6.- EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES

8/14/2019 6.- EXTRACCIN Y SEPARACIN DE PIGMENTOS VEGETALES

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EXTRACCIN Y SEPARACIN DE PIGMENTOS VEGETALES

MANCILLA, C. G. E.; CASTREJN, C. R.; ROSAS, T. M; BLANCO, E. Z. y PREZ, S. L. J.

Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de Mxico, Campus Chapultepec(Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 Mxico, DF.)

RESUMEN:

Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso), clorofila-b(verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones.

Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite suseparacin cuando una solucin de las mismas desciende por a travs de una columna de cromatografaverticalmente sobre una pelcula de un disolvente orgnico, ya que las ms solubles se desplazarn a mayorvelocidad, pues acompaarn fcilmente al disolvente a medida que ste desciende. Las menos solubles avanzarnmenos en la columna.

Aparecern, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o ms, dependiendo del material utilizado)que estarn ms o menos alejados de la disolucin alcohlica segn la mayor o menor solubilidad de lospigmentos. Estas bandas poseern diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolucin.

En la prctica se extrajeron estas clorofilas al primero hervir en agua las espinacas para retirar el almidn, despusse extrajeron con una mezcla de metanol y ter dietlico las clorofilas y por medio de una extraccin lquido-lquido con ter de petrleo clorofilas y carotenos con ayuda de una solucin sobresaturada de NaCl para evitar

emulsiones y obtener las 2 fases. Una vez extrados los pigmentos fotosintticos, se procedi a realizar unacromatografa de adsorcin para separar las distintas clorofilas que componen dichos pigmentos fotosintticos quecomponen las coloraciones de las hojas de las plantas observndose que estas se iban corriendo por la columnadependiendo de la afinidad que tuvieran por el disolvente y se obtenan en diferentes cantidades de acuerdo al tipode clorofila, ya que por ejemplo se obtuvo en mayor cantidad la clorofila alfa debido a que esta es la que componecasi el 75% de las clorofilas de la planta.

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Resumen...1

Introduccin..2I.- Pigmentos fotosintticos..3II.-Fotosntesis....4

III. Clorofilas.......5

IV. Cromatografa..7

Objetivos....10Hiptesis........10

Material.......10Metodologa.....10Resultados....12Discusin de Resultados. .13Conclusiones.14

Referencias.....14


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INTRODUCCIN

La clorofila es un pigmento de las plantas, que les proporciona su color verde y que absorbe la luznecesaria para la fotosntesis. La clorofila absorbeprincipalmente luz violeta roja y azul y refleja luzverde.La abundancia de clorofila en hojas y su ocasionalpresencia en otros tejidos vegetales es la causa de queesas partes de las plantas aparezcan verdes, pero enalgunas hojas la clorofila es enmascarada por otrospigmentos. La extraccin y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para es estudio yconocimiento de sus propiedades.[1]

Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en loscloroplastos, son molculas qumicas que reflejan otransmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez.El color de un pigmento depende de la absorcinselectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de lareflexin de otras. Constituyen el sustrato

fisicoqumico donde se asienta el proceso fotosinttico.

Hay diversas clases de pigmentos:

Principales: Clorofilas (a, b, c, d y bacterioclorofilas) decoloracin verde.Accesorios: Carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloracinamarilla y roja. Ficobilinas de coloracin azul y roja presentes en lasalgas verdeazuladas, que comprenden el filo de losCianofitos. [2]

La Clorofila, es el pigmento que da el color verde a losvegetales y que se encarga de absorber la luz necesariapara realizar la fotosntesis, proceso que posibilita lasntesis de sustancias orgnicas a partir de lasinorgnicas (CO2, H2O y sales minerales), mediante latransformacin de la energa luminosa en energaqumica. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja,violeta y azul, y refleja la verde. Generalmente laabundancia de clorofila en las hojas y su presenciaocasional en otros tejidos vegetales, como los tallos,tien de verde estas partes de las plantas.

En ocasiones, la presencia de clorofila no es tan patenteal descomponerse y ocupar su lugar otros pigmentos deorigen isoprnico tambin presentes en los plastoscomo son los carotenos (alfa, beta y ganma) y lasXantofilas.Las algas verdeazuladas contienen la misma clase declorofila que las plantas superiores, pero la ausencia decloroplastos hace que se distribuya por toda la clula.

Con frecuencia otros pigmentos como la ficobilina(presente tambin en los rodfitos) enmascaran laclorofila y confieren a estas a las clulas, un colorazulado o rojizo. Su funcin es captar la luz ytransferirla a la clorofila.

Las clorofilas presentan una estructura molecular degran tamao de tipo porfirinico, estando formada en sumayor parte por carbono e hidrgeno; constituyendo unanillo tetrapirrolico ocupado en el centro por un nicotomo de magnesio, rodeado por un grupo de tomosque contienen nitrgeno. Del anillo parte una largacadena de 20 tomos de carbono, denominada fitol queconstituye el punto de anclaje de la molcula declorofila a la membrana interna del cloroplasto, elorgnulo celular donde tiene lugar la fotosntesis.

Cuando la molcula de clorofila absorbe un fotn, suselectrones se excitan elevndose a un nivel de energasuperior. Esto es el punto de partida en el cloroplastode una secuencia compleja de reacciones qumicas que

dan lugar al almacenamiento de energa en forma deenlaces qumicos.

Los diversos tipos de clorofilas existentes, sediferencian en pequeos detalles de su estructuramolecular y que absorben longitudes de ondaluminosas algo distintas. [3]

Por cromatografia se pueden separar cuatro clorofilasdistintas:

La clorofila A constituye de manera aproximada el75% de toda la clorofila de las plantas verdes, estando

presente tambin en las algas verdeazuladas y enclulas fotosintticas ms complejas. La clorofila B es un pigmento accesorio presente envegetales y otras clulas fotosintticas complejas;absorbe luz de una longitud de onda diferente ytransfiere la energa a la clorofila A, que se encarga detransformarla en energa qumica. Las clorofilas C y la D son propias de algas ybacterias.

Las clorofilas actan como catalizadores, es decir,como sustancias que aceleran o facilitan las reacciones

qumicas, pero que no se agotan en las mismas. Entrelos carotenoides hay tambin muchos catalizadores eintervienen como pigmentos accesorios en lafotosntesis, transfieren a la clorofila la energa de laluz que absorben para su conversin en energaqumica.[4]

PIGMENTOS VEGETALES

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Los colores que presentan los vegetales son debidos aunos compuestos qumicos llamados pigmentos. Elcolor que presenta un determinado rgano vegetaldepende generalmente del predominio de uno u otropigmento o la combinacin de ellos. Adems, algunosde los pigmentos que condicionan el color estnestrechamente ligados a las actividades fisiolgicas delpropio vegetal.

El color verde en los vegetales es debido a la presenciade dos pigmentos estrechamente emparentadosllamados clorofila a y clorofila b . Se encuentran prcticamente en todas las plantas con semilla,helechos, musgos y algas. Tambin aunqueaparentemente falten en algunas hojas de color rojo oamarillo, cuando se extraen las otras sustanciascolorantes de estas, puede comprobarse incluso all lapresencia de las clorofilas, que estaban enmascaradaspor los dems pigmentos. Asociados con las clorofilas,existen tambin en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son

losxantofilas y carotenos.

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PIGMENTOS FOTOSINTTICOS

Entre todos los caracteres ms externos de losvegetales, el ms notable y caracterstico esprobablemente el color. El color no es nicamente uncarcter llamativo de la vegetacin, sino que, adems,algunos de los pigmentos que lo condicionan estnestrechamente ligados a las actividades fisiolgicas delpropio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cmolas plantas viven y se desarrollan requieren el previoconocimiento de los pigmentos vegetales.

Qu son los pigmentos?

Si es posible encontrar en el reino vegetal todos losmatices y combinaciones de colores del espectro, existeun predominio general de los colores primarios: verde,amarillo, rojo, azul. Estos colores son conferidos a losvegetales por determinados compuestos qumicosdefinidos, llamados pigmentos. El color particular que presenta un determinado rgano vegetal dependegeneralmente del predominio de uno u otro o lacombinacin de ellos. Se debe tener claro que cuando

un vegetal presenta un color blanco, es debido a la faltade tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellasno es absorbida selectivamente como ocurre en laspartes coloreadas, sino que es transmitida o reflejadaprcticamente sin sufrir modificacin.

Las Clorofilas. El color verde tan uniformementepresente en los vegetales es debido a la presencia dedos pigmentos estrechamente emparentados llamadosclorofila a y clorofila b . Se encuentran prcticamenteen todas las plantas con semilla, helechos, musgos yalgas. Pueden formarse en las races, tallos, hojas yfrutos a condicin de que estos rganos estn situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz.Tambin aunque aparentemente falten en algunas hojasde color rojo o amarillo, cuando se extraen las otrassustancias colorantes de estas, puede comprobarseincluso all la presencia de las clorofilas, que estabanenmascaradas por los dems pigmentos.

Dnde estn los pigmentos?

Estos pigmentos se encuentran en el interior de laclulas vegetales especficamente en una organelallamada cloroplasto . Los cloroplastos son simplemente plstidos que contienen pigmentos cloroflicos. Loscompuestos cloroflicos estn ligados qumicamentecon las estructuras internas del cloroplasto (membranatilacoides) y se hallan retenidos en estado coloidal.Asociados con las clorofilas, existen tambin en loscloroplastos dos clases de pigmentos amarillos yamarillo-anaranjados que son los xantofilas ycarotenides. [6]

Cmo se dividen los solventes?

Los pigmentos cloroflicos son insolubles en elsolvente universal llamado agua. Pero s son solubles(afinidad qumica) en solventes orgnicos como porejemplo alcohol etlico y acetona. A los solventes queextraen simultneamente todos los pigmentos de lahoja se los suele llamar extractantes. Existen otrossolventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como porejemplo el tetracloruro de carbono y el ter de petrleo.

En el mtodo de extraccin simple, como se desarrollams adelante se utilizar como extractante el alcoholetlico y como separador el tetracloruro de carbono.Estos dos solventes orgnicos responden en formadiferente a los pigmentos cloroflicos, como astambin a sus diferencias fsicas que hacen que seandos lquidos no misibles y con diferente pesoespecfico.

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En el segundo mtodo por cromatografa se utilizarcomo extractante la acetona y como separador el terde petrleo. Este mtodo se trata de una separacinms fina de los pigmentos, y se basa en la absorcin ysolubilidad diferenciales de varias sustancias entre lasque se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos decarbonato de calcio para deshidratar la muestra, son loscomponentes necesarios para desarrollar la tcnica. [7]

FOTOSNTESIS

El proceso biolgico ms importante de la Tierra es lafotosntesis de las plantas verdes. A partir de sta se produce prcticamente toda la materia orgnica denuestro planeta y se garantiza toda la alimentacin delos seres vivos.

De este proceso qumico y biolgico dependen tresaspectos de suma importancia: Por la fotosntesis las plantas verdes producen

alimentos y materia orgnica para si mismas y paraalimentar a los animales herbvoros, y stos, a su vez, alos animales carnvoros. Se vuelve a utilizar el dixido de carbono ICO,) producido por los animales y por los procesos deputrefaccin o descomposicin. De otra manera el CO,saturara el planeta. Se restituye el oxigeno al aire y se hace posible larespiracin.[8]

Las plantas verdes poseen en su estructura celularorgnulos especiales denominados cloroplastos, quetienen la cualidad de llevar a cabo reacciones qumicas

conocidas como fotosntesis, o sea, de realizar sntesiscon ayuda de la luz solar.

La fotosntesis consiste en los siguientes procesos: El dixido de carbono (CO2 ) es absorbido por losestamos de las hojas, y junto con el agua (H2O), que esabsorbida por las races, llegan a los cloroplastos,donde con ayuda de la energa de la luz se produce laglucosa (C6 H12 O6). Durante esta reaccin se produce oxgeno (O2), quees emitido al aire o al agua y es utilizado para larespiracin de otros seres vivos. la frmula sencilla dela reaccin qumica es la siguiente:6 CO2 + 12 H2O + energa de la luz = C6 H12 06 + 6O2 + 6 H2OEsto significa que se usan 6 molculas de dixido decarbono (CO2) ms 12 molculas de agua (H2O) msenerga de la luz para producir una molcula de glucosa(C6 H12 O6) ms 6 de oxgeno (O2) yquedan6molculos de agua (H2O). A partir de la glucosa (C6 H12 O6) un azcar muycomn en las frutas, se producen la sacarosa, el

almidn, la celulosa, la lignina o madera y otroscompuestos, que son la base de los alimentos para lasplantas mismas y para los herbvoros.Mediante el proceso de la fotosntesis la energa solares acumulada en forma de compuestos qumicos, que alser consumidos por los seres vivos liberan esa energay sirven para mantener los procesos vitales en lasclulas (calor, movimiento, etc.).[9]

De la fotosntesis depende la alimentacin de todos losseres vivos sobre la Tierra, incluido el hombre, enforma directa (herbvoros) o indirecta (carnvoros,carroeros, detritvoros, etc.). Sin plantas verdes nosera posible la existencia ni de los animales ni de losseres humanos. Es ms, las fuentes de energa orgnica(carbn, petrleo, gas natural y lea) no son otra cosaque energa solar acumulada y liberada en los procesosde combustin, mediante la cual se mueve en granparte la sociedad moderna (vehculos, cocinas, fbricas,etc.).

Es por esto que el proceso final de combustin de estasfuentes de energa orgnica produce agua y dixido decarbono. Cuando la combustin es imperfecta o loscombustibles orgnicos contienen impurezas lacombustin, como la de los motores, produceelementos contaminantes, que pueden afectar alambiente y a la salud de las personas.[10]

La fotosntesis es un proceso que ocurre en dos fases.La primera fase es un proceso que depende de la luz(reacciones luminosas), requiere la energa directa de laluz que genera los transportadores que son utilizados enla segunda fase. La fase independiente de la luz

(reacciones de oscuridad), se realiza cuando losproductos de las reacciones de luz son utilizados paraformar enlaces covalentes carbono-carbono (C-C), delos carbohidratos. Las reacciones oscuras puedenrealizarse en la oscuridad, con la condicin de que lafuente de energa (ATP) y el poder reductor (NADPH)formados en la luz se encuentren presentes.Investigaciones recientes sugieren que varias enzimasdel ciclo de Calvin, son activadas por la luz mediante laformacin de grupos -SH ; de tal forma que el terminoreaccin de oscuridad no es del todo correcto. Lasreacciones de oscuridad se efectan en el estroma;

mientras que las de luz ocurren en los tilacoides. [14]

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En los procesos que dependen de la luz (reacciones deluz), cuando un fotn es capturado por un pigmentofotosinttico, se produce la excitacin de un electrn, elcual es elevado desde su estado basal respecto alncleo a niveles de energa superior, pasando a unestado excitado. Despus de una serie de reacciones deoxido-reduccin, la energa del electrn se convierte enATP y NADPH. En el proceso ocurre la fotlisis delagua, la que se descompone segn la ecuacin:

H2 O + cloroplasto + fotn 0,5 O2 + 2H+ + 2 electrones.

En la reduccin de un mol de CO2 se utilizan 3ATP y 2 NADPH, que a travs de una serie de reaccionesenzimticas producen los enlaces C-C de loscarbohidratos, en un proceso que se efecta en laoscuridad. En las reacciones de oscuridad, el CO2 de laatmsfera (o del agua en organismos fotosintticosacuticos/marinos) se captura y reduce por la adicinde hidrgeno (H+ ) para la formacin de carbohidratos[ ( CH2 O )] . La incorporacin del dixido de carbonoen compuestos orgnicos, se conoce como fijacin oasimilacin del carbono. La energa usada en elproceso proviene de la primera fase de la fotosntesis.Los seres vivos no pueden utilizar directamente laenerga luminosa, sin embargo a travs de una serie dereacciones fotoqumicas, la pueden almacenar en laenerga de los enlaces C-C de carbohidratos, que selibera luego mediante los procesos respiratorios u otrosprocesos metablicos.

En la fotosntesis cooperan dos grupos separados de pigmentos o fotosistemas, que se encuentran

localizados en los tilacoides. Muchos organismosprocariotes solamente tienen el fotosistema I (es el msprimitivo desde el punto de vista evolutivo).

Los organismos eucariotes poseen los fotosistemas I yII. El fotosistema I est asociado a las formas declorofila a, que absorbe a longitudes de onda de 700nm ( P700 ), mientras que el fotosistema II tiene uncentro de reaccin que absorbe a una longitud de onda

de 680 nm ( P680 ). Cada uno de estos fotosistemas seencuentra asociado a polipeptidos en la membranatilacoidal y absorben energa luminosaindependientemente. En el fotosistema II, se produce lafotlisis del agua y la liberacin de oxgeno; sinembargo ambos fotosistemas operan en serie,transportando electrones, a travs de una cadenatransportadora de electrones. En el fotosistema I setransfieren dos electrones a la molcula de NADP+ yse forma NADPH, en el lado de la membrana tilacoidalque mira hacia el estroma.[11]

CLOROFILAS

En las plantas superiores, la fotosntesis es posibledebido a la presencia en el cloroplasto, concretamenteen las membranas tilacoidales, de una serie de pigmentos que tienen capacidad para captar la luz.Existen dos tipos bsicos de pigmentos fotosintticos:

Clorofilas. Compuestas por una porfirina que lleva

incorporado un tomo de magnesio en el centro delncleo tetrapirrlico . El in Mg2* est coordinado conlos cuatro tomos de nitrgeno centrales, lo que hacede la clorofila un complejo extraordinariamenteestable. La "cabeza" que acabamos de describir, estunida a una "cola", el fitol, que es un alcohol de 20tomos de carbono. Cabeza y cola se unen a travs deun enlace ster en el que intervienen el grupoalcohlico del fitol y el grupo carboxilo de un cido propinico que est unido al anillo IV del ncleotetrapirrlico. Existen varios tipos de clorofilas, las msimportantes de las cuales son la "a", y la "b". Laclorofila a tiene un grupo -CH3 en el anillo II mientras

que la clorofila b tiene un grupo -CHO en esa mismaposicin.

Carotenoides. Actan como pigmentos accesorios enel proceso de la fotosntesis. Existen dos tipos depigmentos carotenoides: carotenos y xantofilas.

Los carotenos son hidrocarburos isoprenoides que nocontienen oxgeno y estn formados por largasmolculas con un sistema de enlaces conjugadosalternantes, dobles y sencillos, rematados en cadaextremo por un anillo de ciclohexano insaturado-tienen color amarillo-anaranjado.

Lasxantofilas tienen una estructura muy similar a la delos carotenos y su diferencia estriba en la incorporacinde oxgeno en los extremos de la molcula. Segn elgrupo que se incorpore existen variedades dentro de lasxantofilas. Son de color amarillo.[12]

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Como se sealo anteriormente la energa lumnica pueda ser utilizada por los sistemas vivos, primerodebe ser absorbida y quienes realizan esta funcin sonlos pigmentos fotosintticos. Los pigmentos sonsustancias que absorben luz; algunos absorben luz detodas las longitudes de onda y, por lo tanto, parecennegros. Otros, solamente absorben ciertas longitudes deonda, transmitiendo o reflejando las longitudes de ondaque no absorben. La clorofila, el pigmento que haceque las hojas se vean verdes, absorbe luz en laslongitudes de onda del violeta y del azul y tambin enel rojo. Dado que refleja la luz verde, parece verde.

Cuando un pigmento absorbe un fotn o cuanto de luz,un electrn de la molcula de pigmento es lanzado a unnivel energtico ms alto; se dice entonces que estexcitado. Este estado de excitacin puede mantenerseslo por perodos muy cortos de tiempo, deaproximadamente una millonsima de segundo o aunmenos; la energa de excitacin, puede disiparse comocalor; tambin, puede reemitirse inmediatamente comoenerga lumnica de mayor longitud de onda, o puede

provocar una reaccin qumica, como sucede en lafotosntesis, lo cual depende no slo de la estructuradel pigmento dado, sino tambin de su relacin con lasmolculas vecinas.[14]

Las Clorofilas son compuestos del tipo tetrapirrol, almismo grupo pertenecen las ficocianinas y lasficoeritrinas (pigmentos accesorios en algas azules yrojas). Constan de cuatro anillos de pirrol unidos por

medio de puentes de metilo (--CH=) lo que constituyeuna porfirina. El tetrapirrol es el cuerpo bsico de lasporfirinas, dentro de las cuales se incluyen adems delas clorofilas, las hemoglobinas y los citocromos. Lacaracterstica cromfora de la clorofila se debe justamente al sistema de dobles enlaces conjugadosgenerados por la unin de los anillos de pirrol mediantelos grupos metino. En el centro del sistema de anillos(representado como un punto negro en la grfica) sehalla un tomo metlico, para las clorofilas es elmagnesio. El anillo de pirrrol III tiene una estructuraisociclica adicional, el anillo de la ciclopentanona. Elanillo IV esta esterificado con un alcohol, el fitol, querepresenta una cadena de 20 tomos de carbono con undoble enlace, esta "cola" de fitol le da a la clorofilapura una naturaleza cerosa que explica la insolubilidaddel pigmento en agua y su buena solubilidad ensolventes orgnicos. Al respecto, la clorofila presentaun comportamiento doble, ya que la cola de fitol esinsoluble en agua, hidrfoba y el ncleo de la porfirinatiene un carcter hidrfilo, es decir es afn al agua.

Clorofila a y b

En las plantas, la clorofila a es el pigmento involucradodirectamente en la transformacin de la energalumnica en energa qumica, las clulas fotosintticascasi siempre contienen un segundo tipo de clorofila, laclorofila b y otro grupo de pigmentos llamadoscarotenoides. Uno de los carotenoides que seencuentran en las plantas es el -caroteno; loscarotenoides son pigmentos rojos, anaranjados oamarillos, que en las hojas verdes estn enmascarados por las clorofilas, que son ms abundantes; sinembargo en algunos tejidos, como los del tomate

maduro, predominan los colores reflejados por loscarotenoides.

Las otras clorofilas y los carotenoides pueden absorberluz de longitudes de onda diferentes de las que absorbela clorofila a. Estos pigmentos actan como pantallasque transfieren la energa a la clorofila a, extendiendoas la gama de luz disponible para la fotosntesis.

La clorofila puede convertir energa lumnica enenerga qumica solamente cuando est asociada conciertas protenas e incluida en una membrana

especializada, y sin embargo, slo una fraccin muypequea de la luz dentro del espectro visible que incideen las hojas de las plantas es finalmente transformadaen energa qumica.

Otras Clorofilas

Tambin existe una clorofila c, la cual se puede hallaren algas pardas pero es una clorofilina a la cual le falta

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http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/02_04.htm#pirrol#pirrolhttp://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/02_04.htm#pirrol#pirrol


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la cola de fitol y los tomos de hidrogeno en lasposiciones 7 y 8 en el anillo IV.

La clorofila d ha sido encontrada en las algas rojasmientras que la bacterioclorofila es el pigmento tpicode los bacterios fototrpicos.

Carotenoides

En estos colorantes amarillos y rojos, el sistema dedobles enlaces conjugados esta formadoexclusivamente por tomos de carbono, en generalconsisten de una cadena larga de hidrocarburo, por estoson compuestos insolubles en agua, pero s ensolventes grasos. Se dividen en Carotenos que sonhidrocarburos insaturados y en Xantofilas que sonderivados oxigenados de los anteriores.

Los carotenoides que participan en la fotosntesis sedesignan como carotenoides primarios, diferentes delos secundarios que aparecen en flores y frutos comocomponentes de los cromoplastos y en organismos

hetertrofos como bacterias, levaduras y hongos,tambin se pueden originar en organismosfotosinteticamente activos como consecuencia de unanutricin mineral deficiente.

Ficocianinas y ficoeritrinas

Estos pigmentos de color azul-verdoso y rojo-moradoestn limitados a las cianofceas (algas verde-azules) y

rodofceas (algas rojas), al lado de la clorofila a yalgunos carotenoides. Son compuestos emparentadoscon las clorofilas por ser compuestos del tipotetrapirrol, difieren de estas en sus propiedades fsicasy qumicas.

Consisten de un grupo protico de elevado pesomolecular y de un grupo responsable de la coloracin,un grupo cromforo, que se denomina por susimilaridad a los pigmentos biliares ficocianobilina yficoeritrobilina.

El cuerpo bsico consiste en cuatro anillos de pirrolunidos entre si por puentes de metino, pero en este casono forman un anillo cerrado, por lo tanto no hay untomo metlico en posicin central.

El cuerpo bsico consiste en cuatro anillos de pirrolunidos entre si por puentes de metino, pero en este casono forman un anillo cerrado, por lo tanto no hay untomo metlico en posicin central. Los anillos de

pirrol llevan en los carbonos 1 y 8 una funcin deoxigeno, en 4 y 5 un resto propionico a travs de susgrupos carboxilos estn unidos el grupo cromforo a laprotena por medio de enlaces peptdico. [15]

CROMATOGRAFA

Las tcnicas cromatogrficas para el anlisis y purificacin de los productos de reaccin sonampliamente utilizadas en el laboratorio orgnico.

La tcnica cromatogrfica de purificacin consiste enseparar mezclas de compuestos mediante la exposicin

de dicha mezcla a un sistema bifsico equilibrado.

Todas las tcnicas cromatogrficas dependen de ladistribucin de los componentes de la mezcla entre dosfases inmiscibles: una fase mvil, llamada tambinactiva, que transporta las sustancias que se separan yque progresa en relacin con la otra, denominada faseestacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o ungas y la estacionaria puede ser un slido o un lquido.Las combinaciones de estos componentes dan lugar alos distintos tipos de tcnicas cromatogrficas queaparecen en la siguiente tabla:

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Cromatografa de adsorcin.

Dentro de esta tcnica pueden diferenciarse dos tiposde cromatografas de adsorcin denominadascromatografa cromatografa de columna y de capa fina(abreviada TLC, del ingls Thin Layer Chromatography).

Para la tcnica de cromatografa de adsorcin encolumna se emplean columnas verticales de vidriocerrada en su parte inferior con una llave que permitala regulacin del flujo de la fase mvil. Las columnasse rellenan con un adsorbente, como almina o gel deslice (fase estacionaria), mojado con el disolvente quese vaya a emplear en el proceso cromatogrfico. En laparte superior de la columna se pone la disolucin de lamezcla a separar y a continuacin un depsito quecontenga el eluyente (fase mvil) que se va a utilizar enla separacin. Se abre la llave inferior de manera que eleluyente comience a bajar por la columna. En esteproceso, los componentes de la mezcla son adsorbidos

por la fase estacionaria con diferente intensidad, demanera que el proceso de adsorcin-desorcin hace queunos componentes avancen ms rpidamente que otros.El lquido que sale por la parte inferior de la columnase recoge de manera fraccionada. Si los componentesde la mezcla avanzan a muy diferentevelocidad se podrn obtener fracciones cromatogrficasconstituidas por un solo componente.[16]

En toda cromatografa hablaremos de los siguientestrminos :

matriz de la columa. Sustancia que est empapada

de solvente y que se empaqueta en la columna.Tambin se denomina el lecho de la columna.

longitud de la columna. Longitud del dispositivoen el que se empaqueta la columna. Es importanteen algunos tipos de cromatografa como la defiltracin en gel y poco importante en otras comola cromatografa de afinidad.

volumen de la columna. Volumen total de gel quese empaqueta en una columna cromatogrfica.

volumen muerto de la columna. Cantidad desolvente que tiene que atravesar la columna paraasegurar que se ha reemplazado completamente.

Coincide con el volumen de solvente que sale de lacolumna desde que se aplica la muestra hasta queempieza a salir la primera protena. En general, ydependiendo del tipo de cromatografa puede serde 1 a varias veces el volumen de la columna.

'Run Throught'. Es, en columnas de intercambioinico o de afinidad, el volumen de solvente msprotenas que atraviesa la columna sin quedarretenido en ella. Correspondera en el caso de la

cromatografa de afinidad al volumen de solventeque contiene las protenas no afines al ligando.[17]

En la cromatografa de columna las molculas de unamezcla son separadas en base a la afinidad de lasmolculas por la fase estacionaria o por la fase mvil.Si una molcula A tiene ms afinidad por la faseestacionaria que la B, B bajar ms rpido que A.Existen muchos tipos de cromatografa de columna. Enel laboratorio se usan tres tipos de ellas.

A. Filtracin en gel: En esta las molculas sonseparadas por su tamao. El gel consiste de una camade esferas con poros de un tamao dado. El gel seconoce como sefadex, el cual viene con poros dedistintos tamaos. Las molculas de igual o menortamao que el poro entran a las esferas mientras que lasmolculas ms grandes pasan rpidamente por lacolumna. Las molculas de tamao intermedio puedenentrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas.Las molculas salen en orden de tamao por el eludo.

Aunque para efectos de este laboratorio las muestrasque usaremos estn coloreadas, al hacer estacromatografa en la vida real hay que usar otraspruebas para determinar qu fracciones contienen lasmuestras de inters, las cuales suelen ser protenas. Elmaterial que se escoja para la fase estacionariadepender del tipo de muestra que estemos corriendo.Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamao.

B. Intercambio inico: Se usa para purificarprotenas. Separa molculas en base a su carga inica.La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Aleluir una muestra, las molculas de igual carga salen

con el amortiguador. Las molculas de carga opuesta seadhieren al material de empaque con distintos gradosde afinidad. Para desprender las protenas adheridas seusa una solucin alta en cloruro de potasio o de sodio.Esto puede hacerse usando soluciones con incrementosmoderados de salinidad, o de un solo paso, echando lasolucin de mayor concentracin de sal primero. Alsubir la concentracin poco a poco podemos recolectarlas muestras desde las que menos afinidad por lacolumna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante laelucin, la sal va compitiendo con la protena por lascargas de la matriz de la columna, hasta que la

desprende.La columna puede ser de matriz negativa (intercambiocatinico) o positiva (intercambio aninico). El tipo deempaque depender de qu queremos aislar. En estetipo de columna el pH es importante porque puedealterar la carga de la columna.

C. Fase inversa: Esta es una cromatografa deinteraccin en la que la fase estacionaria, con

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molculas hidrofbicas, interacta con molculashidrofbicas en la muestra. La matriz consiste de fibrasde silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraerna las molculas hidrofbicas de la muestra mientrasque las hidroflicas salen con el amortiguador. Lasmolculas son eludas de la columna lavando consoluciones de distinta concentracin de alcohol ocualquier otro solvente no polar.[18]

Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina(Al2O3), Slica u Oxido de Magnesio. La faseestacionaria esta constituida por un slido poroso, elcual queda soportado en el interior de una columnageneralmente fabricada en plstico o vidrio. La fasemvil se encuentra formada por la solucin quelentamente va atravesando la fase estacionaria. Lasolucin que sale al final de la columna se reemplazaconstantemente por nueva solucin que se suministradesde un contenedor por la parte superior de lacolumna.

La migracin de las sustancias de la mezcla a travs dela columna se encuentra retardada en diferente grado

por las interacciones diferenciales que cada una de ellaspueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias seseparan gradualmente formando bandas dentro de labanda total, la separacin, y por tanto la resolucin,aumenta con la longitud de la columna. La bandaindividual de cada sustancia puede ensancharse con eltiempo debido a procesos difusinales, disminuyendopor tanto la resolucin.[19]

LPIDOS SAPONIFICABLES

Una forma de clasificar los lpidos es la que se basa en sucomportamiento frente a la reaccin de hidrlisis enmedio alcalino (SAPONIFICACIN). Los lpidossaponificables son los que se hidrolizan en medioalcalino y por lo tanto tienen cidos grasos en suestructura (ceras, TAG, FG, y EFL), y los nosaponificables son los que no experimentan esta reaccin(Terpenos, esteroides, prostaglandinas, en este grupotambin estaran incluidos los cidos grasos).[20]

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OBJETIVOS:

General: Extraer y separar diferentes pigmentosvegetales

Especficos: Escoger el material adecuado para extraer

clorofilas Aplicar experimentalmente la extraccin porsolventes

Empacar y desarrollar una columna defraccionamiento

Indicar los diferentes pigmentos fotosintticosen la columna de acuerdo a su polaridad

HIPTESIS

Si realizamos una extraccin de las clorofilas de laespinaca que es una planta verde, con disolventesorgnicos como el ter de petrleo en el cul lasclorofilas son solubles y adems realizamos unacromatografa de adsorcin por columna, utilizandodisolventes apropiados como N-propanol en ter de petrleo los cules presentan afinidad por estospigmentos, entonces podremos separar y obtener lasdistintas clorofilas que componen los pigmentosfotosintticos de las espinacas.

MATERIAL

Tijeras 2 vasos de precipitado de 250 ml

1 vaso de precipitado de 150mL 1 probeta de 100ml 2 botes 1 embudo de separacin 1 matraz de fondo redondo 1 pipeta de 1ml, 5ml y 10ml 1 pipeta pasteur

Papel filtro 1 mechero 1 tripie con tela de asbesto 1 columna cromatografca (2X20cm)

1 lana de vidrio 1 embudo de filtracin 1 hielo

MATERIAL BIOLGICO

Hojas de espinaca frescas 2g

REACTIVOS

1. metanol 90%, ter di etlico 10%2. metanol 70%, ter di etlico 30%3. ter di etlico4. ter de petrleo5. NaCl solucin acuosa saturada6. KOH en metanol al 30%7. NaCl al 10%8. azcar glass (como absorbente)9. N-propanol en ter de petrleo al 0.5%

EQUIPO

Parrilla elctrica Balanza analtica

METODOLOGA:

A.- EXTRACCIN

Tomar dos hojas verdes y tiernas de espinacas

1. Separar los pecolos y venas grandes de lashojas y picarlas

2. Colocarlas en un vaso de precipitado de 250mlcon 50ml de agua hirviendo por dos minutos

3. Pasar el vaso a un bao helado y enfriar,descartar el agua

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4. Extraer los pigmentos de las hojas con 50ml deuna mezcla de metanol 90% y ter di etlico10%. Calentar un poco en bao maria (5 min)

5. Repetir la extraccin con 50ml de metanol al70% y ter di etlico 30%. Calentar durante 5min. (Las hojas quedan incoloras)

6. Cambiar los extractos obtenidos de los pasos 5 y6 en un embudo de separacin

7. Aadir 50ml de ter de petrleo

8. Aadir 50ml de solucin acuosa saturada deNaCl y agitar

9. Dejar separar las capas

10. Descartar la capa inferior

11. Lavar la capa superior con dos porciones de50ml de agua destilada

12. Verter la capa verde por la parte superior delembudo, a un matraz de base redonda

13. Evaporar a sequedad a menos de 40C bajo vaci(ENCASO de detener aqu el experimentoalmacenar el extracto evaporado en laoscuridad).

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B.- PREPARACIN DE LA COLUMNA:

1. Colocar un tapn de lana de vidrio o algodn enel extremo de la columna

2. Empacar cuidadosamente el azcar glass,aadiendo esta con un embudo, cuidando de noforzar el empaque. La columna debe quedar de20cm aproximadamente.

C.- CORRIMIENTO DE LA MUESTRA:

1. La muestra se suspende con 0.5 ml de ter de

petrleo2. Usando la solucin suave. Introducircuidadosamente la solucin de la muestra en lacolumna con una pipeta, y permitir que se formeuna estrecha zona inicial

3. La muestra que se adhiere a la parte superior e

inferior del tubo, se puede lavar con un poco deter de petrleo. No dejar secar

4. Desarrollar con N-propanol al 0.5% en ter depetrleo

5. Se puede acelerar el desarrollo aplicando unasuccin de 0.5 atm. Un flujo de 1 ml/ min, dabuena separacin.

RESULTADOS

El corrimiento de la muestra para la separacin de los pigmentos de las clorofilas se desarroll con N-propanol al 0.5% en ter de petrleo.

Poco a poco se iban separando los pigmentos y estose observaba en la almina.

Se iban separando los pigmentos en sus distintastonalidades: abajo amarillo, verde, verde azulado yarriba quedaba de nuevo el amarillo

Se obtuvieron los 4 tipos de clorofilas existentes engran cantidad: 4 tubos de xantofilas, 2 tubos declorofila , 3 tubos de clorofila y 1 tubo completode carotenos.

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Las primeras clorofilas formadas fueron dexantofilas:

La primer capa formada fue de color amarillotransparente, despus la siguiente capa fue decolor amarillo verdoso, seguida de un verdemilitar y por ltimo un color verde olivo.

Las segundas clorofilas extradas fueron las clorofilas

El primer y segundo tubo se observaron de uncolor verde agua; esta fue la clorofila que se present en mayor cantidad y en la mismatonalidad.

Las terceras clorofilas extradas fueron las clorofilas de las que se obtuvieron 3 tubos: el primero verdeclaro, el segundo verde amarillento y el ltimo verdeamarilloso.

Por ltimo se obtuvo un tubo completamente lleno decarotenos en color amarillo.

DISCUSIN DE RESULTADOS

Se hirvieron las hojas de la espinaca en agua paraquitar el almidn de las hojas; la extraccin de lasclorofilas se realiz con una mezcla de metanol yter dietlico en bao mara hasta quedar las hojasde la planta incoloras, despus se realiz unaextraccin lquido-lquido en un embudo deseparacin en solucin saturada de NaCl (paraevitar que se formaran emulsiones) y ter dietlicoel cul extrae pigmentos, clorofilas ybetacarotenos, por lo cul en este disolvente fue en

el que se obtuvieron los pigmentos para lacromatografa posterior. Al realizar la cromatografa de adsorcin en el que

este medio fue la almina (fase estacionaria) y eleluyente la mezcla de N-propanol en ter dietlico,de manera que el eluyente comienz a bajar por lacolumna y los componentes de la mezcla fueronadsorbidos por la fase estacionaria con diferenteintensidad, de manera que el proceso de adsorcin-desorcin hiz que unos componentes avanzaranms rpidamente que otros.

Aparecieron varias bandas de diferentes colores

que estuvieron ms o menos alejados de ladisolucin de N-propanol en ter de petrleo segnla mayor o menor solubilidad de los pigmentos endicha disolucin. Estas bandas tenan diferentegrosor, dependiendo de la abundancia del pigmentoen la disolucin. Las que tenan ms afinidad por eldisolvente bajaban ms rpido que los otrospigmentos.

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Las primeras clorofilas que se extrajeron fueron lasxantofilas, las cules son de color amarillo y olivo.Estas se obtuvieron en pequea cantidad cada unode sus coloraciones diferentes.

Despus se obtuvo la clorofila , la cul se obtuvoen mayor cantidad ya que esta es la que constituyeaproximadamente el 75% de toda la clorofila en lasplantas verdes y es de color verde azulado. Seguida

por la clorofila beta que fue la que se obtuvo ensegundo lugar en cantidad en color verdeamarillento.

Por ultimo se obtuvieron los carotenos que fueronde color amarillo ms intenso que las xantofilas yestos se obtuvieron al final debido a que eranmenos afines al disolvente empleado.

CONCLUSIONES

Se obtuvieron los pigmentos fotosintticos de laclorofila, que son los que le dan color a las hojas de lasplantas ya que la fotosntesis es un proceso que permitea los vegetales obtener la materia y la energa quenecesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva

a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jvenes de pigmentos, capaces de captar la energalumnica.

Gracias a esta prctica, se logr observar comocambian las tonalidades de estos pigmentosfotosintticos que componen a las plantas y se3encuentran en los cloroplastos de la clula vegetal y lesdan color al reflejar o transmitir la luz visible, ademsde que son los que constituyen el sustrato fisicoqumicode la fotosntesis.

REFERENCIAS

[1] Blanco Prieto F. Manual del Laboratorio deQumica. Grficas Cervantes. Salamanca, 1983[2] Garca JL. Experiencias bsicas en la enseanza delas ciencias de la naturaleza II. Instituto de laeducacin. Universidad de Santander. Santander, 1980[3] Gutirrez R. et al. Enseanza de las ciencias en laeducacin intermedia. Ed. Rialp. Madrid, 1990

[4] Villarreal F. et al. Experimentos de Qumica. Ed.Trillas. Mejico, 1981[5] http://blafar.blogia.com/2007/040901-los-pigmentos-vegetales.php[6]http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp6/Pigmentos.htm[7] J. Azcn-Bieto, M. Taln (eds.). Fundamentos deFisiologa Vegetal. Madrid: McGraw-Hill/Interamericana, Edicions Universitat de Barcelona,2000[8] B.B. Buchanan, W. Gruissem, R. Jones.Biochemistry and Molecular Biology of plants.Rockville (USA): American Society of Plant

Physiologists, 2000.[9] D. T. Dennis and D.H. Turpin (eds). Plantmetabolism. Plant physiology, Biochemistry, andMolecular Biology. Orlando, USA: Academic Press,1998.[10] H.W. Heldt. Plant Biochemistry and MolecularBiology. Oxford (U.K.): Oxford University Press,2004.[11] Frank B. Salisbury, Cleon W. Ross. FisiologaVegetal. Mxico: Grupo Editorial Iberoamericana,1994. (traduccin de la 4 edicin original en ingls:Plant Physiology. Wadsworth, 1992).

[12] L. Taiz, E. Zeiger. Plant Physiology. Sunderland,Massachussets: Sinauer Associates Inc., 2002.[13] Imgenes tomadas de Buchanan, Gruissen &Jones. Biochemistry & Molecular Biology of Plants.American Society of Plant Biologists. Rockville,Maryland. USA. 2000[14] Mathews, C. K; Van Holde, K. E. Bioqumica2ED. Madrid: Mc Graw Hill-Interamericana, 1998.657-665

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[15]http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/02_04.htm[16]http://es.geocities.com/qo_11_sepypur/[17]http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm[18] Ruben Dario Cortez. Tcnicas de separacin,cromatografa. [En lnea] Seccin de La RedLatinoamericana de Qumica. Barquisimeto Lara 301.Ultima versin 21 de enero de 1.998.[19] Valcarcel, M. 1988. Tcnicas analticas deseparacin. Editorial Revert. Espaa. pp 335-336,597-613.

Lawrence, A., Kaplan, y Pesce, J. 1986. Quimicaclinica: Tcnicas de laboratorio, fisiopatologia,mtodos de anlisis. Teora, anlisis y correlacion.Editorial Medica Panamericana. Junin, Buenos Aires.1739 p.[20] C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Arhen.Prentice Hall, Pearson. Bioqumica. (3 Ed.).Educacion, Madrid. (2002).[21]http://cmapspublic3.ihmc.us/servlet/SBReadResourceServlet?rid=1189907031953_65535060_462&partName=htmltext

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6.- EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES

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