ENZIMOLOGÍAENZIMOLOGÍA CLÍNICA CLÍNICA

Q.B.P. RICARDO LOZANO M.Q.B.P. RICARDO LOZANO M.

DEFINICION DE CONCEPTOS

ENZIMAS: Son proteínas especializadas que tienen la función de acelerar reacciones químicas.

VELOCIDAD: Cambio en la cantidad de materiales iniciales o bien, de productos por unidad de tiempo. Ej.(moles/s)

CATALIZADOR: Agente que incrementa la velocidad de la reacción química sin alterarse así mismo durante el proceso.

ENZIMA = CATALIZADOR

DEFINICION DE CONCEPTOS

COFACTORES: Moléculas pequeñas, orgánicas o inorgánicas necesarias para la actividad de la apoenzima

HOLOENZIMA: Enzima Activa

SUSTRATO: Molécula sobre la cual actúa la enzima para formar productos

APOENZIMA: Parte proteica de la enzima

CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS

•Todas son proteínas•Son Altamente Específicas•Son sensibles a cambios de pH y Temperatura

CLASIFICACION GENERAL DE ACUERDO A SU FUNCIÓN

1. Oxidoreductasas2. Transferasas3. Hidrolasas

1. Liasas2. Isomerasas3. Ligasas

ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

La alteración de la concentración sérica de una enzima determinada, nos orienta sobre los tejidos más

probablemente afectados.

Es la aplicación del conocimiento de las enzimas al diagnóstico, tratamiento y pronóstico de algunas enfermedades.

Con frecuencia se relacionan los valores de dos o más enzimas distintas para realizar un diagnóstico más preciso

Principios del análisis de enzimas

La concentración sérica de las enzimas es muy baja, pero debido a su alta capacidad de catálisis, se puede determinar su actividad.

ACTIVIDAD ENZIMATICA α CONC. DE ENZIMA

Y se asume que…

Enzimología Clínica se basa en la evaluación de la actividad catalítica “in vitro”

Principios del análisis de enzimas

Existen dos formas de evaluar la actividad enzimática:

Las dos formas se evalúan bajo condiciones controladas de pH y Temperatura.

(los óptimos para la enzima)

• Por la Aparición de productos• Por la Desaparición del sustrato

Principios del análisis de enzimas

La actividad enzimática se expresa como Unidades Internacionales por unidad de volumen

(UI/mL, UI/L)

UI= cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato / min.

En condiciones estándar previamente establecidas

Fases de una reacción enzimática

RETARDO

LINEAL

Fase de agotamiento de sustrato

Producto

Tiempo (minutos)

Fase de Retardo: Ocurre inmediatamente después de mezclar los reactivos (sustrato) con el suero (enzima)

Fase Lineal: La formación del producto permanece constante. El factor limitante es la concentración de la enzima

Fase de agotamiento de sustrato: El sustrato se va agotando y la velocidad de la reacción disminuye hasta anularse

Sustrato

Tiempo (minutos)

RETARDO

LINEAL

Fase de agotamiento de sustrato

Fases de una reacción enzimática

Desaparición de sustrato

Fases de una reacción enzimática

Es necesario realizar las determinaciones enzimáticas en la fase lineal

•Factor limitante es la concentración de la enzima

•Condiciones de reacción son óptimas(exceso de sustrato, pH, Temperatura, etc.)

Técnicas de evaluación enzimática

Se emplean métodos espectrofotométricos

•Si el producto absorbe luz a cierta λ, se registra el aumento de la Absorbancia

•Si el sustrato absorbe luz a cierta λ, se registra la disminución de la Absorbancia

También es posible analizar la variación de algún cofactor u otro componente de la reacción.

Técnicas de evaluación enzimática

Frecuentemente se emplea la aparición de NADH o NADPH como evaluación enzimática.

NAD+ NADH NADH NAD+

NADP+ NADPH NADPH NADP+

Aumenta la absorbancia a 340nm Disminuye la absorbancia a 340nm

Con cualquiera de estas 3 formas es posible:

• Analizar el ΔA/min

Técnicas de evaluación enzimática

• Métodos a Punto Final•Métodos Cinéticos

Se emplean métodos espectrofotométricos

Pueden ser de dos tipos:

Técnicas de evaluación enzimática

• Métodos a Punto Final

Se ponen en contacto los reactivos y la muestra (sustrato y enzima)

Posterior a un período de incubación se determina la absorbancia a la λ indicada (Ai)

Al cabo de un tiempo establecido se detiene la reacción y se mide la absorbancia final. (Af)

Técnicas de evaluación enzimática

• Métodos Cinéticos

1. Se ponen en contacto los reactivos y la muestra (sustrato y enzima)

1. Se determina la absorbancia a la λ indicada (Ai)

1. Se realizan lecturas cada minuto durante 3-5 minutos. Para estar seguros de que se esta trabajando en la fase lineal de la curva.

Consideraciones Importantes

1. No emplear sueros hemolizados

1. No emplear muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces

1. Si se realiza transporte de la muestra desde un lugar lejano al laboratorio se debe conservar en frío sin congelar

La importancia del análisis de la actividad enzimática se fundamenta en el hecho de que

Las enzimas se encuentran y actúan en DENTRO de la célula.

Si ocurre un daño celular, hay ruptura de la misma y se libera el contenido, aumentando así la concentración de

la enzima en el suero o plasma.

Normalmente los niveles de enzimas en el suero son muy bajos o nulos.

Pero la concentración de una enzima por lo general es mayor en un tejido que en otro.

Es decir, la enzima X, podemos encontrarla en riñón, hígado y cerebro, pero su concentración más alta es en riñón.

Existen muy pocas enzimas específicas de un tejido.

Son un grupo de enzimas afines y clínicamente se dividen en dos grupos importantes.

•Fosfatasa Alcalina: actividad óptima a pH= 9.8•Fosfatasa Ácida: actividad óptima a pH= 4.9 – 5.0

FOSFATASAS

Su función consiste en transferir grupos fosfato de un sustrato donador a un compuesto receptor que contiene

un grupo -OH

FOSFATASAS

Su función consiste en transferir grupos fosfato de un sustrato donador a un compuesto receptor que contiene

un grupo -OH

R1 – O – P + R2 – O - H R1 – O – H + R2 – O - P

Fosfatasa

Ester donador de fosfato

Alcohol receptor

R1 – O – P + H – O - H R1 – O – H + H – O - P

Fosfatasa

Ester donador de fosfato

AGUA(receptor)

Ion Fosfato (HPO4)

Se le da el nombre de Fosfatasa Álcalina a la fosfatasa que tiene actividad óptima a un pH de 9 -10

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Se encuentra en hígado, conductos biliares, hueso, placenta , intestino y riñón,.

Su función es remover grupos fosfato del sustrato.

Esta prueba se emplea como marcador de tumores y como indicadora de enfermedad de hígado y huesos cuando se correlaciona con otros datos clínicos y pruebas de laboratorio.

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Forma parte de las Pruebas de Función Hepática

En enfermedad ósea se incrementa debido principalmente a la

actividad aumentada de las células osteoblásticas.

En enfermedad hepática se incrementa debido a que

su excreción se encuentra impedida por alguna

obstrucción biliar principalmente

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Uno de los métodos más empleados para su determinación es el de Bessey- Lowry- Brook

modificado por Bowers & McComb

p-nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenol + HPO-

4 + 2H+

Fosfatasaalcalina

Color amarilloλ= 405 nm

OH-

BCO PbSUERO Pb. 0 25 μLMezcla Reacción de Sustrato

2.5 mL 2.5 mL

Incubar a 37°C/1min

Registrar Absorbancia a λ= 405 nm después del minuto de incubación.

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Prueba Cinética

A1 a 1minuto A2 a 2 minutosA3 a 3 minutos

Cálculos

0.047. x 2.525 mL x 1000Fosfatasa Alcalina U/L = ————————————————————— 18.8 x 1cm x 0.025 mL

Fosfatasa Alcalina U/L = 0.047. x 5372

Fosfatasa Alcalina U/L = 252 U/L

ΔA/min. = Cambio de absorbancia por minutoVolumen del ensayo = Volumen total de la reacción en mL1000 = Conversión de U/mL a U/L18.8 = Coeficiente de absorbancia del p-nitrofenol a 405 nmPaso de luz = Longitud del paso de luz en cmVolumen de muestra = Volumen de la muestra en mL5372 = Factor derivado de las constantes en la ecuación

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Valores Aumentados

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Enfermedad Hepática:•Ictericia obstructiva•Cáncer y Abscesos hepáticos•Cirrosis hepatocelular•Cirrosis biliar

Enfermedad Osea:•Enfermedad metastática de hueso•Sarcoma osteógeno

VALORES ESPERADOS

Fosfatasa Alcalina < 103 U/L (30°C) < 138 U/L (37°C)

Se le da el nombre de Fosfatasa Ácida a la fosfatasa que tiene actividad óptima a un pH de 4.9

FOSFATASA ACIDA (AcP)

Se encuentra en próstata, hígado, hueso, bazo y riñón.

Su mayor importancia se encuentra en la próstata, ya

que su actividad es 100 veces mayor en esta glándula que

en otros tejidos.

FOSFATASA ACIDA (AcP)

La AcP prostática se puede diferenciar de las demás en análisis de laboratorio mediante la adición de L-tartrato, ya que es sensible a este componente.

El aumento de la AcP-prostática se observa cuando el cáncer ha migrado a otros tejidos,

principalmente hacia el hueso.

Su cuantificación se emplea para diagnosticar el cáncer metastático de próstata y monitorear la eficacia del

tratamiento.

FOSFATASA ACIDA (AcP)

α-naftilfosfato + H2O α-naftol + HPO4

-

λmax=405 nm

AcP

α-naftol + Colorante orgánico Rojo de TR

Compuesto Diazóico

Si se agrega L-Tartrato a la solución de reacción, se inhibe la actividad de la AcP-prostática presente en el suero, pero todas las demás fosfatasas ácidas siguen reaccionando.

FOSFATASA ACIDA (AcP)

Después de 5 minutos de incubación leer Absorbancia final de los tubos.

Prueba Cinética

FOSFATASA ACIDA (AcP)

BCOPbAcP

Total

Pb + Tartrato(AcP no

prostática)

Mezcla Reacción de Sustrato 3.0 mL 3.0 mL

3.0 mL

Tartrato de Sodio 060 μL

Atemperar a 37°C todos los tubosSUERO Pb 0 0.2 mL 0.2 mLIncubar a 37° C durante 5 minutos y leer absorbancia inicial de cada uno de los tubos

Cálculos

A/min. x 2 Volumen del ensayo (mL) x 1000Fosfatasa Acida U/L = ————————————————————— Coefici.de abs. x Paso de la luz (cm) x Vol. De muestra (mL)

Fosfatasa Acida U/L = A/min. x 1240 para AcP Total

ΔA/min. = Cambio de absorbancia por minutoVolumen del ensayo = Volumen total de la reacción en mL1000 = Conversión de U/mL a U/L12.9 = Coeficiente de absorbancia del a-naftol a 405 nmPaso de luz = Longitud del paso de luz en cmVolumen de muestra = Volumen de la muestra en mL1240 = Factor derivado de las constantes en la ecuación para AcP Total1264= Factor derivado de las constantes en la ecuación para AcP No prostática

FOSFATASA ACIDA (AcP)

Cálculos

0.003. x 3.2 mL x 1000Fosfatasa Acida Total U/L = ————————————— 12.9 x 1cm x 0.02 mL

Fosfatasa Acida Total U/L = 0.003. x 1240

Fosfatasa Acida Total U/L = 3.7 U/L

ΔA/min. = Cambio de absorbancia por minutoVolumen del ensayo = Volumen total de la reacción en mL1000 = Conversión de U/mL a U/L12.9 = Coeficiente de absorbancia del a-naftol a 405 nmPaso de luz = Longitud del paso de luz en cmVolumen de muestra = Volumen de la muestra en mL1240 = Factor derivado de las constantes en la ecuación para AcP Total1264= Factor derivado de las constantes en la ecuación para AcP No prostática

FOSFATASA ACIDA (AcP)

Cálculos

0.001. x 3.260 mL x 1000Fosfatasa Acida No Prostática U/L = ————————————— 12.9 x 1cm x 0.02 mL

Fosfatasa Acida No Prostática U/L = 0.001. x 1264

Fosfatasa Acida No Prostática U/L = 1.3 U/L

ΔA/min. = Cambio de absorbancia por minutoVolumen del ensayo = Volumen total de la reacción en mL1000 = Conversión de U/mL a U/L12.9 = Coeficiente de absorbancia del a-naftol a 405 nmPaso de luz = Longitud del paso de luz en cmVolumen de muestra = Volumen de la muestra en mL1240 = Factor derivado de las constantes en la ecuación para AcP Total1264= Factor derivado de las constantes en la ecuación para AcP No prostática

FOSFATASA ACIDA (AcP)

Cálculos

Fosfatasa Acida Prostática U/L = AcP Total (sin tartrato) – AcP No Prostática

Fosfatasa Acida Prostática U/L = 3.7 U/L – 1.3 U/L

Fosfatasa Acida Prostática U/L = 2.4 U/L

FOSFATASA ACIDA (AcP)

VALORES ESPERADOS

Fosfatasa Acida Total U/L = 2.4 – 5.0 U/L

Fosfatasa Acida Prostática U/L = 0.0 U/L – 1.2 U/L