acción bactericida de la luz ultravioleta fotorreactivación

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CURSO: Laboratorio de Microbiología

DOCENTE: Mblgo. Carlos Azañero Díaz

GRUPO: ¨D¨

ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA

E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

ACCIÓN BACTERICIDA DE LA LUZ ULTRAVIOLETA,

FOTORREACTIVACIÓN

Microbiología General

1 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

I. INTRODUCCIÓN

Los efectos de la radiación con luz UV sobre los microorganismos pueden variar de

especie a especie y, entre cepas de la misma especie, del medio de cultivo, estado

del cultivo, densidad de microorganismos y otras características como el tipo y

composición del alimento. Los hongos y levaduras son más resistentes durante la

desinfección; sin embargo, los niveles altos de microorganismos deben tomarse en

cuenta cuando se usa UV-C para desinfectar.

La radiación absorbida por DNA puede detener el crecimiento celular y producir la

muerte celular. La luz UV-C que absorbe el DNA causa un cambio físico de

electrones que provoca la ruptura de los enlaces del DNA, retrasar la reproducción

o muerte celular. Esto significa que el efecto bactericida de la UV-C es básicamente

a nivel del ácido nucleico. Un enlace cruzado entre tiamina y citosina (Nucleótido

de bases Pirimídicas) en la misma cadena de DNA ocurre por la radiación de UV-C.

Los fotoproductos más comunes de DNA son dímeros ciclobutil pirimidina. El

efecto obtenido es que la transcripción y réplica del DNA se bloquean,

comprometiendo a las funciones celulares y eventualmente produciendo la muerte

celular. Los efectos en los enlaces cruzados del DNA son proporcionales a la

cantidad de exposición de luz UV-C.

II. OBJETIVO

Estudiar el poder letal de la luz ultravioleta midiendo la supervivencia de una

cepa bacteriana sensible.

Estudiar el fenómeno d la Fotorreactivación.



III. MATERIALES

Material biológico

Cultivos puros bacterianos:Cultivos de Escherichia coli.

Material de Laboratorio

4 placas de petri estériles.

8 placas de agar nutritivo (AN).

32 tubos de 20ml de capacidad con 9ml de SSF estéril.

Un matraz de 250ml con 45ml de MgSO4 0,1M estéril.

Un matraz de 250ml con 10ml de caldo nutritivo (CN) estéril

Baño térmico con agitación

Hielo

Lámpara de luz UV (longitud de onda 240-265nm).

4 focos de luz visible de 100w.

IV. Fundamento teórico:

RADIACIONES UV

Mecanismo de acción: el principal mecanismo del efecto letal de la luz UV

sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante

daño de este. Así provocan la formación de uniones covalentes entre los

residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo

que provoca la formación de dímeros de pirimidina de tipo

ciclobutano.Esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en

el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibición de la

http://www.monografias.com/trabajos28/dano-derecho/dano-derecho.shtml



síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento y la

respiración.

Aplicaciones: estas radiaciones pueden producirse artificialmente con

lámparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para Gram (+) y

Gram (-). Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no

penetran en sólidos y lo hacen pobremente en líquidos

FOTORREACTIVACIÓN

V. procedimiento:

1. Efecto de la temperatura y tiempo de exposición sobre el crecimiento de

microorganismos.

Encender una lámpara de luz UV durante 30 minutos. Antes del ensayo

con el fin de que se estabilice la intensidad de la emisión.

Preparar un cultivo en fase de crecimiento exponencial E. coli. Para ello

añadir 0.1ml de un cultivo incubado durante toda la noche a un matraz

con 10ml de caldo nutritivo estéril. Incubarlo a 370 C con agitación

Empieza por una enzima llamda fotorreactivante

Reconoce los dímeros

formados por la luz UV

Utiliza la luz visible

Rompe los enlaces que unía

a las dos pirimidinas

Actúa un ADNpolimeras colocandolas nuevas bases

Y finalmente una ADNligasa sella la molécula de

ADN

http://www.monografias.com/trabajos12/embrio/embrio.shtml#respi

http://www.monografias.com/trabajos53/impacto-ambiental-mercurio/impacto-ambiental-mercurio.shtml



constante (200rpm) durante 2-3 horas. De esta forma se obtendrá una

concentración celular de aproximadamente 108 UFC/ml.

Añadir al cultivo 45ml de MgSO4 0.1M.

Mantener la suspensión en hielo durante 5-10 minutos.

Dispensar 5ml de la suspensión en cada placa de Petri vacía estéril.

Rotar las placas en contra y a favor del sentido de las agujas del reloj.

Se ha de conseguir una distribución homogénea de la suspensión para

evitar el efecto de apantallamiento que las propias células pueden

crear entre sí.Radiar las muestras con luz UV durante distintos tiempos:

0, 20, 60, 120 seg.

NOTA: La lámpara UV se coloca a una altura de 50cm sobre una

superficie horizontal. La luz debe incidir verticalmente sobre las

muestras. La exposición se realizará en una habitación oscura para

evitar posible Fotorreactivación.

Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril.

Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas

de agra nutritivo.



Incubar a 370 C toda la noche.

Para la fotorreactivación hay que iluminar las placas irradiadas con

cuatro focos de luz visible de 100W durante 40 min a una distancia de

10cm.

Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril.

Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas

de agar nutritivo.

Incubar a 37ºC toda la noche.

Diluciones Aconsejables para el Recuento de Supervivientes

Tiempo(seg) de exposición a la luz UV

Diluciones antes de la fotorreactivación

Diluciones después de la fotorreactivación

0 10-6 10-6

20 10-6 10-6

60 10-5 10-5

120 10-1 10-1



VI. RESULTADOS:

1. Fotorreactivación:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli. Muestraa 0 segundos:

Muestra a 20 segundos:



Cantidad de colonias: 134

Descripción: el crecimiento microbiano es

mayor si nos expone a calor.


Descripción: crecimiento del E. coli en menor

cantidad.


Descripción: mayor crecimiento que a 20

segundos.


Descripción: el crecimiento no se inhibe a

pesar que fue expuesto mayor tiempo que las

demás muestras, indicando que el E. coli tiene

un crecimiento favorable.




Descripción: colonias dispersas por todo la placa.

2. Ultravioleta:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli.






Descripción: colonias dispersas por la placa

indicando que la radiación en UV no inhibe el

crecimiento microbiano.


Descripción: el crecimiento no E. coli no se

inhibe a 60 segundos e incluso crece mejor q el

que no está irradiado.


Descripción: el crecimiento es casi de la misma

proporción que cuando no se irradia.



VII. DISCUSIÓN:

En condiciones apropiadas, la radiación electromagnética controla

eficazmente el crecimiento microbiano. La radiación ultravioleta es útil para

descontaminar superficies y materiales que no absorban luz, como el aire y el

agua. Las microondas, la radiación ultravioleta (UV), los rayos X son tipos de

radiación electromagnética. Sin embargo cada radiación actúa con un

mecanismo específico. La radiación UV, considerada entre 220 y 30nm de

longitud de onda, actúa como un mecanismo diferente. Las ondas UV tienen

suficiente energía para causar roturas en el ADN, produciendo la muerte del

organismo expuesto. Las cabinas de los laboratorios vienen equipadas con una

lámpara microbicida de la luz UV para la descontaminación de una superficie

después de su uso. La radiación UV no penetra las superficies sólidas, opacas,

absorbentes de luz, y su utilidad se limita a la desinfección de las superficies

expuestas. Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 692

Para todos los microorganismos existe una temperatura máxima de

crecimiento por encima de la cual mueren. La aplicación de calor es el

método de esterilización más utilizado. Latemperatura para la esterilización

por calor se selecciona con el fin de eliminar la mayoría de los



microorganismos resistentes al calor en el material, habitualmente

endosporas bacterianas.Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 689

La luz ultravioleta no posee un gran poder de penetración lo que limita su uso

como desinfectante o germicida.Los efectos de la radiación UV son mutaciones

y alteraciones letales en los ácidos nucleídos. Los productos más importantes

de la acción de la luz UV son dímeros:

Que se formas entre dímeros. Los dímeros producidos durante la radiación

impiden la replicación y la transcripción. Estas alteraciones del DNA resultan

letales a menos de que sean reparadas por:

En las células, la radiación afecta en primer lugar a los ácidos nucleicos y las

proteínas, sin que se produzca un calentamiento apreciable. Algunas de las

alteraciones que una radiación ionizante puede producir en un ácido nucleico

son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratación de la

citosina. Otras alteraciones son más perjudiciales, como la formación de

puentes entre ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicación del mismo y

por tanto de la bacteria.Las bacterias Gram-negativas son generalmente más

sensibles a la irradiación que las Gram-positivas y las esporas aún más

resistentes.

Existen varios métodos para la conservación de cepas interesantes de

microorganismos. Entre los más frecuentes figuran la congelaciónde muestras

de cultivos creciendo exponencialmente a los que se ha añadido un agente

Fotorreactivación

Reparación por Escisión

Mecanismo SOS

Timina – Timina

Timina – Citosina

Citosina – Citosina



estabilizante (glicerol al 30%) y se mantienen a -80ºC; la liofilizacióny la

conservación en medios sólidos herméticos. La liofilización y la congelación son

los métodos de conservación más efectivos a largo plazo; pero ambos causan

una gran mortandad entre las bacterias (es decir, probablemente en torno al

80-90% de las CFU que se congelan o liofilizan mueren en el proceso). Estos

métodos son muy aplicados para conservar bacterias; sin embargo, presentan

más problemas en el caso de eucariontes ya que muchos de ellos no se

recuperan después del tratamiento.

Es de común conocimiento que las bacterias y otros microorganismos pueden

reparar su ADN tras haber sido dañados por la radiación ultravioleta (UV).

Conocida como “reactivación”, algunos microorganismos necesitan luz visible

para emprender la reparación (“fotorreactivación”), mientras que otros

pueden reparar su ADN sinluz (“reparación a oscuras”).

Muchas bacterias poseen un eficiente mecanismo de fotorreactivación para

reparar el daño causado por la radiación UV cuando se exponen

inmediatamente después a la luz visible.

Las bacterias contienen complejos sistemas de enzimático de reparación del

ADN dañado por la luz UV, llamados sistemas reguladores SOS, que se activan

como consecuencia de los mismos daños en el ADN. Uno de estos es la

fotorreactivación.

Las cepas más comunes del E. coli contienen alrededor de 20 enzimas de

fotoliasa, capaces de reparar hasta cinco dímeros de timina por minuto cada

una—esto significa que, en una sola célula, pueden reparase hasta 100

dímeros por minuto. 1mJ/cm2 de UV produce, aproximadamente, 3,000-4,000

dímeros (Oguma, 2002), por lo tanto, en teoría, el daño provocado por

1mJ/cm2 de UV puede repararseen sólo 30 minutos.



VIII. CONCLUSIÓN:

La luz ultravioleta tiene un destacado papel sobre ladesaparición bacteriana,

ya que tiene efecto bactericida en la Escherichia coli.El crecimiento depende

del tiempo de irradiación porque en algunos casos la irradiación UV no inhibe

el crecimiento, esto se observa en las muestras que estuvieron20 y 60

segundos; puede que tenga que ver que la bacteria E. coli es mesófila.

El mecanismo de fotorreactivación de la Escherichia coli es unsistema de

reparación directa de los daños producidos por la luz UV. La luz UV produce

dímeros de pirimidinas, fundamentalmente dímeros de Timinas. El enzima

Fotoliasa codificada por el gen PHR reconoce en la oscuridad los dímeros de

Timina y se une a ellos, y cuando se expone a la luz (mediante un fotón)

deshace el dímero de Timinas.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos,

Editorial Mc Graw Hill,10ma Edición, Impreso en España 1998. Capítulo 20,

pág.: 689-691,692.

Carlos Gamazo, Ignacio López-Goñi, Ramón Díaz/”Manual Práctico de

Microbiología”/ 3a Edición- Masson S.A. Barcelona España

http://depa.pquim.unam.mx/genetica/Practica8.htm

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/23_micro.htm



X. CUESTIONARIO:

1. ¿Se puede utilizar la luz UV para mutagenizar cultivos bacterianos?

Las mutaciones ¿Son siempre letales?

Si, ya que la radiación ultravioleta origina dímeros de pirimidina

(generalmente de timina), y la radiación gamma y la alfa que son

ionizantes.

No, ya que las mutaciones pueden provocar cambios morfológicos y

fisiológicos muy grandes y en ocasiones solo puede ser detectada por

medio de técnicas moleculares. De acuerdo a los efectos que causan las

mutaciones se han clasificado en:

Morfológicas.-afectan las propiedades visibles exteriormente del

organismo, como el color, la talla, la forma.

Letales.- afectan la viabilidad de los organismos y pueden ser

dominantes, recesivas o semiletales.

Condicionales.- solo se expresan en condiciones restrictivas.

Bioquímicas.- producen deficiencias metabólicas que pueden

corregirse cambiando las condiciones del medio.

De resistencia.- confieren la capacidad de desarrollarse en presencia

de agentes patógenos o de compuestos inhibidores como los

antibióticos.

http://es.wikipedia.org/wiki/Ultravioleta

http://es.wikipedia.org/wiki/Pirimidina

http://es.wikipedia.org/wiki/Timina

http://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_gamma

http://es.wikipedia.org/wiki/Part%C3%ADcula_alfa

http://es.wikipedia.org/wiki/Ion

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