Esporangiogénesis/Zoosporogénesis:

Los hongos crecieron en todos medios de cultivo evaluados; sin embargo, se encontraron

marcadas diferencias en cuanto al desarrollo de esporangios y liberación de zoosporas.

De los cinco aislamientos evaluados, 93B3 y 81 B2 no presentaron formación de

esporangios ni zoosporas en ninguno de los medios analizados; a pesar de que los

fragmentos miceliares mostraron buena capacidad proliferativa principalmente en

Glucosa, Celobiosa y la mezcla Glucosa/Celobiosa (Figura 2).

Por el contrario, los aislamientos 62CV y 91 D2 realizaron esporangiogénesis después del

tercer día de cultivo en los medios suplementados con Glucosa, Paja de Arroz y mezcla

de Glucosa/Celobiosa, cuando fueron preincubados en medio de mantenimiento Paja de

Arroz durante 5 y 4 días, respectivamente. Un resultado similar se encontró cuando los

hongos se preincubaron en Glucosa durante el mismo tiempo, excepto en el caso de

62CV quien no realizó esporangiogénesis en el medio de Paja de Arroz. (Tabla 1)

En contraste, el aislamiento 5V2 desarrolló esporangios al segundo día de cultivo en los

medios suplementados con Glucosa y Paja de arroz. También se observaron esporangios

al segundo día de cultivo en Celobiosa, cuando se preincubó en Glucosa (Tabla 1). Al

tercer día, el aislamiento 5V2 realizó esporangiogénesis en todos los medios de cultivo

evaluados, y además hizo zoosporogénesis cuando fueron cambiados a medios frescos

de Paja de Arroz al segundo y al tercer día y a Bagazo de Caña al tercer día,

independientemente del medio y el tiempo de preincubación utilizado.

No se detectaron cambios de forma o tamaño de los esporangios en los diferentes medios

de cultivo utilizados, cuando se cultivaron los tres aislamientos que exhibieron la

capacidad de hacer esporangiogénesis bajo las condiciones evaluadas. Los aislamientos

62CV y 5V2 presentaron esporangios esféricos, de forma globosa, contenido granular

café, esporangióforo definido y diámetro aproximado de 50-150 IJm (Figura 4) .

A diferencia de los anteriores, el aislamiento 91 D2, desarrolló pocos esporangios

esféricos y gran cantidad de esporangios ovalados con un diámetro aproximado

de 25 a 30 IJm por 40 a 45 IJm, esporangióforo definido y contenido granular muy

hialino (Figura 3) .

40

41

El único aislamiento que presentó zoosporogénesis fue 5V2 en los medios suplementados

con Paja y Bagazo; cuyas zoosporas fueron ovaladas, poliflageladas y de igual aspecto

en ambos medios.

TABLA 1: Esporangiogénesis de tres hongos anaerobios ruminales después de repiques de Paja de arroz o Glucosa a diferentes medios de cultivo. Negativo (O) , Cantidad escasa (1), Cantidad media (2), Cantidad abundante (3). No se evaluó (").

Medio preincubación Medio Repique Días de incubación en el medio de repique

PAJA DE ARROZ

Glucosa

Celobiosa

Paja de arroz

Bagazo de caña

Glucosa! Celobiosa

1

O

O

O

O

O

62CV

2 3 4

O 3 2

O O O

O 1 2

O O O

O 1 O

5

O

2

O

O

1

O

*

O

O

O

9102

2 3 4

O 1 2

* * *

O 1 2

O O O

O 1 1

5

2

*

3

O

2

1

O

O

O

O

O

5V2

2 3 4

2 3 3

O 2 2

2 3 3

O 3 3

O 2 2

5

3

1

3

3

2

GLUCOSA

Glucosa

Celobiosa

Paja de arroz

Bagazo de caña

Glucosa! Celobiosa

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

1

O

O

1

3

1

O

O

2

1

O

O

O

O

*

O

O

O

O

*

O

O

O

1

*

1

O

1

2

*

2

O

1

3

*

O

3

O

O

O

O

O

2

2

3

O

O

3

3

3

3

1

3

3

3

3

1

3

1

3

3

1

Figura 2. Morfología macroscópica de los aislamientos 81 82 (2a) Y 9383 (2b) cultivados en medios

suplementados con glucosa

Figura 3. Esporangios del aislamiento 9102. 3a: Esporangios maduros en glucosa 3b: sporangios de 3

colonias diferentes. 3c: Esporangio periforme en glucosa. 3d: Esporangio ovalado en Paja

42

Figura 4. Esporangios del aislamiento 5V2 en medios de cultivo suplementados con glucosa (4a ,b) , paja de

arroz (4c-e) y bagazo de caña (4f).

44

Aislamiento de ONA, diseño y evaluación de cebadores.

Ninguno de los protocolos ensayados resultó efectivo para el aislamiento reproducible del

DNA de los hongos bajo estudio, solo en un caso se logró la obtención no reproducible de

DNA.

8e encontraron pocas secuencias de DNAr 188 (de 1 a 2) para los géneros fúngicos

seleccionados en el presente estudio, por tal razón, el análisis se realizó principalmente

con secuencias IT8-1, 5.88 e IT8-2, de las cuales se tiene un mayor número de accesos.

Para aumentar la confiabilidad de las secuencias reportadas en la base de datos, se

utilizaron para el análisis principalmente aquellas que habían sido publicadas en artículos

científicos. De los géneros analizados, solo Orpinomyces presentó una región diagnóstica

en la secuencia bajo estudio, las demás se alinearon con otros géneros de hongos

ruminales lo cual indica que no resultan útiles para la identificación taxonómica.

Para el caso específico de Orpinomyces sp. se evaluaron en total seis (6) secuencias, las

cuales corresponden una fragmento del ADNr 188 seguido del IT81, DNAr 5.88 y un

porción del IT82. Mediante el análisis de alineamiento múltiple se pudo determinar que

estas secuencias mantienen 7 regiones conservadas, estas fueron analizadas mediante el

procedimiento Blast para determinar su especificidad. De este análisis se pudieron

diseñar los siguientes cebadores específicos: un cebador forward 5'- TGT GAT TTT AAT

AAT CAT CCT ACC C -3', con una temperatura de fusión (TM) de 50.goC y un cebador

reverso que alinea de manera específica con todos los géneros de hongos anaerobios

ruminales 5'- AGA TCC ATT GTC AAA AGT TG -3', cuya TM =48.3°C (Anexo 3).

Evaluación de proteínas en el filtrado fúngico

En cuanto a la evaluación de las proteínas presentes en el filtrado fúngico, el análisis de

electroforesis en gel de poliacrilamida-SD8, reveló que el extracto del hongo presenta en

promedio 14 bandas proteicas diferentes (figura 5). 8in embargo, el número de bandas

varía de acuerdo al sustrato en el cual crece el hongo (figura 6), lo cual evidencia que

algunos de estos polipéptidos están sujetos a la regulación de la expresión génica.

Figura 5. SDS-PAGE del extracto crudo del HAR 5V2 incubado en diferentes medios de cultivo sin periodo de adaptación.

1 2 3 4

1 Bagazo de caña lavado; 2 Carboximetil CeJulosa CMC; 3 Paja de arroz; 4 Bagazo de caña

45

~ t \l "t ' , .. l o

I" r-PT() . DE R18 1. " • o , o o o

Figura 6. SDS-PAGE del extracto crudo del HAR 5V2 preadaptado e incubado en diferentes medios de cultivo.

1 2 3 4

1 Bagazo de caña lavado; 2 Carboximetil Celulosa CMC; 3 Paja de arroz; 4 Bagazo de caña

-

Cinética de crecimiento de E1.

Escogencia del método de evaluación de la cinética de crecimiento

Con los tres métodos utilizados se observó una tendencia similar en la cinética de

crecimiento; sin embargo, debido al poco crecimiento de los hongos en los volúmenes

analizados, fue necesario colectar el contenido de dos tubos para realizar la cuantificación

de la masa . De otro lado, debido a que no se contaba con equipo para la cuantificación

precisa de hidrógeno por GLC, el desplazamiento del émbolo medido por una jeringa

hipodérmica de tuberculina probablemente genera imprecisiones dependiendo del

operador. El método del formiato fue de fácil implementación y no presenta las deventajas

de los dos métodos anteriores.

46

Cinética proliferativa en los residuos de cosecha.

El hongo E1 mostró habilidad para crecer en todos los sustratos ensayados; sin embargo

el crecimiento en Cascarilla de café fue tan lento que podía evidenciarse por la inspección

visual de los cultivos. El mayor crecimiento se observó en celulosa cristalina en donde el

hongo alcanzó su fase estacionaria alrededor del día cinco, le siguió bagazo de caña y

luego paja de arroz en donde la fase estacionaria se alcanzó desde el tercer día de

cultivo.

~ 0,1 . ..------­

~ 0.08 .~ 0,06

.2 0.04

:ll 0,02 ~ o +--.,------,----,-----,---1

o 2 4 6 8 10 10

Dias

o 2 4 6 8

Dias

4

E. 3 e QI

E 2 ;:, "O 1 :>

O

O 2 4 6 8 10

Dias

Figura 7. Curva de crecimiento de E1 en medio con los azucares solubles glucosa- celobiosa.

47

Crecimiento de E1 en sustratos complejos 18

15

5EE 12

~ 9

~ 6 o !!:.

3

O ~~~---,--~----.--,--,--,---

O 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo - Da

---+- Celulosa - Bagazo

Paja Cascarilla

Figura 8 _ Curva de crecimiento de E1 en celulosa, bagazo, paja y cascarilla_

Actividad Enzimática

Actividad de celulasa - exoglucanasa

48

En todos los niveles de pH y temperatura se observó actividad exoglucanasa cuyos

valores presentaron una distribución normaL La máxima actividad enzimática, se encontró

a una temperatura de 40 oC y pH =6.0 en todos los sustratos evaluados (fig) . En relación >r con el medio de cultivo en el cual fue cultivado el hongo E1 , la mayor actividad celulolítica

se presentó en Paja de arroz; aún cuando, el análisis estadístico de las actividades

máximas refleja que estos valores no son significativamente diferentes de las actividades

encontradas para Bagazo de caña y Celulosa cristalina. En contraste, los extractos de E1

cultivado en cascarilla de Café presentaron actividades exoglucanasas significativamente

menores, lo cual fue corroborado por el análisis estadístico (fig) .

-1 30

25

E 20 -- 15 :J E 10

5

O

-

4 5 6 7 8 9 10

pH

F Celulosa ~Bagazo--Paja

Figura 9. Efecto del pH sobre la actividad exoglucanasa en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha

30~------------------------------------------------------'

20

n"--------,----------~r_----------._----------._------~

Figura 10. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.

49

E

::J 15

:E E 10

5

O

20 30 40 50 60 70

Temperatura - oC

[-+- Celulosa --­ Bagazo Paja Cascarilla I ~===--===========~

Figura 11. Efecto de la temperatura sobre la actividad exoglucanasa detectada en filtrados del hongo E 1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha

lO

~"---------~----------~----------~-----------r--------~

Figura 12. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 Y 40°C en los diferentes sustratos evaluados

50

51

Actividad de CMC-asa - Endoglucanasa

En todos los niveles de pH y temperatura se observó actividad endoglucanasa cuyos

valores presentaron una distribución normal para pH pero no para la temperatura . En

todos los sustratos evaluados, la máxima actividad enzimática , se encontró a una

temperatura de 50 oC y pH = 6.5 (fig). En este caso, la mayor actividad celulolítica se ~

presentó en Celulosa cristalina seguida de Bagazo de caña y Paja de arroz ; sin embargo,

el análisis estadistico mostró que no existen diferencias significativas entre ellas. Los

extractos de E1 cultivado en cascarilla de Café presentaron actividades endoglucanasas

significativamente menores, lo cual fue corroborado por el análisis estadístico (fig). ( )

0,15

0,1 E-::J

0,05

° 4 5 6 7 8 9

pH

¡--+- Celulosa - Bagazo Paja ~ Cascarilla

Figura 13. Efecto del pH sobre la actividad endoglucanasa en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha

021)

O. 1r.)

f- ­

o.m t

~ " l

0.21 t

O. \l)

~ n~"-______-.__________~________-.__________,-______~

-¡

8'9" 0 Cs._ ~ 1'1;

St .."

Figura 14. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.

0 ,15

E 0,1

....:

=' 0 .05 ·

o 20 30 40 50 60 70

Temperatura - oc I -+-- Celulosa --=- Bagazo p-ja ~-~--a----

Figura 15. Efecto de la temperatura sobre la actividad endoglucanasa detectada en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha.

52