TRANSAMINACIÓN

Baltazar González Chávez (1025715), Kimberly Navarro Vélez (1025088), Jezir

Valencia Gómez (1023851)

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad del

Valle, Cali – Colombia - 2011

RESUMEN

La transaminación es una de las reacciones más importantes del catabolismo y de la

biosíntesis de los aminoácidos, en donde el grupo amino de un aminoácido es

transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto ácido y la enzima aminada

y finalmente el grupo amino es transferido al a-ceto ácido aceptor (ej. Alfa-cetoglutarato)

formando el producto aminoácido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima. En la práctica

se quiso colocar en prueba la reacción de transaminacion, usando como sustratos

alanina-α-cetoglutarato y a partir de la preparación de un extracto enzimático de corazón

de res, la formación de los productos piruvato y glutamato; para lograr la máxima

eficacia de la actividad enzimática, se le brindo a la enzima todas las condiciones

necesarias para que funcionara y diera los productos esperados comprobando por medio

de cromatografía de papel que la enzima era la alanina aminotransferasa por el

desplazamiento de los aminoácidos al ser revelado con ninhidrina. Se observó una

transaminación efectiva por parte de la alanina aminotransferasa presente en el extracto

enzimático, esto se evidencia con la cromatografía de papel. Concluyendo a partir de los

resultados que la enzima efectivamente convierte un a-cetoácido en un aminoácido en

presencia de otro (a.g. Alanina- a-cetoglutarato Piruvato – Glutamato).

Palabras Claves: Transaminación, Alanina Aminotransferasa, Fosfato de piridoxal,

Cromatografía, Metabolismo.

INTRODUCCIÓN:

El catabolismo de los aminoácidos ocurre de manera diferente en plantas y animales.

En las plantas, la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico hace posible la síntesis de

aminoácidos, y ante una alta concentración de estos, el almacenaje en proteínas de

reserva, que de acuerdo a las necesidades metabólicas de la planta se usaran o

acumularan más; sin embargo, en los animales tales macromoléculas de reserva no

existen, de modo que continuamente se deben sintetizar o ingerir a través de la dieta en

forma de proteínas (Peretó et al, 2007). Cuando los aminoácidos obtenidos ya han

cumplido su objetivo en el organismo, y hay un exceso de estos, son degradados.

La degradación requiere inicialmente la eliminación del grupo α-amino; pero esta no es

una reacción fortuita, por tanto, debe realizarse mediante moléculas intermediarias

como las transaminasas, que transfieren el grupo amino al α-cetoglutarato para formar

glutamato que en la mayoría de animales, será posteriormente desaminado mediante la

enzima glutamato deshidrogenasa que utilizando NAD+ o NADP+ como agentes

oxidantes libera amonio (NH4+), que a través del ciclo de la urea se eliminará del

organismo (Berg et al, 2004); al extraer el grupo amino solo queda la estructura

carbonada del aminoácido inicial que consecutivamente será transformada en glucosa o

en acetylCoA, que intervendrán en reacciones glucogénicas o cetogénicas

respectivamente (Peretó et al, 2007).

Las transaminasas, también denominadas amino-transferasas o enzimas anapleróticas

son las encargadas de las reacciones de transaminación (anapleróticas) que fueron

descritas por primera vez por Braunstein & Kritzmann en 1938 que a su vez

determinaron su carácter reversible. Todas las aminotransferasas contienen una

coenzima de gran versatilidad, denominada fosfato de piridoxal (PLP por sus siglas en

ingles); esta coenzima se enlaza a la enzima y al sustrato formando una base de Schiff.

Este enlace es posible gracias al grupo aldehído que presenta, el cual acepta el grupo

α-amino de los aminoácidos y se convierte en fosfato de piridoxamina (PMP) que

transferirá el grupo amino a un 2-oxoácido y con esto se regenerará el PLP y se

producirá un nuevo aminoácido (Nelson & Cox, 2005).

Esta práctica de laboratorio tuvo como principal finalidad la demostración cualitativa de

la transaminación entre alanina (Ala, A) y glutamato (GLU, Q) así como la identificación

del ácido acético como inhibidor de la reacción y la comprensión de la importancia

metabólica de este proceso.

METODOLOGÍA

Se siguió el procedimiento mencionado en la guía de laboratorio de Biología Celular y

Bioquímica II. Observada en el anexo 1.

RESULTADOS

El corazón de res del cual se dispuso fue licuado y posteriormente llevado a

centrifugación. El líquido resultante tenía una textura espesa y de color rojizo salmón.

(a) (b)

Figura 1.Observacion del licuado y trasvaso de la preparación enzimática cruda. (a)Se

observa la coloración rojo-salmón del preparado mientras se trasvasa en un tubo de

centrifuga de 50 mL, (b) Medición del peso del tubo para centrifugación.

Luego de haber pesado los tubos de centrífuga con su respectivo licuado de corazón de

res se procedió a centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 15 minutos. Pasado este

tiempo, la sustancia de los tubos se estratificó en dos fases lo cual se puede observar

en la Figura 2, una fase superior acuosa (sobrenadante) que contenía el extracto

enzimático crudo y una inferior (precipitado). El extracto enzimático fue decantado en

un tubo de ensayo y los sedimentos desechados.

.

Figura 2. Resultado obtenido luego de centrifugar el licuado de corazón. Se observa las

dos fases resultantes de la centrifugación del licuado de corazón de res, arriba la fase

líquida que corresponde al extracto enzimático crudo, y abajo el sobrante que fue

desechado.

Al realizar el punto 2 de los métodos, los tubos 1 y 2 presentaron unas particulas de

color café claro flotando, a diferencia del tubo 3 que se mostró hialino (ver figura 3). A

continuación se muestra el sobrenadante y el resultado de los tubos 1, 2 y 3, del punto

2 de la guÍa.

(a) (b)

Figura 3. (a) Aspecto del tubo 1 luego del baño en ebullición, antes de la filtración, que

muestra sedimentos café claro (b) Apariencia del tubo 2 (izquierda) que presenta

partículas de coloración café claro, el tubo 3 (derecha) es incoloro y sin partículas

suspendidas.

Al haber terminado los puntos 1 y 2 de la guía de métodos se procedió a realizar la

cromatografía que duró 41:54 (min) los resultados obtenidos se pueden apreciar en la

Figura 4, donde en la primera columna (izquierda a derecha), correspondiente al

filtrado libre de proteínas del tubo 1, se observó una mancha oscura superior y otra muy

leve por debajo de la primera, en la columna 2 (filtrado libre de proteínas del tubo 2) se

observan dos manchas oscuras, en la columna 3 (Blanco) se observa una única

mancha superior y por último, en la columna 4 (sustancia patrón) se observan dos

manchas.

Figura 4. Cromatografía de los tubos 1, 2 y 3 con un patrón para comparación. Se

observa las manchas correspondientes a la cromatografía, 1, 2, 3 y P corresponden a

tubo 1, tubo 2, tubo 3 y Patrón respectivamente.

Posterior a esto se realizaron los cálculos del Rf (Formula I) de las manchas de los tubos 2 y

Patrón para comparar, la Tabla 1 ilustra los datos recogidos.

Formula I

Tabla 1. Valores de los Rf obtenidos a partir de la cromatografía. La distancia recorrida

por el solvente fue de 8.1 cm.

# Tubo Distancia

Recorrida Ala (cm)

Distancia Recorrida Glu (cm)

Rf Ala Rf Glu

Tubo 2 3,3 1,1 0,407 0,135

Patrón 2,4 1,5 0,419 0,185

DISCUSIÓN

Para la práctica de transaminación, se preparó un extracto enzimático a partir de

corazón de res. Inicialmente el corazón fue partido en pequeños trozos y se procedió a

realizar el licuado agregando amortiguador de fosfatos que es de gran importancia ya

que mantiene un pH estable para las proteínas globulares que son muy sensibles a los

cambios brucos de pH. Posteriormente la mezcla homogenizada se centrifugó durante

15 minutos para obtener el extracto enzimático crudo (sobrenadante) y se descartaron

los sedimentos celulares. Se prepararon 3 tubos de acuerdo a la metodología (anexo

1). En el tubo 1 se quiso inhibir la función enzimática de modo que se evitase la

formación de piruvato y glutamato, para ello antes de agregar el extracto enzimático, se

colocó el tubo en un baño de agua en ebullición durante 3 minutos, donde la

temperatura modificó la estructura tridimensional de la enzima y junto con la adición de

ácido acético que modifica el pH de la solución, y cambia la estructura de la proteína al

desprotonar el grupo R de la cadena lateral, se logra una desnaturalización de la

enzima y al ocurrirle esto, no se puede llevar a cabo la catálisis enzimática. (Badui

1999). Para el tubo No.2, se quería hacer que el extracto enzimático que contenía la

enzima especifica de transaminacion, funcionara correctamente; para ello se le brindó

los sustratos (alanina-α-cetoglutarato) y temperatura adecuada (37ºC) sabiendo que las

enzimas son extremadamente selectivas y solo funcionaría la que cataliza la producción

de piruvato y glutamato, conocida como alanina aminotransferasa o transaminasa

glutamicopirúvica (GPT) (Bergmeyer & Horder, 1980). Después de 30 minutos de

posible acción enzimática durante la incubación a 37ᵒC, al igual que en el tubo 1 se

inhibe la acción enzimática mediante la adición de acido acético y la exposición a un

baño en ebullición durante 3 minutos. Esto hace que las proteínas precipiten y puedan

ser filtradas quedando solo una solución libre de proteínas y posibles productos por la

acción de la enzima.

Por otra parte el tubo No. 3 fue tomado como blanco; pues éste fue sometido a las

mismas condiciones que el tubo No. 2, pero sin contener el extracto enzimático, y en

vez de este 1 mL de agua destilada, y aunque tenía los mismos sustratos que los otros

dos tubos y también se obtuvo una solución libre de proteínas, el comportamiento fue

diferente.

Posteriormente se realizó una cromatografía como método para determinar

cualitativamente la presencia de Acido Glutámico (Glu, E) como producto de la reacción

entre el ácido α-cetoglutarato y la Alanina. Específicamente, se realizó una

cromatografía de reparto en capa fina (TLC “Thin-Layer chromatography”) la cual

consiste a groso modo en la distribución de los solutos (aminoácidos) sobre la fase

estática de acuerdo a la afinidad con la fase móvil (Smith & Feinberg, 1966); para esta

práctica, la fase estática fue papel Whatman que está hecho a base de celulosa; y

como fase móvil se usó etanol, agua y amoniaco (80:10:10 respectivamente); también

se utilizaron las sustancias citadas en la metodología (Anexo 1), realizando tres

aplicaciones por cada punto para tener una concentración de aminoácidos adecuada, y

se realizó el revelado con ninhidrina al 0,2% en acetona; que debido a su fuerte poder

oxidante decarboxila y desamina al aminoácido, esta ninhidrina reducida reacciona con

otra molécula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de la

desaminación formando un complejo violeta (Teijón,2005). En la Figura 4, las manchas

correspondientes a la sustancia patrón indican la presencia de dos aminoácidos

diferentes. La Alanina, un aminoácido no polar (hidrofóbico), esta característica le

confiere una muy poca afinidad por el solvente de la cromatografía, lo que provoca un

largo recorrido en el cromatograma (Smith & Feinberg, 1966); de modo que, la marca

superior corresponde a este aminoácido. Por deducción, la marca inferior

correspondería al Ácido Glutámico, sin embargo esta afirmación se apoya en el hecho

de que este aminoácido es polar y debido a su gran afinidad con el solvente, recorrerá

poca distancia y tendrá un Rf menor que el de la alanina, estos valores se confirman en

la Tabla 1. En todas las columnas del cromatograma se pudo observar una mancha

superior a la misma altura de la mancha de Alanina de la columna 4(P), de modo que

las manchas de las columnas 1, 2 y 3 corresponden a la porción de Alanina que no fue

transaminada. La columna 1 que contenía el filtrado libre de proteínas con control a

tiempo 0, presentó una ligera mancha inferior que demuestra la formación de una leve

transaminación; aunque se intento detener a tiempo 0 la reacción mediante la adición

de ácido acético, se llevó a cabo; lo que nos dice que esta reacción tiende a suceder de

manera espontánea; pues es una de las reacciones más comunes de un organismo

vivo. En la columna 2 que corresponde al filtrado libre de proteínas sin inhibición

inmediata, se observó una mancha inferior de coloración púrpura oscura que tiene un

Rf cercano al del Ácido Glutámico obtenido en la columna 4(P) (Tabla 1); por tanto, se

puede afirmar que hubo una transaminación entre la Alanina y el Ác. Α-cetoglutárico,

por medio de la alanina aminotransferasa, cuyo producto observado fue el Ácido

Glutámico. En la columna 3 se aplicó una preparación sin extracto enzimático, lo cual

claramente se comprueba al observar en la Figura 4 la ausencia de una mancha

púrpura inferior y por ende la no realización de una transaminación.

La reacción de Alanina + Ácido α-cetoglutárico no solo tiene como producto el Ácido

Glutámico, sino también, Piruvato (Anexo 2). Este último no tuvo comprobación en la

práctica de laboratorio, sin embargo, para detectar el Ácido Pirúvico existen varias

pruebas; las más utilizadas son la prueba del Nitroprusiato de Sodio y la prueba del 2,4

Dinitrofenilhidracina, que dan positivo al reaccionar con el carbonilo 7 etonico del

piruvato mostrando un anillo verde o azul y una coloración café-rojiza oscura

respectivamente. Estas pruebas requieren que la preparación se encuentre a un pH

ligeramente alcalino de 7.4, pues a este pH se inactiva la enzima piruvato

descarboxilasa (Lozano & Campos, 2007) y se evita la formación oxalacetato, un

intermediario implicado en la gluconeogenesis.

El proceso de la transaminación es un proceso llevado a cabo por el metabolismo, más

específicamente por el catabolismo del nitrógeno (de los aminoácidos).Este se da en el

citosol de algunas células en algunas regiones de los animales, es llevado acabo para

la síntesis de aminoácidos a partir de otros aminoácidos o de proteínas. Se basa en el

transporte del grupo amino de un aminoácido a un α-cetoácido, así el aminoácido de

partida se transforma en un α-cetoácido y el α-cetoácido de partida en un aminoácido.

Esto se puede demostrar mediante la aparición de Glutamato a partir del α-

cetoglutarato presente en el sustrato ofrecido a la enzima transaminasa, para este caso

la alanina aminotransferasa, que transporta mediante el piridoxal fosfato (derivado de la

vitamina B6) que se encuentra en el sitio activo de la enzima (Muñoz y García. 1997), el

grupo amino de la alanina a el α-cetoglutarato. Esta enzima es abundante en el hígado,

corazón y músculo (Fuentes, 2003) por esto se utilizó el corazón de res. En algunas

enfermedades a estos órganos, los procesos patológicos crean injuria tisular y

liberación de estas enzimas al plasma, aumentando la concentración de las mismas,

siendo utilizado esta medición de concentración de la enzima como indicador para

diagnóstico y pronostico.

Además de que la transaminación se da para la obtención de distintos aminoácidos,

con unas excepciones como lo son lisina, prolina, hidrixiprolina y treonina, ocurre

también como participante en los procesos de la obtención de energía, el ciclo de

Krebs. Un ejemplo de esto es la valina, la cual al ser metabolizada da α-

cetoisovalerato, este a continuación es rápidamente convertido en succinil-CoA y

utilizado en el ciclo de Krebs, sin posibilidad de volver a transaminarse.

En conclusión, la transaminación es una de las reacciones celulares más importantes y

comúnmente realizadas en organismos animales, ya que a través de ella se pueden

originar aminoácidos de los cuales haya deficiencia en el organismo y sean requeridos

en alguna ruta metabólica; sin embargo, para que haya un proceso de transaminación

efectivo, es necesario que el medio cumpla con la temperatura y acidez apropiadas a la

enzima catalizadora. Además, como se observó en la práctica, la cromatografía es un

excelente método para detectar una transaminación positiva.

BIBLIOGRAFIA

Badui S. 1999. Quimica de los Alimentos. 3 ed. 5 reimpresión. Editorial

Alhambra Mexicana. México.

Berg J., Tymoczko J., Stryer L. Biochemistry. Sexta edición. Estados Unidos. W.

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Bergmeyer, H.U., and Horder, M. IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes, Part 3 IFCC Method For Alanine Aminotransferase, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18, 521

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Smith I., Feinberg J. Paper and thin layer chromatography and electrophoresis.

En Journal of Chromatography. [En línea], 1966, Volumen 23, Pagina 185.

[Citado Octubre 1 de 2011]. En línea: http://www.sciencedirect.com.

bd.univalle.edu.co/science/article/pii/S0021967301986728

Anexos

Anexo 1: Guía de laboratorio de biología celular y bioquímica II, práctica número

2, transaminación

Anexo 2. Reacción de la Alanina transaminasa como catalizador de la reacción entre

alanina y ácido α-cetoglutárico produciendo Piruvato y Acido glutámico.

Alanina