2.8 Estudio microscópicode los microorganismos.

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Preparaciones Microbiológicas

•Preparaciones en fresco (microorganismos vivos)•Preparaciones fijas y teñidas (microorganismos muertos)

FrotisUna capa delgada de muestra extendida sobre un portaobjetos que permite el paso de la luz a través de ella.

•Impronta •Gota de cultivo líquido

•Cultivo sólido resuspendido

•Frotis sanguíneo •Cinta adhesiva transparente

•Hisopo

Tinciones

•Positivas

Se observa teñida la célula sobre un fondo claro.

•Negativas

El fondo se tiñe de oscuro para observar células o estructuras refringentes.

Frotis Sanguíneo Cryptococcus neoformans

Tinciones

•SimplesSe utiliza un solo colorante (básicos).- Azul de metileno- Safranina- Cristal violeta

•CompuestasSe utilizan dos ó más colorantes. Pueden usar mordentes y decolorantes- Giemsa- Wrigth- May Grünwald(Eosina-Azul de metileno)

Bacillus megaterium. Tinción simple con cristal violeta.

Frotis sanguíneo con Yersinia pestis. Tinción de Wrigth.

Médula ósea. Tinción de May Grünwald-Giemsa.

Trypanosoma spen sangre. Tinción de Wrigth.

Tinciones

•Tinción negativa de Cápsula

•Selectivas

Son utilizadas para dar color y aislar partes específicas de los microorganismos

- Endosporas- Flagelo- Núcleo

Tinción negativa de cápsula.Streptococcuspneumoniae.

Tinción de endosporas. Bacillus subtilis.

Tinción de flagelos.Proteus sp

Tinciones

•Diferenciales

Reaccionan de manera diferente entre las distintas clases de bacterias.

- Ziehl-Neelsen

- Gram

Tinción de Ziehl-Neelsen.

Tinción de Gram.

Tinción de Gram.

ColorantesCompuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; están formados por un grupo cromóforo que es la parte responsable del color, y un grupo auxócromo que al formar sales le permite disociarse y combinarse. Mordente : compuesto químico intensificador de color.

•Ácidos.

El cromóforo es el anión de la molécula.

•Básicos.

El cromóforo es el catión de la molécula.

Br

NaO

Br

O

Br

O

Br

COO- Na+

Eosina

N

S(CH3)2N N(CH3)2+

Cl-

Azul de metileno

Técnicas de tinción

•Tinción simpleColorante básico (1 minuto)

Enjuagar con agua

Frotis

Bacillus anthracisTinción simple con cristal violeta.

Staphylococcus aureus.Tinción simple con azul de metileno.

Neisseriagonorrhoeae. Tinción simple con safranina.

Pseudomonas aeruginosa. Tinción simple con safranina.

Técnicas de tinción

•Tinción de cápsula

Extendido

Muestra + tinta china o nigrosina

Safranina de Gram o Cristal Violeta (1 minuto)

Secar al aire

Streptococcus pneumoniae

Acinetobacter calcoaceticus

Técnicas de tinción

Verde de malaquita 5% con emisiones de vapor de agua (10 minutos)

Lavar con agua

Safranina 0.5% (1minuto)

•Tinción de endosporas

Bacillus subtilis

Clostridium tetani

Técnicas de tinción

•Tinción de flagelo

Colorante primario. Para-rosa anilina

Mordente. Acido tánico

Colorante de contraste. Azul de metileno

Proteus vulgaris

Vibrio cholerae

Colorante primario. Cristal violeta 1% en solución de oxalato de amonio al 0.85% (1 minuto)

Colorante de contraste. Safranina 0.25% (1 minuto)

Mordente. Lugol Iº/KI 1g/2g en 300 mL de agua (1 minuto)

Decoloración. Alcohol-Acetona 70:30. Hasta eliminar el exceso de colorante

•Tinción de Gram

Técnicas de tinción

Streptococcus pyogenes

Bacilos Gram negativos y levaduras

Técnicas de tinción

Colorante primario. Fucsina fenicada con emisiones de vapor de agua (10 minutos)

Colorante de contraste. Azul de metileno de Loeffler (1 minuto)

Decoloración. Alcohol-Acido (etanol-HCl) 97:3. Hasta eliminar el exceso de colorante

•Tinción de Ziehl-Neelsen(BAAR)

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis

BaciloÁcidoAlcoholResistente

Fijar carbol- fucsina calentar

Mantener humedo calentar lavar con agua

Decolorar con ETOH-HCl Contrastar con azul Observar 1000X

de metileno

Tinción de

Ziehl-

Neelsen

Nocardia sp.

Bacterias filamentosas,

Acido-Alcohol-Resistentes

Microscopía

Microscopía

http://twistedbacteria.blogspot.com/

Comparación de tamaño entre varios átomos, moléculas y microorganismos. No está dibujado a escala. Tomado de Alcamo´s Fundamentals of Microbiology.

Microscopía

Las bacterias y las célulasde arqueastienenaprox. 1–5 micrómetros(µm) largo.

Microscopía óptica y electrónica

Tipos de microscopías•Óptica de campo claro •Óptica de campo oscuro

•Contraste de fases •De contraste de interferencia diferencial (DIC).

Tipos de microscopías•Confocal •De fluorescencia

•Electrónica de barrido •Electrónica de transmisión

En la microscopía de fluorescencia, el especímen es cubierto con un colorantefluorescente y se ilumina con luz ultravioleta.

Microscopía de fluorescencia de células esporulantes de B. subtitlusCourtesy of Dr. Peter Lewis; School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

La microscopía electrónica provee imágenesdetalladas de células, partes celulares, y virus.

Los electrones son absorbidos, reflejados o transmitidos dependidendo de la densidad de las estructuras en la muestra.El límite de resolución es aprox. de 2nm.

Microscopía electrónica de Transmisión (TEM)

Con la Microscopía Electrónica de Transmisión se visualizan estructuras en cortes ultrafinos de células.

Pseudomonas whole cells TEM

© CNRI/Photo Researchers, Inc.

La microscopía electrónica de barrido (scanning electron microscope (SEM)) Se utiliza para visualizarsuperficies de objetos no seccionados.

© Dr. Dennis Kunkel/Visuals Unlimited

Pseudomonas whole cells SEM

http://www.microscopyu.com/staticgallery/featuredmicroscopist/deerinck/images/deerinckimage8large.jpg

Confocal image of some dividing cells that are triple labeled for Golgi apparatus (green), microtubules (red), and DNA (blue).

Microscopía

http://endospore.freeblog.hu/files/early_microscope.jpg