5 fu dpyd. extracción. ctdna.
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DIAGNÓSTICO e INNOVACIÓN:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA
DNA CIRCULANTE
POLIMORFISMOS DPYD: 5-FU
José Antonio Castellano (FIR-2)
Análisis Clínicos HUGCDN
25/02/2015
José Antonio Castellano (FIR-2)
Análisis Clínicos HUGCDN
25/02/2015
I. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA
II. DNA TUMORAL CIRCULANTE (ctDNA)
III. APLICACIONES:
5-Fluoruracilo - Polimorfismos DPYD
Medicina Personalizada
Estrategias: Prevención, Diagnóstico y Tratamiento
Avances, Técnicas y Abordajes.
Desarrollo de la Farmacogenética y Farmacogenómica. (EMA)
Conocimiento del Genoma Humano para:
•Comprender bases moleculares: respuesta variable al tratamiento.•Identificar nuevas dianas terapéuticas
Un poco de historia…
www.454.com
I.EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA
• Primera etapa de la mayoría de los estudios de Biología Molecular
• Permite obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diferentes fuentes
• Esencial para realizar metodologías como:
PCR cualitativa (1ª G)PCR cuantitativa indirecta (RT-PCR) (2ª G)PCR cuantitativa absoluta (PCR digital/ BEAMing) (3ª G)Secuenciación clásica ( SANGER)PirosecuenciaciónEpigenética (Metilación del DNA)MLPAa-CGHNext Generation Sequencing (NGS)….
Bloque Tumoral
Tejido Tumoral “gold standard” (Biopsia ó Citología)Suero o plasmaSangre TotalEsputos o exudados bronquiales (poca celularidad)Orinas y otros líquidos biológicosHeces
Muestras (5 μm)
Selecciónmuestra
Desparafi-nación
Extracción ADN
Observación por A.P.
TEJIDO TUMORAL: IMPORTANCIA DE UNA BUENA SELECCIÓN DE LA MUESTRA
TIPOS DE MUESTRA:
Xileno + Etanol
56ºC 10 min aprox.
Xileno + Etanol
56ºC 10 min aprox.
Métodos de Extracción
A) MANUALES ó AUTOMATIZADOSA) MANUALES ó AUTOMATIZADOS
B) SEGÚN TIPO DE SEPARACIÓN:1. Basados en soluciones: (Método Fenol-Cloroformo,
Guanidina tiocianato)
2. Basados en columnas cromatográficas:
• Cromatografía INTERCAMBIO IÓNICO
• Cromatografía ADSORCIÓN
• Partículas MAGNÉTICAS
B) SEGÚN TIPO DE SEPARACIÓN:1. Basados en soluciones: (Método Fenol-Cloroformo,
Guanidina tiocianato)
2. Basados en columnas cromatográficas:
• Cromatografía INTERCAMBIO IÓNICO
• Cromatografía ADSORCIÓN
• Partículas MAGNÉTICAS
www.cultek.com
Sales caotrópicas (cloruro de guanidinio, urea y tiourea) Sales caotrópicas (cloruro de guanidinio, urea y tiourea)
Características cobas® DNA SP
Tamaño corte tejido
Sección de 5µm
% celulas tumorales
≥25% / 10%
Proceso aislamiento
Totalmente definido
Tiempo aislamiento
3 horas
Extracción ácidos nucleicos
Alta
Extracción ADN Alta
Co-purificación RNA
Baja
EXTRACCIÓN MANUAL DE DNA
REACTIVOS:-DNA TLB: Tampón Tris-HCl, , Triton x-100, KCl, EDTA, azida sódica. -PK (PROTEINASA-K)-DNA PBB: Tampón Tris-HCl ,Hidrocloruro de guanidina,urea, Triton x-100 .-WB I: Tampón Tris-HCl + 64% guanidina-HCl-WB II: Tampón Tris-HCl + NaCl-DNA EB: Tampón Tris-HCl + azida sódica(hiposalino), también H2O
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EXTRACCIÓN AUTOMATIZADA DE DNA
MagnaPure Compact ROCHE®
Características:-Diferentes tipos de muestra: tejido, suero, sangre, plasma…-Trabajar 1-8 muestras simultáneamente.-Posibilidad de elegir volúmen de elución (100-400 uL)-Menor tiempo de extracción (35-50 min, según protocolo)-Mayor protección para el operador: (Menor toxicidad reactiva) : Filtro HEPA y descontaminación UV incorporado
BOLAS MAGNÉTICASBOLAS MAGNÉTICAS
Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría
Cociente de pureza: A260/A280 = 1,8-2,0 Interferencias: Proteínas
/DNA
Nanodrop 2000 (Thermo)
Rango dinámico2 ng/uL-15000 ng/uL
Cociente de pureza: A260/A230 = 2,2 Interf.: HC, Péptidos, Fenoles, Comp. aromáticos…
ETAPAS: 35 ciclos1.Desnaturalización (94-96ºC) 1-5 minutos2.Hibridación (45-72ºC) Unión de cebadores. Si aumentamos Tª, aumenta Especificidad de unión. También modificar el tiempo mejora la Sensibilidad/Especificidad.3.Extensión (72ºC) 2-5 minutos aprox. Depende del tamaño a amplificar (Act. Polimerasa)
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
PCR MIX
Buffer
Primers
DNA molde
dNTP’s (dATP,dGTP,dCTP,dTTP)
Taq polimerasa
MgCl2 (Cofactor Taq polimerasa)
PCR MIX
Buffer
Primers
DNA molde
dNTP’s (dATP,dGTP,dCTP,dTTP)
Taq polimerasa
MgCl2 (Cofactor Taq polimerasa)
1ª G. 2ª G.
3ª G..
Muestra con “Azul de Bromofenol”Muestra con “Azul de Bromofenol”
Agarosa 1-3 %
Tampón TBEX
Bromuro de Etidio
Agarosa 1-3 %
Tampón TBEX
Bromuro de Etidio
II. DNA Tumoral Circulante ctDNA
>75% ctDNA detectable en Ca AVANZADO : (Páncreas,ovario,CCR,vejiga,gastroesofágico,mama,melanoma, hepatocelular y de cabeza y cuello)
50%-70% ctDNA detectable en tumores LOCALIZADOS: (CCR,gastroesofágico,páncreas ymama)
< 50% ctDNA detectable en tumores PRIMARIOS: (cerebro, renal, próstata o tiroides)
OTRAS UTILIDADES DEL DNA CIRCULANTE:
DPNI: Diagnóstico
Prenatal No Invasivo
EN 1997 SE PRODUCE UN HITO EN EL USO DEL DNA CIRCULANTE, ES EL COMIENZO DE LA UTILIZACIÓN DE ADN FETAL EN EL DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO (Dennis Lo y cols, The Lancet,vol 350,issue 9076; 16 Agosto 1997, pp:485-487)
A partir de sangre periférica materna posibilidad de realizar diagnósticos:-Sexo (gen SRY y DYS14)-Aneuploidías ( cromosomas X,Y,21,18, 13)-RH (exones 5,7 y ocasionalmente exón 10 del gen RhD)-Enfermedades monogénicas (Huntington, Distrofia Miotónica, FQ, b-Talasemia…)
III. APLICACIONES: 5-Fluoruacilo-DPYD
.
Tumores sólidos: Colon, mama, piel (uso
tópico) ,esofágico, estómago,hepatocarcinoma, cabeza y cuello
Mecanismo de acción:Antimetabolito antagonista de pirimidinas (Fase S de la síntesis de DNA). Otros: Gemcitabina, Citarabina, Tegafur, Hidroxiurea, Procarbazina…
Conocer la variación genética implica poder predecir la actividad enzimática y poder evitar efectos secundarios en el paciente tratado.
ADMINISTRACIÓN ORAL 5 FU (PROFÁRMACO)
FOLFOX-4: 5-FU + Leucovorin + Oxaliplatino (2 días consecutivos)FOLFOX-4: 5-FU + Leucovorin + Oxaliplatino (2 días consecutivos)
FOLFIRI: 5-FU + Leucovorin + IrinotecanFOLFIRI: 5-FU + Leucovorin + Irinotecan
Regimen de dosis: Irinotecan [180 mg/m2 IV 90min] + Leucovorin [400 mg/m2
IV 120 min] + 5 FU [ bolus 400-500 mg/m2] y 5 FU [2400-3000 mg/m2 IV 46 h]Regimen de dosis: Irinotecan [180 mg/m2 IV 90min] + Leucovorin [400 mg/m2
IV 120 min] + 5 FU [ bolus 400-500 mg/m2] y 5 FU [2400-3000 mg/m2 IV 46 h]
Otras combinaciones:Otras combinaciones:
XELIRI: Capecitabina + Irinotecan + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 80%)XELIRI: Capecitabina + Irinotecan + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 80%)
XELOX: Capecitabina + Oxaliplatino + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 74%)XELOX: Capecitabina + Oxaliplatino + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 74%)
PRESENTACIONES IV DE 5 FU:
Metabolismo
1. DPD= Dihidropirimidina Dehidrogenasa . 80-85% 5-FU administrado se degrada con DPD 2. TS= Timidilato Sintasa 3. MTHFR= Metilentetrahidrofolato Reductasa
MTHFRMTHFR
Reacciones adversasReacciones adversasReacciones adversasReacciones adversas
RespondedoresRespondedoresRespondedoresRespondedores
No respondedoresNo respondedoresNo respondedoresNo respondedores
POBLACIÓN TRATADA CON 5-FU
EFECTOS SECUNDARIOS 5-FU
•DIARREA
•Náuseas y vómitos ocasionales
•Pérdida de apetito, gusto metálico, llagas.
•Fotofobia
•Inflamación, Dolor. (lugar de punción)
•Dermatitis, Alopecia
•Leucopenia
•Anemia y/o hemorragias (rectales)
•Sequedad, agrietamiento, descamación de la piel
•Eritrodisestesia palmo-plantar (EPP): Erupción cutánea, hinchazón, enrojecimiento, dolor y descamación
•Dolor torácico (casos graves)
•DIARREA
•Náuseas y vómitos ocasionales
•Pérdida de apetito, gusto metálico, llagas.
•Fotofobia
•Inflamación, Dolor. (lugar de punción)
•Dermatitis, Alopecia
•Leucopenia
•Anemia y/o hemorragias (rectales)
•Sequedad, agrietamiento, descamación de la piel
•Eritrodisestesia palmo-plantar (EPP): Erupción cutánea, hinchazón, enrojecimiento, dolor y descamación
•Dolor torácico (casos graves)
POLIMORFISMOS DPYD
Nombre SNPs Mecanismo Implicaciones Observaciones
DPYD*2A
(IVS14+1G>A, rs3918290)
Transición de G>A que provoca la delección del exón 14
“SPLICING”
Toxicidad letal
(4 veces) en pacientes con dosis habituales de 5 FU
Constituye 50% alelos no funcionales conocidos
Evidencia científica 1A
DPYD*13
(rs55886062)
Transición de:
A >T (Ile560Asn)
A >C (Ile560Ser)
Exón 13
Aumenta toxicidad en: heterocigóticos (*1/*13)
Toxicidad muy grave: Heterocigóticos(*2/*13)
Homocigóticos(*13/*13)
Evidencia científica 1A
Mutación missense
rs67376798 A (T funcional)
(D*949V, 2846A>T)
Transición de T>A
(Asp949Val)
Exón 22
Toxicidad grave en pacientes con este alelo mutado
Evidencia científica 1A
Mutación missense
GEN DPYD (OMIM 612779): Gen con 4399 nucleótidos repartidos en 23 exones de codificación para la DPD que abarca 950 kb en el cromosoma 1p22. Existen al menos 30 mutaciones donde 20 son funcionales para el gen DPYD
GEN DPYD (OMIM 612779): Gen con 4399 nucleótidos repartidos en 23 exones de codificación para la DPD que abarca 950 kb en el cromosoma 1p22. Existen al menos 30 mutaciones donde 20 son funcionales para el gen DPYD
www.pharmgkb.orgwww.pharmgkb.org
Otras: DPYD*9A *9B(T85C), rs1801158, rs1801159, rs1801160, DPYD*5 hasta un total 11 mutaciones del gen DPYD.Otras: DPYD*9A *9B(T85C), rs1801158, rs1801159, rs1801160, DPYD*5 hasta un total 11 mutaciones del gen DPYD.
¿Existen diferencias en los Polimorfismos DPYD según la raza?¿Existen diferencias en los Polimorfismos DPYD según la raza?
5 grupos étnicos (N=288): Koreanos, Japoneses, Chinos, Afroamericanos y americanos de origen europeo.
5 grupos étnicos (N=288): Koreanos, Japoneses, Chinos, Afroamericanos y americanos de origen europeo.
Se observaron similitudes entre la población asiática y diferencias en los SNPs respecto a los Afroamericanos y Europeos:
-DPYD*9 (raro en asiáticos)
-DPYD*2A (mayor en Africanos)
Se observaron similitudes entre la población asiática y diferencias en los SNPs respecto a los Afroamericanos y Europeos:
-DPYD*9 (raro en asiáticos)
-DPYD*2A (mayor en Africanos)
¿Qué hacemos?- RT-PCR sondas Fluorescentes (TaqMan,SYBR Green)
- 3 polimorfismos-SNPs:
DPYD*2A, DPYD*13 y rs 67376798
¿Qué hacemos?- RT-PCR sondas Fluorescentes (TaqMan,SYBR Green)
- 3 polimorfismos-SNPs:
DPYD*2A, DPYD*13 y rs 67376798
Wild typeWild type
Heterocigótico (3%)Heterocigótico (3%)
Homocigótico mutado (0.1%)Homocigótico mutado (0.1%)
¿Y cómo sería el informe de los resultados?
Medicina Personalizada: Guía de actuación clínica
CONCLUSIONES
•Conocer la variación genética implica poder predecir la actividad
enzimática
• Existen muchas variantes, en especial SNPs, “single nucleotide
polymorphisms” que nos obligan a ser precisos en el diagnóstico.
•La aparicón de nuevas tecnologías nos ayuda a disminuir el tiempo de
respuesta en los resultados, realizar varios pacientes y polimorfismos
simultáneamente y una importante reducción en los costes.
•Evitamos la administración de terapia ineficaz o que se produzcan
efectos secundarios en el paciente (medicina personalizada)
GRACIAS POR SU ATENCIÓN