Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT

11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Asociación de los niveles séricos de sCTLA4 con parámetros de laboratorio en pacientes

mexicanos con esclerosis múltiple

Yessenia Getsemany Salgado Molina (Becaria)

Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

Programa UAGro Área III: Medicina y Ciencias de la Salud

yessy_b101@hotmail.com

Dr. Salvador Muñoz-Barrios* (Asesor-Investigador)

Unidad Académica de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Guerrero

smunozb@yahoo.com.mx*

Resumen

La Esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune que afecta al sistema nervioso

central presentando lesiones desmielinizantes que conllevan a un deterioro neurológico progresivo.

En esta enfermedad, se han identificado genes de susceptibilidad, incluido el gen CTLA4 (del

inglés, Cytotoxic T lymphocyte Antigen-4). CTLA4 actúa como un regulador negativo de estas

células mediante la inhibición de la proliferación celular y la síntesis de proteínas, además mantiene

la tolerancia periférica. El objetivo del presente estudio fue determinar la asociación de los niveles

séricos de sCTLA4 y parámetros de laboratorio en pacientes con EM y SC. Se analizaron 50

pacientes con EM, clasificados de acuerdo con los criterios de McDonald del 2010 y 50 sujetos

control (SC) pareados por edad y genero, a los cuales se les realizó citometría hemática y se

cuantificaron los niveles séricos de glucosa, de colesterol y de sCTLA4 (del inglés, soluble form

Cytotoxic T lymphocyte Antigen-4).. Se encontró que los niveles séricos de sCTLA4 en el grupo

con EM son más elevados que en el grupo de SC (13.34 pg/mL vs 9.98 pg/mL, p=0.0013), al igual

que el recuento leucocitario (6.9 106/mm3 vs 6.5 106/mm3, p=0.606), conteo de linfocitos (38%

vs 35%, p=0.538), niveles séricos de glucosa (79 mg/dL vs 72 mg/dL, p= <0.001) y colesterol

(199.57 mg/dL vs 174.87 mg/dL, p=0.001). Finalmente, al analizar el efecto de sCTLA4 sobre los

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parámetros de laboratorio, encontramos una ligera disminución del recuento eritrocitario en

pacientes con EM (β=-2.9455, p=0.007). Conclusión: El recuento leucocitario, el conteo de

linfocitos, los niveles séricos de glucosa, colesterol y sCTLA4 se observaron más altos en pacientes

con EM en comparación a los SC.

Palabras claves: Esclerosis múltiple, sCTLA4, parámetros de laboratorio

Introducción

La Esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune que afecta al sistema nervioso

central y médula espinal presentando lesiones desmielinizantes que conllevan a un deterioro

neurológico progresivo (Nylander y Hafler, 2012).

La EM es una enfermedad de etiología desconocida y es de distribución mundial; en México

la prevalencia reportada es de 12-15 casos por cada 100, 000 habitantes (Domínguez et al., 2012).

Esta afección se presenta principalmente en población adulta de 20 a 40 años con una relación

mujer/hombre de 2:3 (Files et al., 2015).

Sin embargo se ha encontrado que el 60% de la susceptibilidad para desarrollar EM es

debido a factores genéticos y aproximadamente la mitad de esta predisposición se atribuye a los

alelos HLA (Axelsson, 2013; Denic et al., 2013); además, han identificado otros genes de

susceptibilidad adicionales entre los cuales se encuentra el gen CTLA4 (Katrin Paap, 2013; Milo y

Kahana, 2010; Mkhikian et al., 2011; Sawcer et al., 2011) en donde la molécula CTLA4 juega un

papel importante en la patogénesis de la enfermedad manteniendo la tolerancia periférica (Tullman,

2013).

La proteína CTLA4, esta codificada por el gen CTLA4 y se expresa en los linfocitos T (LT)

y los linfocitos T reguladores (LTreg), actúa como un regulador negativo de estas células mediante

la inhibición de la proliferación celular y la síntesis de proteínas (Heidari et al., 2010). Este gen

produce dos isoformas diferentes: una proteína de longitud completa (flCTLA4, del inglés, Full-

length protein CTLA4) expresada por LT activados y que funge como un receptor transmembranal

que inhibe la proliferación celular; y una forma soluble (sCTLA4, del inglés Soluble form CTLA4),

la cual se ha observado que funciona como un receptor funcional para los antígenos CD80 y CD86

de las células presentadoras de antígeno sugiriendo que sCTLA4 puede bloquear la interacción de

estos antígenos con la proteína coestimuladora CD28, interfiriendo con su señalización e

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inhibiendo la proliferación de LT (Palacios et al., 2008). Además, CTLA4 además reduce las

señales proinflamatorias y produce anergia (Kow y Mak, 2013).

Existen estudios donde se ha sugerido que los niveles séricos de sCTLA4 contribuyen al

desarrollo de enfermedades autoinmunes como EM, Artritis Reumatoide (AR), Diabetes Tipo 1 y

Lupus Eritematoso Sistémico (Benmansour et al., 2010; Cizmarevic et al., 2011; Devaraju et al.,

2014; Gyu Song y Ho Lee, 2013; Heidari et al., 2010; Malferrari et al., 2005; Muñoz-Valle et al.,

2010; Torres-Carrillo et al., 2013; Wagner et al., 2015). Además, estudios previos han reportado

que los niveles séricos elevados de sCTLA4 podrían estar asociados con el curso clínico de EM

(Saverino et al., 2010).

Sin embargo, en México no existen estudios que evalúen esta asociación, por lo cual nos

planteamos analizar la asociación de los niveles séricos de sCTLA4 con parámetros de laboratorio

en pacientes mexicanos con EM.

Materiales y Métodos

Se realizó un estudio transversal-analítico donde Se incluyeron 50 pacientes con EM de

México, clasificados de acuerdo a los criterios de McDonald 2010 (Polman et al., 2011) que

acudieron a consulta en el Servicio de Neurología del Hospital General de México “Dr. Eduardo

Liceaga” y 50 sujetos control (SC) mexicanos reclutados en la población general pareados por edad

y género con los pacientes con EM.

El proyecto se realizó de acuerdo a las normas y principios éticos para las investigaciones

médicas en seres humanos, establecidos en la declaración de Helsinki y que fueron revisados por

última vez en la 64a Asamblea General realizada en Fortaleza, Brasil, en octubre de 2013. La

participación de los sujetos incluidos en el estudio fue de manera voluntaria, con previa firma de

la carta de consentimiento informado.

A todos los participantes se les tomó una muestra sanguínea mediante un sistema de tubos

al vacío (Vacutainer, BD, EUA). La toma de muestra se realizó con un ayuno mínimo de 12 horas,

se colectaron dos tubos de muestra sanguínea por paciente, uno con y otro sin anticoagulante, este

último se sometió a centrifugación a 3,000 rpm (1046 g) en una centrífuga Z200A (Hermle

LaborTechnik, Alemania) durante 10 minutos a temperatura ambiente para la obtención del suero.

A partir de la sangre periférica recolectada en el tubo con anticoagulante se realizó una

citometría hemática de manera automatizada con un citómetro BC-2800 (Mindray, China). La

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cuantificación de la velocidad de sedimentación globular (VSG) se realizó mediante la técnica de

Wintrobe (Wintrobe y Landsberg, 1935).

Los niveles séricos de glucosa se determinaron mediante la técnica de GOD-PAP. En la

cual, en tubos de 13 x 100 mm se colocaron 10 µl de suero y 1000 µl de reactivo y enseguida se

homogenizaron. Posteriormente, se incubaron por 10 minutos a 37° C. Se leyó la absorbancia a

una longitud de onda de 500 nm en un espectrofotómetro semiautomatizado SpinLab (Spinreact,

España). La concentración de los niveles séricos de glucosa fue calculada de manera automática

por el equipo de laboratorio.

Los niveles séricos de colesterol se determinaron mediante la técnica de CHOD-PAP. En

la cual, en tubos de 13 x 100 mm se colocaron 10 µl de suero y 1000 µl de reactivo y enseguida se

homogenizaron. Posteriormente, se incubaron por 5 minutos a 37° C. Se leyó la absorbancia a una

longitud de onda de 500 nm en un espectrofotómetro semiautomatizado SpinLab (Spinreact,

España). La concentración de los niveles séricos de glucosa fue calculada de manera automática

por el equipo de laboratorio.

La cuantificación de los niveles séricos de sCTLA4 se realizó en las muestras de 50

pacientes con EM y 50 SC, mediante la técnica de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima

(ELISA, del inglés Enzyme linked-immunosorbent assay), este método se basa en la determinación

cuantitativa de la sCTLA4 en suero o plasma humano y la prueba se realizó de acuerdo a las

recomendaciones del fabricante (BioLengend, USA).

Se llevó a cabo un análisis estadístico descriptivo e inferencial, tomando como nivel de

significancia p<0.05. El análisis descriptivo de las variables incluyó el cálculo de medidas de

tendencia central (media aritmética, mediana) y medidas de dispersión (desviación estándar,

percentil 5, percentil 95). El análisis inferencial se realizó utilizando pruebas paramétricas

(ANOVA) y pruebas no paramétricas (X2, Kruskal-Wallis).

Resultados

Se analizaron los datos de 50 pacientes con EM y 50 sujetos control, originarios de México,

pareados por edad y género (cuadro 1), el 52% fueron del género femenino mientras que el 48%

del género masculino. Además, los pacientes con EM presentaron niveles incrementados de

hemoglobina, VSG, glucosa y colesterol comparados con los niveles de los SC (p=0.004, p<0.001,

p<0.001 y p<0.001, respectivamente). Por otra parte, cuando se compararon los niveles séricos de

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sCTLA4 en pacientes con EM y SC, se encontró que los niveles en el grupo con EM son más

elevados que en el grupo de SC (13.34 pg/mL vs 9.98 pg/mL, p=0.0013). Sin embargo, observamos

que el recuento total de eritrocitos y plaquetas se encuentran disminuidos en comparación de los

pacientes con EM (p=0.036 y p<0.001, respectivamente).

Cuadro 1. Características clínicas y de laboratorio de los sujetos control y de pacientes con esclerosis

múltiple pareados por edad y género

Características SC

n=50

EM

n=50 p*/&/#

Edad (años) 37 ± 10 37 ± 11 0.865*

Género

Femenino n (%)

Masculino n (%)

24 (48)

26 (52)

24 (48)

26 (52)

1.000#

Recuento total de eritrocitos (106/mm3) 5.41 ± 0.68 5.16 ± 0.44 0.036*

Hemoglobina (g/dL) 14.8 (12.4-17.3) 15.6 (13.3-17.6) 0.004&

Hematocrito (%) 48.67 ± 6.67 47.05 ± 4.00 0.145*

Recuento total de leucocitos (103/mm3) 6.5 (4.5-10.9) 6.9 (4.05-11.3) 0.606&

Linfocitos (%) 35 (24-68) 38 (18-64) 0.538#

Plaquetas (103/mm3) 259 (157-381) 198 (110-270) <0.001&

VSG 8 (2-18) 13 (2-62) <0.001&

Glucosa (mg/dL) 72 (51-107) 79 (64-109) <0.001&

Colesterol (mg/dL) 174.87 ± 39.90 199.57 ± 35.18 0.001*

sCTLA4 (pg/mL) a 9.98 (7.04-29.36) 13.34 (7.70-21.38) 0.001&

Se muestran media±desviación estándar, para las variables paramétricas; mediana (percentil 5-percentil 95),

para las variables no paramétricas; porcentajes (frecuencia absoluta) para las variables cualitativas. sCTLA4:

Antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico soluble. VSG: Velocidad de sedimentación globular. *Prueba

de t de Student, &prueba de U de Mann-Whitney o #prueba de X2. aLos niveles de sCTLA4 fueron

determinados de forma cuantitativa por ELISA (BioLengend, USA).

Además, al analizar el efecto de sCTLA4 sobre los parámetros de laboratorio, encontramos

una ligera disminución del recuento eritrocitario en pacientes con EM (β=−2.9455, p=0.007).

Además, se nota una tendencia de su efecto negativo sobre el hematocrito (β=−0.2301, p=0.051).

Sin embargo, en las demás variables que analizamos no encontramos efecto alguno. (Cuadro 2).

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Cuadro 2. Efecto de las variables clínicas sobre los niveles séricos de sCTLA4

Modelo sin ajustar Modelo con ajuste&

Parámetro β (IC95%) p β (IC95%) p

Eritrocitos -0.9514

(-2.8325,0.9296) 0.317

-2.9455

(-5.0665,-0.8244) 0.007

Hemoglobina 0.4341

(-0.1441,1.0124) 0.139

0. 0624

(-0.6814,0.8064) 0.868

Hematocrito -0.0285

(-0.2250,0.1679) 0.773

-0.2301

(-0.4613,0.0010) 0.051

Leucocitos 0.1416

(-0.3441,0.6273) 0.563

0.1022

(-0.3765,0.5810) 0.672

Linfocitos 0.0176

(-0.0568,0.0921) 0.638

0.0172

(-0.0564,0.0908) 0.643

Plaquetas -0.0085

(-0.0226,0.0056) 0.234

-0.0060

(-0.0204,0.0083) 0.405

VSG -0.0271

(-0.0892,0.0348) 0.385

-0.0159

(-0.0781,0.0461) 0.610

Glucosa 0.0322

(-0.0355,0.1001) 0.346

0.0180

(-0.0503,0.0864) 0.600

Colesterol -0.0014

(-0.0276,0.0246) 0.910

-0.0046

(-0.0310,0.0217) 0.729

sCTLA4: Antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico soluble. VSG: Velocidad de sedimentación globular;

β: coeficiente de regresión IC95%: Intervalo de confianza del 95% &Ajustado por edad y género

Discusión y conclusiones

La EM es una enfermedad autoinmune multifactorial la cual ha sido asociada con distintos

factores de riesgo genéticos, principalmente alelos del locus HLA-DR. Existen otros alelos de

riesgo que han sido asociados con susceptibilidad para el desarrollo de esta enfermedad como

CD80, TYK2 y CTLA4 (Katrin, 2013; Milo et al., 2010; Sawcer et al., 2001). CTLA4 juega un

papel importante en el proceso inflamatorio, manteniendo la tolerancia periférica (Tullman, 2013).

En nuestro estudio se analizaron 50 pacientes con EM, de estos la mayoría fueron mujeres

observándose que existe que existe una proporción más alta de pacientes del género femenino que

masculino. Esto es importante, ya que se ha reportado que existe una mayor prevalencia de la

enfermedad en mujeres con respecto a los hombres (3:1). Lo cual indica que el componente

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hormonal puede tener un papel importante en la enfermedad, debido a que las hormonas sexuales

actúan como un modulador de la respuesta inmunológica, siendo estas efectoras en la secreción de

citocinas inmunorreguladoras. Se ha reportado que los estrógenos y la prolactina son

inmunoestimuladores, que pueden favorecer la supervivencia de linfocitos B autorreactivos y la

producción de anticuerpos, así como la secreción de metaloproteinasas de matriz (Correale et al.,

1998; Shoenfeld et al., 2008). Además, se ha demostrado que el estradiol modifica selectivamente

la secreción de citocinas en LT CD4+ en pacientes con EM (Shoenfeld et al., 2008). Por otro lado,

se ha documentado que la prolactina, estrógenos y testosterona podrían ser utilizados como terapia,

debido a que los LT vírgenes del SNC estimulados con autoantígenos producen niveles más altos

de inteleucina-5 e interleucina-10. Sin embargo, una disminución de los niveles de interferón-γ

(IFN-γ) podrían indicar un cambio de LT cooperadores tipo 2 a LT cooperadores tipo 1, lo que

podría favorecer al establecimiento de la enfermedad (Gold y Voskuhl 2009; Soldan et al., 2003).

En la valoración clínica, los pacientes tenían niveles incrementados de VSG. Esto es de

suma importancia, ya que se ha documentado que en el proceso inflamatorio de EM, las citocinas

proinflamatorias como factor de necrosis tumoral-α, interleucina-17 e IFN-γ inducen la producción

de interleucina-6, que es la principal citocina inductora de producción de proteínas hepáticas de

fase aguda, como la proteína C reactiva y la proteína amiloide sérica A, lo que conllevan al aumento

de la VSG. Por lo tanto, los niveles elevados de VSG representan el proceso inflamatorio presente

en la EM y que se ve reflejado en nuestros resultados (Wang y Sun, 2009).

En nuestro estudio, observamos una disminución del recuento eritrocitario en pacientes con

EM lo cual podría deberse a la debilidad de la membrana celular ocasionados por cambios

fosfolipidicos en la misma causando lisis celular (Hon et al., 2009). A su vez, encontramos niveles

elevados de hemoglobina lo cual podría deberse a la lisis eritrocitaria ya que al haber fragilidad de

la membrana de los glóbulos rojos podría existir una mayor cantidad de hemoglobina libre. Otra

posible explicación de esto podría ser debido a la fatiga la cual es una las características clínicas

más notorias de esta enfermedad ya que al presentar cansancio el paciente requeriría de mayor

cantidad de oxigenación y por lo tanto habría un aumento de hemoglobina. Sin embargo, no

encontramos estudios que respalden esta hipótesis.

Por otra parte, se encontró el recuento plaquetario ligeramente disminuido en comparación

con sujetos control. Esto puede deberse a que si existe un cambio de fosfolípidos en la membrana

de las plaquetas que conducen a una disminución de ambos (Gul et al., 1970). Además, en los

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pacientes con EM se ha demostrado que presentan una activación plaquetaria incrementada

(Sheremata et al., 2008).

Así mismo, observamos un incremento de los niveles séricos de glucosa y colesterol

comparados con los obtenidos en los sujetos sanos. Esto puede deberse a los diversos síntomas

característicos de EM, como la fatiga, la pérdida de las funciones motoras, entre otros. Estos pueden

conllevar al paciente a llevar una vida sedentaria, lo cual bien se sabe se ha asociado a un aumento

en el riesgo de padecer síndrome metabólico, dislipidemias, resistencia a la insulina lo cual puede

conllevar a su vez a padecer Diabetes Tipo 2 y en el último de los casos estas patologías pueden

contribuir al desarrollo de enfermedades cardiovasculares (Wens et al., 2013).

Por otra parte, cuando se compararon los niveles séricos de sCTLA4 en el grupo de

pacientes con EM y SC, se encontró que los niveles en el grupo con EM son más elevados que en

el grupo control de forma significativa. Esto concuerda con lo publicado por Daroszewski y

colaboradores (Daroszewski et al., 2009) en Enfermedad de Graves; Simone y colaboradores

(Simone et al., 2009) y Pesce y colaboradores (Pesce et al., 2014) en Enfermedad Celiaca en los

cuales los niveles de sCTLA4 son mayores en comparación con los SC. Sin embargo, hay estudios

de reportan niveles de sCTLA4 disminuidos en pacientes con enfermedades autoinmunes en

comparación con los SC. Wang y colaboradores (Wang et al., 2012) demostraron niveles más alto

de esta proteína en SC en comparación con pacientes con Neuromielitis Óptica y EM mientras que

Torres-Carrillo y colaboradores (Torres-Carrillo et al., 2013) reportaron niveles elevados de

sCTLA4 en pacientes AR en comparación con SC.

Por otro lado, se obtuvo una correlación negativa con el recuento total de eritrocitos. Si bien

en la actualidad no se ha descrito como el incremento de sCTLA4 disminuye este parámetro, se ha

observado este mismo fenómeno en otras enfermedades como anemia de células falciformes en

donde se demostró que un fenotipo de LTreg presentan una alta expresión de sCTLA4, induciendo

una fuerte respuesta humoral y una disminución de este mismo parámetro (Vingert, et al., 2014).

Se sugiere que sCTLA4 podría inhibir la activación temprana de LT bloqueando la

interacción del complejo CD28-CD80/CD86 o por el contrario los altos niveles de sCTLA-4

podrían bloquear la interacción CTLA-4-CD80/CD86 en las etapas posteriores de la activación de

dichas células causando una disminución de la señalización inhibidora y por lo tanto mayor

actividad de LT y autoreactividad de las mismas (Torres-Carrillo et al., 2013).

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

En conclusión, el presente estudio sugiere que los niveles séricos de hemoglobina, VSG,

glucosa, colesterol y los niveles séricos de sCTLA4 se observaron más altos en pacientes con EM

en comparación a los SC. Así mismo que los niveles séricos de sCTLA tienen un efecto sobre la

cuenta eritrocitaria. Por lo tanto, existe la posibilidad de que diferentes genes, así como

polimorfismos en CTLA4, podrían estar asociados con susceptibilidad a EM en la población

estudiada.

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