MONOGRAFA

PRODUCCIN DE ANTIBITICOSGrupo:

Bordn Ariel

Damico Johana

Farina Cristian

Lucero Marcos

Introduccin:

La mayora de las personas conoce acerca de la existencia de antibiticos, y su empleo es un hecho frecuente en el mundo entero hace varios aos. La biotecnologa, por su parte, se considera un desarrollo reciente. Sin embargo, la biotecnologa se encuentra presente en la vida cotidiana ms de lo que la gente se imagina, hace muchos aos. Por ejemplo, pocos conocen la relacin que existe entre los antibiticos y la biotecnologa. De hecho, la produccin de antibiticos que se inici a mediados del siglo XX, se considera la primera aplicacin de la biotecnologa a la vida cotidiana de las personas.

Para comprender mejor esta afirmacin, se debe recordar a qu se llama biotecnologa y definir qu es un antibitico.

La biotecnologa se define tradicionalmente como el empleo de organismos vivos para la obtencin de un bien o servicio til para el hombre. Actualmente, la biotecnologa moderna emplea tcnicas de ingeniera gentica, e incluye la produccin de protenas recombinantes, el mejoramiento de cultivos vegetales y del ganado, el empleo de organismos para limpiar el medio ambiente, y otras aplicaciones industriales.

Los antibiticos son por definicin molculas con actividad antimicrobiana, que incluyen una gran cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes familias qumicas. Son metabolitos secundarios, producidos en la mayora de los casos despus de la fase de crecimiento. Los primeros procesos para la produccin de penicilina, que fue el primer antibitico conocido, implicaban el crecimiento de Penicillium notatum sobre la superficie de un medio liquido (Czapek-Dox-glucosa). El periodo de incubacin era usualmente de 6-12 das y posteriormente la penicilina se extraa con solventes previa separacin del micelio.

La historia de las innovaciones en la produccin de penicilina comenz en 1945 con el descubrimiento de una nueva especie, Penicillium chrysogenum, la cual permiti incrementar los rendimientos del producto y trabajar en cultivo sumergido empleando lactosa como fuente de carbono y energa, y agua de macerado de maz (com-steep liquor) como fuente de nitrgeno.

Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogenum por adicin de una apropiada cadena carboxlica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero solamente tienen valor teraputico la penicilina G y la V. Ambas tienen un espectro y actividad similar, pero la penicilina V es ms estable a pH cido, lo que permite su administracin por va oral.

La produccin de penicilina como otros procesos biotecnolgicos est dominada por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que realizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada rea del proceso: cepa, fermentacin y separacin. El proceso a grandes rasgos implica el cultivo de P. chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de 115.000 l, separacin del micelio por filtracin y extraccin del antibitico del caldo, seguida por la cristalizacin o precipitacin cida del mismo.Historia:

Aunque desde hace milenios el hombre usaba empricamente en el tratamiento de heridas y otras enfermedades, tierra y vegetales que son fuentes de mohos y bacterias productores de antibiticos y ya en el siglo pasado varios investigadores hicieron notar la accin bactericida de diversos hongos, no es hasta 1928 con el descubrimiento fortuito en el St. Marys Hospital de Londres por Fleming de un hongo que contamin y destruy varios cultivos de Staphylococcus, que se inicia la era antibitica en la medicina, por tratarse de hongos del tipo Penicillium notatum, Fleming llam al compuesto que producan, penicilina.

No es hasta 10 aos despus, en 1938 Howard Florey y el doctor Ernesto Chain consiguieron aislar un polvo amarillo, muchas veces mas activo contra las bacterias que el caldo de cultivo original, ensayado por Fleming. El polvo era muy impuro, pero era promisorio en la lucha contra las infecciones bacterianas de los animales, y slo hacia 1941 es posible acumular suficiente medicamento para iniciar ensayos clnicos en pacientes afectados de sepsis por Streptococcus y Staphylococcus.

Desde 1942 se comienza la expansin y desarrollo del antibitico en los Estados Unidos, se alcanzan grandes avances en su depuracin y usos clnicos en estudios efectuados en la Universidad de Yale y en la Clnica Mayo, y en 1943 se haban tratado ya 200 pacientes con el nuevo producto. Hacia 1950 se logra la produccin masiva del frmaco en los Estados Unidos y se llega a 150 toneladas en ese ao (200 trillones de U de penicilina.1-3

En la misma dcada del 50 se crea la primera penicilina semisinttica, fenoximetilpenicilina hacia 1954 y en 1959 se introduce la meticilina, primera de la generacin antiestafiloccica. Hacia finales de los aos 60 comienza a usarse la carbenicilina y as se da inicio a las penicilinas con propiedades antipseudomnicas y ya desde 1984 se inicia el uso del cido clavulnico asociado a las penicilinas, comienza la era de los inhibidores de betalactamasas.Estructura qumicaLa penicilina es una sustancia antibitica producida por los hongos Penicillium notatum y P. chrysogenum de la familia Aspergilliaceaes. Es un hongo de color verde azulado que posee delgadas hifas sumergidas como tambin areas tabicadas de las cules arrancan conidiforos ramificados. Es considerada un antibitico betalactmico, que ataca la pared bacteriana que protege a la clula, su espectro bacteriano alcanza a los cocos Gram positivos y Gram negativos, espiroquetas y bacterias Gram positivas.

El ncleo activo de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico, constituido por una estructura Iactmico-tiazolidinica anillada, la cual se une a una cadena lateral variable.

La molcula de penicilina no es grande, pero su estructura es complicada. Posee un "ncleo" central de tomos de carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxigeno y azufre, y una cadena lateral de tomos de carbono e hidrgeno. La estructura de la cadena lateral vara con la cepa (variedad) de hongo y el tipo de nutriente. Las cadenas laterales confieren diversas propiedades a la penicilina. Debido a Io complejo de su estructura an no ha sido hallado ningn mtodo artificial para obtener la molcula de penicilina completa, por lo cual todos los procesos de fabricacin requieren el cultivo del hongo.

Clasificacin

Se conocen diferentes penicilinas todas las cuales derivan de una estructura qumica fundamental comn: dos anillos heterocclicos, uno de trazolidina y otro de beta-Iactama, unido por un encadenamiento emdico a un radical R variable. Por el radical carboxilo la penicilina forma sales con los metales alcalinos.

La clasificacin puede realizarse segn su modo de obtencin: Naturales

Biosintticas

Semisintticas

Con diferentes subgrupos.Algunos autores describen los siguientes grupos:1. Bencilpenicilina y sus formas parenterales de accin prolongada Bencilpenicilina o Penicilina G

Penicilina benetamina

Penicilina benzatinica

Penicilina clemizol

Penicilina procalnica

2. Penicilinas absorbibles oralmente, semejantes a la bencilpenicilina

Azidocillin

Fenetecilln

Fenoximetilpenicilina o Penicilina V

3. Penicilinas resistentes a B-Iactamasas staghyloccicas:

3.1 lsoxazolil-penicilinas

Cloxacillin

Dicloxacillln

Oxacillin

Fluoroxacillin

3.2 Meticillin

3.3 Nafcillin4. Penicilinas de amplio espectro

4.1 Ampicilina

4.2 Esteras del ampicilina

Bacampicillin

Lenampicillin

4.3 Compuestos similares al ampicilina

Amoxicillin

Mecillinam (amdinocilna)

Ciclacillin

5. Penicilinas antipseudomnicas

5.1 Acilureidopenicilinas

Azlocllin

Mezlocilln

Piperacillin

5.2 Carboxipenicilinas

Carbenicilln

Ticarcillin

6. Penicilinas resistentes a B-Iactamasas (de enterobacterias)

Foramidocillin

Temocillin

De estas penicilinas la ms importante es la Penicilina G o bencilpenicilina que se combina con el sodio, potasio, calcio y la procana para formar los compuestos:Penicilina G sdica, G potsica, G clcica y Penicilina G

Procaina, que es de accin prolongada.La penicilina V es importante, ya que es activa por va oral. La penicilina que ms abunda en el comercio es la penicilina G Potsica o bencil Penicilina Potsica. Se presenta como un polvo cristalino blanco inodoro, muy soluble en agua, tambin en alcohol y glicerina, insoluble en ter y cloroformo. Se destruye por accin del calor, por cidos, lcalis y agentes oxidantes y fermentos bacterianos.

Sus soluciones se deterioran a la temperatura atmosfrica, pero refrigeradas permanecen estables por algunos das. Las sales de Penicilina que se fabrican actualmente permiten conservadas en estado slido sin necesidad de refrigeracin.

Biosntesis

El anillo B-lactmico-tiazolidnico de la penicilina se produce a partir de L-cistena y L-valina. La biosntesis se produce por medio de un dipptido compuesto de cido L-a-aminoadpico (L-a-AAA) y L-cistena. Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reaccin de epimerizacin, dando lugar a la formacin del tripptido d-(L-a-aminoadipiI)-L-cisteiniI-D-valina. El primer producto de la ciclacin del tripptido que puede ser aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioqumicas que conducen a este intermediario. La bencilpenicilina (Penicilina G) se produce en el intercambio de L-a-AAA (L-a-aminoadipico) con cido fenilactico activado. El 6-APA, que no es un producto intermediario de biosntesis, se excreta en ausencia de un precursor de la cadena lateral.

La penicilina V es una penicilina modificada, que tiene C5H5ooH2 (fenoximetilo). Es relativamente estable en presencia de la acidez gstrica, es soluble en los lquidos del duodeno y es tambin eficaz por va bucal sin amortiguadores.

Espectro bacteriano

La accin de un antibitico se mide en trminos del espectro bacteriano, la penicilina acta en un sector restringido, se dice que su espectro es limitado. Tiene efecto bacteriosttico (inhibiendo el desarrollo y reproduccin de los grmenes) o bacterioltico (provocando su destruccin) segn la dosis y tiempo de contacto.

La penicilina es particularmente activa contra bacterias Gram positivas en especial en infecciones producidas por estafilococos, estreptococos, neumococos, algunos Clostridium y Iactobacillus; ejerce tambin accin contra treponema pallidum.

Es el antibitico ms usado, especialmente en infecciones estafiloccicas, como ntrax, en heridas y quemaduras infectadas, en el tratamiento de infecciones neumolgicas como neumona, pleuritis y endocarditis neumocicas, en enfermedades estreptoccicas como infeccin puerperal, peritonitis. En infecciones gonoccicas como gonorrea, oftalm 1.Se usa tambin en la sfilis, en la Verruga peruana, profilcticamente en obstetricia y antes de las intervenciones quirrgicas.

En general la penicilina es considerada como una droga antibitica de poca toxicidad, sin embargo puede producir reacciones alrgicas como dermatitis, urticaria, etc.

Desarrollo de cepasLa produccin de penicilina por la cepa aislada por Fleming era de aproximadamente 2 u.i. / ml; los procesos actuales producen un ttulo de penicilina de aproximadamente 85.000 u.i. / ml. Esto se logr por seleccin de cepas.

La mejora del cultivo inicial se produjo en 1943 con el aislamiento de la cepa Penicillium chrysogenum NRRL1951.

Este microorganismo era ms adecuado para la produccin en cultivo sumergido que la cepa original, Penicillium notatum.

Mediante posterior mutagnesis fue aislada la cepa WisQ176, la cual fue adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fue utilizada como cepa original en los distintos programas comerciales de mejora de cepas. Hasta mitad de los aos 60 los mutgenos utilizados ms frecuentemente eran los rayos X, mostaza nitrogenada y radiaciones de longitud de onda corta. Ms recientemente han sido utilizados como mutgenos la nitrosoguanidina, los agentes alquilantes y los nitritos.A principios de los 70 la mejora de cepas por el mero uso de la mutacin haba alcanzado su lmite. El descubrimiento de un ciclo parasexual en Penicillium chrysogenum proporcion una forma de utilizar la recombinacin gentica para el desarrollo de cepas. Se describieron diploides heterocigticos que tenan ttulos de penicilina superiores a los de las cepas haploides parentales. Sin embargo, el mayor porcentaje de cepas con produccin superior de penicilina se produjo a partir de los haploides segregantes de los cruces entre mutantes de diferentes lneas. La tcnica de fusin de protoplastos abri un nuevo enfoque en el desarrollo de cepas de alta produccin obtenindose rendimientos del 8% superiores a los obtenidos por mutacin y seleccin. Adems, algunas de las cepas resultantes han tenido mejores caractersticas de crecimiento, como esporulacin ms estable y mejor crecimiento para la produccin del inculo.

Requerimientos nutricionales y especficosAdems de glucosa y lactosa, Penicillium chrysogenum puede utilizar una gran variedad de fuentes de carbono y energa. Alternativamente se han usado sacarosa, almidn, dextrinas, melaza, aceites vegetales y animales, etanol y glicerol.

Un medio de cultivo en sistema batch puede contener entre 30 y 40 g. 1-1 de lactosa, en tanto que si se emplea un cultivo con alimentacin de fuente de carbono, se puede utilizar glucosa o melaza a una concentracin final de 100 g 1-1. La principal fuente nitrogenada empleada hasta la dcada del 70 fue corn-steep liquor" debido a que aumentaba los rendimientos del antibitico probablemente al suministrar compuestos como aminocidos, factores de crecimiento, precursores de la cadena lateral, adems de elementos trazas. Sin embargo, dada la variabilidad del producto entre distintas partidas, los problemas de suministro, y tambin debido a la introduccin de precursores especficos de la cadena lateral, las industrias buscaron reemplazarlo. Los productos alternativos son la harina de semilla de algodn, extractos y peptonas, y la harina de soja. Sin embargo en algunos casos estos productos son igualmente variables y tanto o ms caros.

En 1976 se demostr la importancia de un suministro continuo de amonio (por alimentacin con (NH4)2S04), que permitiese mantener niveles del mismo de aproximadamente 20 mM. Trabajando en cultivos alimentados y modificando la relacin nitrgeno/carbono en la alimentacin, se comprob que cuando el cultivo estaba limitado en nitrgeno cesaba la produccin de penicilina, la cual se restableca al ser la fuente de carbono la limitante. El requerimiento de grandes cantidades de NH4 + podra reflejar su necesidad para la sntesis de glutamato, el cual es requerido para producir valina y cistena.

El azufre se incorpora como (NH4) 2804 y con la fuente de nitrgeno orgnica (extractos, peptona). El fsforo en forma inorgnica se adiciona como sales de fosfato y se aconseja mantener su concentracin entre 250 y 500 mg 1-1 con alimentacin continua. Adems se debe tener en cuenta que el "corn-steep liquor" es una fuente importante de fsforo.

Si se desea obtener un determinado tipo de penicilina, se debe incluir inicialmente, o bien por alimentacin en los medios, una cantidad relativamente grande de precursor. El requerimiento terico de fenilacetato sdico, es 0.47 g g-1 de penicilina G cida, y de fenoxiacetato de sodio, 0.50 g g-1 de penicilina V cida.

Es aconsejable efectuar una alimentacin continua de estos componentes para evitar la toxicidad de los mismos sobre la cepa y la hidroxilacin por accin del organismo.

Parmetros de produccin

La cantidad de penicilina obtenida en un fermentador (PV) es funcin de la; concentracin de clulas (X), de la velocidad especfica de produccin de penicilina (qp), del tiempo de fermentacin (t) y del volumen de medio de cultivo (V)

Donde P = concentracin de penicilina al tiempo tfPo = concentracin inicial de penicilina

t= tiempo de inoculacin

tf = tiempo de cosecha

Vo = Volumen inicial

V = Volumen al tiempo t

Evidentemente el objetivo es alcanzar altos valores de X y de qp. Desde 1950 la velocidad de produccin de las cepas (q p X) se ha incrementado 40 veces (desde 10 unidades mI-1 h-1 a 400 unidades mI-1 h-1). Entre los factores que afectan qp se tienen el pH, la temperatura, la aireacin y la velocidad especifica de crecimiento. El pH ptimo debe ser mantenido alrededor de 6.5, Io cual permite adems minimizar la hidrlisis de penicilina a cido penicilinico. Se debe tener en cuenta que el pH puede no ser constante debido a que el valor ptimo para crecimiento puede ser diferente del de formacin de producto.

Los pocos estudios realizados con respecto a la temperatura indican que el valor ptimo para crecimiento es de aproximadamente 30 C, en tanto que el ptimo de produccin oscila entre 20 y 25 C. Para un proceso "batch" la temperatura puede variar entre 23 y 28 C, en tanto que para el "batch" alimentado esa variacin est entre 25 y 27 C.

La aireacin presenta un problema especial en esta fermentacin, debido a que al incrementarse la biomasa, y por consiguiente la demanda de 02, aumenta tambin la viscosidad del medio, Io cual crea una resistencia importante para la transferencia de oxgeno. Por lo tanto puede ocurrir que por encima de. un cierto valor de X el suministro de oxigeno pueda ser insuficiente para mantener un qp mximo por un determinado tiempo. Para superar estos problemas se puede incrementar la potencia de agitacin, el caudal de aire, la presin dentro del reactor, cambiar las condiciones de cultivo o incluso trabajar con cepas modificadas que no aumenten la viscosidad. Todo esto indica la necesidad de un adecuado manejo del proceso y del diseo del reactor.

En un cultivo "batch" la velocidad especfica de produccin de penicilina alcanza - valores altos al final del crecimiento exponencial, cayendo posteriormente como se muestra en la Figura 24.

Si la produccin se opera en sistema "batch" alimentado el objetivo es obtener tanta biomasa como sea posible (trmino X de la ecuacin 1) la cual debera producir penicilina a una alta velocidad especfica (qp en ecuacin 1) por el mayor tiempo posible. Se ha observado que el mximo valor de qp es de aproximadamente 15 unidades por mg -1h-l, el cual se alcanza al comienzo de la fermentacin y luego declina. Por otra parte los productores obtienen alrededor de 60.000 unidades ml -1 en 200 h de proceso, lo que significa una productividad media de 300 unidades ml-1 h-1. Por lo tanto si la mxima biomasa alcanzada es de 50 mg ml-1 para un qp de 15 unidades mg-1 h-1, la mxima productividad debera ser de 750 unidades mI-1 h-1, lo que indica que el promedio obtenido es menos de la mitad del mximo. Lo expuesto indica la importancia de mantener un qp elevado.

En este sentido se ha determinado como influye sobre este valor, la velocidad especfica de crecimiento.

El valor de u para la fase de produccin, tiene un limite superior, el cual si es superado, la biomasa requiere un exceso de oxigeno que lleva a una disminucin de qp, si existe una limitacin del mismo en el reactor. EI lmite inferior de u para la produccin vara con la cepa utilizada.

En sistemas de cultivo con alimentacin con glucosa, el valor de qp vara linealmente con u hasta una velocidad de alimentacin de glucosa cuyo valor oscila alrededor de 0,33 m moles de glucosa (g biomasa)-1 h-1, el cual corresponde a un u de 0.015 h-1. A mayores valores de velocidad de alimentacin u se incrementa linealmente pero qp permanece constante (Figura 25). El valor mnimo de u debajo del cual qp desciende linealmente con u se denomina u crtico (uc). No se conocen con precisin las causas de esta disminucin.

El problema por lo tanto es determinar que factores de la biomasa o del entorno limitan el valor de qp para tratar de superarlos. Si el oxigeno es el limitante del crecimiento, se demuestra una relacin lineal entre el valor de u y la velocidad especfica de consumo de oxigeno (qO2). De Io anteriormente expuesto se deduce que durante la fase de produccin o crecimiento lento en un sistema de produccin industrial batch" alimentado (la glucosa es el sustrato limitante) se debern mantener valores adecuados de u y qo2 para lograr un qp apropiado.

Para la mayora de las fermentaciones industriales el u de produccin es menor de 0.01 h-1. Se debe cuidar en esta fase no tener un exceso de glucosa debido a que el mismo puede ocasionar una inhibicin de la actividad o de la sntesis de enzimas involucradas en la biosntesis de penicilina. A pesar de que la limitacin de hexosa disponible es esencial para el xito del proceso, el valor de u puede ser controlado por otros nutrientes, habindose demostrado que la eleccin del nutriente limitante (oxgeno, fsforo, sulfato, amonio, magnesio) tiene un efecto marcado sobre el metabolismo energtico.

La relacin entre qp y u podra indicar la necesidad de prolongar un estado fisiolgico particular de las clulas. Se ha comprobado por estudios en cultivo continuo que existe una correlacin entre la velocidad especfica de crecimiento y la morfologa celular, la cual corresponde a un estado fisiolgico determinado.

Para un valor de qp mayor de 0,023 h -1 se observa solamente crec-miento vegetativo, en tanto que debajo de 0,014 h-1 comienza a tener lugar la formacin de conidias.

Debido a que bajas velocidades de crecimiento son de gran importancia en muchos procesos fermentativos, es una necesidad dilucidar para esos casos que funciones celulares tienen lugar. Luego, se podra estabilizar la funcin deseada, como produccin de penicilina, por periodos prolongados de tiempo. Un valor mnimo de u podra indicar tambin la necesidad de reemplazar clulas viejas o alteradas, las cuales han perdido irreversiblemente su capacidad de sntesis de penicilina.

La duracin de la fermentacin de penicilina puede estar limitada por la capacidad- de transferencia de oxigeno del reactor. Como ya se indic, en algn momento la concentracin celular puede exceder el suministro de oxgeno necesario para mantener un valor alto de qp y la sntesis disminuye.

En algunos procesos la presencia de txicos, inhibidores o factores no conocidos pueden causar una disminucin en el valor de qp. sobre todo al final de la fase de produccin.

ProcesoFabricacin industrial de la penicilina

EI hongo utilizado industrialmente para la produccin de penicilina es Penicillium chrysogenum. EI primer sistema de produccin de penicilina fue el conocido como mtodo de superficie", donde el hongo creca en la superficie de una capa de medio de cultivo en bandejas. Pero despus de 1944, el desarrollo del mtodo de fermentacin sumergida permiti disminuir los requerimientos de espacio y, consecuentemente, los costos de produccin. Este ltimo mtodo es el que se usa actualmente a nivel industrial.1) Preservacin del cultivo

Para la correcta preservacin de los microorganismos se mantienen en tubos inclinados que contienen agar nutritivo como una suspensin en medio liquido congelado a una temperatura de -20 C y -100C (donde puede mantenerse por varios aos).

Antes de comenzar un proceso a partir de un cultivo, el operador debe realizar una exhaustiva evaluacin que asegure el mantenimiento de las caractersticas de la cepa, lo cual implica determinar el grado de esporulacin, la productividad y caractersticas morfolgicas, lo que incluye ensayos en agitadores y en fermentadores de laboratorio2) Preparacin del inculo

La preparacin del inculo debe realizarse para la siembra en el tanque de prefermentacin. Las esporas congeladas de la cepa se llevan lentamente a temperatura ambiente (1Clmin) y luego se resuspenden mediante adicin de H2O destilada estril en la correspondiente ampolla, la concentracin ptima de esporas es de 5 x 103 por ml. El contenido de la ampolla se transfiere a un medio de mantenimiento en agar inclinado en botellas cilndricas de vidrio con tapones de rosca que permiten una buena aireacin cuando estn cerrados.

Despus de incubar a la temperatura adecuada durante un tiempo apropiado, aprox. 96 horas a 23C, para producir cultivos crecidos y esporulados se aaden unos 5-10 mI de H20 estril y se araa la superficie antes de transferir a un frasco de 2 litros cnico que tiene un litro del medio de cultivo, incubndose durante 24 hs a 23C.

Luego se realiza la transferencia estril del inculo del cultivo sumergido a un aspirador u otro recipiente que se pueda utilizar con comodidad para inocular la etapa de prefermentacin en planta.

Medio de cultivo que se utiliza: Sacarosa 20g

NaNO3 6g

KH2PO4 1.5g

MgSO4 0.5g

CaCl2 2.5 g

H20 destilada 1 litro

3) Prefermentacin

Se produce el llenado del reactor con el medio de cultivo y su posterior esterilizacin y enfriado, se procede a la siembra del prefermentador (PF 1) con el inculo. AI comienzo se tiene una fase de latencia, no se producir la evidencia del metabolismo, porque los microorganismos se estn adaptando a su nuevo ambiente.

Luego de esta etapa comienza la fase de crecimiento donde se produce la biomasa, con un tiempo de duplicacin de 6 hs.

Despus de transcurrir 44 hs en el primer prefermentador se produce el transvase (por gravedad) al segundo prefermentador (PF2) comenzando la segunda etapa con una duracin de 42 hs.

En ambas etapas la temperatura deber mantenerse en 24C y pH entre 6 y 7.

Medio de cultivo a utilizar en la prefermentacin: Agua 94.3%

Melaza de caa 4.71%

NaNO3 0.56%

KH2PO4 0.15%

MgS04.7H20 0.05%

CaCl2 0.23%

4) Fermentacin

Se llena el reactor con el medio de cultivo, se procede al esterilizado del mismo a 121C durante quince minutos y a su posterior enfriado a la temperatura de fermentacin a 24C, proceso que demora 4 hs. Una vez esterilizado el medio de fermentacin, se procede a agregar el contenido del segundo prefermentador (PF2) por transvase por gravedad.

Una vez conseguida la temperatura ideal de fermentacin, se conecta el lazo de control de temperatura que regula el caudal de H2O de enfriamiento, se accin-a el agitador llevando la agitacin a rgimen, y se inyecta aire esterilizado que es bombeado con un compresor.

Es esencial la regulacin de pH (de 6 a 3), porque fuera de este intervalo las prdidas seran importantes.

La fermentacin total durar 112 hs, desde la. inoculacin del medio con el contenido del segundo prefermentador hasta la descarga del reactor. La produccin de biomasa ser de 42 gil y se producirn 109/] de penicilinaMedio de cultivo a utilizar en la fermentacin: H2O 87.35%

Lactosa 10%

Melaza de caa 1.5%

CaCO3 0.5%

KH2PO4 0.4%

Aceite Vegetal 0.25%

Descripcin del fermentadorLa funcin del fermentador es la de proporcionar un ambiente ptimo para cada proceso microbiolgico, que permita el crecimiento eficaz de las clulas y la formacin del producto.

Existen dos tipos de fermentadores, segn requieran o no oxigeno: aerobios y anaerobios. En la produccin industrial de penicilina el tipo de fermentador que se utiliza es aerbico que opera en forma discontinua. Este tipo de fermentador consiste en un vaso cerrado que se puede esterilizar, airear, agitar y cuyo contenido puede tener la temperatura regulada con un gran grado de exactitud.

Su forma es corrientemente cilndrica con fondo redondeado y una superficie interior lisa para facilitar su limpieza. Posee un agitador vertical y un sistema de inyeccin de aire estril y serpentinas para mantener la temperatura entre 23 y 25 C. Su altura suele se entre 50% y 100% mayor que su dimetro. En toda la longitud del fermentador y perpendicular a sus paredes se distribuyen con un espaciado regular unas placas deflectoras (cuatro en gral.) para controlar el flujo del lquido. Su ancho es 1/10 del dimetro.

La mayor parte de los fermentaciones industriales de antibiticos se llevan a cabo en fermentadores de 20 a 200 m3.

Esquema del fermentador

5) Filtracin

Una vez finalizada la fermentacin, sin detener la agitacin se procede a la filtracin del medio fermentado a medida que se descarga el reactor. Finalizada esta etapa se limpia el reactor y se comienza a llenar nuevamente con caldo de fermentacin fresco, repitindose el proceso batch.

El primer paso para la filtracin consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vaco tipo cilndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 C con el objeto de disminuir la degradacin enzimtica y qumica durante las etapas de extraccin posteriores.

6) Mezclado y aireacin

El proceso de fermentacin industrial aerobio debe disponer de un sistema de aireacin y mezclado del cultivo. El reactor de tipo tanque con aireacin convencional incluye un sistema de agitacin mecnico consistente en un eje vertical con varios agitadores, estos agitadores generalmente son de turbina de discos que son muy efectivos para conseguir un buen mezclado y una buena dispersin del aire a travs del medio.

La adecuada aireacin es esencial para obtener un rendimiento optimo en la produccin de Penicilina, ya que el hongo productor de esta es un organismo aerobio por lo que requiere la presencia de oxigeno. EI aire suministrado en el fermentador debe ser esterilizado, ya que el aire ordinario contiene gran cantidad de partculas y microorganismos.

El numero en que estas partculas y microorganismos que se encuentran presentes en el aire varia en gran medida dependiendo de la localizacin de la planta, el movimiento de aire y el tratamiento previo de este. Como media el aire exterior tiene de 10 a 100.000 partculas por m3 y 5 a 2000 microorganismos por m3, de estos el 50% son esporas de hongos y el otro 50% son bacterias Gram. Negativas.

Los mtodos existentes para la esterilizacin de los gases y del aire incluyen la filtracin, inyeccin de gas ozono, la depuracin de gas, radiacin (UV) y- el calor. De estos solamente la filtracin y el calor son prcticos a escala industrial.

En los sistemas industriales el aire se esteriliza por filiacin, actualmente estn siendo ampliamente utilizados un sistema de filtros de cartuchos que utilizan membranas plegadas construidas de esteres de celulosa, polisulfona y nylon. Este tipo de sistema de filtracin mediante cartuchos es de fcil instalacin y mantenimiento y de moderado costo.

El aire esterilizado por filtracin se introduce en el caldo de cultivo por un inyector de aire que se encuentra situado en el fondo del fermentador. Una vez que este aire se encuentra agotado sale finalmente a la atmsfera a travs de una conduccin larga que se esteriliza peridicamente. En algunos casos puede incluirse un filtro bacteriolgico en la conduccin de salida, para disminuir tanto como sea posible la diseminacin de los microorganismos presentes en el aire gastado.

7) Recuperacin

Durante el proceso de recuperacin se separa la fase slida que se encuentra compuesta por la biomasa y la Penicilina de la fase lquida compuesta principalmente por agua, trazas de penicilina y partculas menores.

Una vez finalizada la fermentacin el contenido del reactor RF es conducido hacia un filtro de tipo rotatorio de vaco F1 el cual permite obtener altas velocidades de filtrado. El tiempo de filtracin ser de aproximadamente 3 horas.

8) Extraccin

La extraccin de la Penicilina de la torta producida durante la filtracin se realiza en un extractor en contracorriente E1 utilizando como solvente metil propil cetona. Una vez que el solvente a pasado por el extractor es conducido a un evaporador V1, en el cual el solvente es evaporado, producindose la deposicin de los cristales de Penicilina. Una vez que se ha terminado la etapa de evaporacin de los cristales de Penicilina son retirados del evaporador y llevados a un secador S1. donde se produce la extraccin de la humedad residual.

9) Producto final

Una vez que se ha terminado la etapa de purificacin de cristales de Penicilina son retirados del secador y se les realiza una serie de anlisis en relacin con su potencia, esterilidad, toxicidad, pirogeneidad, contenido de humedad, etc.

Una vez que la Penicilina ha resultado satisfactoria para esta serie de anlisis, estar lista para su fraccionamiento y envasado.

10) Envasado

Se envasa en condiciones aspticas en bolsas de polietileno de 10 Kg, o en recipientes de vidrio o acero inoxidable.

11) Subproductos del proceso

Del proceso industrial de produccin de la Penicilina se obtienen dos subproductos que son: el lquido proveniente del filtrado F1 y la torta proveniente del extractor E1.

El filtrado F1 es bsicamente agua la cual se elimina del proceso sin previo tratamiento ya que no contiene ni productos de inters ni elementos contaminantes. La torta obtenida en E1 es sacada al aire libre y luego es preparada para su venta a granel para la preparacin de alimentos para animales.

ESQUEMA DEL PROCESO

Economa del procesoSe atribuye un 80% del costo de produccin de penicilina al proceso de fermentacin y un 20% a las etapas posteriores de extraccin y purificacin. A su vez en el proceso fermentativo, un elevado porcentaje en los costos corresponde al medio de cultivo, en el cual la glucosa es el componente de mayor valor, El mximo rendimiento mencionado en esta fermentacin es aproximadamente 0.1 g de penicilina por gramo de azcar. El balance de materia para glucosa es el siguiente:

GLUCOSA CONSUMIDA = CONSUMO PARA BIOMASA + CONSUMO PARA ENERGIA DE MANTENIMIENTO + CONSUMO PARA PENICILINA

Podemos entonces escribir la siguiente ecuacin:

donde Y'p/s es el rendimiento en producto que se obtendra cuando no hay crecimiento ni mantenimiento, y los dems trminos tienen el significado ya mencionado.

Se ha estimado que de la cantidad total de glucosa consumida, el 20% se utiliza en la formacin de biomasa, el 10% para la produccin de penicilina, y el resto, o sea el 70% para mantenimiento.

El valor de Y'p/s se puede estimar tericamente mediante el conocimiento de la ruta biosinttica que conduce al producto. En el caso de la penicilina el valor mximo terico posible ha sido calculado en 1.1 g de penicilina g-1 de glucosa. Tomando en cuenta el elevado consumo de glucosa para mantenimiento es evidente que deben realizarse todava estudios fisiolgicos con el objeto de reducir ese porcentaje.

En 1980 la produccin mundial de penicilina alcanz las 17,000 toneladas con un valor estimativo de 380 millones de dlares. Estos dos valores son mayores que los de cualquier otro antibitico y no son fijos sino que la produccin tiene una significativa velocidad de crecimiento anual. Esto se debe a su baja toxicidad y la posibilidad de modificar qumicamente la molcula, lo cual incrementa su utilidad.

A pesar de los avances logrados, muchos problemas fundamentales sobre el control de la fermentacin de penicilina permanecen todava sin resolver. Las futuras mejoras en la produccin deberan considerar:

El aumento de qp max y la biomasa (X), la disminucin de uc, la inhibicin de la hidrlisis de la penicilina, la disminucin de la viscosidad de los caldos y del porcentaje de carbono destinado a mantenimiento, la obtencin de cepas con fenotipos y productividad estables, y finalmente el mejoramiento de los sistemas de operacin como el batch alimentado y el continuo.Diseo de ExperimentoMedio de cultivo seleccionado: Preparacin del inculo.

Obtenemos a partir de la bibliografa la cantidad ptima de nutrientes. Para desarrollar el diseo de experimento se tomaron valores un 20% por encima de este valor ptimo, (representados por el signo +), y un 20% por debajo de este mismo valor (representado por el signo -), obteniendo diferentes resultados de todos los experimentos.Variables

Nivel ptimo Nivel Alto (+)

Nivel Bajo (-)

Sacarosa

20g 24g 16g

NaNO3

6g

7.2g

4.8g

CaCl2

2.5g 3g

2g

MgSO4 0.5g 0.6g

0.4gVariable12345678910111213141516

Sacarosa++---+++---+++--

NaNO3+-+--+--++-++-+-

CaCl2+--+--+-+-++-++-

MgSO4+---+--+-++-+++-

RESULTADOSR1R2R3R4R5R6R7R8R9R10R11R12R13R14R15R16

ConclusinSin duda este es un campo donde se puede y debe seguir investigando y desarrollando nuevas tecnologas debido a que los antibiticos requieren un mejoramiento, ya que son productos del metabolismo secundario y suelen generarse en concentraciones muy bajas. Es por eso que una vez elegidas las bacterias productoras, se busca la manera de mejorarlas en el laboratorio para transformarlas en superproductoras. Para esto se utilizan algunas tcnicas como la mutagnesis, que introduce cambios azarosos en el ADN que pueden favorecer o acelerar la sntesis del antibitico, o la ingeniera gentica que nos permite aumentar el nmero de copias de los genes que codifican para las enzimas que intervienen en la produccin del antibitico. De esta forma se fabricar, a partir de una misma clula, ms cantidad del producto final. Adems la ingeniera gentica nos permite transferir los genes de las enzimas que participan en la sntesis del antibitico a organismos ms fciles de crecer y manipular, como Escherichiacoli, para que stos produzcan el antibitico deseado.

Adems de un mejoramiento, la bsqueda de nuevos antibiticos es probablemente ms urgente en la actualidad, ya que muchos antibiticos que fueron alguna vez altamente efectivos han perdido utilidad frente a los organismos patgenos. Este hecho es el resultado de un proceso por el cual los microorganismos desarrollan resistencia frente a antibiticos que en el pasado les resultaban letales.

Si bien los antibiticos son compuestos qumicos producidos naturalmente por los microorganismos, y la adquisicin de resistencia a los antibiticos tambin es un proceso natural en los seres vivos, se considera que el hombre ha influido en este acontecimiento evolutivo. Se cree que el uso indiscriminado de antibiticos por parte del hombre, ha acelerado el proceso de seleccin natural por el cual las bacterias ms resistentes se han visto beneficiadas frente a las ms sensibles. Estas cepas resistentes sobreviven a la presencia del antibitico y pueden propagarse exitosamente.

Consientes del riesgo que significa que los antibiticos sean inocuos para los microorganismos patgenos, diferentes centros de investigacin o compaas farmacuticas en todo el mundo realizan extensas bsquedas de microorganismos o de nuevas molculas antibiticas con diferentes mecanismos de accin.

Finalmente concluimos que con este trabajo hemos tratado de estudiar sintticamente la importancia de los antibiticos en la vida humana y su relacin con la Biotecnologa, as como tambin la produccin de penicilina a nivel industrial.

Bibliografia:

http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=407 https://docs.google.com/document/edit?id=1v-mEND55kazVPU0WaqWkGK8czzrTVV3MqKzG6GL8HYM&hl=es&pli=1 http://blogs.creamoselfuturo.com/bio-tecnologia/2010/05/24/microorganismo-como-fuente-de-produccion-de-antibioticos/ https://lamicrobiologiaumd.wikispaces.com/Microorganismos+que+producen+antibi%C3%B2ticos http://www.monografias.com/trabajos10/antib/antib.shtml#clasif#ixzz3a1wzoVW7 http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=51