Presentacin de PowerPoint

DIPLOMADO EN HEMATOLOGA Y BANCO DE SANGREMDULO IV (13 de Setiembre de 2015)CLASE 6

2INVESTIGACIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

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GENERALIDADESLos aloanticuerpos antieritrocitarios, diferentes de los Ac naturales anti-A o anti-B se denominan inesperados o irregulares.Un aloanticuerpo es aqul Ac que se produce como resultado de la exposicin de un organismo a Ag extraos.

Desde el punto de vista de la medicina transfusional, los Ac contra los Ag sanguneos se clasifica como:

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GENERALIDADESAc contra Aloantgenos: Los que se producen contra Ag de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.Ac contra los propios Ag del individuo: Autoanticuerpos contra Ag. eritrocitarios y plaquetas y los producidos en enfermedades autoinmunes.

De tal forma se considera a los anticuerpos autoinmunes como anticuerpos irregulares o adquiridos y a los aloanticuerpos los podemos dividir en:

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GENERALIDADESRegulares naturales: producidos con el Sistema ABO (anti-A y anti-B).Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1, anti-E, entre otros.Irregulares adquiridos o inmunes: antisistema Rh-Hr (anti-D, anti-c, anti-C y otros), anti-Kell, anti-Duffy.

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GENERALIDADESAc naturales regulares: Preferentemente Ig M. Fijan de manera eficiente el complemento. Pueden provocar lisis intravascular insuficiencia renal e incluso la muerte del paciente.

6Ac adquiridos o inmunes : Generalmente Ig G. Producen hemlisis extravascular en el bazo o en el hgado, mediante fagocitosis del complejo eritrocito + Ac.

7Son aquellos capaces de inducir reaccin hemoltica con acortamiento in vivo de la vida de los hemates incompatibles o en la EHRN.Sinnimo: Aloanticuerpos.

Por estimulacin antignica:Transfusin de hematesEmbarazos o abortosMecanismos desconocidos

Incidencia:Poblacin general 0,3 a 2,0%.Politransfundidos 9%.

Qu son Anticuerpos Irregulares?Cmo se forman los aloanticuerpos?

37C C

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8Son importantes?Ac. considerados importantes o potencialmente peligrosos de significado clnico:Anti-D (D, C, c, E, e), Kell, Duffy, SsU, Diego (Dla)Ac. que pueden ser de significado clnico o importancia cuestionable:Anti-Lea, Leb, -M, -N, -P1, I, Cartwright.Ac. que casi nunca presentan significado clnico o sin importancia:Anti-Ch/Rg (Chido/Rodgers), York (yka), Sda, Xga, Bg.

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9Cundo estudiarlos?Suministro de sangre compatible: Type & Screen (GS + Deteccin anticuerpos).Evaluacin prenatal: Mujer Rh- sin anti-D (inmunoprofilaxis) ttulo (evaluacin fetal).Evaluacin de la EHRN: Identificar la causa.Evaluacin de anemias hemolticas: Causa, clasificar, sangre compatible, aloanticuerpos escondidos.Resolucin de reacciones transfusional hemoltica: Investigacin de la causa, reaccin tarda (10 Ac/GR)

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14/09/201510

Objetivos de Investigar AnticuerposConocer la presencia de anticuerpos clnicamente significativo fuera del sistema ABO.Obtener los conocimientos tericos y bsicos para la realizacin de esta prueba.Comprobar que los pacientes no tengan anticuerpos no esperados (anticuerpos irregulares). Los nicos esperados deben ser los correspondientes al Sistema ABO.Asegurar la supervivencia de los hemates y minimizar los riegos para la salud del paciente.

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Aglutinacin en medio macromolecular (albmina, dextrn, gelatina, polivinilpirrolidona-PVP); la albmina incrementa la constante dielctrica del agua, lo que disminuye el potencial Z. El dextrn y el PVP potencializan la reaccin con puentes de polmeros.Prueba Coombs; es til para poner de manifiesto anticuerpos incompletos o sensibilizantes.Soluciones de baja fuerza inica; reducen la barrera electroesttica facilitando la reaccin Ag-Ac.

11ELEMENTOS QUE INFLUYEN EN LA REACCIN Ag-Ac EN LA BSQUEDA DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Enzimas; potencializan la reaccin Ag-Ac reduciendo la superficie de carga y removiendo estructuras que interfieren en el acceso de las molculas del Ac.Centrifugacin; acelera la reaccin Ag-Ac, por la fuerza que produce la misma.Temperatura; afecta la reaccin Ag-Ac de acuerdo a la T ptima de reaccin: 4 a 22C para los Ac fros, o 37C para los Ac calientes.Proporcin de Ag-Ac; importante en la bsqueda de la zona de equivalencia de la reaccin Ag-Ac.

12ELEMENTOS QUE INFLUYEN EN LA REACCIN Ag-Ac EN LA BSQUEDA DE ANTICUERPOS IRREGULARES

13DETECCIN DE ANTICUERPOS POR CLULAS PANTALLAReactivos:NaCl 9%Suspensin de GR del donante 5%Clula Pantalla IClula Pantalla IIAlbmina 22%Antiglobulina humana poliespecficoClula Control de CoombsIDENTIFICACIN DE ANTICUERPOS POR CLULAS PANELReactivos:NaCl 9%Suspensin de GR del donante 5%Clulas PanelAlbmina 22%Antiglobulina humana poliespecficoClula Control de Coombs

Sinnimos:Deteccin, pantalla, escrutinio, pesquisa, rastreo, screening, tamizaje, Coombs indirecto.

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14/09/201514Clulas que se utilizan para deteccin de anticuerpos antieritrocitarios.

Generalmente vienen identificadas con nmeros romanos I,II, III.

Son preparadas a partir de sangre donada por individuos de grupo sanguneo O.CLULAS PANTALLACLULAS PANEL

Son glbulos rojos seleccionados con antgenos de grupo sanguneo conocidos.

Provienen de distintos individuos.

Para ser funcional el panel de glbulos rojos debe identificar con certeza los aloanticuerpos significativos.

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Panel

14/09/201516 DETECCIN DE ANTICUERPOS POR CLULAS PANTALLA

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17 Tcnica en TuboEnumerar los tubos como I, II, III segn sea el caso 2 3 clulas.

Fase Salina2 gotas de suero + 1 gota de GR, centrifugar y leer.

Fase Trmica o Albmina2 gotas de Albmina al 22% e incubar (37C x 30). Centrifugar y leer.

Fase Coombs o AGHLavar 3 veces con SSF 0.9%. Decantar. 2 gotas de suero Coombs (AGH). Centrifugar, leer e interpretar. Si en negativo adicionar 1 gota de Clula Control Coombs.

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18 Tcnica en GelEn un microtubo (LISS/Coombs):

50 ul de GR 25 ul de suero/plasmaIncubar 37C x 15 minutos Centrifugar y leer.

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19Interpretacin de los Resultados : Clulas PantallaNegativo:La reaccin negativa en todas las clulas indica la ausencia de anticuerpos irregulares.Positivo:Una reaccin positiva en 1 2 clulas y un autocontrol (-) hace pensar la presencia de un aloanticuerpo.Donde hay una reaccin positiva en todas las clulas de la prueba y un autocontrol (+), puede ser debido a un autoanticuerpo.

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20 IDENTIFICACIN DE ANTICUERPOS POR CLULAS PANEL

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21 Tcnica en TuboEnumerar tantos tubos como muestras tenga el panel (1,2,3,4, hasta 11 o segn sea el caso ms clulas).Fase Salina2 gotas de suero problema + 1 gota de GR del reactivo panel, en cada uno de los tubos rotulados.En el tubo para el autocontrol colocar 1 gota de GR al 5% del propio paciente, mezclar, centrifugar y leer.

Fase Trmica o Albmina2 gotas de Albmina al 22% e incubar (37C x 30). Centrifugar y leer.

Fase Coombs o AGHLavar 3 veces con SSF 0.9%. Decantar. 2 gotas de suero Coombs (AGH). Centrifugar, leer e interpretar. Si en negativo adicionar 1 gota de Clula Control Coombs.

22Interpretacin de los Resultados : Clulas PanelPOSITIVO:La aglutinacin presente en 1 o ms tubos del panel con autocontrol (-). Nos indica la presencia de 1 o ms Ac de los Ag presentes en el panel.NEGATIVO:Ninguna aglutinacin en todos los tubos indica la ausencia de Ac perceptibles a los Ag listados en el panel.AUTOCONTROL POSITIVO:Indica presencia de autoanticuerpo.TCNICAS ESPECIALES:Como autoabsorcin (elucin) pueden ser requeridas para revelar el aloanticuerpo subyacente.

23Ejemplo:INVESTIGACIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

I

IIIII

24DETECCION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

4 posibilidadesFSFAF 37FC--++----

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EN ESTE PANEL SE IDENTIFICA QUE EL ANTICUERPO TIENE ACTIVIDAD EN FASE 37C Y CON EL SUERO ANTIGLOBULINA HUMANO: ES TIPO Ig G.descartadosFSFAF 37FC--++--++----------++------------

--++--++------------------------

ES LO MISMO UN AUTOANTICUERPO QUE UN ALOANTICUERPO? Un autoanticuerpo : anticuerpo que esta dirigido contra antgenos propios del paciente, pueden ser especficos (el paciente presenta un fenotipo Rh: EeC y presenta anti-e, anti-E) e inespecficos (panaglutininas: aglutinan todo con una caracterstica homognea).

Un aloanticuerpo es un anticuerpo que esta dirigido contra un antgeno que el paciente no posee. (El paciente presenta un fenotipo Rh: ECc y presenta un anti-e)

REALIZAR LA PRUEBA DE COOMBS DIRECTO (CD)

Esto es para discernir entre la presencia de un posible autoanticuerpo o un aloanticuerpo. CD (+): Posibilidad de estar frente un autoanticuerpo o un aloanticuerpo + autoac De que depender? Historia transfusional del pacienteHa recibido unidades de sangre? S (no descartar los aloanticuerpos, siempre y cuando el tiempo de la transfusin no exceda de los 90 das) No (descartar los aloanticuerpos)

FINALIDAD* Deteccin de Anticuerpos Incompletos (IgG) dirigidos contra antgenos del Glbulo Rojo.

LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA

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FINALIDAD* Deteccin de Fracciones de Complemento Fijados en la membrana del Glbulo Rojo. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA

C3dC3b

C3dC3bC3d

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En resumen:El principio de la prueba de A.G.H es detectar inmunoglobulinas de la clase Ig G y/o fracciones del Complemento unidos a los glbulos rojos.

LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANAPRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)FINALIDAD * Deteccin de GR sensibilizados in vivo - Anticuerpos y/o Complemento fijados en la membrana del GR en el torrente sanguneo.

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LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANAPRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)

=

GR sensibilizadosin vivoSuero de Coombspoliespecfico(Anti-IgGAnti-C3d)REACCINPOSITIVA

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LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANAPRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)APLICACIONES DEL TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)1.- Investigacin de Reacc. Hemolticas Transf.2.- Investigacin de E. H. R. N.3.- Investigacin de A. H. A. I. 4.- Investigacin de Anemias Hemolticas inducidas por Drogas.

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Interpretacion:Si la prueba muestra aglutinacin , se interpreta POSITIVA, significa que hubo sensibilizacin IN VIVO de los eritrocitos y se informa: PAD Positiva , sealando en cruces la intensidad de la reaccin, por ej. 4 +Si no hubo aglutinacin, la prueba es NEGATIVA, y significa que no hubo sensibilizacin IN VIVO

LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANATTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBSEQUIVALENCIA ENTRE EL GRADO DE AGLUTINACIN Y EL SCORE Grado de AglutinacinScore4 + 103 + 82 + 61 + 41/2 + visibles a simple vista 31/2 + visible al microscopio 10 o ausencia de aglutinacin 0

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LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANATTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBSIMPORTANCIA DEL TTULO Y SCORE TTULO del test de Coombs (Anti-IgG)248163264SCORE4+4+3+3+2+1+ 46MUESTRA 13+3+2+1+ 00 26MUESTRA 2TTULO del test de Coombs (Anti-IgG)248163264SCORE4+4+4+3+2+1+ 48MUESTRA 14+4+3+3+ 1+1+ 44MUESTRA 2

Caso 1Caso 2

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CD: 2+CD Monoespecfico IgG IgA IgM C3c C3d Ctl 2+ 0 0 0 0 0

Existen una serie de tcnicas que permiten realizar procedimientos que proporcionan ayuda en ciertas determinaciones.

Las uniones Ag Ac se rompen por medios fsicos qumicos (ter,xileno,digitonina)

Elucin por calor (Fsico). Elucin por glicina cida (qumico). Elucin por cloroquina (qumico). Absorcin

Elucin por calor: Consiste en disociar los anticuerpos adosados al hemate aplicando calor (56 C) por un tiempo de 10 min. Los hemates se incuban en una solucin de albumina al 6% v/v en un tubo de vidrio en constante agitacin, luego se centrifuga por 5 min a 3500 rpm y el sobrenadante obtenido se denomina eluato.

Ventajas: se puede trabajar el eluato a manera de suero se puede enfrentar a pantalla para determinar que ac es y tambin se puede trabajar con los hemates tratados.Desventajas: ocasiona hemlisis de los hemates y se corre el riesgo de perder sitios antignicos.

Elusin por Cloroquina Mediante esta tcnica se puede realizar el desprendimiento de los anticuerpos y despejarlos de los hemates, se agrega un volumen de hemates lavados frente a cuatro de cloroquina y se deja a Tambiente por una hora.Ventajas: los hemates no son sometidos al calor y se trabajara con ellos. Desventajas: No se puede trabajar con el eluato

CD de los hemates

Cmo saber que tipo de tcnica de elucin utilizar?

Depender de lo que se quiera realizar y con lo que se desee realizar. Si se desea realizar autoabsorciones utilizando los hemates del paciente: elucin por calor/ cloroquina. Si slo deseo trabajar con el eluato: elucin por calor.

Qu es una autoabsorcin?

Consiste en enfrentar el plasma del paciente con los hemates eluidos con la finalidad de disminuir la cantidad de autoanticuerpos del plasma (plasma autoabsorbido).Tiene como finalidad dejar limpio el plasma de autoanticuerpos para poder evidenciar la presencia o ausencia de aloanticuerpos en el paciente.En px, Si al exponer a la pantalla es( +): se trata slo de autoac + aloanticuerpos; si es (-), slo se trat de autoanticuerpos.

La deteccin de un Ac y su identificacin, constituyen una de las prcticas ms interesantes en el campo de la Inmunohematologa.Muchos de stos Ac son problemas complejos, que requieren ciertas facilidades en el laboratorio para su resolucin y de parte del investigador, exigen tiempo y experiencia.44CONCLUSIONES: