HEMATOLOGÍA CLÍNICA

TRABAJOS PRÁCTICOS

ALUMNO:…………………………………………GRUPO:….......AÑO: 2011

NÓMINA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

TP1: HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINMA, VSG, COLORACION MGG)

TP2: HEMOGRAMA 2 (FÓRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)

TP3: FÓRMULA PATOLÓGICA-ALTERACIONES SERIE BLANCA

TP4: ANEMIA ARREGENERATIVAS (MICROSCOPIA)

TP5: ANEMIAS REGENERATIVAS (MICROSCOPIA Y RETICULOCITOS)

TP6: INMUNOHEMATOLOGÍA (GRUPO Y FACTOR, COOMBS D e I)

TP7: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA

TP8: CITOQUÍMICA (MPO-PERLS-KLEIHAUER BETKE) - MEDULOGRAMA

TP9: LMA (MICROSCOPIA)

TP10: LLA-SLPC (MICROSCOPIA)

TP11: LMC-SLPC (MICROSCOPIA)

TP12: HEMOSTASIA PRIMARIA (RECUENTO DE Pq, TIEMPO DE SANGRÍA, TIEMPO DE COAGULACIÓN, RETRACCIÓN DE COÁGULO)

TP13: HEMOSTASIA SECUNDARIA (TP, KPTT, MÉTODOS MANUALES Y AUTOMATIZADOS)

MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL)

TP N°……… GRUPO DE LABORATORIO:…… FECHA……………NOMBRE Y APELLIDO……………………………………………………………

1-ACTIVIDADES REALIZADAS (detallar en forma resumida las actividades realizadas)

2- RESULTADOS HALLADOS

DeterminaciónValor halladoMétodoValores de referencia

3- ELEMETOS OBSERVADOS

Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados (coloración y aumento) así como también, en caso de disponer de ellos, datos referentes al cuadro en que fue encontrado (edad, datos de hemograma, patología, tratamiento, etc).

Ej. Se observó un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un cuadro de anemia ferropénica en recuperación (Niño 8 años, GB: 7300 cel/mm3 – GR: 4,18 x 106 cel/mm3 – Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM 30,2 g%, RDW 18 %, Pq 323x103 /mm3, Tratamiento: Hierro oral)

Ej. Se observaron numerosos esferocitos (MGG 100x) en un frotis perteneciente a un paciente con AHAI.

4- DISCUSION DE RESULTADOS (variaciones fisiológicas, patológicas, posibles causas de error, procedimientos para la validación del resultado)

TRABAJO PRÁCTICO N° 1

Ojetivos Generales- Puesta en práctica de normas de bioseguridad básicas.- Práctica de los pasos para la obtención de muestras de sangre venosa para la realización de las determinaciones incluidas en el hemograma.- Aplicación de los criterios necesarios para la elección de anticoagulantes en función de las determinaciones a realizar.- Manejo del material necesario para las prácticas a desarrollar.- Interpretación de resultados.

1 -Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa

1. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene.2. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y, una vez

manipulado, no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo.3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales

usados en recipientes para ese fin. 4. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables, los cuales se

mantendrán puestos durante todo el procedimiento. 5. Antes de iniciar la toma de muestra, tener TODO el material preparado. 6. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizándola visualmente y por

palpación. Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción.

7. Una vez identificada la vena, limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. Dejar secar.

8. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja, se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del émbolo.

9. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba).

10. Después de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego la aguja, presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco.

11. LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN.

12. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma y homogeneizando inmediatamente por inversión suave.

13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. 14. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más

sangrado.15. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de

muestra y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS.16. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro

de muestras.

2 - Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos, el tamaño eritrocitario, no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C).

Los anticoagulantes más utilizados son:

EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético, actua mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja, respecto a las de sodio, de ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el tamaño del eritrocito, especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. El K2EDTA . 2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.8 ± 1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. TENER SIEMPRE PRESENTE QUE 10µL DE ANTICOAGULANTE PUEDEN ANTICOAGULAR HASTA 2,5 mL de SANGRE.

HEPARINA SÓDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

CITRATO TRISÓDICO, C6H5O7Na3, actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando así la coagulación. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1 (Por Ej.:2mL sangre con 250μL anticoagulante); así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1 (Por Ej.: 2 mL sangre con 500 μL anticoagulante).

ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada

cuatro volúmenes de sangre. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0.9 g, Citrato disódico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 mL.

3 - Recuento de hematíes

RECUENTO MANUAL

Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta.

Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3,8%., o Solución de Hayem (HgCl2 0,25%, Na2SO4 2,5%, NaCl 0,5%)

La dilución empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente:Solución fisiológica o citratada: 3,98 mLSangre: 0,02 mL

El recuento se realiza en la cámara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente:

El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños, como se muestra a continuación:

Las líneas reforzadas, o triples, sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeños. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm.

Con la dilución indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cámara y se cuentan los glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). La cámara puede ser cargada con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente.

Considerando entonces, que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total, el cálculo que se debe hacer es el siguiente:

N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3

TC

Donde:

N: número de eritrocitos contados. D: Título de la dilución realizada (200). FC: Factor de corrección de la profundidad, para llevar a 1 mm3 (10). ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400). TC: Total de cuadrados pequeños contados.

Causas de error en el recuento en cámara de Neubauer

El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a:

1. Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. Coagulación parcial. Hemólisis.

2. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre.3. Utilización de material mal calibrado, sucio o húmedo.4. Falta de suficiente agitación de la sangre diluida.5. Cámara de Neubauer mal ajustada, sucia o mojada.6. Llenado incompleto de la cámara Neubauer.7. Empleo de cubreobjetos deformable, no rígido.8. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara.9. Errores del operador al realizar el recuento.10. Errores al efectuar los cálculos.

VALORES DE REFERENCIA

Edad Sexo Intervalo de referenciaRecién nacidos ambos 4,7x1012/L - 6,3x1012/LNiños (2-12 años) ambos 4,0x1012/L - 5,3x1012/LAdultos jóvenes (12-18 años) mujeres 4,1x1012/L - 5,1x1012/L

varones 4,5x1012/L - 5,3x1012/LAdultos jóvenes (19-60 años) mujeres 4,1x1012/L - 5,2x1012/L

varones 4,6x1012/L - 5,9x1012/L

4 - Hematocrito

DEFINICION

El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina, por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. Así, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia.

El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo), es una técnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad.

En la actualidad, todos los autoanalizadores hematológicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas, por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %).

Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados, son un buen parámetro del estado de la serie eritroide.

El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Por Ej., un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración, el Hto. puede ser normal o alto, aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión.

METODO MANUAL

Micrométodo (microhematocrito)

Es una técnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo.

Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de diámetro interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechará la primera gota después de la punción.

Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 mL). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene

la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darán el resultado directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:

A------- 100 x: hematocrito en tanto por ciento B------- x A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular

La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%.

Causas de error

Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor, al perderse mayor proporción de células que de plasma.

El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los

líquidos tisulares que provoca hemodilución. En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce

hemoconcentración. La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hematíes vaya

tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal.

VALORES DE REFERENCIA ( ± 2 DE)

El valor de Hto varía con la edad y el sexo.

Edad y sexo Hematocrito % FracciónRecién Nacidos 54 ± 10 0,54 ± 0,1Niños (hasta 10 años) 38 ± 5 0,38 ± 0,05Mujeres (18-50 años) 42 ± 5 0,42 ± 0,05Embarazadas 39 ± 5 0,39 ± 0,05Varones (18-50 años) 45 ± 5 0,45 ± 0,05

5 - Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina

FUNDAMENTO

Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN según el siguiente proceso:

Hemoglobina + [K3 Fe(CN) 6] ® metahemoglobina

Metahemoglobina + [CNK] ® cianmetahemoglobina

MATERIAL

1. Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH)

2. Tubos: 12 x 100 mm.3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-Na2 (1,5 mg/ml) o con heparina (10

UI/ml). Puede emplearse sangre capilar.4. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 mL.5. Pipetas automáticas: de 20 mL, debidamente calibradas.6. Reactivo de Cianmetahemoglobina:

Composición (pH 7-7,4)

Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] 200 mgCianuro potásico [CNK] 50 mgFosfato monopotásico [KH2PO4] 140 mgDetergente no iónico* 1 mLAgua destilada hasta 1000 mL

Detergentes no iónicos: Tritón X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.

El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo).

7. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. Todo

patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN.

METODO

Se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación:

1. Conectar el espectrofotómetro.2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático

(rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces.

3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.

4. Mediante la micropipeta añadir 20 ml de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operación, es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.

5. Agitar el tubo mediante inversión (4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.

6. Leer la A de la solución a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.7. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una

curva de calibración.

Curva de calibración de hemoglobina

Se toma un Kit. de calibración con estándar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de una CC .baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de CC. conocida y se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las absorbancia y se determina un factor que es el promedio de las tres diluciones. Teniendo que A=ɛ . b. C y como b=1 cm => A/ ɛ = C para facilitar el calculo A . (1/ ɛ) = C donde (1/ ɛ)= F y es la inversa de la pendiente de la curva tendremos que C= F . A

Grafico:

De esta manera controlo:• La linealidad del equipo • El deterioro que sufre el reactivo

Puedo trabajar con un estándar diario, procesado por cada operador que realiza la determinación de hemoglobina, como si fuese una muestra más y determino el factor del estándar: Procesando un estándar todos los días:

CONTROLO EL DETERIORO QUE PUEDE SUFRIR EL REACTIVO DESDE EL DIA QUE SE LO PREPARO Y SE REALIZÓ LA CURVA.

CONTROLO EL FACTOR HUMANO

CAMBIOS EN LA TENSIÓN DE LA RED O DESGASTE DE LA LÁMPARA DEL FOTOCOLORÍMETRO

Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina

La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/l). No obstante, la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen.

Errores en la obtención del espécimen de sangre:1. Errores de extracción2. Empleo de anticoagulantes no recomendados3. Coagulación parcial de la sangre

Errores de la dilución:1. Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas2. No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar

antes de introducirlo en el reactivo 3. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo

Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN:1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en

HiCN

Errores de la determinación:1. Empleo de instrumentos no calibrados2. Cubetas sucias o deterioradas3. Soluciones turbias de HiCN

Errores en la conservación del reactivo:1. Congelación del reactivo, lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4

Fe(CN) 6 y una oxidación parcial de la Hb.

Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales.

6 - Velocidad de sedimentación globular (VSG) o Eritrosedimentación

FUNDAMENTO

El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo.

VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma múltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple.

MECANISMO

El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células.

Desde el punto de vista físico, este fenómeno depende de los siguientes factores:

a. Tamaño de los GRb. Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma,c. Viscosidad del plasma.d. Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad h a una velocidad v: R = 6hvr

La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se hace más lenta al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente.

La etapa más importante es la primera o de aglutinación, ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. Así, cuanto más pequeño sean los agregados, más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa.

Dado que, como se mencionó más arriba, el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR, éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.

La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albúmina retarda la VSG. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que estas células se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina, globulinas y fibrinógeno. Así, mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina, lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas.

METODOLOGIA

Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. Ambos métodos poseen limitaciones. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening.

El método de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias, pero no resultaron confiables.

Tradicionalmente, la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH).

Durante los últimos años, han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. Estos sistemas, aunque reproducen exactamente el método de Westergren, se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas.

MÉTODO DE WESTERGREN

Es el método de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar, como es la necesidad de prediluir la sangre.

A. MATERIALES.

A.1 Anticoagulante

Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) en solución acuosa 32,08 g/l.

A.2 Tubo de sedimentación

Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un diámetro de 2.55 + 0.15 mm. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países.

Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza.Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.

A.3 Gradillas

Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1°. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella.

B. TÉCNICA

A) La sangre se obtiene por punción venosa, evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4°C.

B) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversión repetidas veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.

C) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25°C), sin exposición a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire, manteniéndolo exactamente 60 min.

D) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora).

C. VALORES DE REFERENCIA

EDAD (años) Valores de referencia

Límite superior de la normalidad

Niños mayores y jóvenes

0-15 5 a 10 15

Varones adultos 17-50 4 ± 3 1051-60 6 ± 3 1261-70 6 ± 4 14

Mujeres adultas 17-50 6 ± 3 1251-60 9 ± 5 1961-70 10 ± 5 20

Factores técnicos capaces de modificar la VSG

Causas de aumento Desviación de verticalidad de la pipeta Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta Elevación de la temperatura ambiente Dilución de la sangre Causas de disminución: Reducción del diámetro de la pipeta Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) Cambio de anticoagulante

D. INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos.

Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica, por lo que no se recomienda su empleo.

Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda, y también en el embarazo normal y el puerperio.

Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas.

La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, anormalidades de GR (hemoglobinopatías, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia, defectos cardíacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente.

Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica.

7-OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequeña de sangre (1-2 mm) recién obtenida, ya se trate de punción digital, o del talón (en pediatría) o de la última gota de sangre extraída con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfología de las células.

Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ángulos (extensor), se realiza la extensión de la gota de sangre: conservando un ángulo menor de 45° respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rápidamente. Así se obtiene una fina película de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

Secar rápidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las células.Un extendido así obtenido poseerá tres áreas de diferente espesor y con distribución también distinta de leucocitos:1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del número de linfocitos.2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión (cola) y en ésta se observa un exceso de granulocitos y monocitos.3. Zona ideal: Región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las células.

Para que un frotis sea valido:1) No debe ser demasiado grueso (los elementos estarán retenidos y no serán

identificados.2) No debe ser demasiado delgado (será muy pobre en elementos lo que impediría

una lectura conveniente).3) No debe alcanzar los bordes ni las extremidades del porta (se perderían los

elementos mas voluminosos). La gota debe agotarse sobre el porta.4) No debe presentar agujeros (utilización de portas mal desengrasados) ni estrías o

flecos (provocados por un extensor de bordes no esmerilados, irregulares). Conviene elegir el extensor observando sus bordes en el microscopio para asegurarse de que sean bien lisos.

5) Debe ser regular (si no, el reparto de elementos es heterogéneo y por tanto el recuento variara según los campos examinados).

6) Debe ser secado correctamente (un secado defectuoso produce artefactos: hematíes festoneados por ejemplo).

Existen algunas sutilezas que es necesario cuidar:

El tamaño de la gota debe ser el adecuado y esto lo enseñara la experiencia. Si ha caído un exceso de gota limpiar el porta con gasa o algodón. Repetir el

procedimiento las veces que sea necesario hasta que la cantidad de sangre sea la adecuada.

Si tuvieran que elegir entre un extendido largo, y uno corto, es preferible el segundo, pero lo ideal es que ocupe ¾ partes de la lamina.

Se prefieren en general los frotis delgados pero el excesivamente fino tiene muchos inconvenientes: los hematíes aparecen poligonales con su claridad central desaparecida, las plaquetas se destruyen y los leucocitos resultan rotos o distorsionados.

Nunca debe llevarse la gota de sangre por delante del extensor porque produciría erosión de las células.

Un buen frotis debe constar de una zona inicial gruesa (cabeza), una zona central mediana (espesor ideal para la lectura) y la cola delgada terminada suavemente en un borde convexo sin estrías prolongadas que hablan de un extensor defectuoso. Un buen extendido luce como una pincelada sobre el vidrio.

Aun cuando el frotis sea ideal y el reparto homogéneo no se puede evitar una cierta segregación de los elementos. Los linfocitos (mas pequeños) predominan en el centro de la extensión. Los polimorfonucleares y los monocitos son atraídos hacia los “bordes y cola”.

FROTIS ARRASTRADOS: todos los elementos están en la cola. Deben rechazarse para la formula.

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Defectos observados en frotis con sangre anticoagulada:1) Impide agrupación de plaquetas.2) Los núcleos de los monocitos aparecen como con lóbulos, inclusive pueden estar

desintegrados o coloreados más homogeneamente, más compactos que con sangre fresca, el citoplasma puede aparecer vacuolado.

Importante:Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensiónLos portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados minuciosamente.

8-COLORACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

La coloración se realiza por el método de May Grünwald-Giemsa.

Fundamento

Prácticamente todos los métodos empleados para teñir las células de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.

Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carácter básico fijan en mayor medida la eosina (colorante ácido), mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante básico). Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo (nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidófilos como la hemoglobina adquieren color rosado.

De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente, resultando en un color pardo; eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias de intenso carácter básico que fijan fundamentalmente los colorantes ácidos, dando un color rojo-naranja; y los basófilos, cuya granulación específica posee sustancias de carácter ácido, que fijan colorantes básicos dando un color azul oscuro. Reactivos Solución May Grünwald : eosinato de azul de metileno en metanol.

Solución Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluoresceína).

Método

Cubrir el frotis de sangre seco con solución May Grünwald. Dejar 3 minutos. A continuación, agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua destilada en partes iguales, en proporción igual a la de colorante. Homogeneizar

soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivén. Dejar 3-5 minutos. Volcar, enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el preparado con una solución de Giemsa, obtenida a razón de dos gotas del colorante por ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar con agua, limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodón y secar al aire.

TRABAJO PRÁCTICO N°2Objetivos generales-Familiarizarse con el uso de la cámara de Neubauer-Adquirir destreza en la preparación de diluciones y manejo de muestras de sangre entera-Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cámara de Neubauer para el recuento de glóbulos blancos-Delinear los criterios para la identificación de glóbulos blancos en preparados coloreados con MGG-Realizar fórmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos-Interpretación y validación de resultados

1- RECUENTO DE LEUCOCITOS

Método manual

1) Agregar 20 ml de sangre anticoagulada a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solución de Türk. Esta solución contiene acido acético al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de espátula de azul de metileno. DILUCION 1/20

2) Homogeneizar la mezcla.

3) Cargar la cámara de recuento

4) Ubicar el reticulado de la cámara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de burbujas y que la distribución sea regular.

5) Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cámara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre sí en más del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cámara.

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilución 1:10. Si por el contrario el número resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

6) Cálculo:

m x 10 x d = N° de leucocitos/ mm3

n

Donde: m=número de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilución utilizada, n= número de cuadrantes contados.

Valores de referencia

Adultos 4.000 - 11.000 / mm3

Recién nacidos 10.000 - 25.000 / mm3

Niños de 1 año 6.000 - 18.000 / mm3

Niños de 4 a 7 años 6.000 - 15.000 / mm3

Niños de 8 a 12 años 4.500 - 13.000 / mm3

2-DETERMINACIÓN DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de inmersión, aun para el pequeño aumento a seco. Si no se cumple este requisito la refringencia de los elementos impide una buena observación. Para esto es suficiente depositar una gota en un extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que puede contener otro extendido en cuyo caso se harán coincidir ambas caras que los contengan y desplazarlos suavemente unos contra otros.La observación debe hacerse al principio de manera panorámica con objetivo de 10X para ver la dispersión de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de células grandes como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe evitarse la tendencia a usar e comienzo la inmersión.Luego se pasa a 40 X aumento que resulta útil para evaluar alteraciones de tamaño de los glóbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los glóbulos blancos y para la observación detallada de los elementos sanguíneos.

Formas de recorrer el preparado

Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para establecer los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glóbulos blancos se puede expresar cada tipo de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre.Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos , recordar que se está haciendo una estimación porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta relativamente sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de referencia. Distinto es el caso de pacientes leucopénicos con recuento bajos por ej: 1500 GB / mm3 en estos casos resultará muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos para poder expresar en % , por ello es aconsejable expresar literalmente lo que se vió al observar el preparado por ej: se realiza la fórmula leucocitaria en un paciente leucopénico y solo se logró contar 80 elementos ( pueden ser 70, 90 dependiendo del tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo aconsejable es expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS CONTADOS “x” son Neutrófilos, “y” son eosinófilos, “z” son linfocitos, etc, etc, es decir se expresa cuantos elementos de cada serie se observó en el total de GB contados Y NO EN PORCENTAJE!

FORMULA LEUCOCITARIA EN ADULTOS SANOS LEUCOCITOS (%) ABSOLUTO (cel / mm3)CAYADOS 0 – 1% 100 - 250NEUTROFILOS SEGMENTADOS 55 – 70 % 3000 - 5000EOSINOFILOS 1 – 4 % 20 - 350BASOFILOS 0 – 1 % 10 - 60LINFOCITOS 20 – 40 % 1500 - 4000MONOCITOS 4 – 8 % 100 - 500

No hay variación de la fórmula según el sexo, pero sí según la edad. Nacimiento: 70% de neutrófilos. Primera semana: 50% de neutrofilos y 50% de linfocitos. Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrófilos3-4 años: 50% de linfocitos

y 50% de neutrófilos. 10-12 años: valores de referencia del adulto.

Descripción de cada uno de los elementos que componen una fórmula normal

1. Neutrófilo: Núcleo lobulado (2-5 lóbulos). Los lóbulos están unidos entre sí por filamentos cromatínicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una célula terminal. Mide aproximadamente 12 mm. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulación fina específica de color pardo rojiza.

2. Eosinófilo: Mide aproximadamente 13 mm. El núcleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con más lóbulos. El citoplasma es abundante y está cubierto de granulaciones esféricas de mayor tamaño que las del neutrófilo y que se colorean de anaranjado.

3. Basófilos: Mide aproximadamente 10 mm. El núcleo está irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relación al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamaño pudiendo quedar superpuestas al núcleo, cubriéndolo parcialmente.

4. Linfocitos: Es una célula generalmente pequeña (7 mm), pero puede llegar hasta 12 mm. La forma más pequeña posee sólo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son células más grandes y con

citoplasma más abundante. El núcleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa.

5. Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamaño (18-24 mm). El núcleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporción núcleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tiñe de celeste plomizo y no presenta granulaciones.