ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Preparación de cultivos celulares

ASIGNATURA :

Virología

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo.

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga.

CICLO :

2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.

Preparación de Cultivos Celulares

I. INTRODUCCIÓN :

Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo dentro de células vivas, la investigación sobre virus requiere el uso de hospedadores apropiados. Para el estudio de los virus bacterianos se usan cultivos axénicos en medio líquido o en medio semisólido con agar. Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar, resulta relativamente simple estudiar los virus bacterianos y por esta razón se dispone de un crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus.

En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero a efectos de investigación es deseable disponer de hospedadores más manejables. En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su órgano original. Este fue el comienzo para el desarrollo de los cultivos de tejidos y mas adelante el de los cultivos celulares (líneas celulares). Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o cultivos celulares, y el uso de tales cultivos ha facilitado enormemente la investigación sobre los virus.

Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagación de los virus, constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría de los virus, consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas. Dentro de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un agente que dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados) para luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas complementarias.

No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y líneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de pulmón fetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo órgano y especie (MRC-5). Por otro lado, una línea celular como HEp-2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es posible que los

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pasajes sucesivos de una línea hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, como sucede con Hep-2 en relación a VRS.

Entre los sistemas de cultivo más utilizados tenemos:

a) Cultivos primarios: Se caracterizan por tener varios tipos de células. La mayoría son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10 subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón embrionario humano (REH).

b) Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su número cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón.

c) Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n) número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero (riñón de mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1 (también de tejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de células humanas malignas. Éstas generalmente tienen un número variable de cromosomas y a veces también son denominadas líneas celulares heteroploides. Otras líneas celulares existentes son A9 (fibroblastos subcutáneos de ratón), BHK21 (fibroblastos de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epitelio de rata), L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitos de ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3-A31 (fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de rata). Algunos ejemplos de lineas celulares son:

HEP-2: Células heteroploides humanas derivadas de carcinoma laríngeo. Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS.MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para INFLUENZA y ocasionalmente PARAINFLUENZA.LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomienda para el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina cristalina al medio.MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Se recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.

Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células Hep-2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento de citomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón humano embrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como el herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera evidenciar.

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II. Objetivos:

Obtener un cultivo celular primario (monocapa de células in Vitro). Familiarizarse en el cultivo de tejidos.

III. Materiales:

Material Biológico: Huevos embrionados de 10 a 11 días.

Material de Laboratorio: Estuche de Disección (estéril). Matraz Tripsinizador. Agar. Tripsina. Diversas Soluciones y Medios de Cultivo. Pipetas Placas y frascos. Solución de Yodo alcohol. Ampolla de estreptomicina y ampicilina. Agitador magnético. Solución de Hanks Completo (750 ml):

- Solución A: NaCl (80 g.), KCl (4 g.), CaCl2 (1.4 g.), MgSO2.7H2O (2g.): cada solución que se va pesando se va diluyendo en 450 ml. H2O.- Solución B: Na2PO4 (0.6 g.), KPO4 (0.6 g.), glucosa (10 g.), H2O destilada (450 ml.).- Solución C: Rojo de Fenol 1% (16 ml.).

Hidrolizado de Lactoalbumina 5% Suero fetal bovino. Solución Buffer Fosfato (PBS): NaCl: 8 g, KCl: 0.2 g, Na2PO4: 1.15 g, H2O bidestilada: 1000 ml.

IV. Procedimiento:

Observar al Ovoscopio para descartar embriones muertos o defectuosos. Colocar los huevos seleccionados sobre un portahuevos con la cámara de aire hacia arriba. Llevar los huevos a la cámara de flujo laminar (en el caso de la práctica, entre dos mecheros). Limpiar la cáscara en su mitad superior, primera solución de alcohol yodado y después con alcohol. Colocar las pinzas y tijeras en un vaso con alcohol y agua hirviente.

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Con la tijera larga punta curva estéril recortar el casquete o la cáscara correspondiente a la cámara de aire (las tijeras se enjuagan con el H2O hirviente y vuelven al alcohol para volver a usarlas). Coger las pinzas largas y con la punta retirar la cáscara rota así como la membrana de la cámara de aire (esterilizar las pinzas para volver a usar). Con las pinzas curvas, coger al embrión del cuello y llevarlo a una placa estéril (esta operación repetirla con todos los embriones). Con una tijera (estéril) eliminar la cabeza, las alas y las patas; abrir el embrión con un corte en cruz y retirar las vísceras. Lavar con solución buffer fosfato por un par de veces. Luego, empezar a cortar lo que quede del embrión en pedazos cada vez más pequeños, hasta formar una especie de papilla. Luego lavar los trozitos de carne en la placa por 2 veces con solución Buffer Fosfato (PBS). Luego, llevar al matraz Tripsinizador y se agrega tripsina 25%: 4 ml. por embrión y se deja durante 10 minutos con movimientos giratorios, para esto se pone en un agitador magnético. Esto se puede repetir 2 veces. Transcurrido este tiempo el sobrenadante se vierte a un matraz, se guarda en refrigeración (previo agregar solución de PBS) . Se vuelve a tripsinizar el sedimento, utilizando igual cantidad de tripsina. Lo que se tiene en refrigeración, se pasa por filtro (capa de gasa y algodón) a otro matraz. El filtrado se centrífuga a 1 000 rpm por 5 min. luego se refrigera. Se elimina el sobrenadante y se queda el sedimento. Lavar células con PBS y luego centrifugar a 1 000 rpm por 2 veces mas. Se resuspende en el medio de multiplicación (previamente se cuenta células usando la cámara de New Bauer para obtener 2 x 106 células/ml). Se recogen 10 a 15 ml. y se lleva a una placa estéril, luego se agrega el suero de feto bovino (estimulará el crecimiento). Incubamos a 37°C. Las células caen al fondo en la placa, se multiplican por el medio y llenan los espacios vacíos y forma la monocapa. Se elimina el medio de multiplicación. Cuando se tiene la capa de células homogéneas, ya está listo para el cultivo y aquí se agrega se puede inocular el virus (cuando esta la monocapa recién se inocula el virus).

V. Resultados:

- Se obtuvo un primocultivo de células de embrión de pollo.- Se pudo observar algunos de los pasos importantes para la preparación de un primocultivo.

VI. Conclusiones:

Aunque se careció de varios materiales indispensables para el desarrollo de esta práctica (como p. ej. la centrifuga refrigerada, cámara de flujo laminar, suero fetal bovino), se pudo apreciar la técnica y los pasos para

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desarrollar un primocultivo a partir de embriones de pollo (de 9 a 11 días de desarrollo).

VII. Referencias:

- ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. México D.F.

- JAWETZ E., J. MELNICK, E. SDELBERG (1996) Microbiología Médica. 15º

edic. Edit. El Manual Moderno. México D.F.

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Anexos:

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EN IMÁGENES EL PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UN PRIMOCULTIVO A PARTIR DE EMBRION DE POLLO

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