3.4 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

La cromatografa es un mtodo fsico de separacinbasado en la distribucin de los componentes deuna mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija oestacionaria y otra mvil.

En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquidoque fluye a travs de una columna que contiene ala fase fija.

La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo enuna columna generalmente de vidrio, la cual estrellena con la fase estacionaria.

Luego de colocar la muestra en la parte superior, sehace fluir la fase mvil a travs de la columna porefecto de la gravedad.

Caractersticas: Columnas de vidrio Dimetros de 1 a 5 cm Longitudes de 50 a 500 cm Fase estacionaria slida con de partcula de 150 a

200 m Tiempo de separacin: varias horas

Con el objeto de aumentar la eficiencia en lasseparaciones, el tamao de las partculas de fase fija sefue disminuyendo hasta el tamao de 3 a 10 m, lo cualgener la necesidad de utilizar altas presiones para lograrque fluya la fase mvil.

Se ha convertido en la tcnica de separacin msampliamente utilizada, debido a: Su sensibilidad Fcil adaptacin a determinaciones cuantitativas Separacin de especies no voltiles o termolbiles Aplicacin a sustancias que son de inters primordial

en la industria

De esta manera, naci la tcnica de cromatografalquida de alta resolucin (HPLC), que requiere deinstrumental especial que permita trabajar con las altaspresiones requeridas.

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:

1. Cromatografa de adsorcinLa fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamenteslice (slica) y en mucha menor medida almina.

2. Cromatografa de reparto

En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizancompuestos unidos qumicamente a un soporte slido deslica. Se la subdivide en cromatografa en fase normal yfase reversa.

En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar(como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestosmenos polares eluyen primero.

En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unidoqumicamente es un hidrocarburo aliftico y se empleanfases mviles polares. En este caso, las sustancias mspolares eluyen primero.

3. Cromatografa inicaSe utilizan columnas rellenas con resinas de intercambioinico para separar y determinar iones.

4. Cromatografa de exclusin por tamaoLa fase fija est formada por partculas polimricas o deslice que contienen una red uniforme de poros y llevana cabo un fraccionamiento relacionado con el tamaomolecular.

Las molculas de tamao mayor son excludas y eluyenprimero, mientras que las ms pequeas que penetranen los poros son retenidas ms tiempo.

INSTRUMENTAL

Un equipo para cromatografa lquida de altaresolucin puede representarse por elsiguiente esquema:

FASE MVIL BOMBA VLVULA DE INYECCIN

COLUMNA

DETECTOR

REGISTRADORINTEGRADOR

Chromatograms

Supelcosil LC-PAH Columns. A BConditions: A: 150mm x 4.6mm, 5.

Flow Rate: 1.5 mL/min

Conditions: B: 50mm x 4.6mm, 3.

Flow Rate: 3.0 mL/min

FASE MVIL

La fase mvil puede ser un solvente puro o unamezcla de solventes.

Cuando se trata de una mezcla, puede programarsela bomba para que tome solventes de diferentesbotellas (de vidrio o acero inoxidable) en unaproporcin determinada y realice la mezcla en unacmara de mezclado. El mtodo se denominaelucin con gradiente

Cuando durante toda la separacin se utiliza siempreel mismo solvente, se denomina elucinisocrtica

Instrumento de elucin isocrtica

Sistema de elucin con gradiente

SISTEMA DE BOMBEO Y DE INYECCIN

Se utilizan tres tipos de bombas:

Recprocas De desplazamiento Neumticas

La introduccin de la muestra puede hacerse de dos maneras:

Por medio de una jeringa A travs de una vlvula

El tamao de la muestra es de dcimas de l a 500 l

Inyeccin de la muestra

COLUMNAS

Columnas analticas:

Longitud: de 10 a 30 cm Dimetro interno: 4 a 10 mm Tamao de partcula: 5 a 10 m Eficiencia: de 40,000 a 60,000 platos/m

PrecolumnasPara aumentar la vida de la columna, eliminamateria en suspensin y contaminantes deldisolvente

DETECTOR

Tipos:

a)Los que se basan en una medida de una propiedadde la disolucin.Ejemplos: ndice de refraccin, densidad, constantedielctrica, que se modifica con la presencia delanalito.

b)Detectores basados en la medicin de unapropiedad del soluto, ejemplo: Absorbancia en el UV,Fluorescencia, Infrarrojo, etc.

3.4 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCINNmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Nmero de diapositiva 4Nmero de diapositiva 5Nmero de diapositiva 6Nmero de diapositiva 7INSTRUMENTALNmero de diapositiva 9Nmero de diapositiva 10Nmero de diapositiva 11ChromatogramsFASE MVILNmero de diapositiva 14Nmero de diapositiva 15SISTEMA DE BOMBEO Y DE INYECCINNmero de diapositiva 17Nmero de diapositiva 18COLUMNASDETECTOR