ESTUDIO DE ESTUDIO DE DIHÍBRIDOS (wdp x fb) EN DIHÍBRIDOS (wdp x fb) EN Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster CON LIGACION CON LIGACION

CROMOSOMICA AL SEXO (w-f) Y ENTRECRUZAMIENTO DE ALELOS (b-dp)CROMOSOMICA AL SEXO (w-f) Y ENTRECRUZAMIENTO DE ALELOS (b-dp)

C. Sandra, R Andrea, R. Jennifer.Laboratorio de Genética, Universidad del Tolima, Barrio Santa Helena, Ibagué- Colombia.

Resumen

Se realizó un experimento con líneas de mutantes de Drosophila melanogaster para comprobar los patrones hereditarios en un cruce black forked (bf) ♀ con white dumpy (wdp) ♂, observando la expresión de caracteres dominantes, recesivos, ligados al sexo y los posibles entrecruzamientos. Se obtuvo de sucesivamente la Filial 1 y 2; fenotipos silvestres en hembras y Forked en machos se observaron para la primera generación y 12 mutaciones diferentes para la segunda. Los resultados se analizaron mediante el uso de la prueba de Chi- cuadrado con el fin de verificar la asertividad en experimento. Finalmente se concluye que hay asociación entre las variables estudiadas (ligamiento al sexo y probabilidad de recombinación) pero sin embargo, los datos presentan un margen de error que se debe al azar, a problemas en el conteo realizado o con la identificación de las mutaciones.

Palabras clave: Drosophila melanogaster, mutaciones, dihíbrido, ligado al sexo, entrecruzamiento, Chi- cuadrado.

INTRODUCCION

Uno de los organismos más utilizados en experimentos de genética, es la Drosophila melanogaster, o mosca de la fruta, que se caracteriza por ser de pequeño (de 2 a 3 mm), por tener un ciclo vital corto (10 – 11 días a 25ºC) y por tener un elevado número de descendientes por pareja aproximadamente poner 500 huevos. Drosophila es ideal como modelo biológico experimental porque es fácil de reproducir y manejar la cual se puede mantener en viales de vidrio alimentándola con una papilla compuesta por fruta (banano), levadura, azúcar y/o melaza, mezclada con agar-agar.

Drosophila melanogaster tiene 4 parejas de cromosomas: Los cromosomas sexuales X y Y (I) y 3 parejas de autosomas (II, III, IV). Los cromosomas Y y IV son pequeños y telocéntricos y la mayoría de los genes se localizan en los cromosomas X, II y III que son metacéntricos y grandes.

El cromosoma Y es heterogametico y contiene algunos genes relacionados con la espermatogénesis. La determinación del sexo depende de la relación entre el número de cromosomas X (nX) y el de complementos autosomicos que lleve el individuo (nA); si (nX / nA) = 1 el individuo será hembra y si (nX / nA) = 0,5 el individuo será macho.

El fenotipo normal de la Drosophila melanogaster corresponde a cuerpo de color marrón claro, ojos grandes y rojos, y alas que sobrepasan la longitud del abdomen y son transparentes y ligeramente puntiagudas. Las nerviaciones de las alas están compuestas por 5 venas longitudinales y dos transversales. En los machos, la parte distal dorsal del abdomen es oscura y en la parte ventral se encuentra el pene rodeado por las placas genitales (que le sirven para sujetarse a la hembra), son más pequeños que las hembras y en el tarso del primer par de patas, poseen una estructura compuesta de unos pelos gruesos y cortos, llamada “peine sexual” que permite distinguir sexos

incluso en las pupas maduras, antes de que emerja el adulto. Las hembras tiene un abdomen más grande, de coloración clara y terminación puntiaguda; en la parte ventral el último segmento lleva la placa vaginal, de coloración blanquecina. En Drosophila es posible encontrar diversas mutaciones como Black (b), White (w), Dumpy (dp), Forked (f), Yellow (y), Ebony (e)…etc.

Los patrones Fig1. Drosophila Fenotipo silvestre. Imagen tomada de Archivo

El experimento llevado a cabo con Drosophila se fundamentaba en el estudio de las siguientes mutaciones:

Dumpy (dp) es un mutante autosómico recesivo situado en la posición 13 del cromosoma dos. Posee alas truncadas y reducidas a 2/3 de su longitud.

Fig. 2. Mutación dumpy (dp).Tomado de

http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/genetica/nodo.php?id=57

Este gen corresponde a un fenotipo mutante que afecta el tamaño y la forma de las extremidades, la cutícula torácica, la tráquea y piezas bucales. De acuerdo con sus fenotipos de cutícula, Dumpy se expresa en varios sitios de adhesión celular cutícula-epidérmica, incluyendo la tráquea y las células del tendón del músculo, que

median el anclaje de los músculos de la cutícula. Esto explicaría su utilidad como variación morfológica de los tejidos a través de su regulación de las propiedades mecánicas que podría poseer la mosca, como desplazamiento y dominio del vuelo.

Black (b) corresponde a un mutante autosómico recesivo situado en la posición 48.5 ubicado en el cromosoma dos. Se expresa con un color de cuerpo negro mate.

Fig. 3. Mutación black (b). Tomado de

http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/genetica/nodo.php?id=57

Este fenotipo se observa en expresión de los pigmentos que dan la coloración del cuerpo. El gen produce la beta-alanina, debido a la descarboxilación del aspartato origina entonces la melaninización, la mutación ocurre por errores de marco de lectura, lo que genera el corrimiento de todos los codones, y cambia la secuencia de aminoácidos que codifica una proteína funcional.

Estudios realizados revelan que hay cierto tipo defectos visuales en estos mutantes. El gen también se asocia a defectos en el proceso cuticular y no cuticular , el mutante negro en Drosophila responde anormalmente a estímulos visuales como el adecuado reconocimiento del objetivo y dirección, lo cual sugiere un problema con las funciones de orden superior visual.

White (w).

Fig. 4. Mutación white (w). Tomado de archivo

White Se conoce como la primera mutación encontrada en Drosophila melanogaster. Es una mutación recesiva ligada al sexo en la posición 1,5 del cromosoma X.

Descubierta en 1910 por Thomas Hunt Morgan, quien en cierta ocasión recogió un solo macho mutante de ojos blancos de una población de moscas que suelen tener los ojos rojos brillantes en estado silvestre. Morgan realizo cruces experimentales con dicha mutación, los cuales, lo llevaron a la conclusión de que esta mutación estaba de alguna manera conectada físicamente al gen que determina el género en Drosophila. La proteína producida por la mutación del gen de tipo white sirve como un anclaje de unión de transporte de ATP, que lleva los precursores de los pigmentos del ojo color rojo y marrón, es decir guanina y triptófano, a los ojos durante el desarrollo de pupación.

Forked (f) que es un mutante recesivo ligado al sexo situado en la posición 56.7 ubicado en el cromosoma X. Los individuos que la presentan poseen cerdas acortadas, retorcidas y dobladas con los extremos bifurcados o totalmente doblados.

Fig. 5. Mutación forked (f).

Finalmente, como resultado del experimento es posible encontrar dimutantes como White- dumpy, mutante de ojos y ocelos color blanco y alas truncadas; White Black, que es un mutante de ojos y ocelos color blanco y cuerpo de color negro mate, Black forked mutante de cuerpo negro y setas retorcidas, dumpy forked con alas truncadas y setas retorcidas y trimutantes, como white-dumpy-forked (wdpf), con ojos color blanco, setas retorcidas, alas truncadas y reducidas. Todas las anteriores mutaciones y posibles variaciones de las mismas son posibles en la cruza de individuos para Drosophila melanogaster.

En general, en Drosophila melanogaster existen infinidad de mutaciones que son útiles en el ejercicio de cruces dihibridos o cualquier otra forma de cruza, lo anterior permite reiterar las leyes mendelianas que son imprescindibles en lo que el estudio de un gen se refiera.

Mutaciones con diferentes patrones de herencia como White, black, forked y dumpy pueden estar ligadas al sexo, hacer recombinación en la meiosis, o segregarse independientemente una de otra por lo las proporciones fenotípicas y genotípicas son variables y dependen de muchos factores.

Cromosoma 1 y 2 en Drosophila. Fenotipos trabajados. Tomado de archivo.

Los patrones hereditarios fueron descubiertos y planteados por Gregory Mendel, quien realizó cruzamientos entre variedades o líneas puras que diferían en tres caracteres (AABBCC x aabbcc). A estos organismos se les conoce como polihíbridos. Un polihíbrido (ABC) es un individuo heterocigoto para n loci, es decir, un individuo cuyo genotipo contiene dos alelos distintos en cada locus. Si los loci en estudio son bialélicos (por ejemplo: A,a ; B, b ; ... N,n) el genotipo polihíbrido es AaBb...Nn.

Los polihíbridos producen tantos tipos de gametos distintos como combinaciones diferentes de n alelos hayan, es decir, se pueden formar 2n. Como los alelos se reparten al azar entre los gametos (ley de la segregación independiente) para cada locus X,x la mitad de los gametos serán de "tipo X" y la otra mitad de "tipo x". Por otra parte, como los alelos se combinan independientemente, los alelos A y a se combinan con los alelos B y b con la misma probabilidad, y así lo harán al combinarse los alelos C y c. Es decir, los 2n tipos de alelos se formarán con la misma frecuencia (1/2n).

Las proporciones fenotípicas se ven afectadas por el entrecruzamiento cromosómico (crossing over) donde dos cromosomas se aparean e intercambian secciones de su ADN. El resultado de este proceso es un intercambio de genes, llamado recombinación genética.

MATERIALES Y METODOS

Para el trabajo de adormecimiento, sexado y clasificación de las moscas fue necesario adecuar un kit de laboratorio (pincel 0.0, embudo

pequeño, espuma, cartulina plastificada, un frasco eterizador, tapa eterizadora, gotero). Fue necesario además el uso de cloroformo para adormecer las moscas, medios de cultivo para alimentar cepas de Drosophila que en este caso se utilizo medio con banano, y por último el material biológico; cepas Black forked (bf) ♀ y White dumpy (wdp) ♂

Se realizo una separación de hembras vírgenes correspondientes a Black forked (bf); mediante la revisión cada seis horas de los organismos, con el kit se adormecen todas las moscas y a través de una buena inspección se seleccionan las hembras vírgenes, los adultos machos se descartan en la morgue (frasco con alcohol). Las hembras fueron depositadas en un medio de cultivo para su mantenimiento. Se realizo el mismo procedimiento con la cepa white dumpy (bdp), pero seleccionando solo los machos y descartando las hembras. Los organismos (bf) ♀ y (wdp) ♂ se depositaron en proporciones adecuadas (15 hembras y 15 machos, p.e) en un frasco estéril con medio de cultivo, controlando los factores ambientales temperatura, humedad, iluminación como también las condiciones del medio para que se reproduzcan.

Pasados 6 días fue posible observar una serie de larvas vermiformes blancas comiendo vorazmente del medio, las cuales empiezan a ascender por las paredes del frasco hasta empupar. En ese momento se sacaron los parentales (P1) y se llevaron a la morgue. Luego de obtener un número adecuado de individuos en la F1 era necesario establecer el cruce teórico con el fin de definir las proporciones fenotípicas esperadas así poder cruzar individuos de F1 que serán ahora los parentales de la segunda generación cruzándolos de la manera anteriormente descrita. Finalmente después de obtenida la F2 se separaron machos y hembras de

cada una las mutaciones posibles en un número mínimo de 500 individuos, teniendo una mayor precaución con el aislamiento de dimutantes y trimutantes ya que se entregan vivas al cepario del laboratorio de genética de la Universidad del Tolima.

TABLA 1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.

Actividad Fecha Comentarios

Entrega de medios de Drosophila STOCK

22/03/2011(bf) ♀ y fueron necesarios seis días para un correcto aislamiento.

Siembra de hembras vírgenes y machos (P1)

1/04/2011 Número total de hembras 15. Machos: 15. Se siembra una réplica con 10 individuos de cada sexo

Emerge F1 8/04/2011

Siembra F1xF1 15/04/2011Según las proporciones observadas se sembró F1xF1 Número total de hembras 15. Machos: 15. Se siembran dos replicas cada una con 10 machos y 10 hembras.

Emerge F2 y conteo

23/04/2011

Finalización conteo F2

26/05/2011F2 arrojo un gran número de individuos

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la filial 1 se obtiene fenotipo silvestre para hembras (♀) las cuales genotípicamente son heterocigotos para cada carácter estudiado (color de ojos, cuerpo, forma de las alas y cetas). Los machos (♂) son genotípicamente hemicigotos para los alelos de las mutaciones white forked (herencia ligada al sexo) expresándose solo el carácter forked y siendo silvestre dominante sobre el color de ojos White. Los caracteres

dumpy y black no se expresan pero genotípicamente son heterocigotos para los alelos del macho. En la F1 se obtiene un numero total de 198 individuos, de los cuales, fueron utilizados 35 machos (♂) y 40 hembras (♀) como parentales para la F2.

GRAFICO 1. NUMERO DE INDIVIDUOS UTILIZADOS COMO

PARENTALES DE LA F2.

TABLA 2. NUMERO DE INDIVIDUOS OBTENIDOS EN LA DESCENDENCIA F2.

MUTACION/SEXO ♂ ♀

f 42 116b 37 43w 69 0Dp 18 40S 115 267Wf 15 0Dpf 6 17Wdp 10 0Wb 5 0bf 14 21Wdpf 1 0Wfb 7 0TOTAL 339 504∑ TOTAL 843

GRAFICO 2. NUMERO DE INDIVIDUOS OBTENIDOS EN LA

DESCENDENCIA F2.

Para F2 se obtiene entonces en mayor proporcion al fenotipo silvestre (267♀, 115♂=382), seguido de la mutación forked (116♀, 42♂=158),black (43♀, 37♂=80), dumpy(40♀,18♂=58),black forked(21♀, 14♂=35). Algunas mutaciones se expresaron solo para el genero masculino como: white (69♂), white forked (15♂), white dumpy (10♂), white black (5♂), white dumpy forked (1♂) white forked black (7♂). Es posible entonces comprobar la existencia de alelos dominantes y recesivos, los cuales pueden segregarse según la ubicación en el cromosoma durante la meiosis para un numero α maximo de ocho fenotipos esperados en un cruce dihibridido. Sin embargo, los datos obtenidos no son completamente iguales a los esperados por lo cual es necesario hacer un ajuste con la prueba conocida como Chi cuadrado X2 para examinar la probabilidad de que estas desigualdades ocuran por azar.El ajuste se calcula así:

X2= ∑(No. Observado- No. Esperado) 2

No. Esperado

Para el análisis de los datos fue necesario plantear una prueba de hipótesis genética de la siguiente manera:

Hipótesis nula: Ho: X2: 0

Existe segregación independiente para los alelos wf ligados al sexo y bdp para el cruce dihíbrido en Drosophila melanogaster.

Hipótesis alternativa: H1: X2 >0

Existe dependencia en la segregación de los alelos ligados al sexo wf y entrecruzamiento para los alelos bdp en el cruce dihíbrido de Drosophila melanogaster.

X2c= ♀= 263.563

X2c= ♂= 233.408

♀

Grados de libertad: 6-1: 5

♂

Grados de libertad: 12-1: 11

Como el valor calculado para X2c es

mayor que el valor tabulado, se dice, que hay entrecruzamiento o recombinación de los alelos bdp y ligamiento de los alelos wf para el sexo en Drosophila melanogaster. Puesto que los resultados son muy significativos al nivel del 1% hay evidencia suficiente para rechazar la hipótesis nula y aceptar la hipótesis alternativa.

Los valores esperados se obtienen según las frecuencias fenotípicas del cruce teórico (véase anexos); mediante la multiplicación del número de la muestra por la frecuencia para cada fenotipo.

15.0911.07 X2c:263.563

24.719.68 X2c:233.408

α: 0.05

α: 0.05

α: 0.01

α: 0.01

TABLA 3. PROPORCIONES DE MACHOS ESPERADOS Y OBSERVADOS EN LA F2.

FENOTIPO ♂ OBS. ESP.S 115 42.03F 42 42.03Dp 18 21.01B 37 21.01W 69 42.03Bf 14 21.01Wb 5 21.01Wdp 10 21.01Wfdp 15 42.03fdp 6 21.01wfb 7 21.01wfdp 1 21.01TOTAL 339 336.2

TABLA 4. PROPORCIONES DE HEMBRAS OBSERVADAS Y ESPERADAS EN LA F2.

FENOTIPO ♀

OBS. ESP.

s 267 124.99f 116 124.99dp 40 62.49b 43 21.01fdp 17 62.49bf 21 73.33TOTAL 504 469.3

El ajuste de datos no es bueno, las mutaciones esperadas en el cruce teórico son efectivamente obtenidas, sin embargo las proporciones fenotípicas observadas no son muy precisas y se concluye que el modelo no es útil para procesos futuros. Estos resultados se le pueden atribuir a errores en el conteo y/o sexado,

problemas de fenocopia, contaminación u omisiones en el procedimiento.

CONCLUSIONES

Drosophila melanogaster es una excelente modelo para el trabajo de cepas en cruces de genética. Las diferentes clases de mutaciones permiten corroborar patrones hereditarios y comprobarlos experimentalmente mediante la ejecución de cruces teóricos y la comprobación de datos obtenidos mediante la prueba (Chi- cuadrado).

Los fenotipos de la F1 permiten evidenciar las leyes mendeliadas en función de la dominancia y recesividad de genes ubicados en los cromosomas autosomicos.

La cruza alelos w-f ligados al sexo y involucran el patrón de herencia cruzada, característica para estos genes, por lo tanto la hembra de setas (Forked) cuando se cruza con machos silvestre para este carácter, toda la descendencia masculina en F1 será igual a su progenitora.

En el caso de que la mutación ligada al sexo (w) aparece en el macho progenitor, da como resultado la desaparición del rasgo (w) en la F1 pero re aparece solo en los machos de la F2, comprobándose así el patrón de herencia que salta una generación para los genes ligados al sexo.

Los alelos de genes recesivos ligados al sexo (f-w) se encuentran más frecuentemente en los machos que en las hembras, puesto que los machos de la especie de Drosophila melanogaster son hemicigotos para los caracteres ligados al sexo; estos caracteres no aparecen en las hembras a menos de que el progenitor paterno tenga la mutación.

En las características ligadas al sexo, los gametos parentales y recombinantes formados por la hembra pueden observarse en los machos de la F2 sin importar el genotipo de los mismos.

Los alelos para las mutaciones b-dp que se encuentran en el mismo cromosoma están ligadas, sin embargo en el proceso de recombinación las cromatidas no hermanas de cromosomas homólogos intercambian genes, proceso donde se producen gametos recombinantes, básico para la variabilidad genética de una especie, en Drosophila Melanogaster esto ocurre para hembras y no para machos.

Las desviaciones mencionadas entre los valores observados y esperados del cruce en el modelo experimental dihibrido sugieren que deben ser consideradas como evidencia de ligamiento.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a los asistentes del laboratorio de genética de la Universidad del Tolima, los cuales mostraron interés por el estado del experimento y ayudaron en un mejor entendimiento del cruce teórico. Agradecimiento al docente Alejandro Bastidas por su ayuda en cálculos estadísticos y por supuesto a la docente María Eloísa Aldana, quien

mostro preocupación por el estado del presente trabajo.

BIBLIOGRAFIA

Cruzamiento Poli híbrido. Guía de trabajo online. Universidad Complutense de Madrid. Encontrado en:http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/index.htm

Practicas de Análisis mendeliano. Guía de trabajo online. Universidad Complutense de Madrid.

Mutantes en Drosophila. Universidad del los Andes. Genética de poblaciones. Encontrado en http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/genetica/nodo.php?id=57.

WILLIAN D STANFIELD, Genética, tercera edición, Editorial Mc Graw –Hill, México 1992.

WILKIN. MB, STOPFORD B., Drosophila dumpy is a gigantic extracellular protein required to maintain tension at epidermal-cuticle attachment sites. University of Manchester, School of Biological Sciences, Manchester, M13 9PT, UK

PHILLIPS AM, SMART R, STRAUSS R, BREMBS B, KELLY LE. The Drosophila black enigma: the molecular and behavioural characterization of the black mutant allele. Department of Genetics, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia.