INTERACCIONES ANTIGENO-ANTICUERPO, ENSAYOS INMUNES

Y SISTEMAS EXPERIMENTALES

INTRODUCCIÓN• La utilización de la reacción in vitro entre

antígenos y anticuerpos séricos (serología) sirve de base para muchos ensayos inmunes.

• Debido a la notable especificidad de la respuesta inmune, la interacción entre antígeno y anticuerpo in vitro se utiliza ampliamente con propósitos diagnósticos, para la detección bien sea de antígenos o de anticuerpos. Ejemplo serotipificación de diversos microorganismos utilizando antisueros específicos.

• La interacción de antígenos multivalentes con anticuerpos con al menos sitios de combinación por molécula, que generan ligamiento cruzado (ver Figura), puede resultar en:

• - precipitación (si el antígeno es soluble)• - aglutinación (si el antígeno es particulado)• - activación del complemento

Se utilizan otros ensayos inmunes en la evaluación y el estudio de los componentes celulares del sistema inmune, como son:- métodos de rutina para medir la función linfocitaria (métodos para medir la inmunocompetencia humoral y de células T).- sistemas de cultivo celular- técnicas de ADN recombinante

1. Interacciones Primarias Entre Antígeno y Anticuerpo• Las fuerzas de unión entre un anticuerpo y un

epítope son por enlaces no-covalentes y por tanto relativamente débiles. Involucran fuerzas de van der Waals, electrostáticas e hidrofóbicas.

• Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden disociar fácilmente por:

• - Cambio de pH• - Concentraciones salinas altas• - iones caotrópicos (cianatos que interfieren con los

puentes de hidrógeno de las moléculas de agua)

1.1 Constante de Asociación, Afinidad y Avidez• Es una medida de afinidad de un anticuerpo

monovalente por un epítope del antígeno o un hapteno.

• La afinidad de unión de un anticuerpo anti-A con un antígeno multivalente A puede ser varias veces mayor que la afinidad con un antígeno univalente A (ver Figura).

• La asociación entre un antígeno y anticuerpos depende de:

• - la afinidad de cada epítope y su anticuerpo correspondiente

• - la suma de las afinidades de todos los epítopes involucrados.

• El termino avidez se utiliza para denotar la energía de unión promedio entre anticuerpos y un antígeno multivalente.

• En general, anticuerpos IgM tienen mayor avidez que anticuerpos IgG, aunque la unión de cada Fab en el anticuerpo IgM puede tener la misma afinidad que el Fab de un IgG.

2. Interacciones Secundarias entre Antígeno y Anticuerpo2.1 Reacciones de Aglutinación• La reacción de un anticuerpo con un antígeno

multivalente que es particulado (ejemplo, una partícula insoluble) resulta en el ligamiento cruzado de varias partículas antígenos por los anticuerpos. El ligamiento cruzado resulta eventualmente en la aglutinación de los antígenos por los anticuerpos.

Aglutinación

2.1.1 Título.El ensayo de aglutinación.• - es un método que algunas veces se utiliza para

medir el nivel de un anticuerpo sérico especifico para un antígeno particulado.

• - El título aglutinante de un suero determinado es una expresión semicuantitativa de los anticuerpos presentes en el suero.

• - se realiza mezclando diluciones séricas con una concentración fija de antígeno. Diluciones altas no causan aglutinación del antígeno. La dilución más alta de un suero que alcanza aglutinación visible del antígeno se denomina título.

• Tubos con altas concentraciones de suero que no causan aglutinación representan una prozona. Por qué no aglutina? por exceso de anticuerpos, cada epítope de una partícula se une únicamente a una sola molécula de anticuerpo, por lo que se previene el ligamiento cruzado entre diferentes partículas.

• Debido al fenómeno de prozona es imperativo que el antisuero se pruebe en diferentes diluciones.

2.1.2 Potencial Zeta. • Ciertos antígenos partículados pueden poseer una

carga eléctrica, ejemplo, carga neta negativa de eritrocitos debido al ácido siálico.

• Partículas cargadas suspendidas en solución salina generan un potencial eléctrico llamado potencial zeta, que impide estén muy cerca la una de la otra.

• Debido al potencial zeta, anticuerpos con brazos Fab cortos (IgG) puede que no aglutinen antígenos, mientras que anticuerpos como IgM con Fab más largos y pentavalentes si lo pueden hacer.

• ¿Cómo aglutinar antígenos de eritrocitos con anticuerpos IgG?

2.1.3 El Test de Coombs• El termino denota, la detección usando anti-

inmunoglobulinas, de cualquier Ig unida a un antígeno

- Emplea anticuerpos contra inmunoglobulinas (por eso también se llama el test anti-inmunoglobulina).- Se basa en dos hechos importantes: i) inmunoglobulinas de una especie son inmunogénicas cuando se inyectan en otra especie ii) muchas de las anti-inmunoglobulinas (ejemplo, IgG de conejo anti-humano) se unen a la porción Fc del anticuerpo, dejando libre las porciones Fab para que reaccionen con el antígeno.

• Cuando se utiliza por ejemplo, IgG humano contra antígenos de eritrocitos exhibiendo potencial zeta no hay aglutinación, pero al adicionar IgG de conejo contra IgG humano éste se une a Fc y puede hacer ligamiento cruzado de IgG humanos sobre eritrocitos relativamente distantes (ver Figura).

• Incluso la adición de anti-inmunoglobulina puede causar aglutinación en caso de concentración alta de anticuerpos dirigidos contra eritrocitos (fenómeno de prozona).

Hay dos versiones del Test de Coombs.1. Test directo.• Detecta anticuerpos unidos.• - se adicionan anti-inmunoglbulinas a las partículas

(ejemplo, eritrocitos) que se sospecha tienen anticuerpos unidos a antígenos sobre sus superficies.

• - Ejemplo: recién nacido con sospecha de enfermedad hemolítica. Si el Test de Coombs utilizando una suspensión con eritrocitos de un bebé aglutina significa que presenta la enfermedad.

2. Test indirecto.• Detecta anticuerpos en suero. - se utiliza para detectar la presencia, en el suero, de anticuerpos específicos contra antígenos particulados. - anticuerpos séricos si se adicionan a partículas puede que no las aglutinen debido al potencial zeta. La adición subsiguiente de anti-Ig causará aglutinación. - Ejemplo: detección de anticuerpos IgG anti-Rh en la sangre de mujeres Rh-negativas.

2.1.4 Aglutinación Pasiva.• Si el antígeno es un constituyente natural de

una partícula, la reacción de aglutinación se conoce como aglutinación directa.

• Si la reacción de aglutinación ocurre entre anticuerpos y antígenos solubles que se han adherido a una partícula insoluble, se conoce como aglutinación pasiva.

• La reacción de aglutinación (directa o pasiva, sin o con el Test de Coombs) se utiliza ampliamente en clínica. Ejemplos:

- tipificación de eritrocitos en bancos de sangre- diagnóstico de diversas enfermedades hemolíticas mediadas inmunológicamente (anemia auto-hemolítica inducida por droga)- tests para el factor reumatoide (IgM humana contra IgG humana)- test confirmatorio para sífilis- test látex de embarazo (detección de HCG en la orina de una mujer embarazada)

ENSAYOS DE AGLUTINACIÓNHemaglutinación de Isoantígenos• En la tipificación sanguínea, los anticuerpos se

adicionan a células sanguíneas rojas dando una reacción positiva cuando se amontonan las células o "hemaglutinación".

• Los reactivos se preparan en una solución coloreada para observar más facilmente los agregados RBC. De la misma manera, en un suero de paciente, se le puede probar al anticuerpo, la capacidad de generar hemaglutinación de RBCs debido a la presencia del anticuerpo que reconoce isoantígenos que no están presentes en los RBCs del propio paciente.

- Personas con el tipo de sangre A tienen anticuerpos anti-B;-Personas con el tipo de sangre B tienen anticuerpos anti-A;- Personas con el tipo de sangre O tienen anticuerpos anti-A y anti-B; - Personas con el tipo de sangre AB no tienen anticuerpos que reconozcan ningún isoantígeno. Por tanto, la prueba es un método rápido para determinar si un paciete tiene niveles normales de anticuerpos típicos basados en el tipo de sangre sanguíneo

• Prueba de Aglutinación en Látex• El test de aglutinación en látex es uno de los

diversos tipos de aglutinación por anticuerpos que detectan antígenos en una muestra utilizando anticuerpos unidos a una cama u otro material visible.

• Detecta la presencia de antígenos bacterianos que están presentes como reactivos en el sistema, unidos a la superficie de camas azules de látex. Una reacción positiva causa la agrupación de las camas. Las camas agrupadas se pueden ver a simple vista. Una reacción negativa deja las camas de látex en solución y de aspecto azul lechoso.

2.2 Reacciones de Precipitación• 2.2.1 Reacciones en soluciones.• Ocurren cuando se mezclan anticuerpos y

antígenos solubles.• La precipitación de complejos antígeno-

anticuerpo ocurre debido a que anticuerpos divalentes cruzan ligadamente antígenos multivalentes formando un enrejado, que cuando alcanza un determinado tamaño precipita (reacción de precipitina).

Precipitación• Una reacción de precipitación ocurre como

resultado de la combinación de anticuerpos en solución con sustancias solubles con las que los anticuerpos reaccionan.

• Si ocurre in vivo una reacción de precipitación en las articulaciones o en el riñón, ocasiona inflamación debido a que los complejos inmunes en esas áreas son filtrados hacia afuera causando irritación.

Precipitación (continuación)• En un test de precipitina sérica, se combinan

las diluciones del antígeno el anticuerpo en solución acuosa hasta que ocurre una reacción de precipitacion y particulas visibles se acumulan.

• Con un nefelometro se puede medir la cantidad de "flocculation“, midiendo las propiedades de dispersión de la luz de particulas en agregación. La prueba "Gold Standard" para la sífilis tiene como base una reacción inmunológica de floculación.

Precipitación en Solución • Es dificil de lograr la “Zona de Equivalencia”

precisa donde hay una concentración perfecta tanto de antígeno como de anticuerpo en solución.

• Se requerirían preparar muchos tubos con diversas concentraciones de anticuerpos y antígenos para lograr justo la cantidad apropiada.

• Únicamente después de la centrifugación el anillo delgado se hace más visible.

• En la práctica, las reacciones de precipitación se preparan generalmente, como reacciones de difusión en agar, para hacer más visible el precipitado.

Inmunodifusión en Geles de Agar• Se utiliza un gel de agarosa como matrix para

combinar difusión con precipitación. Los reactivos difunden a través del gel resultando en precipitación cuando se alcanzan los puntos de equivalencia.

• Un solo antígeno puede dar lugar a una sola línea de precipitación en la presencia de su anticuerpo homólogo. Cuando hay dos antígenos presentes en un sistema, cada uno se comporta independientemente. Por lo tanto, si se detectan varias bandas de precipitación, equivalen al menos a un número igual de combinaciones antígeno-anticuerpo.

• Los anticuerpos séricos no son homogéneos(uno tiene anticuerpos que reconocen todo tipo de organismos infecciosos y de alergénos).

• Es dificil obtener un solo antígeno aun en las preparaciones más puras, de modo que hay diversas reacciones posibles antígeno-anticuerpo en una sola mezcla.

• La difusión en gel permite examinar dichos sistemas múltiples debido a que la técnica permite la separación de las reacciones.

• Como los componentes individuales en un sistema reaccionan independientemente, los tests de precipitación en agar se denominan "inmunodifusión doble " o simplemente inmunodifusión (anteriormente se denominaba de Ouchterlon).

• El color blanco espeso de la matrix sólida de agar permite visualizar la reacción de precipitación. El método se utiliza clinicamente en inmunología/reumatología.

• Esta técnica tiene diversas y diferentes aplicaciones; ejemplos incluyen:

• - Determinación de la homogeneidad de sistemas antígeno-anticuerpo.

• - Diagnosticar enfermedades autoinmunes especificas.

• - Después de la purificación de una mezcla de antígenos.

• - Elucidar las reacciones entre antígenos relacionados serológicamente.

La precipitación aparece como una línea continua en la forma de un ángulo entre los dos pozos y el pozo 3. Esta banda sin ninguna proyección en el angulo se denomina banda de identidad.

Si se coloca en el pozo 1 una solución con antígenos X y Y, en el pozo 2 una solución con solo antígeno X, y en el pozo 3 antisuero con anticuerpos especificos tanto para X como para Y, se observa una reacción similar a la de la Fig. Note que hay una proyección de reacción hacia el pozo XY, lo que indica que están relacionados los dos materiales antigénicos de los pozos 1 y 2, pero que el material en el pozo 1 posee una especificidad antigénica que no posee el material en el pozo 2. esto indica una identidad parcial.

Si el material en los pozos 1 y 2 no poseen antígenos en común y el antisuero en el pozo 3 posee especificidades para ambos materiales, la reacción aparece como dos líneas que se cruzan.

Inmunoelectroforesis (IEP)• La (IEP) es un procedimiento que combina la

separación de antígenos por electroforesis de zona con la difusion de anticuerpos precipitantes en angulos rectos hacia la dirección de la migración del antígeno.

• La extensión de la migración de cualquier proteína depende del buffer de electroforesis, tiempo, voltaje, y punto isoeléctrico de la proteína. En especial, el pH determina la separación de una proteína de otra.

• La diferencia neta entre el punto isoeléctrico de una determinada proteína y el pH del buffer de electroforesis determina la extensión de la migración hacia el catodo o el anodo.

• Este método inmunológico se utiliza para detectar anormalidades en proteínas séricas especificas y para identificar inmunoglobulinas especificas utilizando reactivos anticuerpos anti-humanos.

• Los reactivos anticuerpos anti-humanos se han preparado contra fracciones purificadas de globulinas humanas y se obtienen comercialmente para propósitos de investigación o biomédicos.

WESTERN BLOT

RADIOINMUNOENSAYO

ELISA

CLASIFICADOR DE CELULAS ACTIVADO

POR FLUORESCENCIA

Anticuerpos Monoclonales

Método de Inmunofluorescencia • Su propósito es detectar la localización y la

abundancia relativa de cualquier proteína para la cual se tiene un anticuerpo.

• Utilizando anticuerpos para la proteína, puede conocer donde esa proteína se localiza.

• Por ejemplo, si va a utilizar anticuerpos para la bomba calcio ATPasa, que se localiza en el reticulo endoplasmático de la célula debe tener presente:

• - que el anticuerpo utilizado reconoce la calcio ATPasa de gallina.

• - la inmunofluorescencia se puede utilizar para cualquier proteína.

• La clave para éste método es la habilidad para visualizar el anticuerpo cuando se mira a través de un microscopio.

• Como los anticuerpos son más pequeños que las calcio ATPasas, el anticuerpo no se puede ver directamente.

• Por lo que se usa un marcador fluorescente unido covalentemente al anticuerpo.

• Cuando una luz ilumina el marcador fluorecente, este absorve la luz y emite una luz de color diferente que es visible para el investigador y se puede fotografiar.

Figure. Illustration of the direct and indirect methods for immunofluorescence.

Figura. In most immunofluorescence experiments, two antibodies are employed. The first one, called the primary antibody, is typically generated in a mouse and binds to your favorite protein, which in this case is the chicken calcium ATPase (shown as a series undulating striped line that zigzags through the ER membrane 10 times). The secondary antibody was purchased from a company that sells antibodies that bind to mouse antibodies and have a fluorescent dye covalently attached to it. As illustrated here, the secondary antibodies can bind to multiple sites on the primary antibody and thus produce a brighter signal since more dyes are brought to a single location.

Figura. This immunofluorescence micrograph shows the ER being labeled with a monoclonal antibody against the chicken calcium ATPase. This chicken cell was fixed, permeablilized, and processed for immunofluorescence. White indicates the location of the fluorescent antibody and thus the calcium ATPase to which the antibody was bound.

Immunofluorescence image of the eukaryotic cytoskeleton. Actin filaments are shown in red, microtubules in green, and the nuclei in blue.

Immunofluorescence - Axons of the Drosophila CNS antibody [BP102] (ab12455)

RATONES TRANSGÉNICOSGenes responsible for particular traits or disease susceptibility are chosen and extracted. Next they are injected into fertilized mouse eggs. Embryos are implanted in the uterus of a surrogate mother. The selected genes will be expressed by some of the offspring.Since the first gene transfers into mice were successfully executed in 1980, transgenic mice have allowed researchers to observe experimentally what happens to an entire organism during the progression of a disease. Transgenic mice have become models for studying human diseases and their treatments.

The image shows transgenic mice that carry the piggyBac transposon that has caused their cells to express red fluorescent protein. (Credit: Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Yale University).

Transgenic mouse lines expressing GFP, known as "green mice." FEBS Lett, 407, 313-9 (1997)

RATONES KNOCKOUT

N2KO mice created by the PI in 1997, that contain a targeted deletion of the Nhlh2 transcription factor (Good et al, 1997). These animals develop an adult onset overweight phenotype, characterized by increased body weight and body fat after 7 (females) to 12 (males) weeks of age. Weight gain is not due to increased food intake but due, rather, to failure to partake in high levels of physical activity. Thus, failure to exercise leads to adult-onset obesity in N2KO mice (Coyle et al., 2002). This problem extends directly to humans, as being overweight is a worldwide problem that affects nearly 60% of the U.S. adult population, due in part to sedentary lifestyles.