7. Enzimas

Catalizadores Biológicos

EnzimasCatalizador: Incremento en la velocidad de reacción.

Enzimas: Hasta 1020 . Otros catalizadores 102-104

Con excepción de algunos RNAs, todas las enzimas son proteínas globulares.

Son muy específicas y diferencian entre esteroisómeros.

Velocidad de la reacción

• Depende de la energía de activation, DG°‡

Energía de activación• Cantidad de energía libre requerida para iniciar la reacción,

es decir para llevar a los reactivos al estado de transición.

Estado de transición

• Tiene la cantidad necesaria de energía

• Arreglo correcto de los átomos para dar los productos

EnzimasVía alternativa de menor energía de activación: Más

rápida.

No altera el cambio de energía libre estándar ni la constante de equilibrio.

Analogía

…con enzima

Disminuye la energía de activación requerida para que las moléculas del sustrato alcancen la estado de transición.

¿Por qué la energia requerida para alcanzar el estado de transición es mas baja con la enzima?

Centro Activo o catalitico(El bolsillo magico)

(1) Estabiliza la transición

(2) Excluye agua

(3) Grupos reactivos

(4) Acercamiento y orientacion de R

Un ejemplo…• Considere la reacción

H2O2 H2O + O2

Condiciones de reacción

Energía de activación (kJ/mol)

Tasa relativa

Sin catálisis 75,2 1Superficie de platino 48,9 2,77 x 104

Catalasa 23,0 6,51 x 108

Qué afecta la actividad enzimatica?

Cinética Enzimática

• Para la reacción

La velocidad de la reacción puede ser observada por la aparición de productos o desaparición de reactivos

– La velocidad de reacción está dado por la ecuación

Velocidad

A + B P

Rate = [A]t

[B]t

[P]t

_ _= =

Cinética Enzimática

• Para la reacción

Velocidad

k es una constante de proporcionalidad llamada constante específica de velocidad de reacción.

Orden de reacción: la suma de exponentes (f+g), muestra como la velocidad se ve afectada por concentración de los reactivos.

A + B P

Rate = k[A]f[B]g

– Considere la reacción

Con la ecuación determinada experimentalmente:

Velocidad

Orden de la reacción?

A + B C + D

Rate = k[A]1[B]1

Cinética Enzimática

Respuesta = 2

Considere la reacción:

Glucógenon + Fosfato Glucosa 1-fosfato +Glucógenon-1

Con la ecuación determinada experimentalmente:

Velocidad= k[Glucógeno] [ƒosfato]

– Orden de la reacción?

Cinética Enzimática

Respuesta = 2

Cinética enzimáticaMuchas reacciones en bioquímica son de 1er y 2do orden.

También existen las de orden 0:

• La velocidad no depende de las concentraciones de los reactivos

• sino de otros factores: Presencia de catalizador.

• p.e: Cuando la concentración de reactivos es tan alta que la enzima está saturada.

Unión enzima substrato

S: el reactante

El sitio activoPequeña porción de la enzima…

donde se une el substrato(s)...

por fuerzas no covalentes (p.e, puentes de hidrogeno, atracciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals)…

y se realiza la catálisis.

Modelos de UniónDescriben la formación del complejo enzima-substrato.

Modelo Llave-Cerradura:

No es el válido X

Ajuste inducidoLa unión induce un cambio conformacional que resulta en la complementariedad.

Formación de Producto

Ejemplo de Catálisis EnzimáticaQuimotripsina

• Cataliza hidrólisis selectiva de enlaces peptídicos donde el carboxi es dado por Phe y Tyr.

• También hidrólisis de enlaces éster (modelo para ver comportamiento de la enzima).

QuimotripsinaComportamiento de enzimas No Alostéricas

• Velocidad depende [S] hasta un punto…

• La velocidad de reacción no cambia, la enzima esta saturada.

• Curva hiperbólica

Aspartato Transcarbamoilasa (ATCasa)Comportamiento de enzimas Alostéricas

Cataliza 1er paso en la formacion de CTP y UTP (DNA y RNA).

• Reacción catalizada:

Carbamoil fosfato + aspartato Carbamoil aspartato + HPO42-

• Velocidad depende de [S] aspartato.

Enzimas Alostéricas• Alostérica: Del griego alo (otra) y sterica (forma).

• No siguen la cinética de M-M. Curvas sigmoidales.

• Enzima Alostérica: Oligómero cuya actividad biológica es afectada por otras sustancias que se unen a ellas.

ATCasa Comportamiento Alostérico

• Forma sigmoidal - característica del alosterismo

• Se alcanza la máxima velocidad por un mecanismo diferente.

Proteínas alostéricas:

Cambios sutiles en un sitio de la

proteína afectan la estructura y

función en otro sitio alejado.

Cinética de Michaelis-Menten

• Describe la velocidad de reacción de muchas reacciones enzimáticas de enzimas no alostéricas.

Leonor Michaels Maud Menten (1875-1989) (1879-1960)

Cinética de Michaelis-Menten

• La reacción catalizada por enzimas puede ser resumida así:

Cinética de Michaelis-Menten

• Siempre velocidad inicial = V0: aún no ha habido conversión a productos.

• A bajas [S]: Primer orden

• A altas [S]: Saturación de la

enzima: Orden 0.

• Se alcanza V máxima

Ecuación de Michaelis-Menten

KM: Constante de Michaelis = [S] a la cual la Vini es igual a la mitad de su Vmax (Vmax/2) alcanzable a una [E].

Relaciona: Velocidad inicial a cualquier [S] con velocidad máxima de una reacción enzimática.

Vmax [S]Vinit = KM + [S]

Michaelis-Mentenequation

Ecuación de Michaelis-Menten

Vmax [S]Vinit = KM + [S]

Michaelis-Mentenequation

Técnicamente esta ecuación y KM sólo aplicable para curvas hiperbólicas (enzimas no alostéricas).

Linearizando la ecuación de M-M…

Es difícil determinar Vmax experimentalmente

La ecuación puede linearizarse tomando el recíproco de cada lado

Vmax [S]V =

KM + [S](an equation for a hyperbola)

V1 =

Vmax

+ 1Vmax [S]

1

y m x + b

V1 =

KM •

= •

Gráfica del doble recíproco (Lineweaver-Burk)

para obtener Vmax y KM

¿Cuál es el significado de KM?

KM = [S] con 50% de los sitios activos de la enzima llenos.

– KM tiene unidades de concentración.

– KM a menudo se aproxima a la cte de disociación para ES. Mide que tan unido esta S a E (no siempre).

Cuanto más grande el valor de KM, menos fuerte la unión entre S y E

Para comparar Actividad relativa de diferentes enzimas

Vmax dividida por varias unidades relativas a la enzima.

Para preparaciones de enzimas impuras: Actividad específica: Vmax/concentración de proteína

Para una enzima homogénea: Número de recambio: Vmax/moles de enzima presente

Constante catalítica: kcat: Vmax/número de sitios activos

Asumiendo que la enzima esta saturada con el sustrato y la reacción se da a máxima velocidad

Constante Catalítica y KM

Enzima Función kcat* KM

**

Catalasa Conversión de peróxido en agua y O2

4x107 25

Anhidrasa Carbónica Hidratación de CO2

1x10612

Acetil colinesterasa Producción de acetil colina 1,4x104 9,5x10-2

Quimotripsina Enz. Proteolítica 1,9x102 6,6x10-1

Lisozima Degrada pared celular de polisacáridos de bacterias. 0,5 6x10-3

•: Mol de S convertida a mol de P por seg. Unidades sg-1 •**: Unidades de KM son milimolares

Actividad CatalíticaLa cantidad de enzima es pequeña y se mide por su actividad catalítica.

Unidades de actividad enzimáticas:1 micromol de sustrato transformado o de producto formado por minuto.

Inhibición EnzimáticaInhibidor Reversible: Se une de manera reversible

• Inhibidor competitivo: se une al sitio activo y bloquea el acceso al sustrato

Inhibidor competitivo• Misma Vmax

Inhibidor no competitivo• No se une al sitio activo

• Inhibe la enzima por cambio en su conformación.

Inhibidor no competitivo

• Mismo KM

Enzimas Alostéricas

Su actividad biológica es afectada por otras sustancias que se

unen a ellas.

Efectores Alostéricos

Dímerosregulatorios

Trímeroscatalíticos

ATCasa

¿Por qué hay enzimas alostéricas?

Porqué existen múltiples formas para la estructura 4ria de la proteína.

Efectores Alostéricos Inhibidores y Activadores

Activador: curva similar a la hiperbólica.Inhibidor: Más [S] para la misma velocidad de reacción.

Modelos para el comportamiento de enzimas alostéricas

• Modelo Concertado

• Modelo Secuencial

Zimógenos• Precursores inactivos que se activan por ruptura de 1 o

más enlaces covalentes.

Quimotripsinógeno• Se produce en páncreas y se activa en intestino delgado. • Tripsina: Cliva para producir Quimotripsina.

Sitio activo

Quimotripsina

• Cataliza hidrólisis selectiva de enlaces peptídicos en el que el carboxi esta dado por Phe o Tyr.

• Es una serina proteasa.

• His 57, Serina-195 y Asp 102 se encuentran en el sitio activo.

Mecanismo de acción de los AA críticos en la Quimotripsina

El oxígeno de Ser es nucleófilo y ataca al grupo carbonilo del enlace peptídico

Especificidad de la enzima• Absoluta: cataliza la reacción de un único sustrato.

• Relativa: cataliza la reacción de sustratos estructuralmente relacionados.

• Estereoespecificidad: cataliza una reacción en la que un estereoisomero.

Clasificación de las enzimas

1. Oxidoreductasas

2. Transferasas

3. Hidrolasas

4. Liasas

5. Isomerasas

6. Ligasas

Nombre de las enzimasNombre del sustrato - asa:

• Lipasa• Amilasa• Proteasa

Luego según tipo de reacción:• Deshidrogenasas• Transferasas

Nomenclatura del International Union of Biochemistry (IUB): Numérico y nombre.

1. Oxidoreductasas

A-red B-Oxi

+ A-oxi B-red

+

Deshidrogenasas, Oxidasas, Peroxidasas, Reductasas, Monooxigenasas

Oxidación ReducciónPérdida de electrones Ganancia de electronesGanancia de Oxígeno Pérdida de OxígenoPérdida de Hidrógeno Ganancia de Hidrógeno

1. OxidoreductasasAlcohol deshidrogenasa

2. Transferasas

A* B

+ A B*

+

C1- transferasas, Glicosil-transferasas, Amino-transferasas, Fosfo-transferasas

2. Transferasas

3. Hidrolasas

A-B

H2O+ A-H B-OH

+

Esterasas, Glicosidasas, Peptidasas, Amidasas

OHH

3. HidrolasasCarboxipeptidasa A

4. Liasas (sintasas)

A

+

A-BB

4. Liasas(sintasas)Piruvato descarboxilasa

5. Isomerasas

Iso-A

Epimerasas, Cis-trans isomerasas, Transferasas intermoleculares

A

5. IsomerasasMalato Isomerasa

6. Ligasas (sintetasas)

AB

A

+

B

+ XTP + XDP

X dependientes de energia

6. Ligasas (sintetasas)Piruvato Carboxilasa

Isoenzimas• Diferente estructura pero catalizan la misma reacción.

• Aunque varían en la secuencia de AA son parecidas.

• Enzimas “personalizadas”: Requerimientos específicos del tejido o determinadas condiciones metabólicas.

• 1era enzima de la glucólisis: Hexoquinasa y Glucoquinasa (hígado).