja dereplicación

Dos moléculas de DNA hijas

Es Bidireccional

Al abrirse la doble hélice se forma una estructura llamada “burbuja de replicación”, cuyo tamaño aumenta a medida que avanza la separación de las dos cadenas de DNA, evento que se produce en forma simultánea en los 2 extremos de la burbuja.

Cada burbuja, tiene dos

horquillas de replicación que a partir de ese punto de origen común avanzan en ambas direcciones opuestas

Es Semidiscontínua

• La cadena hija que adopta como molde a la cadena progenitora que corre en dirección 3’→5’ se sintetiza en forma continua, al crecer en dirección 5’→3’, y se denomina cadena adelantada (“leading strand”).

• La otra cadena hija, cuyo molde es la cadena del DNA progenitora que corre en dirección 5’→3’ es sintetizada de un modo singular, ya que para poder crecer en esa dirección debe sintetizarse en dirección opuesta al avance de la horquilla de replicación. El problema se supera haciendo de que la síntesis sea discontinua, lo cual significa que la nueva cadena se sintetiza de a pequeños fragmentos y se le llama cadena retrasada (“lagging strand”).

La síntesis de la cadena retrasada se lleva a cabo en la dirección opuesta a la del movimiento de la horquilla de crecimiento, a partir de una serie de iniciadores de RNA cortos formados por la primasa en múltiples sitios de la segunda cadena molde. Los segmentos resultantes de RNA más DNA se conocen como fragmentos de Okasaki.

La Replicación es Multifocal en Eucariotas

• En eucariotas, para poder llevar a cabo la replicación en un tiempo razonable, ha de ser multifocal, es decir, empezar por muchos puntos a la vez. Se ha comprobado que en el DNA de células de mamíferos existen cerca de 50 000 a 100 000 replicones.

• En cambio la replicación del DNA bacteriano es monofocal, es decir, existe un sólo origen de replicación.

Requiere de Cebadores

Para empezar la síntesis de DNA se requiere una cadena de nucleótidos para agregarle un nuevo nucleótido. Cada fragmento de Okazaki se inicia con un RNA cebador “primer” (~10 bases de largo).

Ocurre en Fase S del ciclo celular. La replicación del DNA ocurre con alta fidelidad dentro de un período de tiempo determinado en forma precisa dentro del ciclo celular.Síntesis de DNA = replicación

EN PROCARIOTAS

• DNA Helicasa.• Proteínas SSB (Single- Strand binding). • Topoisomerasas I y II (girasa)• RNA primasa. • DNA Polimerasas (DNA Pol)

I, II y III• Pirofosfatasa.• DNA Ligasa • DNA molde o “template”• Cebadores• Los 4 desoxirribonucleótidos trifosfato:

(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)• Mg++• Abrazadera β

• RNAH asa

REQUERIMIENTOS DE LA REPLICACION

EN EUCARIOTAS

• DNA Helicasa.• Proteínas RFA y RFC• Topoisomerasas I y II• RNA primasa. • DNA Polimerasas (DNA Pol)

α,β, γ, δ, ε• Pirofosfatasa.• DNA Ligasa • DNA molde o “template”• Cebadores• Los 4 desoxirribonucleótidos trifosfato:

(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)• Mg++• PCNA (Proliferating cell nuclear antigen)• ORC (origin recognition complex)• Nucleasa reparadora

DNA POLIMERASAS (DNA Pol)• La DNA Polimerasa, agrega un nucleótido al extremo 3’ de la cadena de DNA en

crecimiento y forma un enlace fosfodiéster entre este extremo y el grupo 5’-fosfato de nucleótido entrante.

• El nucleótido trifosfato entrante provee la energía necesaria para esta reacción por la hidrólisis de los dos fosfatos terminales (PPi).

• Este pirofosfato es luego hidrolizado a fosfato inorgánico (Pi), lo cual permite que la reacción de polimerización sea irreversible.

DNA HELICASAS y PROTEÍNAS SSB.

– Una helicasa y las proteínas de unión a las monocadenas (SSB) trabajan para desenrollar y mantener las cadenas de DNA separadas antes del avance de la horquilla de replicación

– Las helicasas son enzimas capaces de despla-zarse a lo largo del DNA utilizando la energía de la hidrólisis del ATP, para separar las cadenas.

– Las proteínas SSB mantienen las cadenas separadas

Topoisomerasas Topoiso

merasas

Las Topoisomerasas tipo I relajan el DNA, por corte y cierre de una cadena del DNA.

Las Topoisomerasas tipo II cambian la topología del DNA mediante el corte y la reparación del DNA bicantenario.

ETAPAS DE LA REPLICACION

INICIACIONReconocimiento de orígenes de replicación

Separación de hebra

Posicionamiento de maquinaria de replicación

ELONGACIONCrecimiento bidireccional de la horquilla de replicación

Replicación semiconservativa, semidoscontinua, coordinada.

TERMINACIONReconocimiento de señales de terminación

Desensamble de replisomas

1) INICIACION• La síntesis del DNA se inicia en regiones especiales llamadas orígenes de replicación.• Los orígenes de replicación típicamente contienen múltiples secuencias repetidas cortas.

Estos segmentos de DNA singulares son reconocidos por proteínas multiméricas que se unen al origen y, a su vez, reclutan hacia éste otras enzimas de la replicación.

1) INICIACION• La síntesis del DNA se inicia en regiones especiales llamadas orígenes de replicación.• Los orígenes de replicación típicamente contienen múltiples secuencias repetidas cortas.

Estos segmentos de DNA singulares son reconocidos por proteínas multiméricas que se unen al origen y, a su vez, reclutan hacia éste otras enzimas de la replicación.

• La iniciación de la replicación del DNA en E. coli, se produce por la unión de la proteína dnaA al único origen de replicación (oriC), seguida por la fijación de la DnaB, una helicasa que disocia el DNA a la altura de la horquilla.

• La asociación de la primasa (dnaG) a este complejo forma un primosoma. Tras la síntesis del iniciador la primasa se separa.

2) ALARGAMIENTO DE LAS CADENAS:

Una vez que el origen de replicación se ha formado, el alargamiento para formar la cadena adelantada progresa sin mayor dificultad.Una primasa se une a un sitio adyacente a la helicasa en el segmento monocatenario del molde de la cadena retrasada e inicia la síntesis de otro iniciador de RNA, el mismo que la polimerasa procede a alargar para formar otro fragmento de Okasaki.El núcleo polimerásico que sintetiza la cadena adelantada se desplaza, junto con su abrazadera de subunidad β, a lo largo de su molde en la dirección del movimiento de la

horquilla, y así alarga la cadena.

Una vez que los cebadores de la cadena retrasada han sido elongados por la DNAP III, ellos son removidos Por la RNAHasa + DNA polimerasa I y ésta última rellena dichos espacios.

La enzima tiene actividad polimerasa 5’→3’, 3’→ 5’ exonucleasa (“proofreading”) en una sola cadena polipeptídica. La exonucleasa 5’→3’ remueve los cebadores, mientras que la polimerasa funciona simultáneamente llenando los espacios con DNA por elongación del extremo 3’ del fragmento de Okasaki adyacente. El enlace fosfodiéster final entre los fragmentos es catalizado por la DNA ligasa

3) TERMINACIÓN

La replicación finaliza cuando una horquilla de replicación se encuentra con el otro lado del cromosoma circular en el lugar de terminación, la región ter (τ ). La región ter está formada por un par de secuencias ter de repeticiones invertidas.Cada secuencia ter evita una progresión posterior de una de las horquillas de replicación cuando se une una proteína de unión ter (TBP) de 26 KDa.Las dos moléculas hijas de DNA se separan porque actúa una topoisomerasa de tipo II.

(T1)

(T2)

LA DNA POLIMERASA HACE UNA LECTURA DE PRUEBA (PROOFREADING)

Muchos errores de copiado que se producen durante la replicación del DNA son corregidos por la función de lectura de prueba de la DNA Polimerasa, que pueden reconocer bases erróneas (mal apareadas) en el extremo 3’ de la cadena en crecimiento y luego extraerlas por medio de una actividad inherente de exonucleasa 3’ →5’.

DNA POLIMERASAS EUCARIOTICAS: , , , y .

• Las enzimas son similares a aquellas involucradas en la replicación del DNA bacteriano. La DNA topoisomerasa II está involucrada en aliviar superenrollamientos positivos en el DNA, mientras que la helicasa desenrolla las dos cadenas.

• LA DNA Pol- tiene baja procesividad y una primasa asociada y carece de actividad exonucleasa. Está involucrada en la síntesis de la cadena retrasada. Es fuertmente inhibida por afidicolina (fuerte también para y )

• DNA Pol tiene alta procesividad en presencia de PCNA (tiene una función homóloga a la subunidad de Pol III de E. coli ) y no tiene asociada una primasa, sugiriendo que replica la cadena líder eucariótica.

• DNA Pol es encontrada en la mitocondria y replica su DNA.• DNA Pol y tienen buena procesividad y están involucradas en la

reparación del DNA.

INICIO DE REPLICACION EN EUCARIOTAS

Los origenes de replicación contienen contienen tramos de ADN especiales, compuestos por cientos de nucleótidos. Todos poseen una secuencia común denominada ARS (autonomous replication sequence).

El ADN de los orígenes de freplicación se halla asociado aun complejo de proteínas llamadas ORC (origin recognition complex).

El ORC es requerido durante la activación de los orígenes de replicación.

En G1, Factores de replicación defosforilados se unen al ORC para formar complejo de pre-replicación.

Al comienzo de la fase S, ORC recluta a otras proteínas – por ejemplo la denominada MCM (minichromosome maintenance proteins) y cdc6 (cell division cycle)- con las cuales integra un cimplejo mayor llamado pre-RC (pre replication complex).

Este cataliza el inicio de la replicación despues de ser inducido por el factor SPF (S-phase promoting factor), este también es llamado FPR (factor promotor de la replicación).

La unión de cdc45 activa el MCM helicasa y facilita la unión de RPA, una proteína de unión a cadena simple (SSB).

Además de participar en la activación de los orígenes de replicación, el ORC impide que el ADN se reduplique dos veces durante la fase G2, por lo que evita que la célula comience la mitosis teniendo un número de moléculas de ADN mayor que el normal.

• La DNA Polimerasa α, que posee actividad de primasa, inicia la síntesis del DNA a través de la formación de un RNA cebador seguido por una cadena corta de nucleótidos de DNA. Una vez que la DNA polimerasa α colocó entre 30 y 40 nucleótidos, la DNA polimerasa completa la replicación sobre las cadenas líder y retrasada.

• La DNA polimerasaε también parece participar en la replicación nuclear. Estudios recientes muestra que la DNA Pol ε replica la cadena líder.

• Los cebadores son eliminados por una nucleasa reparadora y su lugar lo ocupa una pieza equivalente de DNA, sintetizada por la DNAP- . El proceso culmina al actuar la DNA ligasa.

REMOCIÓN DE CEBADORES

RNase R1 – remueve RNA primer

Endonuclease: remueve ribonucleótidos y la DNA Pol δ sintetiza los deoxiribonucleóotidos

DNA LIGASA

Cataliza formación del enlace fosfo-diester entre dos fragmentos de Okazaki

INHIBIDORES DE SINTESIS DE DNA

• Quinolonas, ácido nalidíxico: se unen a la DNA girasa. La unión del antibiótico al complejo DNA-girasa inhibe la replicación del DNA.Las quinolonas y las nuevas fluoroquinolonas, como ciprofloxacina y norfloxacina son antibióticos de amplio espectro y especialmente utilizados en infecciones urinarias y en infecciones por Escherichia coli y Salmonella.