2.Biosintesís de Metabolitos Primarios y Secundarios.2015
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Biosintess de
Metabolitos Primarios
y Secundarios
Dra. Sully Cruz V.
Fitoqumica
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Biognesis y Biosntesis
Biognesis: Sntesis de cualquier sustancia,
sin importar si se requiere o no energa.
Biosntesis: Lo reservan para definir la
produccin de molculas mediante un
proceso endoergnico.
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Importancia del estudio de
los procesos biosintticos
Quimiotaxonoma
Determinacin de estructuras orgnicas.
El estudio de mecanismos de reacciones
orgnicas.
Cultivo de tejidos y rganos para producir
metabolitos en gran escala.
Elaborar productos naturales a partir de los
intermediarios.
Sntesis de frmacos.
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Enzimas
Muchas reacciones que tienen lugar
en la clula son enzimo-dependientes.
Catalizadores orgnicos.
Suelen actuar slo sobre una
sustancia o clase de sustancias, ya que es especfica para un grupo o enlace determinado.
Influyen en la velocidad de una reaccin sin cambiar el punto de equilibrio.
Lipasa cataliza la sntesis e hidrlisis de los glicridos formados por el glicerol y cidos grasos.
-glucosidasa (prunasa) sntesis e hidrlisis de -glucsidos.
En las plantas, estas reacciones son reversibles, segn las diferentes condiciones que dan lugar a variaciones diarias y estacionales de la acumulacin de metabolitos.
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Enzimas Son de naturaleza coloidal, se componen de
protena.
Son solubles en agua como en soluciones salinas diluidas y precipitan por el alcohol o la acetona.
Son inactivadas mediante calor, luz UV y rayos X.
Son biocatalizadores (qumica analtico o clnica) o para efectuar transformaciones qumicas especficas.
La actividad se ve afectada por la reaccin del medio y la presencia de sustancias (sales).
Sus pesos moleculares son elevados.
Pueden inactivarse la parte proteica purificada (apoenzima).
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Coenzimas
Molculas orgnicas constituidas por
steres del cido fosfrico y diversos nuclesidos.
Sirven para transportar energa en forma de enlaces fosfato de alta energa.
ATP (adenosin trifosfato) y ADP aporta energa.
NAD y NADP intervienen en los sistemas de oxidoreduccin con enzimas apropiadas.
CoA (coenzima A) participa en el transporte de grupos acetilo y acilo.
Acetil-CoA desempea un papel central en el metabolismo vegetal y animal.
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Clasificacin de las enzimas
Oxidoreductasas (sustancias fenlicas quinonas)
Transferasas
Hidrolasas (hidrlisis de steres, glicridos)
Liasas
Isomerasas
Ligasas (Sintetasas)
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Enzimas ms importantes
Aminocido-descarboxilasas:
Acido glutmico Acido gama-amino
butrico
cido glutmico
descarboxilasa
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Amino-transferasas:
H
R- C-COOH Aminotransferasa R-CO-COOH + NH3
NH2
Las aminotransferasas o transaminasas
son un conjunto de enzimas del grupo de
las transferasas, pues transfieren grupos
amino desde un metabolito a otro,
generalmente aminocidos
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Metil-transferasas:
Metil-transferasa Acido nicotnico Trigonelina
COOH -COOH
N N-CH3
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Hidroxilasas aromticas:
Fenilalanina-hidroxilasa
Fenilalanina Tirosina
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Estearasas:
Estearasa
Tropina + Ac. Trpico Atropina + H2O
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Fotosntesis Proceso de conversin de la energa luminosa
solar en energa qumica. La energa qumica as obtenida hace posible la sntesis de las molculas orgnicas. Proceso de xido-reduccin.
El dixido de carbono es convertido en azcares por las plantas verdes.
CO2 + H2O (CH2O) + O2 Tiene lugar en los cloroplastos.
Produccin de ATP a partir de ADP y fosfato y descomposicin de agua por la energa de la luz.
Se distinguen dos fases:
La fase lumnica.
La fase oscura.
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Metabolismo Vegetal
En los organismos vivos los compuestos qumicos son sintetizados y degradados por una serie de reacciones qumicas, muchas de ellas mediadas por un enzima.
Ese proceso es conocido colectivamente como metabolismo, e incluye el catabolismo (degradacin) y el anabolismo (biosntesis).
Tipos:
Primario y Secundario
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Metabolismo Primario
El metabolismo primario conjunto de aquellas vas de sntesis y de utilizacin de los compuestos esenciales para la supervivencia y el desarrollo correcto de los organismos, que son denominados metabolitos primarios.
Todos los organismos poseen caminos metablicos similares con los que sintetizan y utilizan para ello un cierto nmero de sustancias qumicas: azcares, aminocidos, cidos grasos comunes, nucletidos y los polmeros derivados de ellos (polisacridos, protenas, lpidos, ARN, ADN, etctera).
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Metabolismo Primario
El metabolismo primario comprende los procesos qumicos que cada planta debe realizar cada da para sobrevivir y reproducirse
Fotosntesis
Gliclisis
Ciclo del cido ctrico
Sntesis de aminocidos
Transaminacin
Sntesis de protenas y enzimas
Sntesis de coenzimas
Sntesis de materiales estructurales
Duplicacin de material gentico
Reproduccin celular (crecimiento)
Absorcin de nutrientes
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Metabolismo Secundario Los metabolitos secundarios y las vas para su
sntesis y utilizacin constituyen el metabolismo secundario.
Esas rutas metablicas son debidas a la informacin gentica especfica del organismo, en mayor grado que las rutas del metabolismo primario.
Son activadas durante estados particulares del crecimiento o durante perodos de condiciones adversas (dficit hdrico y nutricional, ataque, etctera).
Aunque entre esos organismos se encuentran bacterias, hongos, levaduras y animales, los vegetales son los organismos con mayor actividad y riqueza de metabolismo secundario.
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Metabolitos Secundarios
No son esenciales para la clula vegetal.
Su deteccin contribuye a efectuar
caracterizaciones quimio-taxonmicas.
Ej: alcaloides, glicsidos, aceites
esenciales, resinas, taninos, esteroides,
saponinas. Aminocidos escasos en el
reino vegetal y que no forman
protenas: cido pipeclico,
hipoglicinas, cido stizoblico, beta-
urasil-3-alanina.
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Factores que afectan produccin
de metabolitos secundarios:
Factores extrnsecos:
Clima y temperatura.
Agua de lluvia y humedad
atmosfrica.
Condiciones del suelo: condiciones
fsicas: tamao de las partculas,
humedad y temperatura.
Condiciones qumicas: pH, iones.
Condiciones microbiolgicas.
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Factores que afectan
produccin de metabolitos
secundarios:
Factores intrnsecos:
Genticos.
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Metabolismo Primario y Secundario
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Clasificacin
Los productos naturales de origen vegetal se
clasifican en grandes categoras qumicas:
Glcidos.
Lpidos.
Aminocidos, aminas y protenas.
Compuestos fenlicos.
Terpenoides (isoprenoides).
Alcaloides.
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Glcidos
Los componentes glucdicos del reino vegetal son muy diversos y son los ms abundantes.
La celulosa es el compuesto orgnico ms sintetizado.
Los glcidos pueden ser:
Monosacridos.
Oligosacridos.
Polisacridos.
Hetersidos.
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Acido orselinico
fenilpirona Antrona
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Polictidos
Est presente en bacterias, hongos y en
plantas.
Sirve nicamente para la produccin de
metabolitos secundarios.
arte del malonil-CoA que forma el primer
paso en la sntesis de cidos grasos.
Ejemplos:
Griseofulvina (antibitico producido por Penicillium griseofulvum)
Aflatoxinas (toxinas producidas por Aspergillus flavus y por A. parasiticus)
Ocratoxinas (toxinas producidas por algunos tipos de Aspergillus y de
Penicillium)
Lovastatina (producida por A. terreus).
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Terpenos (Terpenoides)
Se inician a partir del Acetil-CoA.
Produce tanto metabolitos primarios
(carotenos, esteroles) como secundarios.
Ejemplos:
Ciertos carotenos.
Toxinas como la toxina T2 y los tricotecenos (producidos por alguna especie
de Fusarium).
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Terpenos (Terpenoides)
Grupo de compuestos lipdicos diverso y
numeroso:
formado por alrededor de 30,000 compuestos
insolubles a parcialmente miscibles en agua
son biosintetizados a partir del acetil-CoA o intermediarios de la gliclisis
Compuestos derivados de la unin de unidades isopreno de 5-carbonos (C5H8)
los terpenos se conocen tambin como isoprenos o isoprenoides
Tambin se conocen como terpenoides si se encuentran presentes otros elementos (especialmente oxigeno)
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Terpenos (Terpenoides)
Ruta del cido mevalnico: 3 molculas de acetil-
CoA se unen para formar cido mevalnico
El cido mevalnico es un intermediario de 6-
carbonos -fosforilado con 2 grupos fosfato
(pirofosfato) -descarboxilado y deshidratado para
producir isopentenil pirofosfato (isopentenil
difosfato) - IPP
Ruta independiente del mevalonato: utiliza
intermediarios de la gliclisis para sintetizar IPP
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Biosntesis de terpenos
La biosntesis de los terpenos depende de
un nmero variable de condensaciones
consecutivas de los dos monmeros
activos
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La principal funcin de los esteroles
en plantas es formar parte de las
membranas y determinar su
viscosidad y su estabilidad.
Algunos esteroles tienen funciones
protectoras frente a insectos como en
el caso de la ecdisona aislada del
helecho comn
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cidos grasos y derivados
cidos grasos: cidos monocarboxlicos
de cadena carbonada lineal, de nmero
par de tomos de C. Saturados e
Insaturados.
Metabolitos derivados de los cidos
grasos naturales: Triglicridos,
Poliacetilenos, Eicosanoides.
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Sntesis de cidos grasos
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Compuestos Fenlicos
El elevado nmero de compuestos fenlicos puede formarse gracias a una biosntesis muy compleja, pero perfectamente regulada.
Se conocen tres vas que pueden llevar a la formacin de compuestos aromticos:
Acetato-mevalonato: puede producir anillos aromticos con grupos hidroxilo en algunos casos, pero los compuestos formados son terpenos.
Acetato-malonato: produce el anillo A de los flavonoides.
cido shiqumico: es la va principal de formacin de compuestos fenlicos.
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Sntesis de Fenoles: Va del
Acetato-Malonato
En algunas plantas el ciclo bencnico se forma
mediante la ciclacin de cadenas policetnicas.
stas se forman por condensacin de grupos acetato
que proceden del cido malnico.
La condensacin de tres molculas de malonil CoA
se produce mediante una descarboxilacin
simultnea, con lo cual se forma el anillo bencnico.
A partir del cual se puede formar el anillo A de los
flavonoides o el 6-metil-salcilico, importantsmo
como seal sistmica de defensa de la planta.
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Sntesis de Fenoles: Va del
cido Shiqumico
El cido trans-cinmico es precursor de las cumarinas y furocumarinas.
El cido p-cumrico es precursor de: lignanos y ligninas.
El cido dihidroxi-shiqumico, precursor inmediato del cido shiqumico forma compuestos fenol-carboxlicos (C6-C1).
El cido dihidroxiqunico, segundo precursor inmediato del cido shiqumico, (se mantiene en equilibrio con el cido qunico) se une el cido protocatquico (un fenol-carboxlico) cido glico.
El cido glico y sus derivados constituyen los taninos hidrolizables por esterificacin con monosacridos.
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Sntesis de Fenoles: Origen
Mixto
Generalmente, los fenoles se forman mediante la incorporacin de uno, dos o tres residuos acetatos (procedentes cada uno de ellos de un malonil CoA) a un cido cinmico (o a alguno de sus derivados).
Esta cadena lateral as formada, con frecuencia sufre una ciclacin, con lo cual se obtienen muy diversos compuestos qumicos.
Un grupo lo constituyen los derivados estilbnicos. Algunos se comportan como fitoalexinas, sustancias de defensa vegetal, con actividad antifngica y antibacteriana.
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Sntesis de Fenoles: Origen
Mixto El grupo ms numeroso e importante lo constituyen los
flavonoides, que presentan dos anillos (A y B) unidos por
una cadena de tres tomos de carbono
Con frecuencia entre ambos anillos (A y B) se sita un
heterociclo que, en parte, es responsable de la gran
diversidad de flavonoides identificados en el reino vegetal.
Suelen encontrarse en forma de O-hetersidos, aunque
tambin hay C-hetersidos.
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Sntesis de Fenoles El ncleo de chalcona es el precursor de todos los
flavonoides.
Este ncleo se forma en los cloroplastos, a partir de cinamoil-CoA, que procede del retculo endoplasmtico.
Los grupos acetato proceden de tres malonil-CoA.
La chalcona sintetasa (eliminndose tres molculas de CoA y tres CO2) incorpora una cadena poliacetilnica, formndose la chalcona
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Sntesis de Fenoles
A partir de las chalconas se forman, por reacciones catalizadas mediante enzimas especficos, los distintos grupos y compuestos de flavonoides y afines
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La ruta del cido malnico es una fuente importante
de fenoles en hongos y bacterias, pero es poco
empleada en plantas superiores.
La ruta del cido siqumico es responsable de la
biosntesis de la mayora de los compuestos fenlicos
de plantas. Esta ruta est presente en plantas, hongos
y bacterias, pero no en animales.
La fenilalanina y el triptfano se encuentran entre
los aminocidos esenciales para los animales que
se incorporan en la dieta.
La tirosina no es esencial en el sentido de que los
animales pueden sintetizarla por hidroxilacin de
fenilalanina.
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Biosntesis de alcaloides
Estructuras complejas, muchos pasos biosinteticos
se encuentran como mezclas de compuestos estructuralmente relacionados (ej. alcaloides triterpnicos de la papa)
las rutas biosintticas comienzan con una descarboxilacin
Pueden incluir otros componentes (ej) vinblastina, (terpenoide indlico dimrico); solanidina (alcaloide tripterpnico de la papa)
sntesis y almacenamiento rgano especficos (cortezas, races, flores)
secuestrados en clulas y estructuras especiales (vacuolas, vesculas de ltex, epidermis)
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Biosntesis de alcaloides
La sntesis de alcaloides est relacionada con la
evolucin de las plantas. As, se hallan en muchas Angiospermas, sobre todo Dicotiledneas, siendo raras en las Monocotiledneas (a excepcin de las Liliceas).
Raramente se encuentran alcaloides en las Gimnospermas, las Pteridofitas y las Talofitas.
Algunos alcaloides son peculiares de un gnero (como la aconitina del Acnito), mientras que otros, como la cafena, se pueden localizar en numerosas plantas filogenticamente muy alejadas: Rubiceas, Esterculiceas, Sapindceas, Lilicceas...
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Aminocidos esenciales como
precursores biosintticos
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Biosntesis de Alcaloides
AMINOCIDOS
BSICOS:
Ornitina, arginina: Pirrolidnicos (nicotina).
Tropnicos (hiosciamina).
Pirrolizidnicos (retronecina).
Lisina: Piperidnicos (anabasina, sedamina, lobelina,
espartena, lupinina).
Alcaloides del Lycopodium.
AROMTICOS:
Fenil-alanina: (Efedrina, taxol, lunarina).
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Biosntesis de Alcaloides - Tirosina:
Feniletilaminas (tiramina, hordenina).
Isoquinolnicos (peyotina, lofoforina).
Benzilisoquinolnicos: Derivados de la reticulina (morfina, berberina, papaverina, narcotina).
- Otros.
Isoquinolnicos derivados de la norbelladina (Amaryllidaceae).
(Colchicina).
(Emetina y relacionados).
Betalainas (Cariofilales).
Triptfano:
Bases simples (triptamina, bufotenina, psilocina,estricnina).
Derinados de la carbolina (harmanina).
Ergolina: (ergotamina).
Triptfano-monoterpenos.
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Vas de sntesis simplificadas
de algunos alcaloides
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Tipos de reacciones
involucradas en los procesos
biosintticos
Formacin de la base de Schiff: es la condensacin
de un grupo amino con un grupo carbonilo
C=O + NH2-R` C=N-R` + H2O
Condensacin aldlica entre compuestos que
contienen el grupo amino
H-N=CH-CH2 + -CH2-CH=N- NH-CH-CH2-
-CH-CH=N-
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Tipos de reacciones
involucradas en los procesos
biosintticos
Condensacin de la carbinolamina
N-C-OH + HC-X N-C-C-X + H2O
Oxidaciones
-CH2OH NAD+ NADH + H+ -C=O
H
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Tipos de reacciones
involucradas en los procesos
biosintticos
Transaminaciones
CH3 CH3
C=O H-C-NH2
COCH COOH
Reduccin de los grupos carbonilos y de
dobles enlaces conjugados
-CH=CH-C=O -CH2-CH2-CH2OH
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Mtodos para el estudio
de las Rutas Biosintticas
Marcaje con Istopos:
Se utilizan istopos marcados (C, H, N) con el
objeto de rastrear el metabolismo de las
sustancias.
Se pueden hacer crecer las plantas en una
atmsfera de CO2 marcado con C14.
Se analizan los tejidos a determinados intervalos
para establecer cmo van apareciendo los nuevos
compuestos formados.
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Mtodos para el estudio
de las Rutas Biosintticas
Secuencia Precursor-Productos
Un probable precursor de la molcula se
administra ya marcado a la planta.
Se separa el producto, se purifica y se
determina su radioactividad la cual se
compara con la de la molcula del
producto esperado.
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Mtodos para el estudio
de las Rutas Biosintticas
Mtodos para la introduccin del precursor a la planta:
Por inyeccin directa de soluciones radioactivas a la planta.
A travs del cultivo de la planta en una solucin del metabolito.
Esparciendo sobre las hojas una solucin del metabolito.
Infiltrando la solucin radioactiva a travs del tallo.
Mediante el cultivo de rganos aislados, con lo cual se elimina la interferencia de otros rganos que puedan producir cambios en los metabolitos.
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Cultivo de tejidos
Cultivos en medio slido:
Consiste en germinar las semillas aspticamente y
cuando se hayan desarrollado suficientemente se
separa una raz, un tallo, o una hoja en
condiciones estriles y se coloca sobre el medio de
cultivo.
La esterilizacin puede hacerse tratando la planta
con una solucin de hipoclorito de sodio o calcio al
0.8-2.5% durante 5 a 30 min. Luego el tejido se
lava varias veces con agua destilada.
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Cultivo de tejidos
Cultivos en Medio Lquido
Se limita a rganos en suspensin. La raz es el
rgano ms comnmente cultivado.
Para ello se transfiere tejidos de callus a un medio lquido, luego que ste se ha dispersado, se transfiere
peridicamente a otro medio (agua de coco, levadura
o casena).
El cultivo de tejidos permite conocer los reguladores
del crecimiento de las plantas, lo cual ha llevado a
optimizar la produccin de plantas medicinales,
comestibles y ornamentales.
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Los estudios de cultivo de tejidos
vegetales han permitido entender y
descubrir los reguladores de
crecimiento de las plantas, lo que ha
llevado a optimizar la produccin de
plantas medicinales, comestibles y
ornamentales.
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Micropropagacin de
especies medicinales y
aromticas
Se define como el conjunto de
tcnicas que permiten el cultivo en
condiciones aspticas de rganos,
tejidos, clulas y organelas,
empleando medios de cultivo
artificiales (Pierik, 1991).
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Coleccin de germoplasma
Establecimiento de un huerto clonal
Marcha fitoqumica
Seleccin de material elite
Establecimiento de un protocolo de asepcia
Seleccin del explante
Evaluacin de medios de cultivo
Iniciacin
Multiplicacin
Enraizamiento
Endurecimiento y aclimatacin
Adaptacin en campo
Etapas de la micropropagacin
para la regeneracin de especies
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La clula vegetal como unidad
fundamental
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Subcultivos bajo cmara de flujo laminar
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Test de viabilidad y estabilidad celular
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Regeneracin in vitro de
especies
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ETAPAS
Seleccin del explante elite procedente de plntulas
micropropagadas
Evaluacin de las condiciones de cultivo para induccin de
callognesis
Multiplicacin de los callos
Transferencia y disgregacin de los callos en medios sumergidos
(a nivel de matraces)
Evaluacin de las condiciones (fsico-qumicas y biolgicas) de
cultivo para el mantenimiento y multiplicacin de biomasa
Tamizaje y produccin de un inculo adecuado para llevar a
condiciones de un biorreactor
Evaluacin de condiciones de cultivo (fisicos-qumicos y
biolgicos) bajo condiciones automatizadas de un biorreactor
de laboratorio
Cultivo de clulas en suspensin
para produccin de bioactivos
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Secuencia del proceso para
produccin de callo friable
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Multiplicacin de callos
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Transferencia y disgregacin de
callos en medio sumergido
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Establecimiento de clulas en
suspensin
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Cultivo de clulas en
suspensin
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Evaluacin de condiciones de cultivo bajo
condiciones automatizadas de un
biorreactor de laboratorio
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Fsicoqumicos
Luz: presencia o ausencia; fotoperodo, intensidad y calidad
Agitacin
Temperatura
Concentracin de gases (O2 y CO2)
Composicin qumica del medio de cultivo
pH
Biolgicos
Estado fisiolgico celular
Viabilidad
Estabilidad celular
Inmovilizacin celular
Monitoreo de elicitores biolgicos
Parmetros a evaluar
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Monitoreo del ciclo celular
Curva de cintica celular
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Alcaloides Alergenos Antraquinonas Agentes antileucmicos Agentes antitumorales Agentes antivirales Agentes antibiticos Agentes insecticidas Agentes molusquicidas Aromas Perfumes Saborizantes Pigmentos Aceites esenciales Benzoquinonas Carbohidratos Chalconas Diantronas Furanocumarinas Hormonas Vitaminas
Lpidos Naftoquinonas Acidos nuclicos Nucletidos Inhibidores enzimticos Opiaceos Acidos rganicos Protenas Pptidos Fenoles Hormonas Reguladores de crecimiento Esteroides Reserpina Glicsidos cardacos Esteroides derivados Azcares Taninos Flavones y flavonoides Terpenos y terpenoides
Algunos de los productos generados por
plantas
Fuente: Fundamentals of Food Technology, 1996
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Algunos de los productos
comercializados en la
actualidad Producto Fuente de clulas Biorreactor Volumen
Shikonin Lithospermum erythrorhizon
Batch culture 750 litros
Sistma en dos etapas
Berberine Thalictrum minus, Coptis japonica
Batch culture y en produccin continua en biorreactores de turbina
4000 litros
Saponinas de Ginseng
Panax ginseng Cultivo de clulas y raices
20.000 litros
Taxol Taxus brevifolia Biorreactor de turbinas
75.000 litros
Sanguinarine Papaver somniferum Biorreactor Airlift
300 litros
Fuente: Smith, 1995
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Comparacin de la produccin de clulas
vegetales en biorreactores, con respecto a
los cultivos naturales
Producto Especie Produccin en cultivos celulares
% Peso seco Cultivo natural
Relacin de produccin Cultivo/Planta
Antociania Vitis sp 16 10 1.6
Euphorbia milli 4 0.3 13.3
Perilla frutescens
24 1.5 16
Antraquinona
Morinda citrifolia
18 2.2 8.2
Berberina Coptis japonica 13 4 3.3
Thalictrum minor
10 0.01 1000
Acido rosmarnico
Coleus blumei 27 3 9
Shikonina Lythospermum erythrorhizon
14 1.5 3.3
Fuente: Zhong et al., 1995.
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1. Seleccin de la fuente vegetal
2. Induccin de callos in vitro en medios slidos
3. Seleccin de lneas celulares altamente productoras
4. Cultivo de clulas en suspensin en medios lquidos a nivel de matrax
5. Optimizacin del cultivo y seleccin
6. Produccin de un buen inculo para llevar a biorreactor
7. Transferencia a biorreactor a escala de 100 litros
8. Transferencia a biorreactor a escala de 10.000 litros o ms
9. Procesos de separacin celular y de producto
10. Procesos de recuperacin: Separacin y purificacin (Down-stream processing)
Mhlbach, 1998.
Secuencia del proceso para
produccin de metabolitos en
biorreactores
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Bioproductos de las nuevas
bioindustrias