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ADITIVO DE LEVADURAS DE MANZANA

PARA ALIMENTACIÓN ANIMAL

Por:

D. Ph. Daniel Díaz Plascencia.

D. Ph. Carlos Rodríguez Muela. D. Ph. Pablo Fidel mancillas Flores.

Facultad de Zootecnia y Ecología Universidad Autonoma de Chihuahua, México.

[email protected]

www.lebas.com.mx

Noviembre de 2013

mailto:[email protected]

http://www.lebas.com.mx/

2

RESUMEN GENERAL

Esta investigación consta de seis experimentos, cuyo objetivo fue la evaluación y desarrollo de

diferentes sustratos, y cepas de levaduras autóctonas obtenidas de la fermentación de subproductos de

manzana, para elaborar un aditivo de levaduras vivas y activas para ser usado de manera segura en la

alimentación animal. El primer trabajo consistió en el desarrollo de un aditivo de levaduras, empleando

oxigenadores en medios líquidos para evaluar ocho tratamientos, utilizando diferentes niveles de

manzana molida y melaza de caña como sustratos, y dos cepas de levaduras obtenidas de la fruta de la

manzana. El segundo trabajo consistió en evaluar el comportamiento fermentativo in vitro de ocho

cepas de levaduras aisladas de subproductos de manzana, tomando como base los resultados del

primer estudio. Dichas levaduras fueron identificadas a través de la amplificación del ADNr 18S

mediante la reacción en cadena a la polimerasa (PCR), para luego ser multiplicadas a escala mediante

la fermentación sólida sumergida (FSS). El tercer trabajo consistió en determinar el nivel óptimo a

utilizar del aditivo en dietas para vacas lecheras. En el cuarto trabajo se evaluó el efecto del aditivo de

levaduras y bagazo de manzana (BMZN) en la dieta de becerros Angus en crecimiento sobre el

comportamiento productivo y sistema inmune. El quinto trabajo consistió en evaluar el efecto en la

fermentación in vitro de dietas con la adición del aditivo y BMZN. El sexto trabajo consistió en evaluar el

efecto en la fermentación in vitro de dietas para becerros en crecimiento adicionadas con cuatro cepas

de levadura. Cabe destacar que en la actualidad no hay un aditivo líquido de levaduras en México para

ser usado en la ganadería, por lo que nos consideramos pioneros en esta area. La importancia de los

cultivos vivos de levaduras es por que producen enzimas, vitaminas del complejo B, minerales y

diversos tipos de aminoácidos y como consecuencia, estimulan la absorción de nutrientes creando un

ambiente intestinal saludable y mejorando el sistema inmune. Por otra parte, los minerales traza tales

como el Zinc, Cobre y Manganeso son elementos que juegan un papel importante en varias funciones

3

corporales, necesarias para mantener una salud óptima y por lo tanto son nutrientes esenciales para

todos los animales, ejercen su efecto sobre un correcto crecimiento, reproducción, rutas de secreción

hormonal y respuesta inmune. Del mismo modo, los antioxidantes pueden formar parte de enzimas que

directa o indirectamente protegen a las células contra los efectos adversos de numerosas drogas y

sustancias carcinogénicas. La adición de antioxidantes en la dieta de animales domésticos mejora la

respuesta inmune y disminuye el estrés oxidativo, generando una mayor resistencia a enfermedades

infecciosas y degenerativas. Este aditivo levaduras está enfocado principalmente en la reducción del

uso indiscriminado de antibióticos en la producción animal, formando parte de los probióticos,

prebióticos y simbióticos que se perfilan como las opciones más destacadas respecto de la utilización

de antibióticos en animales y como una solución promotora de la calidad y de la seguridad alimentaria,

actuando de manera directa en el sistema inmunológico del animal que lo consume, reduciendo de esta

manera la frecuencia del uso de antibióticos a largo plazo.

4

CONTENIDO

Página

RESUMEN GENERAL…………………………………………………………………………………….. 2

LISTA DE CUADROS……………………………………………………………………………………... 10

LISTA DE GRÁFICAS…………………………………………………………………………………….. 12

LISTA DE FIGURAS………………………………………………………………………………………. 13

LISTA DE ABREVIACIONES…………………………………………………………………………….. 14

INTRODUCCIÓN GENERAL……………………………………………………………………………... 15

REVISIÓN DE LITERATURA…………………………………………………………………………….. 17

Producción de manzarina…………………………………………………………………………. 17

Fermentación de Manzana………………………………………………………………………... 17

La Manzarina en la Alimentación Animal………………………………………………………... 18

Fermentación Sólida……………………………………………………………………………….. 19

Fermentación Semi-Sólida………………………………………………………………………… 21

Fermentación Líquida……………………………………………………………………………… 22

Principales Características de las Levaduras…………………………………………………… 23

Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae………………………………….. 23

Fermentación en Estado Sólido Comparada con la Fermentación Sólida Sumergida…….. 23

Optimización de Medios de Cultivo………………………………………………………………. 24

La Manzarina en la Alimentación Animal……………………………………………………….. 25

Uso de Levaduras en la Nutrición Animal……………………………………………………….. 25

Cultivos de Levadura en la Fermentación Ruminal…………………………………………….. 27

5

Página

Temperatura Ambiental Sobre el Comportamiento Productivo……………………………….. 28

Alimento Funcional…………………………………………………………………………………. 29

Producto Nutracéutico……………………………………………………………………………... 29

Probióticos en la Alimentación Animal…………………………………………………………… 30

Mecanismos de Acción de las Levaduras en el Rumen……………………………………….. 31

Función de la Pared Celular de Levaduras en el Sistema Inmune…………………………… 31

Función de los Microminerales en el Sistema Inmune………………………………………… 32

Zinc…………………………………………………………………………………………… 33

Manganeso………………………………………………………………………………….. 34

Cobre………………………………………………………………………………………… 34

Actividad Antioxidante……………………………………………………………………………... 36

Biometría Hemática en Rumiantes……………………………………………………………….. 37

Digestibilidad y Fermentación de los Alimentos en el Rumen………………………………… 38

Producción de Gas y Perfiles de AGV en el Rumen…………………………………………… 39

ESTUDIO I. DESARROLLO DE UN INOCULANTE A PARTIR DE DOS SUSTRATOS MEDIANTE FERMENTACIÓN SÓLIDA SUMERGIDA……………………………………………….

40

RESUMEN………………………………………………………………………………………………….. 41

MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………………………… 43

Localización del Área de Trabajo………………………………………………………………… 43

Material y Equipo Experimental…………………………………………………………………... 43

Tratamientos………………………………………………………………………………………... 43

Variables Medidas………………………………………………………………………………….. 46

6

Página

Análisis Estadístico………………………………………………………………………………… 50

RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………………………………… 52

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES…………………………………………………………… 58

ESTUDIO II. COMPORTAMIENTO FERMENTATIVO DE OCHO CEPAS DE LEVADURAS AISLADAS DE SUBPRODUCTOS DE MANZANA……………………………………………………

59

RESUMEN………………………………………………………………………………………………….. 60




Material Biológico y Medios de Cultivo…………………………………………………............ 61

Preparación de Inóculos…………………………………………………………………………… 62

Tratamientos………………………………………………………………………………………... 62





ESTUDIO III. CINÉTICA DE FERMENTACIÓN IN VITRO DE RACIONES PARA VACAS HOLSTEIN ALTAS PRODUCTORAS……………………………………………………………………

74

RESUMEN………………………………………………………………………………………………….. 75




7

Página

Preparación del Aditivo……………………………………………………………………………. 77

Tratamientos………………………………………………………………………………………... 78





ESTUDIO IV. INÓCULO DE LEVADURAS Y BAGAZO DE MANZANA FERMENTADO EN LA DIETA DE BECERROS ANGUS EN CRECIMIENTO SOBRE EL COMPORTAMIENTO PRODUCTIVO Y SISTEMA INMUNE…………………………………………………………………..

95

RESUMEN………………………………………………………………………………………………….. 96


Localización del Área de Estudio………………………………………………………………… 97

Descripción de los Animales y Tratamientos……………………………………………………. 97

Material Biológico…………………………………………………………………………………... 99

Manejo de los Animales…………………………………………………………………………… 100

Toma de Muestras…………………………………………………………………………………. 101




ESTUDIO V. FERMENTACIÓN IN VITRO DE DIETAS CON UN INÓCULO DE LEVADURAS Y DE BAGAZO DE MANZANA FERMENTADO PARA BECERROS EN CRECIMIENTO………..

126

RESUMEN………………………………………………………………………………………………….. 127

MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………………………... 129

8

Página


Descripción de los Tratamientos…………………………………………………………………. 129

Análisis Químico de las Dietas……………………………………………………………………. 129

Digestibilidad in vitro de la MS, FDN, FDA y el Contenido de LDA de la Dieta……………... 130

Obtención del Líquido Ruminal…………………………………………………………………… 131

Producción de Gas in vitro………………………………………………………………………… 131

Producción y Perfiles de AGV…………………………………………………………………….. 133

Nitrógeno Amoniacal (N-NH3)…………………………………………………………………….. 133

Ácido Láctico………………………………………………………………………………………... 134




ESTUDIO VI. FERMENTACIÓN IN VITRO DE DIETAS PARA BECERROS EN CRECIMIENTO ADICIONADAS CON CUATRO CEPAS DE LEVADURAS………………………………………….

152

RESUMEN………………………………………………………………………………………………….. 153



Descripción de los Tratamientos…………………………………………………………………. 155

Análisis Químico de las Dietas……………………………………………………………………. 157

Digestibilidad in vitro de la MS, FDN, FDA y el Contenido de LDA de la Dieta……………... 157

Obtención del Líquido Ruminal…………………………………………………………………… 158

Producción de Gas in vitro………………………………………………………………………… 158

9

Página

Producción y Perfiles de AGV…………………………………………………………………….. 158

Nitrógeno Amoniacal (N-NH3)…………………………………………………………………….. 159

Ácido Láctico………………………………………………………………………………………... 159




FOTOGRAFÍAS……………………………………………………………………………………………. 176

LITERATURA CITADA……………………………………………………………………………………. 189

10

LISTA DE CUADROS

Cuadro Página

1 Diseño de tratamientos con dos sustratos y diferentes combinaciones con la Levadura A………………………………………………………………………………….

44

2 Diseño de tratamientos con dos sustratos y diferentes combinaciones con la Levadura D………………………………………………………………………………….

45

3 Medias (± EE) en la comparación de los diferentes sustratos con la levadura A….. 56

4 Medias (± EE) en la comparación de los diferentes sustratos con la levadura D…..

57

5 Medias (± EE) del comportamiento fermentativo in vitro entre tratamientos de ocho cepas de levaduras………………………………………………………………….

70

6 Medias (± EE) de producción de gas entre cepas de levaduras durante la fermentación ruminal in vitro (PG en mL/0.2g MS)…………………………………….

72

7 Contenido y análisis calculado de la dieta para vacas Holstein altas productoras con producción esperada de 35 L de leche vaca/d utilizada en el experimento……

79

8 Diseño de tratamientos con diferentes niveles de inóculo……………………………. 80

9 Medias (± EE) del comportamiento fermentativo entre tratamientos (t) durante la fermentación in vitro……………………………………………………………………….

88

10 Medias (± EE) del comportamiento en la producción de gas entre tratamientos (t) durante la fermentación ruminal in vitro (PG en mL/0.2g MS)………………………..

90

11 Medias (± EE) del comportamiento en la producción de AGV´s entre tratamientos (t) durante la fermentación in vitro………………………………………………………

93

12 Composición del alimento concentrado por tratamiento………………………………. 98

13 Temperatura ambiental promedio registrada durante el experimento…………. 107

14 Medias (± EE) del comportamiento productivo de becerros alimentados con tres

dietas diferentes……………………………………………………………………………

108

15 Medias (± EE) de la concentración de zinc (μmol/L) en suero sanguíneo de becerros alimentados con tres dietas diferentes……………………………………….

111

11

Cuadro

Página

16 Medias (± EE) de la concentración de manganeso (μmol/L) en suero sanguíneo de becerros alimentados con tres dietas diferentes…………………

113

17 Medias (± EE) de la concentración de cobre (μmol/L) en suero sanguíneo de becerros alimentados con tres dietas diferentes…………………………………..

115

18 Medias (± EE) de la actividad antioxidante (μmol/L FeSO4)2 en plasma

sanguíneo de becerros alimentados con tres dietas diferentes…………………

118

19 Medias (± EE)2 de células blancas de biometría hemática de becerros alimentados con tres dietas diferentes…………………………………………………..

120

20 Medias (± EE)2 de células rojas de biometría hemática de becerros alimentados con tres dietas diferentes……………………………………………..

121

21 Medias (± EE) de la digestibilidad in vitro de las fracciones de la fibra de dietas conteniendo bagazo de manzana fermentado y un inóculo de levaduras…………..

138

22 Parámetros de la degradabilidad ruminal de MS de tres dietas diferentes…………. 143

23 Comportamiento en la producción y perfiles de AGV entre tratamientos durante la fermentación in vitro……………………………………………………………………….

146

24 Medias (± EE) del comportamiento en la concentración de N-NH3, ácido láctico y pH de tratamientos durante la fermentación in vitro……………………………………

149

25 Diseño de tratamientos para la preparación de los inóculos con las cuatro cepas de levaduras………………………………………………………………………………..

156

26 Digestibilidad in vitro de las fracciones de las fibras entre tratamientos…………….. 162

27 Parámetros de la digestibilidad ruminal de MS entre tratamientos………………….. 168

28 Comportamiento en la producción y perfil de AGV entre tratamientos durante la fermentación in vitro……………………………………………………………………….

170

29 Comportamiento en la concentración de N-NH3, ácido láctico y pH entre tratamientos durante la fermentación in vitro……………………………………………

172

12

LISTA DE GRÁFICAS

Gráfica Página

1 Medias (± EE) de la producción de gas del T1 (heno de avena, ensilaje de maíz y concentrado), T2 (heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado y bagazo de manzana fermentado) y T3 (heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado e inóculo de levaduras) durante la fermentación ruminal in vitro……………………..

142

2 Medias (± EE) de la producción de gas durante la fermentación ruminal in vitro del T1, T2, T3 y T4 conteniendo todos los tratamientos heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado y su respectiva cepa de levadura…………………………….

166

13

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Cuadrícula de un hematocímetro (cámara de Neubauer)………………………… 49

14

LISTA DE ABREVIACIONES

Abreviación

Significado

AGV´s

Ácidos grasos volátiles AcL Ácido láctico AS Azucares solubles BM Bagazo de manzana C Cenizas cel Células CL Conteo de levaduras CP Conteo de protozoos cm centímetros d Día

EE Extracto etéreo FC Fibra cruda FEL Fermentación en estado líquido FES Fermentación en estado sólido FL Fermentación liquida FS Fermentación solida

FSS Fermentación solida sumergida gbrix Grados brix

h Hora Lev Levadura mL Mililitro mM Milimolar MS Materia seca min minutos NH3 Amoniaco nm nanómetros

N-NH3 Nitrógeno amoniacal NNP Nitrógeno no proteico PC Proteína cruda PG Producción de gas pH Potencial hidrogeno PV Proteína verdadera rpm Revoluciones por minuto S Sustratos t Tratamiento T Temperatura

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INTRODUCCIÓN GENERAL

El uso indiscriminado de promotores de crecimiento en la producción animal y la creciente

demanda por satisfacer las necesidades de alimentos, en una sociedad cada vez más exigente, nace la

necesidad de plantear nuevas alternativas para reducir el uso de antibióticos usados hoy en día en la

ganadería que ponen en riesgo la salud humana y animal.

Algunos microorganismos benéficos, conocidos como 'probióticos', así como ciertas

biomoléculas y compuestos derivados, se suministran directamente a los animales para mejorar su

metabolismo, salud y producción (Glade y Biesik, 1986; Wiedmeier et al., 1987; Cole et al., 1992). Los

probióticos estimulan la digestión y ayudan a mantener el equilibrio microbial en el intestino de los

animales, acciones que contrarrestan el estrés derivado de los cambios en las dietas, las condiciones

detrimentales de manejo, y el ataque de patógenos (Kornegay et al., 1995; Anderson et al., 1999). Las

enzimas, vitaminas y otros nutrientes o factores de crecimiento producidos por estos microorganismos

originan respuestas de producción benéficas en los animales que los consumen (Kornegay et al., 1995;

Castro y Rodríguez, 2005).

El desarrollo de productos mediante la fermentación solida sumergida (FSS) ha mantenido un

interés creciente en los últimos años. Esto se debe entre otros factores, al aumento en los costos de los

ingredientes convencionales como esquilmos agrícolas y subproductos agroindustriales utilizados en la

alimentación del ganado. Un ejemplo lo representan los cultivos de levaduras, los cuales se han

empleado en una forma dinámica en las últimas décadas buscando mejorar la respuesta productiva de

los animales a menor costo. Está documentado y estudiado que los aditivos alimenticios de levaduras,

compuestos fundamentalmente por Saccharomyces cerevisiae han permitido mejorar la salud y la

productividad de los animales que las consumen (Miller et al., 2002; Lila et al., 2004).

16

La búsqueda de alternativas de alimentos económicamente viables para los animales que

mejoren su productividad y que no compitan con la alimentación humana y que además constituyan

fuentes naturales y seguras para la salud humana y la de los propios animales son algunas de las

primicias para los nutriólogos (Calsamiglia et al., 2005). Es importante mencionar que el enriquecimiento

nutritivo de subproductos agroindustriales a través de procesos de fermentación, también se ha probado

en otro tipo de sustratos (Reid, 1985; Peñaloza et al., 1985). Diversos estudios se han enfocado a

evaluar el proceso de fermentación en la búsqueda de su optimización (Becerra et al., 2008; Díaz-

Plascencia et al., 2010a; Rodríguez et al., 2010). Estos autores describieron la existencia de una

variabilidad en la concentración y calidad nutritiva del producto, dependiendo en su mayor parte, por los

niveles de concentración de carbohidratos estructurales del sustrato utilizado.

El uso de un inóculo de levaduras Kluyveromyces lactis obtenido a partir del bagazo de

manzana, por medio de la técnica fermentación sólida sumergida (FSS) contribuirá en un futuro no muy

lejano en el desarrollo de levaduras de gran utilidad en la nutrición y alimentación animal, al aportar de

una manera eficiente levaduras benéficas activas (LEBAS), siendo una vía biotecnológica adecuada

para el aprovechamiento de desechos agroindustriales ricos en carbohidratos (Díaz-Plascencia et al.,

2010a).

Por lo anteriormente escrito el objetivo del presente estudio fue la evaluación de diferentes

sustratos y cepas de levaduras autóctonas obtenidas de la fermentación de subproductos de manzana

para la elaboración de un aditivo líquido para ser usado en la alimentación animal bajo condiciones

aeróbicas.

17

REVISION DE LITERATURA

Producción de Manzana

A nivel mundial se producen aproximadamente 60 millones de toneladas de manzana al año en

una superficie de 5.6 millones de hectáreas, siendo China el principal productor con más de 20 millones

de toneladas, seguido de Estados Unidos de Norte América con 5.0 millones. Estos países aportan el

45% de la producción mundial, mientras que México aporta 0.46 millones de toneladas al año; de este

total en la región Noroeste del Estado de Chihuahua, México; se produjeron alrededor de 409,778

toneladas de manzana (SAGARPA, 2007) de este total, cerca de 145,000 toneladas se comercializaron

como manzana de desecho (UNIFRUT, 2007). Este desecho, no apto para consumo humano, es

utilizado en su mayoría en la industria de la extracción para la elaboración de jugo; proceso del cual se

obtiene un residuo o subproducto conocido como bagazo de manzana o pomasa. Gran parte de este

bagazo es utilizado inadecuadamente en la alimentación animal y el resto, junto con buena parte de

manzana de desecho que se queda en la huerta sin utilización alguna, dan origen a un problema de

contaminación del medio ambiente por su alta velocidad de putrefacción, con la consecuente pérdida de

nutrientes y dinero para el productor. Se estima una producción de pomasa de aproximadamente

32,000 toneladas (UNIFRUT, 2007) la cual no es aprovechada, o en algunos casos, se sub utiliza en la

alimentación animal.

Fermentación de Manzana

Becerra (2006) y Díaz (2006) desarrollaron un proceso biotecnológico del cual obtuvieron un

producto al que llamaron “manzarina” el cual usan en la alimentación animal, que se obtiene de la

fermentación en estado sólido de la manzana. En este proceso la energía de los carbohidratos

disponibles y la urea como fuente de nitrógeno son utilizadas para el crecimiento de la microbiota epifita

de la manzana. El desarrollo biotecnológico de la manzarina como alimento alternativo para consumo

18

animal, está llamada a constituir un elemento importante en el desarrollo de la producción animal en el

Estado de Chihuahua, demostrando la factibilidad de aprovechar los recursos alimenticios de bajo valor

nutritivo, como son los subproductos de manzana a través de la fermentación en estado sólido (Díaz,

2006). El uso de la fermentación en estado sólido de subproductos de manzana constituye una

alternativa para el aprovechamiento de estos, evitando la contaminación ambiental provocada por la

rápida descomposición de los mismos (Díaz-Plascencia et al., 2010b).

La Manzarina en la Alimentación Animal

La manzarina ha sido utilizada como ingrediente en la elaboración de bloques multinutricionales

los cuales fueron evaluados en la alimentación de becerros en crecimiento (Rodríguez et al., 2006a). La

manzarina es un suplemento proteico que se ha obtenido a mediana escala en condiciones rusticas

para utilizarla y evaluarla como ingrediente en dietas para rumiantes. Se encontró que puede sustituir

parte de los ingredientes en dietas de vacas lecheras, con incrementós en la producción láctea

(Gutiérrez, 2007) y beneficios en la salud del animal (Gallegos, 2007). Han sido evaluadas como

ingrediente en la dieta para la alimentación de borregos en engorda (Hernández, 2008) y como parte del

suplemento en alimentación de bovinos de carne (Rodríguez et al., 2006b).

Rodríguez et al., (2006b) reportaron que becerros en engorda, alimentados con bloques

multinutricionales, elaborados con un 14.6% de manzarina como ingrediente puede tener ganancias

diarias de peso de 0.570 kg d-1; la dieta se baso en el uso de forraje verde picado, ensilaje y rastrojo de

maíz y como concentrado proteico, mineral y energético, se utilizaron los bloques multinutricionales. El

consumo de bloque fue de 1.52 Kg a-1 d-1, el costo de la materia prima para la elaboración de los

bloques fue menor al utilizar la manzarina comparado con el costo de la materia prima que se requiere

para elaborar bloques multinutricionales con harinolina como principal fuente de proteína.

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Cave mencionar y destacar que toda esta información presentada ha servido como plataforma

para plantear el desarrollo de un aditivo liquido de levaduras vivas, ayudando de una manera

significativa en la reducción de la mano de obra que se requiere para desarrollarlo y llevarlo a cabo.

Fermentación Sólida

La fermentación sólida (FS) puede ser definida como un cultivo de microorganismos adheridos

a un soporte sólido poroso y humedecido en el cual el medio líquido está extendido en una capa muy

fina en contacto con una interface aérea. Las bacterias, levaduras y hongos son los microorganismos

que pueden crecer en la fermentación sólida, pero la mayoría de las investigaciones se llevan a cabo

con hongos filamentosos. El crecimiento en forma de micelio y su tolerancia a bajas actividades de agua

y condiciones de alta osmolaridad hacen que los hongos sean la microflora natural más adecuada para

la fermentación sólida (Hesseltine, 1972).

Pandey et al., (2001) define como fermentación en estado sólido al crecimiento de

microorganismos en un material sólido y húmedo, siendo el material sólido la fuente energética, el

sustrato también puede estar formado por un material sólido e inerte y húmedo, al cual se le adiciona

una fuente energética.

En la fermentación en estado sólido, generalmente no se requiere agregar agua si el sustrato

tiene un contenido alto de humedad (70 a 80%) (Pandey et al., 2001) y no necesariamente se tiene que

inocular con alguna especie de microorganismo, si existe la posibilidad de potencializar el crecimiento

de algunas de las especies microbianas de las que se encuentran de manera natural en los sustratos;

algunos de estos tienen una amplia diversidad de microorganismos, en este caso se tiene un sistema

heterogéneo. El modelo de crecimiento miceliar da una ventaja adicional a los hongos filamentosos

sobre los microorganismos unicelulares en la colonización de la matriz sólida y en la utilización de los

nutrientes del medio de cultivo. El modelo básico de crecimiento de los hongos es una combinación del

20

crecimiento apical con la generación de nuevas hifas por ramificación. Mientras que el crecimiento

apical se lleva a cabo de manera lineal, la ramificación se lleva a cabo de manera exponencial y como

resultado se logra una alta velocidad de crecimiento y una gran capacidad de cubrir eficientemente la

superficie de cultivo (Valiño et al., 2002).

La estructura de la pared celular unida al crecimiento por las puntas y la ramificación da a los

hongos una estructura sólida y firme que les permite penetrar en el interior de la matriz sólida. Las

enzimas hidrolíticas son excretadas por las puntas de las hifas sin que se diluyan como en el caso de la

fermentación líquida lo que hace la acción de las enzimas hidrolíticas sea eficiente y les permite

penetrar en la mayoría de los substratos sólidos, lo que aumenta la disponibilidad de los nutrientes del

interior de los substratos (Raimbault, 1998).

Existe un gran interés en la utilización de S. cerevisiae para transformar desechos

agroindustriales en productos bioquímicos de valor comercial, por medio de la fermentación sólida (FS),

porque se ha encontrado que durante la FS se manifiestan características fisiológicas diferentes en los

microorganismos en comparación con la Fermentación liquida (FL). Entre los productos comerciales

más importantes, se encuentran algunas enzimas que son excretadas al medio y cuya producción por

FL se presenta en forma muy disminuida debido a los fenómenos de represión catabólica (Ramesh y

Lonsane, 1991; Solís-Pereira et al., 1993). A veces, las enzimas producidas por FS tienen

características modificadas, como un aumento en su termo resistencia, menores tiempos de producción

y mayor actividad (Grajek y Gervais, 1987; Pandey et al., 1992; Acuña-Argüelles et al., 1995).

Los efectos que se derivan de la utilización de FS sobre los microorganismos son múltiples

como modificaciones en el transporte de azúcares, la composición de la pared, la membrana celular y

en la actividad enzimática (Grajek y Gervais, 1987; Pandey et al., 1992). Mientras que las bacterias y

las levaduras requieren de alta actividad de agua (A, > 0.98), los hongos filamentosos pueden crecer

21

con valores de Aw tan bajos como 0.85, y por esta razón, son microorganismos muy bien adaptados

para la fermentación sólida sugiere incluso que un bajo nivel de Aw favorece la germinación y el

crecimiento miceliar de los hongos (Raimbault, 1998). De acuerdo con Raimbault, (1998) el soporte de

la fermentación sólida debe cumplir con varios requerimientos como son: Poseer una matriz porosa que

puede ser biodegradable o inerte, y requiere presentar una gran superficie de área por volumen dentro

del rango de 103 o 106 cm2/cm3 que permita el crecimiento microbiano en la interface sólido-líquido.

Debe absorber agua en una o varias veces su propio peso con una actividad de agua relativamente

grande en la interface sólido-líquido para poder permitir una alta velocidad de los procesos bioquímicos.

Fermentación Semi-Sólida

Este tipo de fermentación, utilizada básicamente para hongos, el microorganismo se desarrolla

en la superficie húmeda de un material sólido, el cual generalmente es algún grano de cereal

procesado, aunque se han realizado intentos para utilizar materiales de desecho. Esto permite al hongo

crecer en condiciones similares a las encontradas en la naturaleza; las esporas, los propágulos

infectivos mediante los cuales el hongo sobrevive e infecta insectos, son producidas en el aire. Aunque

las fermentaciones semi sólidas son relativamente fáciles de desarrollar en pequeña escala, el escalado

de las mismas a las proporciones necesarias para productos comerciales es bastante difícil (Taborsky,

1992).

En el caso de los hongos entomopatógenos, los países en vías de desarrollo han aplicado

métodos de fermentación en sustrato sólido, pero estos presentan muchas restricciones para la

producción a nivel comercial. Por un lado, el escalado se dificulta por problemas asociados con la

esterilización del sustrato, intercambio gaseoso, control de la temperatura, mantenimiento de cultivos

puros y recuperación del producto a partir del sustrato (Jackson, 1997).

22

Por otra parte, el tiempo de fermentación necesario para la esporulación en sustratos sólidos

generalmente requiere semanas, la cantidad de personal y la infraestructura grandes espacios físicos,

son factores que aumentan los costos de gran manera en este tipo de metodologías (Deshpande, 1999;

Jackson et al., 2004).

Fermentación Líquida

Se puede definir a la fermentación líquida (FL) o sumergida como un cultivo de células

microbianas dispersas en forma homogénea en un recipiente agitado que puede no ser aireado por

medios mecánicos. La forma de fermentación liquida más utilizada en los laboratorios de investigación

es el matraz agitado. El desarrollo de esta técnica ha sido importante porque ha permitido el cultivo de

organismos aeróbicos en condiciones homogéneas con una densidad moderada de la biomasa y ha

simplificado el estudio de la fisiología de los organismos. A su vez, el cultivo de suspensiones de células

en fermentadores agitados ha evolucionado a gran escala, pues no es raro ver fermentadores con

volúmenes superiores a 10 mil litros, en los cuales se producen todo tipo de compuestos derivados del

metabolismo microbiano (Jackson, 1997).

En estos sistemas, la agitación mecánica permite aumentar la transferencia del gas a la

biomasa de tres formas básicas: 1) Dispersa el gas en burbujas más pequeñas incrementando el área

de interface gas-líquido. 2) Incrementa el tiempo de contacto de líquido con las burbujas de gas. 3)

Disminuye el grueso de la capa estacionaria del líquido al aumentar la turbulencia del cultivo. Además,

la agitación mezcla el cultivo manteniéndolo homogéneo. Esto es particularmente importante para la

dispersión de la biomasa y la transferencia de calor (Henzler y Schedel, 1991).

Gran parte del gasto energético que debe realizarse en la FL está relacionado con la necesidad

de satisfacer la demanda de oxígeno en el crecimiento de los microorganismos, esto es muy claro en el

caso de Aspergillus niger, que es un organismo aeróbico estricto y necesita una alta tasa de

23

transferencia de oxígeno para mantener su crecimiento (Righelato, 1975; Solomon, 1975; Raimbault,

1998).

Principales Características de las Levaduras

Hubert (1987), Jones y Thomas (1987) mencionan que los cultivos de levaduras

Saccharomyces cerevisiae presentan varias características importantes: 1) No son patógenos, ni

tóxicos. 2) No se absorben en el tracto digestivo. 3) No dejan residuos en los tejidos animales. 4) Se

utilizan en pequeñas cantidades. 5) Proliferan in vivo e in vitro. 6) Promueven el crecimiento de

bacterias celulolíticas. 7) Son estables a temperaturas elevadas y 8) no causan mutación.

Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae

Las levaduras requieren para su óptimo crecimiento un ambiente acuoso, pH con rango de 3.5 a

5.0, posiblemente debido a que la actividad de las proteínas plasmáticas de las levaduras en los límites

de su membrana se da en estos valores de pH (Rose, 1987a); en estas condiciones de pH requerido

para el crecimiento de la levadura, la actividad bacteriana a nivel ruminal tendría consecuencias

detrimentales para los microorganismos y para los rumiantes; aunque las levaduras mantienen su

actividad metabólica y resisten el estrés físico asociado con el secado, calentamiento y exposición al pH

ácido en condiciones anaeróbicas (Dawson, 1993).

El rango de temperatura óptima para el crecimiento de las levaduras es de 28 a 30 ºC, con

sobrevivencia a 37 ºC por medio de la formación de ascosporas (Dengis et al., 1995), aunque a 39 ºC

que es la temperatura del ambiente ruminal, se ve afectado su crecimiento y disminución de la viabilidad

de la levadura a 48 h de incubación (Mendoza y Ricalde-Velasco, 1993).

Fermentación en Estado Sólido Comparada con la Fermentación Sólida Sumergida

Doelle et al., (1992) consideran como ventajas los siguientes aspectos: Los medios de cultivo

son simples, generalmente subproductos agrícolas que presentan un alto contenido de los nutrientes

24

necesarios. La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones,

especialmente de bacterias y levaduras. La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte,

lo que permite una alta transferencia de oxígeno al microorganismo. Pueden emplearse,

frecuentemente conidios como inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los

costos y las manipulaciones en la preparación del inóculo. Los conidios de los hongos que se producen

son mucho más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se aplican como

agente de biocontrol. El proceso de recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados

integralmente, como alimento animal ó productos para el control biológico. Los procesos se consideran

generalmente como tecnologías limpias.

Entre las principales desventajas se encuentran: Aplicación limitada para microorganismos que

crecen en contenidos bajos de humedad. La extracción del calor metabólico puede ser un problema,

sobre todo cuando se trabaja a gran escala y no se controla el proceso. La naturaleza sólida del

sustrato trae problemas al medir los parámetros de la fermentación tales como el pH, la temperatura, el

contenido de humedad y la concentración de sustrato y productos. Los procesos de transferencia de

masa son limitados por la difusión. Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el

escalado están muy poco caracterizados. El tiempo de fermentación es mayor debido a que

generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de crecimiento

(Gervais y Bazelin, 1986).

Optimización de Medios de Cultivo

Los medios de cultivo con fines industriales, en la mayoría de los casos han sido diseñados

mediante procedimientos empíricos de ensayo y error, no solo en la formulación del medio de cultivo,

sino también en las condiciones de operación. De cualquier manera es probable que el medio de cultivo

original pueda ser optimizado, modificando el porcentaje de los componentes del mismo y las materias

25

primas utilizadas, siendo factible en muchos casos optimizar un medio de tal manera que no sea

solamente más productivo, sino de menor o igual costo que el original, para lo cual se requiere del uso

de varios métodos de optimización (Maddox y Richert, 1977).

Un aspecto relevante en la optimización de un medio de cultivo de interés industrial no es sólo

el logro de una formulación racional del mismo, sino también la posible inclusión de materias primas de

bajo costo que hagan rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de subproductos de bajo valor

comercial que puedan sustituir componentes costosos y que puedan ser utilizados como fuentes de

carbono o nitrógeno (Dreyer et al., 2000).

La Manzarina en la Alimentación Animal

Becerra et al., (2008); Villagrán et al., (2009); Díaz-Plascencia et al., (2010b), coinciden en que

durante la FES del BM, el producto obtenido se ve enriquecido nutricionalmente y esto es resultado del

incrementó de la cantidad de levaduras con que se inoculó o de la potencialización del desarrollo

poblacional de aquellas que se encuentran presentes de manera natural en el BM; esto genera que en

el caso de la manzarina, se pueda asumir que además de ser un alimento rico en PV, sea un alimento

con un aporte importante de levaduras, debido a la alta cantidad de levaduras que contiene, ya sea

obtenida del bagazo de manzana o de manzana de desecho.

Una célula de levadura puede llegar a pesar 7.922x10-11g (Haddad y Lindegren, 1953), tomando

esto en cuenta, las levaduras pueden representar una fracción importante de la MS de la manzarina,

considerando que se han obtenido conteos de hasta 4.5x108 cel/mL (Rodríguez et al., 2006b), en base

seca esa cantidad puede ser hasta 10 veces mayor.

Uso de Levaduras en la Nutrición Animal

En la alimentación de rumiantes, las levaduras agregadas en la dieta influencian el metabolismo

microbiano ruminal (Miller-Webster et al., 2002); se ha reportado que al agregar cultivos de levaduras

26

en dietas con una alta proporción de concentrado, se puede reducir la producción de lactato e

incrementar un poco el pH en el rumen (Moya et al., 2008); incluso la adición de cultivos de levaduras

en la dieta de vaquillas lecheras puede incrementar la cantidad total de bacterias viables en el rumen

(Lazcano y Heinrichs, 2008).

Sin embargo, aún y cuando algunas levaduras son anaerobias facultativas, debido a su hábitat

natural aerobio (requieren oxígeno para el desarrollo normal de sus poblaciones), 24 h después de

suspender su suplementación en la dieta, la cantidad de levaduras viables en condiciones rumínales

puede ser indetectable (Kung et al., 1997). Cuando se incluyen en dietas para ganado lechero, las

vacas alimentadas muestran tendencias a tener menor concentración de ácidos grasos no esterificados

en la circulación sanguínea periférica, después del parto (AlIbrahim et al., 2008); tienden a incrementar

el porcentaje de grasa en la producción de leche (Putnam et al., 1997; Wang et al., 2001), tienden a

incrementar la producción de leche (Putnam et al.,, 1997; Wohlt et al., 1998; Wang et al., 2001;

Bitencourt et al., 2008), pueden incrementar el consumo de materia seca (Wohlt et al., 1998; Dann et

al., 2000) e incluso pueden disminuir la pérdida de condición corporal antes del parto (Robinson, 1997).

En no rumiantes, productos obtenidos de las levaduras, tienen un efecto benéfico en la ecología

microbiana del conducto gastrointestinal; disminuyen la población de clostridium perfringens (Hernot et

al., 2008), pueden capturar bacterias patógenas en el conducto gastrointestinal, esto debido a que esas

bacterias se unen a las paredes celulares de levaduras (Ganner et al., 2008), permitiendo tener un

efecto de modulación en la concentración microbiana en el intestino de cerdos destetados (Weedman et

al., 2008). Los cultivos vivos de levaduras permiten la estabilización de la micro flora normal del ciego

cuando se ofrecen en la dieta a cerdas gestantes y lactantes (Walker et al., 2008), existiendo la

posibilidad de incrementar su productividad, debido a incrementós en la ganancia de peso de las

camadas y reducción del número de días del destete al empadre exitoso (Kim et al., 2008).

27

Cultivos de Levadura en la Fermentación Ruminal

La inclusión de Sc en el alimento resulta en un aumento en el número total de bacterias

celulolíticas (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus), tanto in vitro como in vivo (Lila et al.,

2004). En otro estudio, Chaucheyras et al., (1995) observaron la estimulación del crecimiento del hongo

Neocallimastix frontalis. Los mismos autores reportaron que Sc parece estimular la utilización de lactato

por Megasfaera elsdenii y Staphylococcus ruminantium propiciando un aumento en la síntesis de

propionato (Lila et al., 2004). Estos últimos autores reportaron que la disminución del nivel de ácido

láctico resulta en un incremento del pH ruminal favoreciendo el crecimiento de las bacterias celulolíticas,

provocando un incremento en la digestión de la fibra y en la producción de ácidos grasos volátiles

(AGV). Por otra parte, el efecto de Sc sobre la concentración de nitrógeno amoniacal (N-NH3) es muy

variable, y se ha observado tanto una reducción como un incremento (Chaucheyras-Durand y Fonty,

2001).

Calsamiglia et al., (2005) han reportado evidencia del efecto de las levaduras sobre la

fermentación ruminal, mencionando que las levaduras y sus medios de cultivos pueden contener

nutrientes (ácidos orgánicos, vitaminas del grupo B, enzimas, aminoácidos, etc.) que estimulan el

crecimiento de las bacterias que digieren la celulosa y utilizan el ácido láctico. Estos mismos autores

reportaron que las levaduras vivas mediante su acción de respiración, consumen el oxígeno residual

disponible en el medio ruminal, protegiendo a las bacterias anaeróbicas estrictas. Newbold et al., (1996)

compararon varias cepas de Sc y observaron una fuerte correlación entre la capacidad de las levaduras

de consumir oxígeno y el crecimiento bacteriano, lo que les permitió concluir que el efecto de

estimulación de Sc sobre las bacterias ruminales podría atribuirse, al menos parcialmente, a su

actividad respiratoria.

28

En otro estudio, Yoon y Stern (1996) reportaron un mecanismo de acción para levaduras y

hongos mediante el cual el aumento del pH ruminal y la reducción de la disponibilidad de oxígeno

estimulan el incremento del crecimiento de las bacterias celulolíticas y por ende, se mejora la

degradabilidad de la fibra, disminuye el llenado ruminal, aumenta la ingestión de materia seca e

incrementa la producción, sin que mejore necesariamente la eficacia de utilización de nutrientes. Chung

et al., (2011) publicaron que la levadura también tiene un potencial de incrementar el proceso de

fermentación en el rumen de manera que disminuya la formación de gas metano (CH4). En otro estudio

propusieron que a través de una selección de cepas, puede ser posible desarrollar un producto de

levadura comercial que disminuya la producción de CH4 mientras minimiza la acidosis ruminal y

promueva la digestión de la fibra y fermentación ruminal (Newbold y Rode, 2006).

Temperatura Ambiental Sobre el Comportamiento Productivo

La temperatura ambiental es una de las variables más investigada y al mismo tiempo la más

utilizada como indicador de estrés. Mujibi et al., (2010) mencionaron que los efectos de la temperatura

ambiente sobre el rendimiento de los animales han sido estudiados ampliamente en el ganado bovino,

ya que los rumiantes dentro de su capacidad genética y fisiológica se ajustan continuamente para

enfrentar los cambios ambientales (Young et al., 1989).

Arias et al., (2008) indicaron que animales adaptados al medioambiente en el que viven,

experimentan estrés debido a las oscilaciones en las temperaturas o por una combinación de factores

negativos a los que se someten durante un corto período de tiempo, enfrentándolo a través de

modificaciones fisiológicas y de comportamiento. Por ende, en la mayoría de los casos la respuesta

revela cambios en los requerimientos de nutrientes, siendo las necesidades de agua y la energía los

más afectados cuando el ganado se encuentra fuera de la zona termo-neutral (Conrad, 1985). Arias et

al., (2008) demostraron que los cambios en los requerimientos, así como las estrategias adoptadas por

29

los animales para enfrentar el periodo de estrés, resultan en una disminución en su desempeño

productivo. Como parte del comportamiento de aclimatación del animal, el consumo de materia seca

(CMS) y el consumo diario de agua son directamente afectados, ya que ambos se relacionan con el

balance térmico e impactan la regulación de la temperatura corporal (Finch, 1986). Collin et al., (2001)

encontraron que en los animales dentro de su zona de termoneutralidad, la energía de la dieta es

utilizada para mantenimiento, crecimiento, producción, reproducción y actividad física; mientras que

abajo o arriba de esta zona la energía es reorientada a funciones para mantener la condición

homeotérmica y en algunos casos puede existir un aumento en la demanda de energía para estos

procesos.

Alimento Funcional

Se refiere a cualquier alimento en forma natural o procesada, que además de sus componentes

nutritivos contiene componentes adicionales que favorecen a la salud, la capacidad física y el estado

mental de una persona. El calificativo de funcional se relaciona con el concepto bromatológico de

"propiedad funcional", la característica de un alimento, en virtud de sus componentes químicos y de los

sistemas fisicoquímicos de su entorno, sin referencia a su valor nutritivo. En Europa se define alimento

funcional a "aquel que satisfactoriamente ha demostrado afectar benéficamente una o más funciones

específicas en el cuerpo, más allá de los efectos nutricionales adecuados en una forma que resulta

relevante para el estado de bienestar y salud o la reducción de riesgo de una enfermedad" (Roberfroid,

2000).

Producto Nutracéutico

Cualquier producto que pueda tener la consideración de alimento, parte de un alimento, capaz

de proporcionar beneficios saludables, incluidos la prevención y el tratamiento de enfermedades. El

concepto de alimento nutracéutico ha sido recientemente reconocido como "aquel suplemento dietético

30

que proporciona una forma concentrada de un agente presumiblemente bioactivo de un alimento,

presentado en una matriz no alimenticia y utilizado para incrementar la salud en dosis que exceden

aquellas que pudieran ser obtenidas del alimento normal" (Zeisel, 1999).

Probióticos en la Alimentación Animal

La dieta juega un rol importante en la salud animal y humana. En años recientes, se ha

dedicado especial atención a la producción de alimentos funcionales, teniendo como objetivo adicionar

microorganismos o compuestos benéficos dentro del organismo a través del consumo diario de la dieta

(Di Criscio et al., 2010).

Los probióticos han mostrado resultados prometedores en varias áreas de producción animal.

Un probiótico se define como un cultivo o cultivo mixto de microorganismos vivos que benefician al

hombre o animales mejorando las propiedades de la microflora autóctona del intestino (Champagne et

al., 2005). En otro estudio, se mencionó que los probióticos son microorganismos viables y benéficos

para el huésped cuando son consumidos en cantidades apropiadas, lo que se traduce en una mejor

producción y salud (Rook y Burnet, 2005). Los beneficios incluyen la inhibición de bacterias patógenas,

reducción de niveles de colesterol en suero, diarrea y cáncer intestinal; mejoran la tolerancia a la

lactosa, absorción de calcio, síntesis de vitaminas y estimulan el sistema inmune (Sánchez et al., 2009).

Bontempo et al., (2006) sugirieron posibles mecanismos que exhiben el papel benéfico en el animal,

indicando la colonización y adhesión en la mucosa intestinal (competencia por receptores), competencia

por nutrientes, producción de sustancias antimicrobiales y la estimulación de la mucosa y sistema

inmune.

Las levaduras como probióticos están ganando popularidad en los sistemas de engorda, ya que

son resistentes y con una alta viabilidad en condiciones ambientales adversas. Comitini et al., (2005)

reportaron que las levaduras ejercen actividad inhibitoria sobre diferentes cepas de bacterias

31

patógenas, desarrollando una actividad bactericida o bacteriostática debido a ciertos compuestos

metabólicos producidos por las mismas. Stephens et al., (2007) mencionaron que corderos alimentados

con probióticos disminuyeron la excreción de Escherichia coli O157:H7, los mismos autores publicaron

que la suplementación microbial directa en el alimento también redujo la cantidad de Salmonella ssp. en

bovinos productores de carne. La utilización de varias especies de probióticos favorecen el

incrementado de la ganancia diaria de peso (GDP) y eficiencia alimenticia de corderos y bovinos en

engorda durante el periodo inicial de la alimentación (Lema et al., 2001).

Mecanismos de Acción de las Levaduras en el Rumen

Aunque se han propuesto muchos mecanismos de acción que regulan la respuesta en los

rumiantes al incluir levaduras (Rose, 1987b; Martin y Nisbet, 1992; Wallace y Newbold, 1992; Dawson,

1993; Newbold et al., 1996), estos aún no quedan debidamente esclarecidos (Marrero, 2005). Uno de

los mecanismos propuesto es que las levaduras vivas a través de su respiración aerobia permiten

eliminar el pequeño porcentaje de oxigeno (1%) que entra al rumen cuando el animal ingiere los

alimentos, facilitando así el crecimiento de los microorganismos anaerobios más estrictos como

bacterias Celulolíticas y hongos (Rose, 1987a; Newbold et al., 1996). Otro mecanismo de acción

propuesta es que los cultivos de levaduras proveen vitaminas (específicamente tiamina), glucanos,

mananoproteínas y ácidos orgánicos que estimulan el crecimiento de microorganismos que digieren la

fibra y utilizan el ácido láctico (Nisbet y Martin, 1991; Chaucheyras et al., 1995; Oeztuerk et al., 2005).

Función de la Pared Celular de Levaduras en el Sistema Inmune

La pared celular de las levaduras contiene mananooligosacáridos (MOS) que pueden actuar

como receptores de alta afinidad compitiendo con los sitios de unión con las bacterias gram negativas,

las cuales poseen fimbrias específicas de manosa tipo 1 (Ofek et al., 1977), eliminando patógenos del

sistema digestivo y evitando la colonización y fijación del patógeno a la mucosa (Nocek et al., 2011).

32

Ferket, (2003) mencionó que este beneficio puede provocar una respuesta antigénica importante,

mejorando así la inmunidad humoral contra patógenos específicos a través de la presencia de

antígenos a las células inmune atenuada, además, este proceso puede suprimir la respuesta inmune

proinflamatoria, la cual es perjudicial para el comportamiento productivo. Otro componente

predominante de la pared celular de levaduras, es el β-1,3/1,6-glucano (β-glucano), el cual a mostrado

tener efecto inmunomodulatorio cuando las levaduras se usaron como suplementos en dietas para aves

(Chae et al., 2006), cerdos (Li et al., 2006) y animales acuáticos (Dalmo y Bogwald, 2008).

Pocos estudios han investigado el uso de los componentes de la pared celular de levaduras

sobre la función inmune en ganado lechero (Nocek et al., 2011). Sin embargo, Franklin et al., (2005)

observaron que la suplementación de vacas secas con MOS mejoró la respuesta inmune humoral

contra rotavirus e incrementaron la transferencia de anticuerpos para sus crías. Reed y Nagodawithana,

(1991) publicaron que los oligosacáridos presentes en la pared celular de Sc tales como glucanos y

mananos mejoran el sistema inmune e influyen en la interacción patógeno-huésped en el tracto

digestivo de animales y humanos. Animales de laboratorio, que consumieron glucanos de avena

mejoraron la función de neutrófilos incrementando la defensa contra patógenos (Murphy et al., 2007).

Esto puede ser particularmente importante en becerros jóvenes, que son comúnmente afectados por

protozoarios, virus y bacterias que causan enfermedades del tracto digestivo y algunos otros que

pueden dar lugar a infecciones sistémicas (Magalhâes et al., 2008). Así mismo, productos solubles de

cultivos de levaduras inhiben la actividad y crecimiento microbiano y modulan el sistema inmune

(Jensen et al., 2008).

Función de los Microminerales en el Sistema Inmune

Los minerales traza (MT) tales como el cobre (Cu), zinc (Zn), manganeso (Mn) y cobalto (Co)

son importantes para el correcto crecimiento, reproducción y respuesta inmune (Dorton et al., 2007), y

33

en muchos procesos fisiológicos de los animales (Spolders, 2007). Sin embargo, el impacto de la

suplementación de MT sobre la inmunidad en rumiantes ha sido variable (Spears, 2000). Este mismo

autor mencionó que la suplementación de oligoelementos se centró en un principio en prevenir signos

clínicos de deficiencia y la disminución de la producción, pero el rol de estos elementos en la inmunidad

ha sido enfatizado en estudios más recientes. La concentración de Zn y Cu en suero están

influenciados por muchos factores, tales como el tiempo de muestreo y el animal (Spolders et al., 2010).

Por otro lado, en los componentes de la sangre pueden influir muchos factores externos (clima, estación

del año y hora del día) y factores internos tales como la raza, edad y etapa de lactación (McDowell,

2003).

Las deficiencias de MT resultan en un daño en la tasa de crecimiento (Blackmon et al., 1967),

dificultades al parto (James et al., 1987), y disminución en la producción de células T, células B,

neutrófilos y macrófagos, propiciando un incremento en la susceptibilidad a infecciones (Chandra,

1999).

Zinc. Es un microelemento esencial para el buen funcionamiento de las células, también ha

sido identificado como un componente estructural, catalítico o regulador de más de 200 enzimas

involucradas en el metabolismo de proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos (Vallee y Auld, 1990),

siendo esencial para la integridad del sistema inmune (Hambridge et al., 1986), aunque su rol específico

sobre la respuesta inmune no está muy claro. Así mismo, Murray et al., (2000) mencionaron que es un

componente estructural de la enzima superóxido dismutasa (SOD), que ayuda a eliminar radicales libres

producto de varios procesos en el cuerpo. Por otro lado, la función protectora de Zn contra la formación

de radicales libres y estrés oxidativo, ha dado lugar a estudios sobre el efecto antioxidante de Zn y su

participación en el sistema de defensa antioxidante (De Oliveira et al., 2009). Al considerar la gran

variedad de enzimas que contienen Zn (lactato dehidrogenasa, fosfatasa alcalina, alcohol

34

dehidrogenasa, anhidrasa carbónica, superóxido dismutasa, carboxipeptidasas, málico dehidrogenasa,

etc.) resulta fácil suponer las graves consecuencias que ocasiona una deficiencia celular de Zn

(Kirchgessner et al., 1993).

Hambridge et al., (1986) publicaron que una deficiencia de Zn, daña la función inmune a través

de una reducción en la función de células T así como una disminución en la función de muchos

componentes claves del sistema inmune (timo y neutrófilos). Cymbaluk et al., (1986) mencionaron que

altas concentraciones de Zn obstaculizan la utilización de Cu y van acompañados de cojeras, anomalías

óseas y puede producir anemia (De Auer y Seawright, 1988).

Manganeso. Es otro antagonista potencial del Cu, por lo tanto, ingredientes con alto contenido

de Mn en la dieta pueden tener impacto negativo en la absorción de Cu (Hansen et al., 2009). Grace

(1994) publicó que la concentración de Mn de algunos forrajes puede contener más de 100 mg/kg de

MS, mientras que el contenido de Cu es típicamente bajo. El papel antagónico del Mn sobre el Cu es

limitado, sin embargo, estudios con ratas han mostrado una interacción complicada entre el efecto de

Mn en la dieta (10 a 50 mg/kg de MS) y Cu (<1 a 6 mg/kg de MS) sobre índices de niveles de fierro (Fe)

en suero sanguíneo (Reeves et al., 2004). Hidiroglow (1979) menciono que el Mn se absorbe

pobremente (1 % o menos) en dietas de rumiantes. En otro estudio, mencionaron que los factores

dietéticos que pueden influir en la biodisponibilidad de Mn han recibido poca atención, probablemente

porque la deficiencia no es considerada como problema principal en rumiantes (Van Bruwaene et al.,

1984). Por otro lado, la limitada evidencia sugiere que dietas altas en calcio y fosforo puede reducir la

biodisponibilidad de Mn (Hidiroglow, 1979).

Cobre. Es un elemento esencial en la nutrición animal, y participa en muchos procesos

biológicos del organismo, la mayoría relacionados con actividades enzimáticas (Grace, 1994). Así

mismo, Swenson y Reece (1993) publicaron que forma parte integral del sistema citocromo, de enzimas

35

Cu-superóxido dismutasa (CuSOD), CuZn-superóxido dismutasa (CuZnSOD), ceruloplasmina (Cp),

citocromo oxidasa, tirosinasa (polifelin oxidasa), ácido ascórbico oxidasa, monoamina oxidasa

plasmática. Spears (2000) mencionó que en bovinos y otras especies se ha documentado que el Cu

ejerce efecto sobre el sistema inmune. En otro estudio, se encontró que la habilidad fagocitica de

neutrófilos se incrementó al doble cuando administraron Cu a terneros con deficiencia (Jones y Suttle,

1981). Prohaska y Failla (1993) reportaron que la inmunidad humoral y células mediadoras fueron

dramáticamente disminuidas en ratas y ratones con deficiencia de Cu. Así también, la respuesta inmune

humoral de novillos en crecimiento fue mejorada cuando fueron inyectados con 90 mg de Cu antes del

destete y alimentados con 7.5 mg Cu/kg de MS durante la fase de crecimiento (Ward y Spears, 1999).

La deficiencia de Cu en bovinos es un desorden bastante común en todo el mundo y sus dietas

son regularmente altas en la concentración de Cu (arriba de 35 mg/kg de MS), el máximo nivel de

suplementación de Cu para ganado lo estableció la Unión Europea (Council Regulation (EC) No.

1334/2003/EC), muy por encima de los requerimientos fisiológicos generales (10 mg/kg MS; NRC,

1996). Kendall et al., (2001) comentaron que el margen relativamente amplio en la suplementación de

Cu es porque en bovinos, y en rumiantes en general, los requerimientos nutricionales no dependen

exclusivamente de la concentración de Cu en la dieta, si no que estriban altamente de la

suplementación y disponibilidad del Cu, lo cual justifica la interferencia con antagonistas, principalmente

molibdeno (Mo), azufre (S), fierro (Fe) y Zn. Hansen et al., (2009) publicaron que la deficiencia de Cu en

ganado productor de carne, puede presentarse en forma de una disminución de crecimiento,

despigmentación del pelo y anemia. Estos signos puede ser explicados por la reducida actividad de

cuproenzimas tales como citocromo c oxidasa, tirosinasa y ceruloplasmina, que son importantes en la

producción de energía, melanina y metabolismo de Fe, respectivamente (NRC, 1996).

36

Actividad Antioxidante

La nutrición tiene un gran efecto sobre la salud y la inmunidad en los animales, las deficiencias

nutricionales perjudican la respuesta inmune y por lo tanto, incrementan la morbilidad y mortalidad

(Chew, 1995). Este mismo autor mencionó que los antioxidantes sirven para estabilizar los radicales

libres altamente reactivos, por lo que mantienen la integridad funcional y estructural de las células. Los

antioxidantes han sido agrupados en enzimáticos y no enzimáticos, y son las sustancias capaces de

controlar en el organismo la producción de radicales libres (RL) que se generan como consecuencia del

metabolismo aerobio, ya sea secuestrando RL o estabilizándolos (Halliwell y Whiteman, 2004).

Tremellen (2008) mencionó que para contrarrestar los RL existe en primera instancia el sistema

antioxidante enzimático, que incluye la seleno-enzima glutatión peroxidasa (GPx) que actúa

fundamentalmente reduciendo el peróxido de hidrogeno (H2O2), y la SOD que actúa sobre el anión

superóxido (O2-) transformándolo en un radical secundario (H2O2) para una posterior acción de la GPx.

La mayoría de las moléculas presentes en el organismo son químicamente estables, es decir,

tienen un número par de electrones en su orbital externo, pero existen otras cuyo número de electrones

es impar, estas sustancias químicas altamente inestables y reactivas se conocen como radicales libres

(Barquinero, 1992). Halliwell (1992) reportó que cuando un radical interactúa con una sustancia estable,

toma de ella un electrón cargando positivamente la molécula; así el compuesto estable se convierte en

un radical libre altamente agresivo, pudiendo generar más radicales, dando lugar a una reacción en

cadena. Por otra parte, el oxígeno aun siendo esencial para la vida, también es tóxico por ser una

sustancia oxidante ya que puede aceptar electrones desestabilizando a la molécula que lo pierde, por

tanto en el metabolismo aerobio se producen oxidantes denominados metabolitos oxigenados reactivos,

entre los que se encuentra el O2-, hidróxido (OH) y H2O2 (Ceballos et al., 1998).

37

El confinamiento y el estrés calórico pueden contribuir a incrementar los requerimientos de

antioxidante en los animales. Por lo que se ha motivado en realizar estudios en los que se ofrecen

suplementos antioxidantes a los animales, en la dieta o en forma parenteral, observándose que la

suplementación mejora la respuesta inmune y disminuye el estrés oxidativo, provocando una mayor

resistencia a enfermedades infecciosas y degenerativas (Chew, 1995). Así mismo, González-San José

et al., (2001) publicaron que a medida que un individuo envejece dicho balance está a favor de los

oxidantes, lo que hace de interés la necesidad de ingerir alimentos con antioxidantes para disminuirlos.

En otro estudio, mencionaron que la vitamina E es un antioxidante fenólico lípido soluble; por lo que su

actividad antioxidante se basa en la habilidad de donar un átomo de hidrógeno a radicales libres

(Yurttas et al., 2000).

Biometría Hemática en Rumiantes

En la práctica clínica de la Medicina Veterinaria los parámetros de los valores de biometría

hemática (BH) son una ayuda diagnóstica fundamental en el análisis y orientación del estado clínico de

un animal y en el seguimiento de un determinado hato; esta información es útil en los casos de control,

valoración de procesos de estabilidad enzoótica y el estado nutricional de los animales. Así mismo, la

BH es un examen de ayuda diagnóstica que en la evaluación clínica permite tomar decisiones

profilácticas y curativas. Barrio et al., (2003) mencionaron que la BH es la evaluación numérica y

descriptiva de los elementos celulares de la sangre (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas);

constituyendo una de las pruebas más solicitadas en el laboratorio clínico, ya que acompaña casi todos

los protocolos de diagnóstico con precisión, exactitud y rapidez.

Los componentes celulares sanguíneos, transportan oxígeno (glóbulos rojos o eritrocitos),

protegen de organismos extraños y antígenos (glóbulos blancos o leucocitos), fagocitando, capturando

o destruyéndolos, e inician la coagulación (Aiello y Mays, 2000). Estos mismos autores, mencionaron

38

que las células sanguíneas se dividen en leucocitos (fagocitos y linfocitos); los fagocitos se subdividen

en monocitos (mononucleares) y granulocitos (polimorfonucleares), así mismo, estos últimos se

subdividen en neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Por otro lado, los linfocitos son glóbulos blancos

responsables de la inmunidad humoral y celular, su producción se origina en la medula ósea. En otro

estudio, Aiello y Mays (2000) reportaron que los análisis hematológicos muestran las cantidades de los

elementos celulares; su evaluación permite determinar problemas de salud, inflamación de tejidos o

funciones proliferativas de la medula ósea.

Digestibilidad y Fermentación de los Alimentos en el Rumen

Por algunos años, los microbiólogos y nutriólogos de rumiantes se han interesado en la

manipulación del ecosistema microbial del rumen para mejorar la eficiencia en producción (Callaway y

Martin, 1997). La adición de extractos de Aspegillus oryzae y cultivos de Sc en la dieta de rumiantes

mejoran la digestibilidad de MS, proteína cruda (PC) y hemicelulosa; aumentando el número de

bacterias en el rumen, disminuyendo la concentración de lactato e incrementado la producción de leche

en vacas frescas (Gomez-Alarcon et al., 1990). Sin embargo, la respuesta a la suplementación con

cultivos de levaduras u hongos han sido variables (Martin y Nisbet, 1992). Estudios previos (Newbold et

al., 1996) han mostrado que el cultivo de levadura incrementa el número de bacterias celulolíticas en el

rumen, y en algunos casos incrementan la degradación de celulosa. Por otra parte, los microorganismos

que se adhieren a la digesta, representan más del 75 % de la microflora total del rumen, y Sc estimula

el crecimiento principalmente de F. succinogenes, R. albus y R. flavefaciens siendo las más activas en

la degradación de la fibra (Chaucheyras-Duran y Fonty, 2001). Así también, otros autores han utilizado

la levadura Sc como aditivo en dietas fibrosas para rumiantes produciendo mejoras en la eficiencia de

utilización y disponibilidad de los nutrientes (Newbold et al., 1998) e incrementos en la digestión ruminal

39

de la MS, materia orgánica y FDN, tanto in vivo como in vitro, así también, en la degradabilidad de FDA

y nitrógeno (Biricik y Turkman, 2001).

Producción de Gas y Perfiles de AGV en el Rumen

Se conoce que la cuantificación de la producción de gas en fermentaciones in vitro se utiliza

para determinar la digestibilidad y la cinética de la fermentación ruminal de los alimentos (Theodorou et

al., 1994), lo que unido a las ecuaciones de regresión múltiple y los componentes nutricionales del

sustrato (Noguera et al., 2004) propician con bastante precisión la estimación de la degradabilidad in

vivo y la digestibilidad aparente de la MS de forrajes (Blümmel et al., 1997); ajustando los perfiles

acumulados de gas a una ecuación apropiada que permita resumir la información cinética (Groot et al.,

1996). Por otro lado, la energía para el crecimiento microbiano se deriva de la fermentación de los

carbohidratos, principalmente almidón y celulosa, cuya digestión anaerobia produce AGV, succinato,

lactato, etanol, dióxido de carbono (CO2), CH4 y trazas de hidrógeno (H2); sin embargo, estos también

aportan esqueletos de carbono esenciales para la síntesis de biomasa microbiana (Opatpatanakit et al.,

1994). En otro estudio (Getachew et al., 1998) reportaron que la producción de gas es generada

principalmente cuando el sustrato es fermentado hasta acetato y butirato, produciéndose propionato

únicamente desde la neutralización del ácido y por consiguiente, es de menor cantidad. Por otra parte,

los microorganismos ruminales son muy sensibles a cambios en el pH y la mayoría prefieren un rango

entre 6.5 a 6.8. Grant y Mertens (1992) comentaron que las bacterias celulolíticas, en particular, son

más sensibles a bajos pH que las amilolíticas. Así mismo, Hoover et al., (1984) demostraron que un pH

alto (7.5) o bajo (5.5) compromete severamente la digestión de la fibra.

Noguera et al., (2004) reportaron que la técnica de producción de gas permite detectar

diferencias entre sustratos generados por su madurez, condiciones de crecimiento, especie o cultivo y

métodos de preservación.

41

RESUMEN

Con el objetivo de evaluar dos sustratos para la elaboración de un inoculante para raciones a

base de levaduras, fueron utilizadas dos cepas de levaduras mediante fermentación solida sumergida

(cepa A, levadura comercial del genero Saccharomyces cerevisiae y cepa D, levadura del genero

Kluyveromyces lactis, obtenida del bagazo de manzana) bajo condiciones aeróbicas utilizando

oxigenadores en un medio de cultivo liquido. Los tratamientos usados fueron: t1) 200 mL manzana

molida (MA) + 1 g levadura A; t2) 132 mL manzana molida (MA) + 34 g melaza (ME) 1 g levadura A; t3)

66 mL manzana molida (MA) + 66 g melaza (ME) + 1 g levadura A; t4) 100 g melaza (ME) + 1 g

levadura A; t5) 200 mL manzana molida (MA) + 1 g levadura D; t6) 132 mL manzana molida (MA) + 34 g

melaza (ME) + 1 g levadura D; t7) 66 mL manzana molida (MA) + 66 g melaza (ME) + 1 g levadura D;

t8) 100 g melaza (ME) + 1 g levadura D. Todos los tratamientos contaron con la adición de 1.2% de

Urea, 0.2% de sulfato de amonio, 0.5% de suplemento mineral aforando a 1,000 mL con agua destilada

en matraces de vidrio con 5 repeticiones por tratamiento y diferentes tiempos de muestreo (0, 12, 24, 48

y 96 horas). Las variables evaluadas fueron: pH, temperatura, azucares solubles, conteos de levaduras,

nitrógeno amoniacal y ácido láctico. Se utilizó un diseño con arreglo factorial 2x4 en parcelas divididas.

Los resultados mostraron que el pH tuvo diferente comportamiento entre sustratos y levaduras

(P<0.01). La temperatura se incrementó (P<0.01) de la h 0 a la h 12 en todos los sustratos. El nitrógeno

amoniacal aumentó en el t4 (P<0.01) entre sustratos y levaduras. El ácido láctico reporto los niveles

más bajos en el t1 (P<0.01) entre sustrato y levaduras. Los azúcares solubles mostraron una perdida

similar (P<0.01) entre sustratos y tiempo. El conteo total de levaduras fue (P<0.01) sobresaliendo el

sustrato 4, con la levadura D, con valor de 2.8x109± 0.00 cel/mL a la h 48, en tanto que para la levadura

A, el mayor valor fue de 9.6x108±0.02 cel/mL en t4 a la h 96. Se concluye que el uso de melaza como

42

sustrato, favorece el crecimiento de levaduras especialmente de la cepa D de origen K. lactis, a las 24

horas de fermentación durante la preparación de un inoculante para raciones.

43

MATERIALES Y MÉTODOS

Localización del Área de Trabajo

El estudio se llevó a cabo en laboratorio de nutrición de la Facultad de Zootecnia y Ecología de

la Universidad Autónoma de Chihuahua, ubicada en el km 1 del Periférico Francisco R. Almada de la

ciudad de Chihuahua; latitud norte 28º 35´, longitud oeste 106º 04´, con una altitud de 1595 m.s.n.m.;

tiene una temperatura media anual de 17 ºC (Álvarez, 1992).

Material y Equipo Experimental

El material utilizado para este experimento fue: manzana de desecho molida, melaza de caña,

urea, sulfato de amonio, premezcla de minerales y vitaminas, agua destilada, levadura A y levadura D,

picadora estacionaria, balanza analítica, matraces Erlenmeyer de 1,000 mL (Kimax)®, bombas

oxigenadoras portátiles mangueras y conexiones de plástico, envases de plástico de 10 mL,

potenciómetro de mesa (HANNA)®, microscopio, cámara de neubauerMR, refractómetro HI 96801

(HANNA)®, termómetro digital (TAYLOR) ® y espectrofotómetro Coleman Junior® II modelo 6|20

Tratamientos

Para la realización de este estudio se prepararon cuatro combinaciones con los dos sustratos

dando origen a ocho tratamientos con una levadura comercial, A; del género Saccharomyces

cerevisiae, y una cepa de levadura de manzana, D; del género Kluyveromyces lactis, utilizando la FSS,

(Cuadro 1 y 2). Todos los tratamientos contaron con la adición de 1.2 g de urea, 0.2 g de sulfato de

amonio, 0.5 g de premezcla de vitaminas y minerales traza y se aforo a 1,000 mL con agua destilada en

matraces de vidrio.

44

Cuadro 1. Diseño de tratamientos con dos sustratos y diferentes combinaciones con la Levadura A.

Lev. A

Ingredientes %

T1 T2 T3 T4

Manzana molida (g) 20 200 132 66 0

Melaza de caña (g) 10 0 34 66 100

Lev. A (g) 0.1 1 1 1 1

Urea (g) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

Minerales (g) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Sulfato de amonio (g) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Agua destilada (mL) CBP 797.1 831.1 865.1 897.1

TOTAL mL 1000 1000 1000 1000

45

Cuadro 2. Diseño de tratamientos con dos sustratos y diferentes combinaciones con la Levadura D.

Lev. D

Ingredientes %

T1 T2 T3 T4

Manzana molida (g) 20 200 132 66 0

Melaza de caña (g) 10 0 34 66 100

Lev. D (g) 0.1 1 1 1 1

Urea (g) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

Minerales (g) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Sulfato de amonio (g) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Agua destilada mL CBP 797.1 831.1 865.1 897.1

TOTAL mL 1000 1000 1000 1000

46

Sus combinaciones fueron evaluadas en 40 matraces Erlenmeyer de 1,000 mL, cada

tratamiento constó de 5 repeticiones, a cada matraz se le adaptó un oxigenador portátil con la finalidad

de suministrar el oxigeno necesario para favorecer el crecimiento de las levaduras. Durante el periodo

de fermentación fueron tomadas 5 muestras por sustrato en diferentes horas (h), (0, 12, 24, 48 y 96 h).

Variables Medidas

pH

Se determinó de manera directa con un potenciómetro digital de una precisión de ±0.1

unidades, tomando como base la metodología descrita por Rodríguez et al., (2001a).

Temperatura (T)

Se midió directamente con la ayuda de un termómetro digital de una precisión de ±0.1.

Azucares Solubles (AS)

Se tomó la lectura con la ayuda de un refractómetro digital de una precisión de ±0.2. Para este

análisis fueron utilizadas 2 gotas de muestras para su lectura directa y se utilizaron 3 gotas de agua

destilada para su calibración.

Conteo de Levaduras (CL)

Para este análisis se tomó como base, la metodología descrita por (Díaz, 2006). Se realizó en

las muestras de la h 0, 12, 24, 48 y 96. Se tomaron las muestras de 30 mL de cada matraz, fueron

depositadas en frascos de plástico con tapa de 50 mL; en cada muestra, se agregaron dos gotas de

solución de formalina al 10% para preservarla en refrigeración hasta realizar el conteo. El CL se realizó

por microscopía; con una pipeta de volumen variable con un rango de 100 a 1000 µl y puntas

desechables se tomó 1 mL de muestra líquida y se preparó una dilución serial utilizando solución salina

como diluyente; con una pipeta de volumen variable con un rango de 0.5 a 10 µl y puntas desechables;

47

se tomaron 10 µl de la dilución de cada muestra, y se colocaron en un hematocímetro (cámara de

Neubauer) para el conteo.

La cámara de Neubauer se lavó con agua destilada después de cada CL. La cantidad de

células identificadas como levaduras, de manera individual o en gemación se contaron en las cuatro

esquinas del hematocímetro (4 cuadrantes de 1 mm2 cada uno; (Figura 1). Se calculó el promedio de

células de levaduras (cel) por cuadrante y se calculó la cantidad de células por mililitro (cel/mL) para su

análisis estadístico, los valores fueron convertidos a logaritmo base 10 (Log10 cel/mL).

Nitrógeno Amoniacal (N-NH3)

De las muestras líquidas obtenidas de las h 0, 12, 24, 48 y 96 se tomaron 30 mL de cada

muestra, se colocaron en frascos de plástico de 50 mL y se congelaron (-5 °C) para su conservación

hasta el momento de la determinación de N-NH3 las muestras se descongelaron a temperatura de

refrigeración, (4 °C) y la concentración de N-NH3 de las muestras líquidas se determinó por colorimetría

según el procedimiento de (Broderick y Kang, 1980).

La ecuación de predicción para calcular la concentración de N-NH3 en las muestras líquidas, se

obtuvo del análisis por triplicado de soluciones estándar con concentraciones de 0, 5, 10, 15, 20 y 25 µl

de N-NH3/mL; se utilizó H2O como blanco (estándar con concentración de 0 µl/mL). El procedimiento

para medir la absorbancia de las muestras líquidas diluidas, de las soluciones estándar y de los blancos

(0 µl/mL), se realizó por triplicado y consistió en lo siguiente: en tubos de ensayo se agrego 920 µg de

agua destilada y 80 µl de la muestra concentrada para completar 1 mL, se mezclaron en vórtice (Vortex

Genie II) posteriormente se tomaron 50 µl de la muestra diluida para cada repetición y se depositaron

en tubos de ensayo, a lo que se le agregaron 2.5 mL de fenol y se mezclo en un vórtice, posteriormente

se agrego 2 mL de hipoclorito y se mezclaron nuevamente, para el estándar o el blanco, se agrego 50

48

µl de agua destilada, 2.5 mL de fenol y 2 mL de hipoclorito, las soluciones obtenidas se mezclaron en

un vórtice y se incubaron por 5 min en baño de agua caliente (temperatura de 95~100 °C).

Las muestras se dejaron enfriar por 5 minutos a temperatura ambiente para después tomar la

lectura de la absorbancia del contenido de cada muestra, se midió a una longitud de onda de 630 nm;

previamente el valor de la absorbancia fue ajustado a 0 utilizando los blancos como referencia. Con los

resultados de la absorbancia de las muestras líquidas diluidas, la ecuación de predicción obtenida con

las soluciones estándar y el porcentaje de dilución de las muestras líquidas en agua, se calculó la

concentración de N-NH3 en milimolar por mililitro de muestra (mM/mL).

Ácido Láctico (AcL)

De las muestras líquidas obtenidas de la h 0, 12, 24, 48 y 96 se tomaron 30 mL de cada

muestra, se colocaron en frascos de plástico de 50 mL y se congelaron (-5 °C) para su conservación

hasta el momento de la determinación de AcL. Al momento de la determinación, las muestras se

descongelaron a temperatura de refrigeración (4 °C) y la concentración de AcL de las muestras líquidas

se determinó por colorimetría según el procedimiento de Taylor (1996). Como estándar se utilizaron

soluciones con una concentración de 5, 10, 15, 20 y 25 µl de AcL/mL y agua destilada como blanco (0

µl de AcL/mL). El análisis se realizó por triplicado, se agregaron 3 mL de H2SO4 concentrado y 0.5 mL

de la muestra diluida en tubos de ensayo, del estándar o del blanco, las soluciones obtenidas se

mezclaron en vórtice (Vortex Genie II) y se incubaron por 10 minutos en baño de agua caliente

(temperatura de 95~100 °C). Posteriormente, se agregaron 100 µl de solución de CuSO4 al 4% y 200 µl

de solución de 1.5% de p-fenilfenol en etanol al 95% en cada Celda; las soluciones obtenidas se

mezclaron en vórtice nuevamente y se dejaron reposar por al menos 30 minutos a temperatura

ambiente (no menos de 20 °C).

49

Figura 1. Cuadrícula de un hematocímetro (cámara de Neubauer). a, b, c y d, fueron los cuatro cuadrantes utilizados para el conteo de levaduras, su superficie suma un total de 4 mm2, el espacio entre un cubre objetos y la superficie de la cámara de Neubauer, utilizando los límites de cada cuadrante como guía tiene 0.1 mm3 de volumen.

50

La absorbancia del contenido de cada Celda se midió a una longitud de onda de 570 nm. Con la

concentración de AcL y la ecuación de predicción obtenida con las soluciones estándar y el porcentaje

de dilución de las muestras líquidas en agua, se calculó la concentración de AcL en milimolar por

mililitro de muestra (mM/mL).

Análisis Estadístico

El diseño para este experimento se hizo con un arreglo factorial con dos efectos principales,

considerando efectos fijos los niveles sustrato y levadura; el efecto aleatorio del matraz dentro de cada

tratamiento (parcela), el efecto de tiempo, el efecto de las interacciones de sustrato, levadura y tiempo,

para el último el efecto de la interacción doble factor sustrato y factor levadura; los datos se evaluaron

con el procedimiento (Proc Mixed) del programa SAS (2004), para un diseño al azar de 8 tratamientos

con arreglo factorial 4x2.

Modelo Estadístico

Yijkl = μ + Si + Lj + SLij + R(SLk) ij + R(S*L) ijk + Tl + S*Til + LTjl + SLTijl + εijkl

Donde:

Yijkl.- Es la variable de respuesta.

µ.- Es la media general.

Si.- Es el efecto del i-ésimo del sustrato.

Lj.- Es el efecto del j-ésimo nivel de levadura.

SLij.- Es el efecto de la interacción sustrato por levadura.

R(SLk) ij-. Es el efecto anidado de la repetición del i-ésimo nivel de sustrato y j-ésimo nivel de

levadura.

R(S*L) ijk.- Es el efecto anidado de la repetición dentro del i-ésimo nivel de sustrato por la

interacción del j-ésimo nivel de levadura.

51

Tl.- Es el efecto del I-ésimo tiempo de fermentación sobre la variable respuesta.

S*Til.- Es la interacción del sustrato por tiempo.

LTjl.- Es la interacción de levadura por tiempo.

SLTijl.- Es la interacción sustrato levadura y tiempo.

eijkl.- Es el error experimental.

52

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

pH

Esta variable mostró efecto (P<0.01) por efecto de levadura por hora con la levadura A y D

durante el proceso de fermentación; Según los valores estimados, de la h 0 a la h 96 de FSS, el pH con

la levadura A, incrementó su valor de manera gradual en el tiempo de 4.88 a 5.51±0.08 y la levadura D,

incrementó de 5.02 a 5.99 ±0.08. El incrementó de pH está relacionado a que los microorganismos

presentes durante el tiempo de fermentación, convierten los carbohidratos de fácil fermentación a

ácidos orgánicos como el AcL y acético fundamentalmente, que reducen el pH en el medio (Rodríguez

et al., 2001b) también está relacionado directamente con la producción de NH3 y con una menor

producción de ácidos orgánicos como lo reporto (Elías et al., 1990 y Morgan, 2003) con datos similares.

En la FSS de algunos sustratos, la disminución del pH está relacionada con el incremento de la

concentración de ácidos orgánicos; la producción de ácidos orgánicos la cual es resultado del consumo

de carbohidratos de fácil fermentación (Calderón et al., 2005). Considerando lo anterior puede

observarse en el caso de las levaduras A y D pudieron haber tenido bajos niveles de ácidos orgánicos e

incrementó en la producción de NH3 de la h 0 a las 24 h de fermentación, durante este periodo puede

haberse dado un incrementó en la concentración de aminoácidos. Los resultados son confirmados con

el análisis de concentración de NH3 y AcL.

Temperatura (T)

Esta variable presento un comportamiento (P<0.01), por efecto de la interacción sustrato por

levadura y tiempo, incrementando la temperatura de la h 0 a la h 12 en todos los sustratos con las

levaduras A y D posteriormente disminuyo la temperatura en los sustratos para mantenerse cerca de la

temperatura de incubación. El calor acumulado en los sustratos fermentados es el resultado de la

actividad metabólica de los microorganismos; la temperatura también puede ser afectada por la

53

conductividad del material biológico fermentado como lo menciona (Ibarra et al., 2002). En el proceso

de obtención de la manzarina, la temperatura interna tiende a mantenerse constante a pesar de los

cambios de temperatura ambiental; aun así, esta puede influenciar ligeramente la temperatura del

sustrato (Ruiz et al., 2002). En este estudio el incrementó de la temperatura podría deberse a una mejor

conductividad del calor; debido a la melaza en los medios de cultivo, permitiendo deducir por su

apariencia, que los sustratos tuvieron mejor conducción de calor, como sucede con polvos de uso

industrial (Peña et al., 2002).

Azucares Solubles (AS)

Esta variable mostró un comportamiento (P<0.01) por efecto de la interacción sustrato por

levadura y tiempo, indicando que la disminución en los azucares fue distinto entre sustratos. El

comportamiento de los azucares en la fermentación fue distinto por sustratos, esto coincide con la

producción de levaduras, en donde se muestra una clara apreciación de cómo los azucares juegan un

papel importante en la producción de levaduras; el sustrato melaza manzana también presento un

crecimiento de levaduras favorable pero el sustrato melaza contiene la mayor cantidad de azucares

disponibles para las levaduras, por lo que se considera un excelente sustrato para producir levaduras.

Este mismo comportamiento está muy ligado en la misma trayectoria que siguió el ácido láctico. Es

importante destacar que las tasas específicas de crecimiento y los rendimientos de las levaduras

encontrados en este estudio, se encuentran dentro de los valores reportados por los investigadores

(Kosaric et al., 1989; Lyutskanov et al., 1990; Ferrer et al., 1996), quienes en sus experimentos de

producción de levaduras obtuvieron datos similares a este experimento.


Se encontró efecto (P<0.01) por efecto de la interacción sustrato por levadura y tiempo, esto

indica que hubo diferencias en la cantidad de levaduras y su comportamiento fue en aumento en los

54

distintos sustratos con las diferentes levaduras A y D en los valores estimados, de la h 0 a la h 96 de la

FSS mostrando una mayor producción de levaduras en el sustrato melaza con ambas levaduras. La

concentración más alta de levaduras se observó en el sustrato 4 que contiene 100% melaza. La

levadura A, reporto una producción de 9.6x108±0.02 cel/mL y la levadura D con el mismo sustrato

reporto una producción de 2.2x109±0.03 cel/mL siendo esta, la ultima, la mejor opción para producir

levaduras. En este caso las levaduras son más favorecidas en el NNP que fue aportado por la urea y el

sulfato de amonio, datos similares lo reportaron (Elías et al., 1990; Becerra et al., 2008; Díaz-Plascencia

et al., 2010b) en trabajos similares. El aumento en la calidad nutritiva de algunos sustratos fermentados,

se puede atribuir en gran parte al incrementó de la población de levaduras, es conocido desde hace

décadas que su valor proteico es alto y debido a esto, como concentrado, las levaduras pueden ser

comparables a la pasta de soya, aun y cuando su contenido de metionina es bajo (Klose y Fevold,

1945). En otros estudios se ha demostrado que la melaza y la combinación de manzana expuesta a

FSS específicamente con levaduras, mejora su calidad nutritiva (Hang et al., 1981; Joshi y Sandhu,

1996) en estudios similares donde usaron la melaza y bagazo de manzana.


En esta variable se encontró efecto (P<0.01) por efecto de la interacción sustrato por levadura y

tiempo entre sustratos. El sustrato 4, que contenía el 100% melaza con la levadura A, mostró un

incrementó en la concentración de NH3 de la h0 a la h 12 con un valor de 4.25±0.01 a 5.15±0.03

mM/mL. Los sustratos 1, 2 y 3 mostraron una reducción gradual a partir de la h12 a la h 96 con las

diferentes levaduras. La urea añadida a los sustratos en procesos de FSS, es transformada a NH3 por

efecto de especies microbianas ureolíticas (Valiño et al., 2002; Calderón et al., 2005), si el sustrato tiene

un aporte energético bajo, los microorganismos no pueden incorporarlo en la formación de aminoácidos

para su crecimiento ó lo hacen en una proporción baja. Cuando se tiene un pH bajo, el NH3 producido

55

es retenido en el sustrato (Rodríguez et al., 2001b). El NH3 también puede producirse por actividad

desaminativa como lo reporta (Calderón et al., 2005). El NH3 puede ser utilizado por ciertos

microorganismos como forma de energía como resultado de esto, la cantidad de algunos

microorganismos presentes en los sustratos fermentados se puede incrementar (Valiño et al., 2002). La

reducción de NH3 con la levadura D puede estar relacionada a que las levaduras utilizaron el NH3 de

manera eficiente durante el proceso de fermentación al no presentar excesos en los diferentes

sustratos que pudieran alterar o detener la fermentación tal y como sucedió en el presente estudio

donde se aprecia que la levadura D consumió la totalidad del amoniaco del medio liquido en la h48.


Esta variable mostró significancia (P<0.01) por efecto de la interacción sustrato por levadura y

tiempo entre sustratos. El sustrato 1 que contiene 100% manzana reporto los niveles más bajos de AcL

con las levaduras A y D en comparación con los demás sustratos. Los sustratos 2, 3 y 4 mostraron un

incremento gradual en la producción de AcL con la levadura A en función al tiempo de la h 0 a la h96. El

aumento de AcL en las fermentaciones inhibe el crecimiento microbiano e induce a la muerte celular de

la levadura (Elías y Lezcano, 1993; Ludovico et al., 2001). Es conocido que la toxicidad del AcL

depende del pH en el sistema. A un pH bajo, el AcL presente se encuentra principalmente en forma no

disociada y puede entrar a la célula microbiana por difusión pasiva (Geros et al., 2000) en el citoplasma

se disocia debido al pH más neutro y se liberan los protones, bajando el pH del citoplasma, lo cual

interfiere con algunos senderos metabólicos (Schüller et al., 2004). El aumento del pH, coincide con la

disminución en la concentración de AcL (Cuadro 3 y 4). Esta disminución, pudo haber estado asociada

a una fermentación secundaria del AcL, formando otros ácidos orgánicos más débiles. La incorporación

de oxigeno por el movimiento del sustrato, elimina las condiciones de anaerobiosis y por lo tanto impide

la producción de AcL (Anrique y Viveros, 2002).

56

Cuadro 3. Medias (± EE) en la comparación de los diferentes sustratos con la levadura A

a, b, c, d, e Literales distintas como superíndice indican diferencia (P<0.01) entre tratamientos

Horas

Variable Sustratos Lev 0 12 24 48 96

1 A 3.8±0.00e 3.5±0.01d 3.6±0.01f 3.6±0.01d 6.0±0.85b

2 A 4.9±0.02c 4.6±0.01c 4.7±0.05d 4.7±0.05c 5.6±0.16c

pH 3 A 5.2±0.01b 4.8±0.03b 4.8±0.03c 4.8±0.03c 5.1±0.12e

4 A 5.5±0.01a 5.2±0.01a 5.2±0.03a 5.2±0.03b 5.1±0.07e

1 A 26.1±0.04a 26.6±0.16b 25.9±0.06b 25.9±0.06b 26.3±0.04a Temperatura 2 A 26.1±0.08a 27.0±0.00a 25.9±0.08b 25.9±0.08b 26.2±0.03a

°C 3 A 25.9±0.08b 27.1±0.06a 26.1±0.04a 26.1±0.04a 26.3±0.00a

4 A 26.5±0.07a 27.9±0.05a 26.1±0.10a 26.0±0.05a 26.5±0.04a

1 A 0.5±0.03f 0.4±0.06f 0.4±0.02e 0.4±0.02e 0.0±0.00d Azucares 2 A 3.1±0.05d 2.5±0.07e 2.2±0.03c 2.2±0.03c 1.3±0.07c (grbrix) 3 A 5.6±0.05c 4.0±0.04c 3.3±0.04b 3.3±0.04b 2.8±0.18b

4 A 8.0±0.17ª 5.5±0.05b 4.9±0.05a 4.9±0.05a 3.9±0.11a

1 A 9.1x107±0.08b 1.7x108±0.06b 2.3x108±0.00d 3.9x108±0.01d 5.1x108±0.04e Levaduras 2 A 1.1x108±0.03a 3.6x107±0.05c 3.2x108±0.04c 3.7x108±0.03d 5.1x108±0.01e (cel/mL) 3 A 1.1x108±0.04a 3.9x107±0.01c 3.8x108±0.01c 6.5x108±0.05c 7.5x108±0.00d

4 A 8.6x107±0.01b 3.7x107±0.02c 3.6x108±0.01c 7.7x108±0.00b 9.6x108±0.02b

1 A 3.0±0.01b 2.2±0.03c 1.7±0.06c 1.2±0.03b 0.0±.0.00c HN3 2 A 3.1±0.00b 3.0±0.02b 2.5±0.02b 1.2±0.01b 0.9±.0.00b

mM/mL 3 A 3.0±0.01b 3.4±0.02b 2.2±0.02b 1.0±0.00b 0.2±0.01b

4 A 4.2±0.01a 5.1±0.03a 3.2±0.00a 2.1±0.02a 1.2±0.03a

1 A 0.0±0.00d 0.0±0.00d 0.0±0.00d 1.9±0.02b 1.3±0.00b AcL 2 A 0.8±0.01d 0.9±0.05d 2.0±0.03b 3.0±0.00a 3.3±0.01a

mM/mL 3 A 1.6±0.00c 1.7±0.00c 1.8±0.00c 1.8±0.03b 1.9±0.17b

4 A 2.6±0.08b 3.2±0.23a 3.8±0.04a 4.0±0.01a 4.8±0.00a

57

Cuadro 4. Medias (± EE) en la comparación de los diferentes sustratos con la levadura D

Horas

Variable Sustratos Lev 0 12 24 48 96

1 D 4.0±0.01d 3.8±0.07c 3.4±0.04g 4.6±0.27c 4.7±0.21f

2 D 4.9±0.02c 4.8±0.01b 4.6±0.14e 5.5±0.10a 6.2±0.16a

pH 3 D 5.4±0.01a 5.3±0.00a 4.9±0.04b 5.4±0.09a 5.6±0.17c

4 D 5.6±0.00a 5.4±0.00a 5.0±0.01a 5.3±0.07b 5.3±0.12d

1 D 26.1±0.02a 27.1±0.03a 26.5±0.04a 26.58±0.04a 26.52±0.08a Temperatura 2 D 26.2±0.03a 26.9±0.05b 26.4±0.10a 26.40±0.06a 26.16±0.11a

°C 3 D 26.2±0.03a 26.9±0.09b 26.6±0.07a 26.48±0.05a 26.22±0.16a

4 D 26.4±0.00a 27.2±0.06a 26.7±0.09a 26.48±0.04a 26.48±0.09a

1 D 1.82±0.06e 0.60±0.05f 0.2±0.02e 0.0±0.00e 0.0±0.00d Azucares 2 D 5.22±0.13c 3.80±0.03d 1.9±0.12d 1.8±0.04d 1.5±0.05c (grbrix) 3 D 6.78±0.17b 5.32±0.04b 3.3±0.12b 3.1±0.02b 2.5±0.09b

4 D 8.40±0.24a 8.18±0.17a 4.1±0.05a 3.8±0.14b 3.5±0.02a

1 D 1.5x107±0.02c 2.0x108±0.04b 4.8x108±0.01b 6.7x108±0.00c 7.3x108±0.03d Levaduras 2 D 1.7x107±0.03c 2.6x108±0.01b 5.3x108±0.03b 8.1x108±0.01b 7.3x108±0.03d (cel/mL) 3 D 1.9x107±0.03c 4.1x108±0.02a 6.6x108±0.04b 1.1x109±0.02a 8.9x108±0.02c

4 D 1.7x107±0.01c 3.7x108±0.03a 1.5x109±0.04a 2.8x109±0.00a 2.2x109±0.03a

1 D 3.0±0.00b 2.8±0.01c 2.4±0.04b 1.0±0.00b 0.0±0.00c HN3 2 D 3.1±0.00b 2.5±0.01c 2.2±0.01b 1.2±0.00b 0.2±0.01b

mM/mL 3 D 3.0±0.01b 2.7±0.00c 2.6±0.00b 0.3±0.00c 0.0±0.00c

4 D 4.0±0.00a 3.4±0.00b 2.2±0.00b 0.1±0.02c 0.0±0.00c

1 D 0.0±0.00d 0.0±0.00d 0.0±0.00d 0.0±0.00c 0.0±0.00c AcL 2 D 2.8±0.15b 1.8±0.02c 1.0±0.00c 0.9±0.09c 0.0±0.00c

mM/mL 3 D 2.5±0.20b 1.8±0.00c 0.8±0.00d 0.2±0.00c 0.0±0.00c

4 D 3.3±0.11a 2.7±0.01b 1.1±0.00c 0.0±0.00c 0.0±0.00c

a, b, c, d, e Literales distintas como superíndice indican diferencia (P<0.01) entre tratamientos

58

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En el desarrollo de este inóculo se observó que la levadura D, Kluyevromyces lactis mostró la

mayor cantidad de levaduras con el sustrato 100% nivel de melaza a las 48 horas de fermentación. El

pH óptimo para el desarrollo de levaduras Kluyveromyces lactis fue de 5.30 a 5.65 con una temperatura

de 26 °C. La levadura D mostró mejores resultados en la reducción del ácido láctico y del amoniaco. En

la elaboración de este inoculó se recomienda no utilizar ninguna fuente de minerales y vitaminas

siempre y cuando el sustrato sea melaza ya que la melaza aporta minerales y vitaminas, al aportar más

minerales y vitaminas puede ocasionar un efecto antagónico que pueda afectar la fermentación.

60

RESUMEN

Con el objetivo de evaluar el comportamiento fermentativo in vitro de ocho cepas de levaduras

aisladas a partir de subproductos de manzana, fueron desarrollados ocho inóculos de levaduras con las

siguientes cepas 2, 9, 11 y 13 de Kluyveromyces lactis (Kl); 3 y 8 de Issatchenkia orientalis (Io); 4 y 6

de Saccharomyces cerevisae (Sc), para ser evaluados mediante la técnica de producción de gas in

vitro. Los ocho tratamientos consistieron de 0.2 g muestra de alimento + 10 mL líquido ruminal + 20 mL

saliva artificial y 1 mL de inóculo de las diferentes cepas. Los diferentes inóculos fueron evaluados en

120 frascos de vidrio de 50 mL, con 3 repeticiones por tratamiento y diferentes tiempos de muestreo

12, 24 y 48 h para las variables nitrógeno amoniacal (NH3), ácido láctico (AcL) y conteo de levaduras

(CL) 3, 6, 12, 24 y 48h para la producción de gas (PG). Los datos se evaluaron con el procedimiento

(Proc Mixed del SAS 9.0) para un diseño al azar de ocho tratamientos en parcelas divididas en el

tiempo. Los resultados mostraron efecto (P<0.01) de cepa y tiempo de fermentación en las variables

NH3, AL y CL. Los valores más bajos de NH3 fueron observados con la cepa Kl-2 y los más altos con las

cepas Io-3, Io-8 y Sc-6, con valores de 22.5, 24.8, 24.8 y 24.1 mM/mL, respectivamente. En el CL se

encontró efecto (P<0.01) con un mejor desempeño de las cepas Kl-2, Kl-9, Kl-11, Kl-13 y Sc-6 con

conteos celulares de 1.9, 1.3, 1.2, 1.1 y 1.0 x 107cel/mL, respectivamente a las 48h. Por lo tanto, se

concluye que la levadura K lactis mostró ser la cepa más efectiva para la fermentación ruminal con

mejor comportamiento en cuanto a mayor conteo de células y reducción de ácido láctico.

61



El estudio se llevó a cabo en laboratorio de nutrición animal de la Facultad de Zootecnia y

Ecología de la Universidad Autónoma de Chihuahua, ubicada en el km 1 del Periférico Francisco R.

Almada de la ciudad de Chihuahua; latitud norte 28º 35´, longitud oeste 106º 04´, con una altitud de

1595 m.s.n.m.; tiene una temperatura media anual de 17 ºC (Álvarez, 1992).


El material utilizado para este experimento fue: ocho cepas de levaduras obtenidas de la

fermentación del bagazo de manzana, melaza de caña, urea, sulfato de amonio, premezcla de

minerales y vitaminas, agua destilada, balanza analítica, matraces Erlenmeyer de 1,000 mL (Kimax)®,

bombas oxigenadoras portátiles, mangueras y conexiones de plástico, envases de plástico de 10 mL,

frascos de vidrio de 50 mL, malla de nylon®, potenciómetro de mesa (HANNA)®, microscopio, cámara

de NeubauerMR, refractómetro HI 96801(HANNA)®, termómetro digital (TAYLOR)®, espectrofotómetro

Coleman Junior® II modelo 6|20, Incubadora Shaker I2400, CO2 y tres vacas holstein en producción

fistuladas con promedio de 600 kg de peso vivo.

Material Biológico y Medios de Cultivo

Las ocho cepas de levaduras que se utilizaron para este trabajo fueron obtenidas a partir de la

fermentación en estado sólido de bagazo de manzana (BM), las cuales fueron identificadas a través de

la extracción y amplificación del ADNr 18S mediante la reacción en cadena a la polimerasa (PCR, por

sus siglas en ingles), en el laboratorio de transgénesis animal de la Facultad de Zootecnia y Ecología de

la Universidad Autónoma de Chihuahua. Para la identificación se realizó un cultivo de levaduras por

dilución seriada y se aislaron 16 colonias a las cuales se les extrajo ADN para amplificar una región del

ADNr 18S (752 pb). El producto de PCR obtenido se sometió a secuenciación y el análisis de las

62

secuencias se realizo con el programa Blast de la base de datos del National Center for Biotechnology

Information (NCBI). El análisis de las secuencias mostró que las levaduras correspondientes a las 16

colonias aisladas fueron: Saccharomyces cerevisae; Issatchenkia orientalis y Kluyveromyces lactis

(Villagrán et al., 2009). Las cepas utilizadas para este trabajo fueron K. lactis, cepas 2, 9, 11 y 13; I.

orientalis, cepas 3 y 8; S. cerevisae, cepas 4 y 6, todas obtenidas a partir de la fermentación en estado

sólido del BM.

Las cepas se mantuvieron viables mediante resiembras periódicas en cuñas y en cajas petri. El

medio que se utilizó fue Extracto de Malta a razón de 33.6 g/L y el tiempo de incubación fue de 48

horas a una temperatura de 30 °C. Posteriormente, se conservaron en refrigeración a una temperatura

de 4 °C.

Preparación de Inóculos

Se utilizaron ocho cepas de levaduras para la elaboración de ocho inóculos, todos contaron con

la adición de 100 g de melaza, 1 g de levadura obtenidas de las diferentes cepas, 1.2 g de urea, 0.2 g

de sulfato de amonio y 0.5 g de premezcla de vitaminas y minerales traza aforándose a 1,000 mL con

agua destilada y utilizando oxigenadores para cada matraz, el tiempo de fermentación para cada

inóculo fue de 96 h a una temperatura ambiente promedio de 20 °C. Una vez terminado el tiempo de

fermentación para cada uno de los inóculos, se procedió a realizar los conteos de levaduras, a lo que

posteriormente se realizaron diluciones de cada uno hasta ajustarlos a en 1.8x109 células viables/mL.

Tratamientos

Con las ocho cepas se prepararon ocho tratamientos: t1) 0.2 g de muestra + 10 mL líquido

ruminal + 20 mL saliva artificial y 1 mL inóculo cepa 2; t2) 0.2 g de muestra + 10 mL líquido ruminal + 20

mL saliva artificial y 1 mL inóculo cepa 9; t3) 0.2 g de muestra + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva

artificial y 1 mL inóculo cepa 11; t4) 0.2 g de muestra + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva artificial y 1

63

mL inóculo cepa 13; t5) 0.2 g muestra + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva artificial y 1 mL inóculo

cepa 3; t6) 0.2 g de muestra + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva artificial y 1 mL inóculo cepa 8; t7)

0.2 g de muestra + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva artificial y 1 mL inóculo cepa 4 y; t8) 0.2 g de

muestra + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva artificial y 1 mL inóculo cepa 6. Sus combinaciones

fueron evaluadas en 120 frascos de vidrio de 50 mL, con 3 repeticiones por tratamiento (t) y diferentes

horas (h) de muestreo 12, 24 y 48 h para las variables; conteos de levaduras (CL), nitrógeno amoniacal

(NH3) y ácido láctico (AcL); y 3, 6, 12, 24 y 48 h para la PG.

Variables Medidas



las mismas condiciones que se describen en la primer parte de este trabajo.


De las muestras líquidas obtenidas de la h 12, 24 y 48 se determinó por colorimetría según el

procedimiento de (Broderick y Kang, 1980) siguiendo los mismos procedimientos que se describen en la

primer parte de este trabajo.


De las muestras líquidas obtenidas de la h 12, 24 y 48 se determinó por colorimetría según el

procedimiento de (Taylor, 1996) siguiendo los mismos procedimientos que se describen en la primer

parte de este trabajo.

Producción de Gas In Vitro (PG)

El procedimiento de PG in vitro fue hecho de acuerdo a la técnica de Menke y Steingass (1988)

con algunas modificaciones hechas por (Muro, 2007). Este método es usado para determinar la

cantidad de gas producido para forrajes en un periodo de incubación de 96 h. La cantidad de gas

64

liberado está estrechamente relacionado con la degradabilidad del alimento. La preparación de la

muestra involucró el molido del sustrato en una malla de 1mm (Menke et al., 1979). Se secaron las

muestras a 105 ˚C por 8 horas. El medio ruminal in vitro estuvo formado por búferes de bicarbonato y

fosfato, un agente reductor, una fuente de nitrógeno, varios minerales y resazurina. El CO2 fue usado

durante la preparación del medio para asegurar un ambiente anaerobio en el tiempo de inoculación.

La solución A (micro mineral) está constituida por 13.2 g CaCl2.2H2O, 10.0 g MnCl2.4H2O, 1.0 g

CoCl2.6H2O, 8.0 g FeCl3.6H2O en 100 mL con agua destilada; la solución B (solución búfer) consta de

39.0 g NaHCO3 ó 35.0 g NaHCO3 + 4.0 g de (NH4) HCO3 en 1 litro con agua destilada; la solución C

(macro mineral) está constituida por 5.7 g Na2HPO4, 6.2 g KH2PO4, 0.6 g Mg SO4.7H2O en 1 litro con

agua destilada; solución resazurina (100 mg de resazurina) hecha en 100 mL con agua destilada; y la

solución reductora que consta de 4 mL 1N NaOH, 625 mg Na2S.9H2O, agregado a 95 mL de agua

destilada.

La incubación se llevó a cabo en frascos de vidrio de 50 mL; dentro de estos se colocó 0.2 g de

muestra, 10 mL de líquido ruminal y 20 mL de saliva artificial y 1 mL de levadura de los diferentes

inóculos por tratamiento.

Para la recolección del líquido de ruminal se utilizaron tres vacas Holstein en producción con un

peso promedio de 600 kg, fistulado en el saco dorsal del rumen y provisto con una cánula simple (Bar

Diamond, Inc). Las mismas se encontraban estabuladas en cubículos individuales y consumían una

dieta integral formada por grano de maíz, semilla de algodón, salvado de trigo, grasa animal, grasa de

sobre paso, gluten de maíz, harinolina, pasta de soya, melaza de caña, minerales traza, bicarbonato de

calcio, sal común, urea, ensilaje como forraje y alfalfa más agua a voluntad.

65

La composición química de la dieta consumida por las vacas fistuladas en (base seca) fue la

siguiente: MS, 61.13; PC, 17.80; FC, 21.87; Ceniza, 11.13, EE, 4.45 y ELN, 44.75 de acuerdo al

método de la AOAC, (2000).

El fluido ruminal se colectó 15 minutos antes de iniciar la prueba con la ayuda de una bomba de

vacío. La toma del fluido ruminal colectado de las vacas fue realizada en la mañana inmediatamente

antes de la alimentación, considerando que los microorganismos son menos activos pero más

consistentes en su composición y actividad (Menke y Steingass, 1988; Blümmel y Orskov, 1993).

Las muestras se trasladaron al laboratorio en un termo con capacidad para 1000 mL

herméticamente cerrado previamente atemperado y posteriormente se filtró a través de muselina. El

procedimiento se realizó bajo atmósfera de CO2 con el propósito de garantizar las condiciones de

anaerobiosis. Los frascos con muestra, líquido ruminal y saliva artificial se sellaron y se incubaron a 39

°C con agitación constante (68 rpm), protegiéndolos de la luz; el periodo de evaluación duró 48 h. La

presión interna de los frascos (ejercida por la PG) se midió con un transductor de presión a las 3, 6, 12,

24 y 48 h de incubación. Los valores de presión se convirtieron a volumen de producción de gas (PG en

mL) según Theodorou et al., (1994) la PG neta/h de cada muestra, se obtuvo de la diferencia de la PG

observada menos el promedio de PG del blanco. Los datos se expresaron en mililitros de PG por cada

0.2 g de materia seca (mL PG/0.2 g MS).

Parámetros de Fermentación Ruminal In Vitro (A, B, C)

Las soluciones A, B, C y resazurina se agregaron dentro de un matraz con agua destilada, el

cual se introdujo en un incubador rotatorio (Incubador Shaker I2400) a 39 ºC, posteriormente se le

agregó la solución reductora y se burbujeó CO2 a toda la mezcla hasta que el color de tornó de azul a

rosa y finalmente claro (transparente). El fluido ruminal previamente colectado fue filtrado a través de

una media de nylon y mezclado junto con la saliva artificial, la relación final saliva artificial: fluido ruminal

66

fue de 2:1. Es de mencionar que los parámetros A, B y C solo se utilizaron para la preparación de las

muestras, pero no se utilizaron en la interpretación de los resultados debido a que solo se busco ver el

efecto de degradación ruminal in vitro en el tiempo de este experimento.


Se realizó con un modelo mixto, utilizando como efectos fijos el tiempo y tipo de cepa (inóculo).

Como efecto aleatorio, se utilizó la repetición anidada dentro de cada tratamiento; los datos se

evaluaron con el procedimiento (Proc Mixed ) del programa SAS, (2004) para un diseño al azar de ocho

tratamientos en parcelas divididas en el tiempo.

Modelo Estadístico

Yiju = µ + Ci + R(Cij) + Tk + C*Tik + εijk

Donde:

Yijk.- Es la variable de respuesta.


Ci.- Es el efecto del i-ésimo nivel de cepa.

R(Cij).- Es de la repetición del i-ésimo nivel de cepa.

Tk.- Es el efecto del j-ésimo tiempo de fermentación sobre la variable de respuesta.

C*Tik.- Es el efecto de la interacción del i-ésimo nivel de cepa por tiempo.

eijk.- Es el error experimental.

67



Se encontró efecto (P<0.01) por la interacción tiempo por inóculo, esto indica que hubo

diferencias en la cantidad de levaduras con un incrementó en los distintos tratamientos en función al

tiempo. La concentración más alta de levaduras que se encontró en la producción de gas (PG) se

observó en el t1, con la cepa Kl-2 que sobresalió en todos los tiempos de muestreo, el t5 con la cepa lo-

3 y el t6 con la cepa lo-8 desaparecieron rápidamente del ambiente ruminal. Las levaduras de los

diferentes inóculos sometidas a la PG disminuyeron gradualmente a medida que transcurrió el tiempo

de fermentación lo cual coincide con resultados similares obtenidos por (Ingledew y Jones, 1982;

Arambel y Rung-Syin, 1987; Castillo, 2009) cuando estudiaron el crecimiento de la S. cerevisiae en

ambiente ruminal. Estos autores señalan que las levaduras son incapaces de mantener una población

productiva dentro del ambiente ruminal, ya que este contiene factores inhibitorios para su crecimiento

como la temperatura.

Los inóculos t1, t2, t3 y t4 con la levadura K. lactis y t8, con la levadura S. cerevisiae mostraron

tener una mayor población de levaduras en el rumen con respecto a los demás inóculos hasta la h48,

esto debido al aprovechamiento del ácido láctico como una fuente de energía para seguir viables y

seguir desarrollándose, lo que concuerda con otros trabajos realizados por Rodríguez, (2009) y Díaz-

Plascencia et al., (2010a). Los inóculos t5, t6 y t7 proporcionaron una concentración de levaduras

aceptables, pero de inmediato las mismas entran en fase de degradación, lo que corrobora lo planteado

por Williams et al., (1990). Sin embargo es de mencionar que el proceso de fermentación anaeróbica en

el rumen por parte de los microorganismos convierte a los substratos principalmente en carbohidratos y

proteínas, en proteína microbiana y otros productos finales de la fermentación como lo son los ácidos

68

grasos volátiles, bióxido de carbono (CO2), péptidos y aminoácidos entre otros (Henderickx y Martin,

1963; Mc Donald et al., 2002 y Dehority, 2003).


Se encontró efecto (P<0.01) por la interacción tiempo por inóculo, indicando diferente

comportamiento entre las cepas a través del tiempo de fermentación, este incrementó de tratamiento lo

cual fue más marcado en los tratamientos t5, t7 y t8. El nitrógeno amoniacal (N-NH3) constituye la

fuente principal de nitrógeno para los microorganismos ruminales, el cual puede suplir entre el 40 y el

100% de las necesidades de nitrógeno para la síntesis de proteína microbiana (Dewhurst et al., 2000).

Este efecto es dado por la urea añadida a los sustratos en los procesos de fermentación, ya que es

transformada a NH3 por efecto de especies microbianas ureoliticas así lo han reportado diversos

autores en diferentes trabajos en la producción de manzarina y sacharina principalmente, mostrando

efectos similares a este (Valiño et al., 2002; Calderón et al., 2005; Rodríguez, 2009; Díaz-Plascencia et

al., 2010b).

Si el sustrato tiene un aporte energético bajo, los microorganismos no pueden incorporarlo en la

formación de aminoácidos para su crecimiento o lo hacen en una proporción baja. Cuando se tiene un

pH bajo el NH3 producido es retenido en el sustrato, Díaz-Plascencia et al., (2010a). El NH3 también

puede producirse por actividad desaminativa y de esta manera el NH3 puede ser utilizado por ciertos

microorganismos que no hidrolizan la urea agregada al medio de fermentación y como resultado, la

cantidad de algunos microorganismos presentes en los sustratos fermentados se puede incrementar e

incluso pueden desaparecer, haciendo que se incrementen o bajen los niveles de NH3; como resultado

de esto, se modifica el medio de fermentación y provoca cambios en el pH, en la velocidad de tránsito

ruminal y en la población microbiana predominante, que a su vez pueden alterar la actividad proteolítica

(Cardozo et al., 2000; Cardozo et al., 2002).

69


En el análisis de los datos de esta variable se observó un efecto (P<0.01) en las horas de

fermentación sobre la concentración de AcL, en todos los tratamientos. Los valores estimados de las

medias de los tratamientos t1, t2, t3 y t4 con el inóculo de la levadura K. lactis, presentaron más perdida

de AcL en comparación a los otros inóculos de la h 12 a la h 48. El comportamiento para esta variable

por parte de las cepas de los tres géneros diferentes, se aprecia que a las 48 horas, las cuatro cepas de

K. lactis tuvieron menos AcL, luego las dos cepas del genero S. cerevisiae y las que más concentración

mostraron de AcL fueron las dos cepas de I. orientalis.

El incrementó de AcL en algunas fermentaciones inhibe el crecimiento microbiano e induce a la

muerte celular de la levadura o de los microorganismos presentes, así lo manifiestan varios estudios

(Elías y Lezcano, 1993; Madrid et al., 1999 y Ludovico et al., 2001). Es conocido que la toxicidad del

AcL depende del pH en el sistema. A un pH bajo, el AcL presente se encuentra principalmente en forma

no disociada y puede entrar a la célula microbiana por difusión pasiva (Geros et al., 2000); en el

citoplasma se disocia debido al pH más neutro y se liberan los protones, bajando el pH del citoplasma,

lo cual interfiere con algunos senderos metabólicos (Schüller et al., 2004), así como en el transporte de

nutrientes e iones, cambiando la estructura de la membrana, en los ácidos grasos, la composición de

los fosfolípidos y la síntesis de proteína (Madrid et al., 1999; Ramos et al., 2006).

El ácido láctico es producido por el catabolismo de los carbohidratos y es el mejor indicador de

la correcta fermentación de los forrajes en condiciones anaerobias, sin embargo la levadura K. lactis,

tiene un efecto muy marcado en la utilización del AcL al utilizarlo como fuente de energía para seguir

sobreviviendo por periodos prolongados, (Cuadro 5).

70

Cuadro 5. Medias (± EE) del comportamiento fermentativo in vitro entre tratamientos de ocho cepas de levaduras

Horas

Variable Tratamientos Cepa 12 24 48

1 Kl-2 12.1±0.75a 15.3±0.33b 22.8±0.35b

2 Kl-9 12.0±1.15a 15.1±0.48b 23.2±0.33b

3 Kl-11 12.6±0.76a 15.0±0.32b 23.2±0.31b

NH3 4 Kl-13 12.2±0.59a 15.0±0.86b 23.2±0.21b

(mM/mL) 5 Io-3 13.3±0.28a 17.5±1.67a 24.5±0.00a

6 Io-8 11.7±0.72a 16.5±1.65a 24.7±0.04a

7 Sc-4 13.3±0.02a 15.0±0.40b 23.8±0.10b

8 Sc-6 13.2±0.14a 13.8±0.23c 24.0±0.07a

1 Kl-2 21.7±0.31d 7.5±0.10e 2.4±0.01c

2 Kl-9 27.5±0.30c 10.1±0.04d 2.8±0.34c

3 Kl-11 34.7±0.22b 10.4±0.18d 2.3±0.31c

AcL 4 Kl-13 28.1±0.20c 15.8±0.35c 2.3±0.07c

(mM/mL) 5 Io-3 45.7±0.39a 34.4±0.28a 17.6±0.31a

6 Io-8 32.8±0.34b 21.9±0.51b 15.3±0.43a

7 Sc-4 26.3±0.30c 17.7±0.47c 8.8±0.32b

8 Sc-6 36.1±0.36b 18.2±0.18c 9.9±0.39b

1 Kl-2 3.3x107±0.01a 2.5x107±0.01a 1.9x107±0.02a

2 Kl-9 2.6x107±0.01b 1.5x107±0.02b 1.3x107±0.01b

3 Kl-11 2.6x107±0.01b 1.4x107±0.03b 1.2x107±0.03b

Levaduras 4 Kl-13 2.3x107±0.02c 1.4x107±0.03b 1.1x107±0.02b

(cel/mL) 5 Io-3 2.2x107±0.02c 8.0x106±0.02c 3.2x106±0.26d

6 Io-8 2.4x107±0.01c 9.0x106±0.00c 1.5x106±0.05e

7 Sc-4 2.8x107±0.02b 1.1x107±0.03b 9.8x106±0.00c

8 Sc-6 2.6x107±0.01b 1.3x107±0.06b 1.0x107±0.03b a, b, c, d, e Literales distintas como superíndice indican diferencia (P<0.01) entre tratamientos

71

Producción de Gas (PG)

Se observó efecto (P<0.01) sobre la PG en todos los tratamientos. En los inóculos donde se

incluyeron las diferentes cepas de levaduras, se puede observar el máximo incrementó de la PG

acumulada en la h 3 y en la h 48 (Cuadro 6).

La velocidad y grado de fermentación de los carbohidratos en el rumen varía según el tipo y

estructura de los mismos (Ivan et al., 2005) y según la población microbiana predominante (Dehority,

2003). El incrementó en la producción de gas que se obtuvo con estas cepas que podría ser el

resultado del incrementó de la producción de ácido propiónico debido a que el dióxido de carbono es

producido cuando el ácido propiónico es formado por alguna bacteria ruminal por la ruta metabólica

succinato propionato (Wolin y Miller, 1988).

Tang et al., (2008), también encontraron un efecto positivo en la adición de un cultivo de

levaduras en la producción de gas de pajas de diferentes cereales. Resultados similares coinciden por

varios autores cuando utilizaron la técnica PG para evaluar el comportamiento de las levaduras frente a

diferentes sustratos (Lila et al., 2004; Marrero, 2005; Castillo, 2009).

72

Cuadro 6. Medias (± EE) de producción de gas entre cepas de levaduras durante la fermentación ruminal in vitro (PG en mL/0.2g MS)

Horas

Tratamientos Cepa 3 6 12 24 48

T testigo 3.16±0.03e 1.63±0.12h 0.83±0.03b 0.60±0.00f 0.60±0.00g

1 Kl-2 4.63±0.06a 2.80±0.00c 2.80±0.00b 2.60±0.05a 2.00±0.05a

2 Kl-9 4.36±0.08b 2.86±0.03b 2.83±0.03b 2.36±0.14b 2.03±0.03a

3 Kl-11 4.36±0.12b 2.40±0.00g 2.23±0.03e 2.23±0.03c 2.03±0.03a

4 Kl-13 4.26±0.12c 2.46±0.03f 2.33±0.08d 2.20±0.05c 1.93±0.08b

5 Io-3 4.26±0.03c 2.96±0.18a 2.93±0.06a 2.33±0.27b 1.03±0.08e

6 Io-8 4.16±0.12d 2.60±0.11d 2.16±0.06f 1.80±0.00e 0.66±0.14f

7 Sc-4 4.33±0.08b 2.86±0.06b 2.83±0.08b 2.66±0.06a 1.80±0.01c

8 Sc-6 4.36±0.08b 2.56±0.03e 2.46±0.03c 2.10±0.10d 1.43±0.06d

a, b, c, d, e , f, g, h Literales distintas como superíndice indican diferencia (P<0.01) entre tratamientos.

73


De las ocho cepas de levaduras utilizadas en este experimento, la K. lactis, mostró ser la más

viable en la producción de gas y la que resistió mas a la degradación ruminal, mostrando tener un mejor

desempeño en la producción de levaduras y en la participación por reducir el ácido láctico. Las

levaduras S. cerevisae y I. orientalis, mostraron tener un papel importante durante la fermentación,

siendo estas las que dan las condiciones primarias a la levadura K. lactis, para los procesos de

fermentación posteriores.

75

RESUMEN

Con el objetivo de determinar el nivel óptimo de un inóculo a base de levaduras, adicionado a

dietas para vacas holstein altas productoras, fueron evaluados cuatro tratamientos: t1) 0.2 g de muestra

de la dieta sin adición de levaduras t2) 0.2 g de muestra con 3x1011 cel/kg de MS; t3) 0.2 g de muestra

con 6x1011 cel/kg de MS y t4) 0.2 g de muestra con 9x1011 cel/kg de MS. Los tratamientos contaron con

10 mL de líquido ruminal + 20 mL saliva artificial. El inóculo fue elaborado a partir de 4 cepas de

levaduras: Kluyveromyces lactis, cepas 2 y 11; Issatchenkia orientalis, cepa 3 y Saccharomyces

cerevisae, cepa 6. Las variables evaluadas fueron pH, conteo de levaduras (CL), conteo de protozoos

(CP), nitrógeno amoniacal (NA), ácido láctico (AcL), ácidos graso volátiles (AGV) con muestreos a las

12, 24, 48 y 96 h y para la producción de gas (PG) con muestreos a las 3, 6, 12, 24, 48 y 96 h. Los

datos se evaluaron con el procedimiento (PROC MIXED) para un diseño al azar de cuatro tratamientos

en parcelas divididas en el tiempo. Todas las variables evaluadas mostraron (P<0.01) de tratamiento

por la interacción de tiempo. El pH se incrementó (P<0.01) a través del tiempo de 7.1 a 7.4; en tanto

que los tratamientos t2, t3 y t4 con inóculo mostraron un descenso gradual a partir de la h12 a la h24.

En el CL se incremento (P<0.01) con mayor producción el t4, (1.8x107±0.01 cel/mL a la h48). CP

sobresalió (P<0.01) en el t4, con 2.0x107±0.00 cel/mL a la h48. El NA subió (P<0.01) en todos los

tratamientos de la h12 a la h96. El AcL bajo (P<0.01) con la adición del aditivo en el t2, t3 y t4 con un

marcado descenso en la reducción del AcL, de la h12 a la h96 con valores de 7.12±0.19 a 2.04±0.19 en

t2 de 6.73±0.19 a 1.36±0.17 en t3 y de 10.73±0.29 a 1.95±0.16 mM/mL en t4 siendo este el que mejor

reducción presento de AcL. La producción de AGV´s subió (P<0.01) entre tratamientos con mayor

concentración de acetato, propionato y butirato los cuales fueron superiores en el t2 a las 12 y 24 h. Se

concluye que la adición del inóculo a las dietas favoreció la PG, CL, CP y AGV´s con una marcada

reducción del AcL con la adición del inóculo a la dieta en los t2, t3 y t4 mostrando que el nivel más

76

adecuado de inóculo para ser empleado en las dietas para vacas altas productoras fue de 10mL/kg de

MS.

77



El estudio se llevó a cabo en laboratorio de nutrición animal de la Facultad de Zootecnia y

Ecología de la Universidad Autónoma de Chihuahua, ubicada en el km 1 del Periférico Francisco R.

Almada de la ciudad de Chihuahua; latitud norte 28º 35´, longitud oeste 106º 04´, con una altitud de

1595 m.s.n.m.; tiene una temperatura media anual de 17 ºC (Álvarez, 1992).


El material utilizado para este experimento fue: cuatro cepas de levaduras obtenidas del bagazo

de manzana, melaza de caña, urea, sulfato de amonio, agua destilada, suero de leche, balanza

analítica, bombas oxigenadoras, mangueras y conexiones de plástico, envases de plástico de 10 mL,

frascos de vidrio de 50 mL, maya de nylon®, potenciómetro de mesa (HANNA)®, microscopio, cámara

de NeubauerMR, refractómetro HI 96801(HANNA)®, termómetro digital (TAYLOR)®, espectrofotómetro

Coleman Junior® II modelo 6|20, Incubadora Shaker I2400, cromatógrafo SRI 8610 CO2 y tres vacas

Holstein fistuladas con promedio de 620 kg de peso vivo, alimentadas con una dieta típica para vacas

en producción.

Preparación del Aditivo

Las cepas de levaduras utilizadas para este trabajo fueron: Kluyveromyces lactis, cepas 2 y 11;

Issatchenkia orientalis, cepa 3 y Saccharomyces cerevisae cepa 6, todas obtenidas a partir de la

fermentación en estado sólido del bagazo de manzana (BM), las cuales fueron identificadas a través de

la extracción y amplificación del ADNr 18S mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por

sus siglas en ingles), en el laboratorio de transgénesis animal de la Facultad de Zootecnia y Ecología de

la Universidad Autónoma de Chihuahua (Villagrán et al., 2009). Además se agregaron 250 g de melaza

de caña, suero de leche 750 mL, 1x108 células vivas de levaduras de las diferentes cepas, 2 g de urea,

78

.04 g de sulfato de amonio por inóculo utilizando un oxigenador; el tiempo de fermentación para el

inóculo fue de 96 h a una temperatura ambiente promedio de 28 °C. Una vez terminado el tiempo de

fermentación se realizó el conteo de levaduras encontrando la cantidad de 1.2x109 para posteriormente

ajustar la cantidad de células requeridas por tratamiento; empleando las mismas condiciones y

metodología que se describen en la segunda parte de este trabajo.

Tratamientos

t1) Testigo: 0.2 g de muestra de la dieta sin adición del inóculo + 10 mL líquido ruminal + 20 mL

saliva artificial; t2) 0.2 g de muestra con 3x1011 cel/kg de MS+ 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva

artificial; t3) 0.2 g de muestra con 6x1011 cel/kg + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva artificial y t4) 0.2

g de muestra con 9x1011 cel/kg + 10 mL líquido ruminal + 20 mL saliva artificial.

Para cada tratamiento se pesó 1 Kg de MS de alimento (ración completa) ofreciéndose a las

vacas altas productoras, (Cuadro 7). Posteriormente se molió la muestra de alimento y se agregó la

cantidad mencionada de inóculo de levaduras por tratamiento en una charola de plástico, se mezcló

manualmente y se homogenizó con el alimento, posteriormente se tomó la cantidad de 0.2 g de muestra

de la dieta y se depositó en frascos de vidrio de 50 mL a lo que se les agregó también: 10 mL líquido

ruminal + 20 mL saliva artificial, (Cuadro 8).

Sus combinaciones fueron evaluadas en 48 frascos de vidrio de 50 mL, con 3 repeticiones por

tratamiento (t) y diferentes horas (h) de muestreo 12, 24, 48 y 96 h para las variables; pH, conteos de

levaduras (CL), conteos de protozoarios, nitrógeno amoniacal (NH3), ácido láctico (AcL), producción de

gas (PG), ácidos grasos volátiles (AGV´s).

Para la producción de gas in vitro (PG) fueron utilizados 12 frascos de vidrio de 50 mL con 3

repeticiones por tratamiento en diferentes horas de muestreo 3, 6, 12, 24, 48 y 96 h.

79

Cuadro 7. Contenido y análisis calculado de la dieta para vacas Holstein altas productoras con producción esperada de 35 L de leche vaca/d utilizada en el experimento.

Ingredientes %

Alfalfa 25

Maíz rolado 20

Pasta de soya 14

Cáscara de soya 13

Salvado de trigo 10

Semilla de algodón 10

Melaza 4

Grasa de sobrepaso (vegetal de palma) 2.5

Premezcla de vitaminas y minerales 0.5

Ortofosfato 0.5

Bicarbonato de sodio 0.5

Total 100

Análisis Calculado

Energía neta lactante 1.73 MC/Kg

Materia seca 85.69 %

Proteína total 17.29 %

Extracto etéreo 5.85 %

Fibra detergente neutro 32.70 %

Fibra detergente ácido 23.10 %

Fibra cruda 17.84 %

Cenizas 5.93 %

Fosforo total 0.58 %

Calcio 0.87 %

Magnesio 0.22 %

Potasio 1.47 %

* Formulación y análisis calculado por medio del software Nutrión 5 ** Requerimientos nutricionales tomados del (NRC, 2001)

80

Cuadro 8. Diseño de tratamientos con diferentes niveles de inóculo.

Tratamientos

Muestra g

Inóculo cel/kg

Líquido ruminal mL

Saliva artificial mL

t1 (0 mL) 0.2 0 10 20

t2 (10 mL/kg) 0.2 3x1011 10 20

t3 (20 mL/kg) 0.2 6x1011 10 20

t4 (30 mL/kg) 0.2 9x1011 10 20

81

Variables Medidas

pH

Se midió de manera directa con un potenciómetro digital de una precisión de ±0.1 unidades.



las muestras de las h 12, 24, 48 y 96 únicamente, siguiendo las mismas condiciones que se describen

en la primera parte de este trabajo.

Conteo de Protozoarios (CP)

Los protozoarios se contaron al microscopio óptico en cámara de Neubauer. Para ello los

protozoarios se tiñeron con una solución de violeta de genciana al 0.01% en ácido acético glacial al 1%

según método de Painting y Kirsop (1990).


De las muestras líquidas obtenidas de la h 12, 24, 48 y 96 se determinaron por colorimetría

según el procedimiento de (Broderick y Kang, 1980) siguiendo las mismas condiciones que se

describen en la primera parte de este trabajo.


De las muestras líquidas obtenidas de las h 12, 24, 48 y 96 y fue determinado por colorimetría

según el procedimiento de Taylor, (1996) siguiendo las mismas condiciones que se describen en la

primer parte de este trabajo.


El procedimiento de PG in vitro fue hecho de acuerdo a la técnica de Menke y Steingass (1988)

con algunas modificaciones hechas por Muro, (2007) y con las mismas condiciones que se describen en

la segunda parte de este trabajo.

82

Concentración de Ácidos Grasos Volátiles (AGV’s)

La concentración de ácido acético, propiónico y butírico se determinó por cromatografía de

gases. Los análisis se hicieron en un cromatógrafo SRI 8610, con una columna Alltech phase EC™

1000, de 15 metros de largo, 0.53 mm de diámetro interno y un espesor de capa de 1.20 µm. Las

muestras se inyectaron con una jeringa Hamilton de 10 µl. Cada muestra se inyectó (2 µl) dos veces;

se utilizó nitrógeno como gas acarreador y un detector de iones con flama alimentada por una mezcla

de hidrógeno y aire.

El programa de temperatura usado fue: inició 100°C, incrementó desde 100 hasta 130°C en

dos minutos (∆15°C*min-1), incrementó desde 130 hasta 140°C en 1 minuto (∆10°C*min-1), para

terminar, la temperatura se incrementó desde 140 hasta 200°C en 2.4 minutos (∆25°C*min -1). La

columna se calentó a 200°C por al menos 30 minutos antes de comenzar a realizar el análisis de las

muestras diariamente. El estándar de ácidos grasos volátiles se preparó únicamente con ácido acético

(3.46 g*L-1), ácido propiónico (3.97 g*L-1) y ácido butírico (1.53 g*L-1) con las concentraciones

recomendadas por Galyean (1997).

83


Se realizó con un modelo mixto, en el cual, se utilizaron como efectos fijos el tiempo y el

tratamiento. Como efecto aleatorio, se utilizó la repetición anidada dentro de cada tratamiento; los datos

se evaluaron con el procedimiento (Proc Mixed) del programa SAS, (2004) para un diseño al azar de

cuatro tratamientos en parcelas divididas en el tiempo.

Modelo Estadístico

Yiju = µ + Ci + R(Cij) + Tk + C*Tik + εijk

Donde:

Yijk.- Es la variable de respuesta.


Ci.- Es el efecto del i-ésimo nivel de tratamiento.

R(Cij).- Es de la repetición del i-ésimo nivel de tratamiento.

Tk.- Es el efecto del j-ésimo tiempo de fermentación sobre la variable de respuesta.

C*Tik.- Es el efecto de la interacción del i-ésimo nivel de tratamiento por tiempo.

eijk.- Es el error experimental.

84


pH

Esta variable mostró efecto (P<0.01) por la interacción tratamiento por tiempo, los valores

estimados, de la h12 a la h96 el pH en el t1, incrementó su valor de manera gradual en el tiempo de

7.1±0.00 a 7.4±0.00 en tanto que los tratamientos t2, t3 y t4 mostraron un descenso gradual a partir de

la h12 a la h24, con un ligero incremento de la hora 48 a la 96. El pH ruminal refuerza el balance entre

la capacidad amortiguadora y la acidez de la fermentación ya que al disminuir el pH, se estrechan las

relaciones acetato propionato, por consecuencia al incrementarse el pH se amplían las relaciones

acetato propionato (Hobson, 1972).

En el presente estudio el pH fue más alto de lo normal, arriba de 7 ya que la alfalfa tiene

propiedades amortiguadoras y además se incluyó bicarbonato de sodio en la dieta, lo que también hace

que suba el pH del rumen.

La composición de la dieta y las prácticas de alimentación influyen sobre el pH ruminal, ya que

a medida que se incrementa la proporción de ingredientes de fermentación rápida disminuye el pH y

viceversa (Kaufmann, 1976). Aún cuando no puede definirse un pH óptimo en el medio ruminal, los

microorganismos presentan cierto intervalo en el cual se reproducen mejor y su metabolismo es más

eficiente, los protozoarios manifiestan su principal desarrollo a pH cercano a 6.5 y son severamente

afectados con pH superiores a 8 e inferiores a 5.5, siendo este último uno de los factores que más

afectan su población (Hino et al., 1973).


Se encontró efecto (P<0.01) por la interacción tratamiento por tiempo en la cantidad de

levaduras, con un comportamiento de reducción en los distintos tratamientos en función al tiempo. La

85

concentración más alta de levaduras que se encontró en la PG se observó como era de esperar en el

t4, con un valor de 5.4x107±0.00 a la h12 y de 1.8x107±0.01 cel/mL a h48.

Las levaduras de los diferentes tratamientos disminuyeron a medida que transcurrió el tiempo

de fermentación lo cual coincide con resultados similares obtenidos por (Ingledew y Jones, 1982;

Arambel y Rung-Syin, 1987; Castillo, 2009), cuando estudiaron el crecimiento de la S. cerevisiae en

ambiente ruminal. Las levaduras mantienen su actividad metabólica y resisten el estrés físico asociado

con el secado, calentamiento y exposición al pH ácido en condiciones anaeróbicas. No obstante, se ha

demostrado que S. cerevisiae presenta crecimiento limitado bajo esas condiciones (Andreasen y Stier

1953) y es incapaz de mantener una población productiva dentro del ecosistema ruminal (Dawson y

Newman 1987; Arambel y Rung-Syin 1987), en donde mencionan que no pueden mantener una

población viable en el rumen y son incapaces de establecerse permanentemente (WiIliams et al., 1990);

por tal motivo, no es común que desarrolle crecimiento a nivel ruminal, en forma adicional a lo anterior

el crecimiento de las levaduras se ve afectado por la presencia de ácidos grasos insaturados, tales

como el colesterol y el ácido nicotínico. En este estudio la mayor cantidad de células viables

adicionadas por tratamiento permitió una permanencia mayor en el ambiente ruminal, pues las

levaduras ayudaron a mantener el medio anaerobio y fueron capaces de permanecer por más de 48

horas viables, en particular las del t4.

Conteo de Protozoarios (CP)

Se encontró efecto (P<0.01) por la interacción tratamiento por tiempo en la cantidad de

protozoarios destacando el t4 con una producción de 2.0x167±0.00 cel/mL. El incrementó

probablemente se debió a que hubo un pH favorable y un suministro de N-NH3 y del AcL adecuados

para su crecimiento y multiplicación.

86

La degradación de los protozoos generalmente está asociada con una disminución en la

proporción de butirato e incrementó de propionato o acetato (Jouany, 1994). Los tiempos de

multiplicación varían de 5 a 14 h para los protozoarios como lo mencionan Williams y Coleman (1988) y

de 24 a 30 h para los hongos (Bauchop, 1981; Joblin, 1981). Es posible que la eficiencia del crecimiento

bacteriano este directamente relacionada con la tasa de dilución de las bacterias y/o del contenido

ruminal, debido a que las bacterias en el rumen están asociadas a los sólidos alimenticios, al líquido y la

pared ruminal; por lo tanto, la tasa de crecimiento bacteriano puede estar en relación a la tasa de

dilución del líquido, lo cual se explica porque solamente en cultivos continuos in vitro de estado estable,

la tasa de crecimiento específico de los microorganismos es igual a la tasa de dilución del cultivo

(Bergen, 1979).

Se ha reportado también, que la adición de levadura S. cerevisiae incrementa la concentración

de bacterias gran - en el contenido ruminal (1.6x 104 vs 2.0xl05 UFC/mL), unidades formadoras de

colonias) y también incrementa el contenido de bacterias gram- en las heces (1.1x104 vs 2.6x105

UFC/mL), mencionando además, que la levadura estimula el crecimiento de bacterias amilolíticas a

nivel ruminal Wiedmeier et al., (1987), Harrison et al., (1988), Dawson et al., (1990), Gedek et al., (1993)

estos resultados que fueron confirmados por Kumar et al., (1994), quienes indican que la levadura

incrementa el número de bacterias totales, bacterias viables totales, celulolíticas, amilolíticas y

protozoarios; sin embargo; se han encontrado resultados contradictorios por Chiquette (1995), Sohn y

Song (1996).


Se encontró efecto (P<0.01) por interacción tratamiento por tiempo en el N-NH3, este

incremento fue para todos los tratamientos de la h12 a la h96. Este efecto es dado por la urea añadida a

los sustratos en los procesos de fermentación, ya que es transformada a NH3 por efecto de especies

87

microbianas ureoliticas así lo han reportado diversos autores en diferentes trabajos en la producción de

manzarina y sacharina mostrando efectos similares a este (Valiño et al., 2002; Calderón et al., 2005 y

Rodríguez, 2009), si el sustrato tiene un aporte energético bajo, los microorganismos no pueden

incorporarlo en la formación de aminoácidos para su crecimiento o lo hacen en una proporción baja.

Cuando se tiene un pH bajo el NH3 producido es retenido en el sustrato, Díaz-Plascencia et al., (2010).

La digestión de las proteínas también está relacionada con su solubilidad dentro del rumen,

cuando la solubilidad es menor, disminuye la liberación de amoníaco; por lo tanto, la síntesis de

proteína microbiana se ve limitada por la deficiencia de este compuesto (Pérez Gavilán, et al., 1976).

Distintas fuentes de nitrógeno contribuyen a la producción de amoníaco ruminal: el nitrógeno no

proteico (NNP) de la dieta, nitrógeno salival y posiblemente pequeñas cantidades de urea que penetran

al rumen a través de sus paredes, todas éstas son convertidas casi totalmente en amoníaco;

dependiendo del tipo de dieta suministrada a los rumiantes, los microorganismos ruminales convierten

en amoníaco del 60-90% de nitrógeno diario consumido y del 50-70% del nitrógeno bacteriano puede

ser derivado del amonio de la dieta. La concentración óptima de nitrógeno amoniacal (N-NH3) en rumen,

es aquella que resulta en la máxima tasa de fermentación o la máxima tasa de producción de proteína

microbiana por unidad de sustrato fermentado (Mehrez et al., 1977).


Se encontró efecto (P<0.01) por interacción de tratamiento por tiempo en los tratamientos t2, t3

y t4 mostrando efecto en la reducción del AcL, de la h12 a la h96. Con El aumento en la concentración

de AcL en el t4 se debe fundamentalmente, al establecimiento de las bacterias lactogénicas Dawson et

al., (1990) y Kumar et al., (1994), quienes indican que la levadura incrementa el número de bacterias

totales, bacterias viables totales, celulolíticas, amilolíticas y protozoarios (Cuadro 9).

88

Cuadro 9. Medias (± EE) del comportamiento fermentativo entre tratamientos (t) durante la fermentación in vitro.

Horas

Variable t 12 24 48 96

1 7.1±0.00a 7.1±0.00a 7.3±0.00a 7.4±0.00a

pH 2 7.1±0.00a 6.1±0.00b 6.4±0.00b 6.4±0.00b

3 7.1±0.00c 6.1±0.00b 6.3±0.00c 6.4±0.00b

4 7.1±0.00d 6.1±0.00b 6.4±0.00b 6.4±0.00b

1 4.3x105±0.01d 1.5x104±0.05d 0.0±0.00d 0.0±0.00

Levaduras 2 1.6x107±0.02c 4.3x106±0.02c 2.0x106±0.05c 0.0±0.00

(Cel/mL) 3 2.8x107±0.00b 9.6x106±0.00b 4.6x106±0.01b 0.0±0.00

4 5.4x107±0.00a 2.8x107±0.01a 1.8x107±0.01a 0.0±0.00

1 4.1x105±0.00d 4.5x105±0.03d 0.0±0.00d 0.0±0.00c

Protozoos 2 4.6x105±0.00c 5.6x105±0.00c 4.3x104±0.02c 0.0±0.00c

(Cel/mL) 3 5.6x105±0.00b 7.0x105±0.00b 6.0x105±0.01b 1.7x105±0.02b

4 1.1x106±0.02a 2.0x106±0.00a 1.2x106±0.03a 6.0x105±0.00a

1 1.3±0.03a 1.6±0.08a 2.0±0.05d 2.4±0.03c

NH3 2 1.1±0.08d 1.6±0.03b 2.4±0.03a 2.4±0.03b

(mM/mL) 3 1.3±0.05b 1.5±0.08c 2.3±0.05b 2.4±0.05c

4 1.2±0.05c 1.5±0.05c 2.3±0.05c 2.5±0.06a

1 6.7±0.10c 6.7±0.10a 5.9±0.09a 6.3±0.16a

AcL 2 7.1±0.19b 5.7±0.17c 2.3±0.09c 2.0±0.19b

(mM/mL) 3 6.7±0.19c 5.9±0.19b 2.2±0.16d 1.3±0.17d

4 10.7±0.29a 4.5±0.17d 2.5±0.00b 1.9±0.16c

a, b, c, d Literales distintas como superíndice indican diferencia (P<0.01) entre tratamientos

89

El incrementó de AcL en algunas fermentaciones inhibe el crecimiento microbiano e induce a la

muerte celular de la levadura o de los microorganismos presentes, así lo manifiestan varios estudios

(Elías y Lezcano, 1993; Madrid et al., 1999; Ludovico et al., 2001).


Se encontró (P<0.01) por interacción de tratamiento por tiempo en todos los tratamientos. El

incrementó máximo de PG se presento en los t3 y t4 a partir la h 3 a la h 6 con valores de 4.7±0.05 en

t3 y 4.7±0.05 en t4 posteriormente fue reduciéndose de manera gradual. La velocidad y grado de

fermentación de los carbohidratos en el rumen varía según el tipo y estructura de los mismos (Ivan et

al., 2005) y según la población microbiana predominante (Dehority, 2003). El incrementó en la

producción de gas que se obtuvo con estas cepas que podría ser el resultado del incrementó de la

producción de ácido propiónico debido a que el dióxido de carbono es producido cuando el ácido

propiónico es formado por alguna bacteria ruminal por la ruta metabólica succinato propionato (Wolin y

Miller, 1988). Tang et al., (2008) también encontraron un efecto positivo en la adición de un cultivo de

levaduras en la producción de gas de pajas de diferentes cereales.

El patrón de fermentación en los rumiantes se lleva a cabo en el ambiente ruminal que está

influenciado por la interacción entre la dieta, la población microbiana y el propio animal (Allen y Mertens

1988). Dos aspectos importantes en el rumen para la fermentación, son las condiciones para una

eficiente actividad celulolítica y las necesidades para una síntesis óptima de proteína microbial. Sin

embargo, la importancia relativa de estos procesos varía de acuerdo con las características del alimento

(Cuadro 10).

90

Cuadro 10. Medias (± EE) del comportamiento en la producción de gas entre tratamientos (t) durante la fermentación ruminal in vitro (PG en mL/0.2g MS).

Horas

t 3 6 12 24 48 96

1 3.0±0.06c 2.0±0.03d 1.8±0.00d 1.2±0.03d 1.0±0.03d 0.7±0.03c

2 4.0±0.03b 2.5±0.03c 2.0±0.03b 2.0±0.06a 1.7±0.06a 1.1±0.05a

3 4.7±0.05a 3.7±0.03a 2.2±0.03a 1.7±0.00c 1.6±0.06c 1.0±0.00b

4 4.7±0.05a 3.3±0.03b 1.9±0.03c 2.0±0.03b 1.7±0.05b 0.6±0.10d

a, b, c, d Literales distintas como superíndice indican diferencia (P<0.01) entre tratamientos

91

Concentración de (AGV´S)

Se encontró efecto (P<0.01) por interacción de tratamiento por tiempo en todos los tratamientos

durante la producción de gas in vitro, la concentración de ácido acético en el t2, fue mayor de la h12 a la

24 que el t1 con valores de 24.9±0.02 a 39.0±0.01 mM/mL en el t2 y de 10.9±0.03 a 29.0±0.02 mM/mL

el t1. El t3 tuvo una producción mínima de ácido acético de la h12 a la h48 con valores de 17.3±0.04 a

19.8±0.22 para después incrementar su concentración a 52.2±0.05 en la h96. El t4 mostró una

reducción en la concentración de ácido acético de la h12 a la h96 con medias de 33.2±0.02 a 21.8±0.16

mM/mL. La concentración de ácido propiónico mostró efecto (P<0.01) por interacción de tratamiento por

tiempo. El ácido propiónico reporto una concentración mayor en el t2 a la h24 de 11.7±0.01 en

comparación con el t1 con 10.6±0.07. El t3 fue incrementado su concentración de la h12 a la h96 con

medias de 5.5±0.04 a 16.5±0.04. El t4 mostró un ligero incrementó en la concentración de ácido

propiónico de la h12 a la h96 con valores de 10.3±0.02 a 10.5±0.01. En la concentración de ácido

butírico se encontró efecto (P<0.01) por interacción de tratamiento por tiempo. La mayor concentración

de ácido butírico se encontró en el t2 a la h24 con valor de 4.7±0.13 mM/mL. El t3 incrementó su

concentración de ácido butírico de la h12 a la 96 con valores de 4.7±0.04 a 10.1±0.04 mM/mL siendo

este el que mayor concentración obtuvo durante la fermentación ruminal. El t4 incrementó su

concentración de ácido butírico de la h12 a la h24 con valores de 6.1±0.01 a 7.3±0.04 mM/mL.

Los AGV´s son un producto de desecho de algunos microorganismos en condiciones

anaerobias (Van Soest, 1982); en la FES de mezclas de caña de azúcar y boniato, puede haber

producción de ácido acético y sus niveles pueden ser fluctuantes durante el proceso; también puede

haber presencia de ácido propiónico en concentraciones muy bajas, este último puede desaparecer

después de 48 h de FES (Rodríguez et al., 2001a); en este trabajo, sucedió algo similar, hubo presencia

de ácido acético y ácido propiónico; la concentración de ácido acético fue mayor en el t2 a las 24h a las

92

96h la concentración de ácido propiónico fue mayor en el t2 en lah24 a las 96h la presencia de estos

ácidos, indica que en ciertos momentos de la producción de gas hubo condiciones de anaerobiosis,

encontrando además, ácido butírico.

El comportamiento que siguió el ácido acético y los incrementos de ácido propiónico y butírico

en los diferentes tratamientos coinciden con la disminución de AcL en este trabajo. Van Soest (1982),

describe que, en ciertas reacciones químicas, que se presentan en los procesos metabólicos, se

pueden producir ácido propiónico y ácido butírico a partir del AcL. La posible disminución de ácido

propiónico y ácido butírico después de 48h de fermentación in vitro pudo deberse a que también se

utilizaron como fuentes de energía (Van Soest, 1982). El incrementó de ácido acético durante la

fermentación in vitro del t1 y t2, pudo ser resultado de diferentes procesos, como el de la metabolización

de aminoácidos por bacterias clostrídicas o el de la metabolización de hexosas, pentosas y/ó ácidos

orgánicos por acción de bacterias heterolácticas, homolácticas, enterobacterias y/ó levaduras (Ojeda et

al., 1987).

En este estudio la adición del inóculo de levaduras del t2 con 10mL/kg de MS favoreció la

fermentación in vitro en las concentraciones de ácido acético, propiónico y butírico en las primeras 24h

de fermentación (Cuadro 11).

93

Cuadro 11. Medias (± EE) del comportamiento en la producción de AGV´s entre tratamientos (t) durante la fermentación in vitro.

Horas

AGV´s t 12 24 48 96

1 10.9±0.03d 29.0±0.02b 33.8±0.11a 22.6±0.17b

Ac. Acético 2 24.9±0.02b 39.0±0.01a 25.5±0.22b 19.7±0.05d

(mM/mL) 3 17.3±0.04c 19.9±0.01c 19.8±0.22d 52.2±0.05a

4 33.2±0.02a 29.3±0.09b 21.8±0.23c 21.8±0.16c

1 4.6±0.03c 10.6±0.07b 11.0±0.06a 7.4±0.03c

Ac. Propiónico 2 8.4±0.04b 11.7±0.01a 9.0±0.03c 7.8±0.03c

(mM/mL) 3 5.5±0.04c 6.6±0.11c 7.4±0.04d 16.5±0.04a

4 10.3±0.02a 10.4±0.02b 10.5±0.02b 10.5±0.01b

1 3.1±0.01c 6.6±0.01c 7.4±0.04a 4.7±0.05d

Ac. Butírico 2 4.7±0.13b 7.6±0.27a 6.1±0.03b 5.4±0.02c

(mM/mL) 3 4.7±0.04b 5.4±0.03d 5.9±0.02c 10.1±0.04a

4 6.1±0.01a 7.3±0.04b 5.5±0.07c 6.6±0.05b

94


La adición del inóculo de levaduras en los diferentes tratamientos mostró una participación en la

reducción del ácido láctico y favoreció la producción de protozoarios, resistiendo por más tiempo a la

degradación ruminal en el T2, T3 y T4. La adición del inóculo a las dietas favoreció la producción de

gas, el conteo de levaduras y el conteo de protozoos totales con una marcada reducción del ácido

láctico.

La adición del inóculo de levaduras favoreció la fermentación in vitro en las concentraciones de

ácido acético, propiónico y butírico en las primeras 24h de fermentación siendo el T2 con 10 mL/kg de

MS es el nivel más óptimo recomendó en las dietas para vacas altas productoras al encontrar una

mayor concentración de AGV´s.

96

RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de un inóculo de levaduras (IL) y bagazo de

manzana fermentado (BMZN) en la dieta de becerros Angus en crecimiento sobre el comportamiento

productivo y sistema inmune. Se utilizaron 26 becerros (PV=112±6.2 kg) de cuatro meses de edad, los

cuales fueron distribuidos al azar en tres tratamientos: T1 (testigo, n=9), T2 (BMZN, n=9) y T3 (IL, n=8),

alimentados con las siguientes dietas: T1: heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado;

T2: HA + EM + concentrado + BMZN; T3: HA + EM + concentrado + IL. Las dietas fueron isoproteicas

(28.8 % PC) e isoenergeticas (1.26 Mcal/kg MS). Las variables evaluadas fueron peso vivo (PV),

ganancia diaria de peso (GDP), consumo diario de alimento (CDA), conversión alimenticia (CA) y

concentración de Zn, Mn y Cu en suero sanguíneo. Además, se cuantificó actividad antioxidante (AA)

en plasma sanguíneo y biometría hemática (BH) en sangre completa. Las variables fueron evaluadas

cada 28 d de la prueba, excepto BH (56 y 84 d). Las variables de la prueba de comportamiento se

analizaron con un modelo estadístico que incluyó como efecto fijo el tratamiento. En la concentración de

Zn, Mn, Cu, AA y BH se incluyeron como efectos fijos tratamiento y muestreo; y como efecto aleatorio el

animal. El T3 fue superior (P<0.05) en CDA y CA (8.512±0.12 kg/d y 1.530±0.03, respectivamente). El

Mn presentó diferencia significativa (P<0.05) el día 28 de muestreo, siendo T2 y T3 quienes

manifestaron la menor concentración (4.29±2.11 y 7.28±2.22 µmol/L). El día 28 de muestreo el T1, T2 y

T3 mostraron menor (P<0.05) concentración de Cu (8.04±2.34, 8.32±2.34 y 9.76±2.47 µmol/L). La AA

reveló efecto de tratamiento (P<0.05) el día 84 de la prueba, siendo superiores el T2 y T3 con

15.72±0.03 y 15.71±0.03 mmol/L, respectivamente. El T1 y T2 mostraron la concentración más alta

(P<0.05) de Leu el día 84 (9.82±0.95 y 11.11±0.95 x 103/µL, respectivamente) y Lin (7.30±0.92 y

8.73±0.92 x 103/µL). Se concluye que el T3 incrementó el CDA y CA, por otra parte, mantuvo la

cantidad de Leu y Lin cerca del nivel máximo, sin mostrar variaciones significativas a través del tiempo.

97


Localización del Área de Estudio

El presente estudio se desarrolló en las instalaciones del rancho La Cañada, localizado en el

municipio de Guerrero, Chihuahua, Chih., México. Ubicada en las coordenadas 28º 33' 05" latitud norte

y 106º 30' 07" longitud oeste, con una altitud de 2,010 msnm, según sistema de posicionamiento global

(GPS por sus siglas en inglés, MAGELLAN®, MobileMapper-Pro).

El clima es semihúmedo templado; la temperatura media anual es de 13 ºC, con una media

máxima de 42 ºC y una media mínima de -17.6 ºC. La precipitación promedio anual es de 517.2 mm,

con una humedad relativa del 65 % y un promedio anual de 90 días de lluvia (INAFED, 2010). El

experimento inicio el 17 de febrero y finalizo el 25 de mayo de 2012.

Descripción de los Animales y Tratamientos

Se utilizaron 27 becerros Angus destetados con peso inicial de 112±6.2 kg y edad promedio de

cuatro meses. Los becerros se asignaron aleatoriamente a tres tratamientos; T1 (testigo, n=9): heno de

avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 (BMZN, n=9): HA + EM + concentrado + BMZN y

T3 (IL, n=8): HA + EM + concentrado + IL. Los concentrados (Cuadro 12) se adicionaron al HA y EM al

momento de ofrecer el alimento.

El BMZN se preparó con 75 kg de manzana de desecho, al cual se le adicionaron 350 gr de

urea + 100 gr de sulfato de amonio + 200 gr de premezcla de vitaminas y minerales traza,

posteriormente se mezclaron en un fermentador aeróbico por 72 h, manteniendo el mezclado por 15

min en cada tiempo (0, 6, 12, 24, 48 y 72 h). Esta cantidad de mezcla se preparó en dos etapas, la

primera para preparar el concentrado para los meses febrero y marzo (600 kg), y la segunda para

los meses abril y mayo (600 kg).

98

Cuadro 12. Composición del alimento concentrado por tratamiento.

Ingredientes T1 T2 T3

% (BS)

Maíz rolado 32.0 30.6 32.0

Melaza 10.0 5.0 8.0

Harinolina 41 % PC 20.6 15.0 20.6

Pasta de soya 44 % PC 30.0 30.0 30.0

Carbonato de calcio 2.4 2.4 2.4

BMZN2 0.0 12.0 0.0

Sal común 2.0 2.0 2.0

Minerales y vitaminas12:101 3.0 3.0 3.0

Inoculo de levaduras 0.0 0.0 2.0

Análisis calculado

ENg Mcal/kg 1.26 1.25 1.26

PC % 28.81 28.83 28.89

PD % 53.91 51.78 53.07

Ca % 1.67 1.77 1.68

P % 0.98 0.99 0.99

Cu mg/kg 16.12 13.75 15.32

Mn mg/kg 31.66 30.18 31.17

Zn mg/kg 42.48 40.32 42.70

1Mezcla de minerales y vitaminas 12:10: P, Ca y Mg (12.0, 11.5, 0.6 %), Mn, Zn, Fe, Cu, I, Co y Se (2160, 2850, 580, 1100, 102, 13, 9 ppm), Vitamina A, D3 y E (220000, 24500, 30 UI/kg). 2BMZN = Bagazo de manzana fermentado.

99

Material Biológico

Las cuatro cepas de levaduras que se utilizaron para este trabajo fueron obtenidas a partir

de la fermentación en estado sólido de bagazo de manzana (BM), las cuales fueron identificadas a

través de la extracción y amplificación del ADNr 18S mediante la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles), en el laboratorio de transgénesis animal de la Facultad

de Zootecnia y Ecología de la Universidad Autónoma de Chihuahua. Para la identificación se

realizó un cultivo de levaduras por dilución seriada y se aislaron 16 colonias a las cuales se les

extrajo ADN para amplificar una región del ADNr 18S (752 pb). El producto de PCR obtenido se

sometió a secuenciación, realizando su análisis por medio del programa Blast de la base de datos

del National Center for Biotechnology Information (NCBI).

El análisis de las secuencias mostró que las levaduras correspondientes a las 16 colonias

aisladas fueron: Saccharomyces cerevisiae; Issatchenkia orientalis y Kluyveromyces lactis

(Villagrán et al., 2009). Las cepas utilizadas para este trabajo fueron K. lactis cepas 2 y 11; I.

orientalis cepa 3 y S. cerevisiae cepa 6. Todas obtenidas a partir de la fermentación en estado

sólido del BM. Las cepas se mantuvieron viables mediante resiembras periódicas en cuñas y en

cajas petri. El medio que se utilizó fue Extracto de Malta a razón de 33.6 g/L y el tiempo de

incubación fué de 48 horas a una temperatura de 30 °C. Posteriormente, se conservaron en

refrigeración a una temperatura de 4 °C.

El IL que se utilizó en el presente experimento, se preparó en 5 botes de 20 L, a 4 de ellos

se le agregaron cultivos de levaduras provenientes de 3 cajas Petri de cada una de las cepas

descritas anteriormente, adicionando a cada uno de los 5 botes, 6 g de urea, 1 g de sulfato de

amonio, 500 g de melaza de caña, 2.5 g de premezcla de vitaminas y minerales y 6 L de agua

100

destilada. A cada bote se le adaptó un oxigenador portátil durante 96 h con la finalidad de

suministrar el oxígeno necesario para favorecer el crecimiento de las levaduras.

Posteriormente se tomaron muestras de 10 mL de cada bote en frascos de plástico de 50

mL cerrados herméticamente, los cuales se trasladaron al Laboratorio de Nutrición Animal para

realizar el conteo de levaduras por microscopia, con la ayuda de una micropipeta (Nichiryo LE) de

un volumen de 10 a 100 µL y puntas desechables, así mismo, se preparó una dilución serial de 1

mL de muestra utilizando como diluyente agua destilada, posteriormente se tomaron 10 µL de la

dilución de cada muestra y se colocaron en un hematocímetro (cámara de Neubauer) para el

conteo (Díaz, 2006).

La cantidad de células individuales o en gemación se contaron en los 4 cuadrantes de la

cámara de Neubauer. Se determinó el promedio por cuadrante y se calculó la cantidad de células

por mililitro (cel/mL), ajustando la cantidad de cada cepa a 3.7 x 109 cel/mL en 500 mL por medio

de diluciones con el sustrato sin levaduras, para adicionar 2 L de inóculo en el concentrado del T3.

Manejo de los Animales

Previo al inicio del experimento los becerros fueron pesados e identificados con arete

plástico, vacunados vía intramuscular (IBR, DVB, PI3, VRSB) con una dosis de 2 mL/animal,

desparasitados interna y externamente vía subcutánea con Ivermectina 1 % (1 mL/50 kg de PV).

Posteriormente, fueron divididos al azar en tres grupos de nueve becerros, cada grupo estuvo

formado por tres corrales (18 m2) con piso de tierra, provistos con bebedero y comedero alojando

tres animales cada uno, con disponibilidad permanente de agua y alimentados ad libitum una vez

al día a las 9:00 h. Se utilizaron tres dietas de crecimiento durante el experimento (NRC, 1996),

ofreciendo 1.2 kg de HA y 1.7 kg de EM en base a materia seca (MS), adicionando 1.2 kg de MS

de concentrado por animal por día según el tratamiento correspondiente. Cada 14 d se ajustó el

101

consumo de alimento, pesando el alimento ofrecido y rechazado por tres días consecutivos,

donde únicamente se aumentaron los kg de HA y EM en un 15 %, asegurando la disponibilidad de

la dieta durante todo el día.

Un becerro fue descartado de la prueba, debido a causas ajenas al efecto de tratamiento,

por lo que el tamaño de muestra del T3 fue de 8 becerros.

Toma de Muestras

Temperatura ambiental. La temperatura ambiental (TA) máxima y mínima se registró

diariamente con un termómetro de mercurio a las 7:00 am y 1:00 pm.

Comportamiento productivo. Las variables de la prueba de comportamiento se midieron

al inicio y cada 28 d durante todo el experimento, pesándose individualmente a los becerros los

días 1, 28, 56 y 84 de la prueba, utilizando una báscula REVUELTA® con capacidad de 1500 kg

para conocer su peso vivo (PV). El alimento ofrecido y el rechazado fueron registrados tres días

consecutivos por corral a mitad de cada periodo de pesaje mediante una báscula manual PEXA,

para calcular el consumo de materia seca (CMS), ajustándose a un rechazo de un 10 %.

Para calcular la ganancia diaria de peso (GDP) se realizó una resta entre pesos

consecutivos y el producto se dividió entre 28, siendo el número de días que transcurrieron entre

un pesaje y otro. La información obtenida sobre el CMS y GDP fue usada para determinar la

conversión alimenticia (CA), la cual es la cantidad resultante entre la cantidad de alimento

consumido y la ganancia de peso en un periodo de 28 d.

Muestras sanguíneas. Por animal se colectaron cuatro tubos de muestra de sangre por

punción directa de la vena yugular después del pesaje individual y antes que recibieran la dieta

durante la mañana, estas muestras se preservaron en hielera abastecida con hielo.

102

Determinación de minerales en suero. Para la medición de Zinc (Zn), Manganeso (Mn) y

Cobre (Cu) se colectaron dos tubos Vacutainer® (sin anticoagulante), al inicio y cada 28 d de la

prueba. Las muestras obtenidas fueron centrifugadas a 3500 xg durante 10 min a 4 ºC para

extraer el suero sanguíneo; se colectó el sobrenadante en viales color ámbar de 10 mL

previamente marcados y posteriormente se congelaron a - 20 ºC hasta realizar su análisis. Previo

a su medición, se descongelaron en refrigeración a 4 ºC, posteriormente se tomaron tres

submuestras de 2 mL para cada mineral (Zn, Mn y Cu) en tubos (BD Falcon) de 5 mL,

adicionándole ácido tricloroacético (ATCA) al 20 % (1 mL ATCA: 1 mL de suero), mezclándose en

vórtice (Vortex Genie II) por 10 segundo (s) para después centrifugar a 3500 xg durante 10 min y

4 ºC para obtener un sobrenadante desproteinizado, posteriormente la cantidad de sobrenadante

se diluyó con agua destilada en la misma proporción (1 mL:1 mL).El análisis fue realizado con

estándares preparados con glicerol para mantener las características de viscosidad de las

muestras diluidas. Todas las soluciones utilizadas fueron preparadas con agua tridestilada.

La solución estándar de Zn (ZnSO4·7H2O) fue preparada con 1.09 g diluidos en 250 mL de

agua tridestilada, adicionando el 5 % de glicerol; el estándar de Mn (MnSO4·H2O) fue preparado

con 0.77 g diluidos en 250 mL de agua tridestilada, adicionando el 10 % de glicerol; y la solución

estándar de Cu (CuSO4·H2O) fue preparada con 9.71 mL diluidos en 100 mL de agua destilada,

adicionando 10 % de glicerol. Las soluciones de trabajo de los estándares fueron preparadas un

día antes de analizar las muestras. Todas las muestras fueron analizadas por duplicado por medio

de espectrofotometría de absorción atómica (AAnalyst 200, Perkin-Elmer instruments), siguiendo

las recomendaciones de Makino y Takahara (1981) reportando los resultados en partes por millón

(ppm).

103

Medición de la actividad antioxidante en plasma (AA). Para la medición de actividad

antioxidante (AA) se colecto una muestra en tubo Vacutainer® (7.2 mg de EDTA como

anticoagulante) al inicio y cada 28 d del experimento. Las muestras destinadas para determinar

AA, se trasladaron al laboratorio de nutrición animal de la Facultad de Zootecnia y Ecología donde

fueron centrifugadas a 3500 xg por 10 min a 4 ºC, el plasma se decantó en viales color ámbar de

una capacidad de 10 mL, previamente rotulados, posteriormente se congelaron a - 20 ºC hasta el

momento de su medición. Esta variable se analizó con la técnica desarrollada por Benzie y Strain

(1996), la cual tiene como objetivo medir la habilidad del plasma para reducir el fierro o FRAP por

sus siglas en inglés (Ferric Reductive Ability of Plasma). Esta técnica se realiza por colorimetría,

diluyendo las muestras de plasma en agua destilada y metanol (73.75 % de agua destilada, 25 %

de metanol y 1.25 % de plasma).

Para la medición de AA se prepararon tres soluciones: 1.- Solución búfer (300 mM de

C2H3NaO2·3H2O, pH 3.6) se agregaron 3.1 g de acetato de sodio trihidratado, se añadieron 16 mL

de ácido acético glacial (C2H4O2) y se aforó a 1 litro (L) con agua destilada, esta solución se

preservó a 4 ºC; 2.- Solución de ácido clorhídrico (HCl) 40 mM, se adicionó 1.46 mL de HCl

concentrado en un matraz de 1 L, aforándose con agua destilada, esta solución se preservó a

temperatura ambiente; 3.- Solución tris-piridil-triacina (TPTZ; 10 mM/L de 2,4,6-trispyridyl-s-

triazine), se mezclaron 0.031 g de TPTZ en 10 mL de la solución 2, este reactivo se preparó al

momento en que fue utilizado; 4.- Solución de cloruro férrico hexahidratado (20 mM de

FeCl3·6H2O), se mezclaron 0.054 g en 10 mL de agua destilada, esta solución se preparó un día

antes de ser utilizada y se preservó en refrigeración (4 ºC).

104

La solución FRAP estuvo compuesta por las soluciones 1, 3 y 4 en una relación de 10:1:1

(v/v/v), este reactivo fué preparado al momento en que fueron preparadas las muestras para su

análisis, ya que no puede ser preservado.

La solución estándar para la curva de calibración se preparó con 0.0417 g de sulfato

ferroso heptahidratado (FeSO4·7H2O) diluido en 50 mL de metanol grado HPLC (CH3OH), con

esta mezcla se prepararon muestras de 0.0 (blanco), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 mL, a dichas

cantidades se les agregó metanol (excepto a la última) hasta completar 1 mL y posteriormente a

cada una se le adicionó 3 mL de agua destilada, se agitaron en vórtice por 10 s, posteriormente

cada punto de la curva se analizó por triplicado, extrayendo 200 µL de cada punto y adicionándole

1,800 μL se solución FRAP por cada tubo del triplicado, nuevamente se agitaron en vórtice y

después de 10 min de reposo a temperatura ambiente se procedió a tomar la lectura en un

espectrofotómetro Junior® II Coleman modelo 6/20 a una absorbancia de 593 nanómetros (nm).

Con los datos que se obtuvieron se elaboró una curva de predicción en base a una ecuación de

regresión.

Una vez descongelado el plasma se procedió a preparar las muestras, se tomaron 7 μL de

plasma y se añadieron a un tubo en el que previamente se habían adicionado 200 μL de agua,

enseguida se agregaron 195 μL de metanol y se mezclaron en vortex, a dicha mezcla se le

añadieron 2,000 μL de solución FRAP, pasados 10 min de reposo se procedió a tomar la lectura a

una absorbancia de 593 nm. El blanco se preparó de la misma forma que las muestras, excepto

que se le adicionaron 7 μL de agua destilada, las muestras y el blanco se prepararon por

triplicado. Con la ecuación y la cantidad de absorbancia de la muestra, se calculó la AA por

micromolar (µm) de plasma sanguíneo, los resultados se expresaron en micromolar equivalentes

a Fe2 (µm Fe2).

105

Biometría hemática (BH). Para analizar biometría hemática (BH) se colecto un tubo

Vacutainer® (7.2 mg de EDTA como anticoagulante) los días 56 y 84 del experimento. Se

determinaron diferentes componentes sanguíneos en cantidad, porcentaje y peso, siendo los

siguientes: Leucocitos (Leu), Neutrófilo (Neu), Linfocitos (Lin), Células mixtas (Cm), Eritrocitos

(Er), Hemoglobina (Hem), Hematocrito (Hto), Volumen corpuscular medio (VCM), Hemoglobina

corpuscular medio (HCM), Concentración de hemoglobina corpuscular medio (CHCM) y Plaquetas

(Pq).

Las muestras para BH se enviaron a las instalaciones de ASSAY Laboratorio Clínico S. de

R. L. de C. V., donde realizaron su análisis mediante un citómetro Beckman Coulter®/act/dif/1al.


Las variables de la prueba de comportamiento, como el PV, CDA, GDP y CA se analizaron

tomando como efecto fijo el tratamiento y el peso inicial como covariable en un diseño

completamente al azar. Por otra parte, se analizaron Zn, Mn, Cu, AA y BH tomando como efectos

fijos tratamiento y muestreo, y su interacción, y como efecto aleatorio al animal, se utilizó la

prueba de Tukey para establecer las posibles diferencias entre las medias de los tratamientos

(Steel y Torrie, 1997).

106


Temperatura Ambiental

La TA promedio que se registró durante los meses transcurridos en este experimento, se

muestra en el (Cuadro 13). La TA es probablemente la variable más investigada y al mismo

tiempo la más utilizada como indicador de estrés. Los efectos de la temperatura ambiente sobre el

rendimiento de los animales han sido estudiados ampliamente en el ganado bovino (Mujibi et al.,

2010), y se ha encontrado que un animal dentro de su capacidad genética y fisiológica, se ajusta

continuamente para enfrentar los cambios ambientales (Young et al., 1989). Por otro lado, Arias

(2006) mencionó que la temperatura ambiente efectiva de confort es el estado constante de

temperatura corporal, la cual puede ser mantenida sin necesidad de ajustes fisiológicos o de

comportamiento.

En este estudio es probable que los animales hayan experimento un cuadro de estrés por

frío, y como respuesta incrementaron el consumo de alimento para generar calor metabólico lo

que coincide con Young (1983) quien reporto que animales expuestos a bajas temperaturas

desencadenan diversos mecanismos de termorregulación donde los requerimientos para

mantenimiento permanecen sin cambios hasta que la temperatura crítica sea superada; por el

contrario, puede provocar daños de tejidos, del sistema inmune y disminución en la respuesta

reproductiva y de crecimiento (Moberg, 1987).

Prueba de Comportamiento

Se observó un efecto significativo (P<0.05) sobre el CDA y CA como consecuencia de la

dieta (Cuadro 14). Los becerros del T3 fueron superiores (P<0.05) en el CDA (8.512 ±0.12 kg/d) y

en la CA (1.530±0.03) que aquellos que se les ofreció bagazo de manzana fermentado y la dieta

testigo.

107

Cuadro 13. Temperatura ambiental promedio registrada durante el experimento

Fecha Día de muestreob Temperatura °Ca

Máxima Mínima

17-Febrero / 01-Marzo 1 24.3 -7.3

02-Marzo / 30-Marzo 28 27.2 -3.0

31-Marzo / 27-Abril 56 30.4 0.9

28-Abril / 25-Mayo 84 30.7 2.6

Promedio 28.1 -1.7

a La temperatura máxima y mínima corresponde al promedio registrado en el transcurso de los días de las fechas indicadas. b Son los días de muestreo durante el tiempo que duró el experimento.

108

Cuadro 14. Medias (± EE) del comportamiento productivo de becerros alimentados con tres dietas

diferentes.

Variables Tratamientos1

T1 T2 T3

Peso vivo, kg 184.96±4.34ª 178.34±4.36ª 183.60±4.61ª

CDA, kg/d 7.89±0.12b 7.54±0.12b 8.51±0.12ª

GDP, kg/d 0.86±0.05ª 0.79±0.05ª 0.85±0.05ª

CA 1.39±0.03b 1.38±0.03b 1.53±0.03ª

a,b Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de manzana fermentado (BMZN); T3 = HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL).

109

Sin embargo, a pesar de que los becerros que recibieron un IL en su dieta mostraron un efecto

sobre CDA y CA, no hubo (P>0.05) diferencia en PV y GDP al compararse con los otros dos

tratamientos. Es posible que el IL haya estimulado el crecimiento numérico de las bacterias celulolíticas

e incrementado la fermentación de la fibra a nivel ruminal, aumentando así el consumo de alimento sin

mejorar el PV y GDP.

De acuerdo con otras investigaciones, el aumento en el consumo diario de alimento observado

es resultado de un incremento en la degradación ruminal de la fibra por efecto de la adición del cultivo

de levadura (Newbold et al.,1996), lo que parece estar asociado al estímulo en crecimiento y actividad

de las bacterias celulolíticas, incrementando el flujo de proteína hacia el intestino delgado por lo que se

espera un mejor desarrollo del animal por tener más disponibilidad de nutrientes (Biricik y Turkmen,

2001). Young (1983) indicó que animales expuestos a condiciones de frío por abajo de la temperatura

corporal crítica, está asociada con la aclimatación metabólica, lo que se traduce en mayor producción

de calor para mantener las funciones vitales del organismo. Delfino y Mathison (1991) reportaron

evidencia de que las bajas temperaturas provocan un comportamiento pobre en términos de eficiencia

alimenticia.

En el presente estudio, posiblemente la TA extrema que se registró durante el desarrollo de la

prueba limitó la expresión del potencial productivo de los animales. La menor producción durante el

invierno está asociada a mayor demanda de energía para mantenimiento y menor digestibilidad del

alimento (Arias et al., 2008) por incremento en la actividad de la glándula tiroides que influye en el tracto

gastrointestinal, causando incremento de la motilidad intestinal y tasa de pasaje de los alimentos (NRC,

1996). En otro estudio mencionaron que el consumo de alimento se incrementó en invierno sin tener

efecto en la eficiencia alimenticia, por lo que la energía del alimento fue dirigida para mitigar los efectos

110

de las condiciones climáticas adversas, tales como, incrementar la producción de calor o la acumulación

de grasa corporal para ayudar a disminuir la perdida de calor (Mujibi et al., 2010).

Concentración de Minerales en Suero

Zinc. El (Cuadro 15) presenta la concentración en suero sanguíneo, mostrando significancia

(P<0.05) el día de muestreo. El Zn superó el nivel más alto dentro de la especie, excepto el día 56,

siendo este día donde los tres tratamientos registraron la concentración más baja (P<0.05), con valores

de 11.14±2.77, 10.56±2.81 y 12.30±2.90 µmol/L para el T1, T2 y T3, respectivamente. Así mismo, al

final del experimento el T2 reveló diferencia (P<0.05) mostrando 22.29±2.81 µmol/L, inferior al 1 y 28 d

de muestreo, pero superior al 56 d. Los valores de referencia para el Zn van desde 13.96 a 16.43

μmol/L (McDowell y Arthington, 2005).

La concentración de Zn mostró significancia al incrementarse los niveles cuando se presentaron

las temperaturas más bajas. El rol específico del Zn en en la respuesta inmune no está completamente

claro, sin embargo, se considera esencial para la integridad del sistema inmune (Hambridge et al.,

1986). Murray et al., (2000) mencionaron que el Zn es un componente estructural de la enzima

superóxido dismutasa (SOD), la cual ayuda a eliminar los radicales libres producidos en el cuerpo

durante una respuesta inmune. Droke y Spears (1993) publicaron que la respuesta inmune de corderos

alimentados con deficiencia marginal de zinc (8.7 mg/kg MS) en su dieta, no revelaron diferencias con

respecto a los corderos que recibieron cantidades adecuadas de zinc (44.0 mg/kg MS). Sin embargo, en

este estudio se obtuvieron los límites fisiológicos más bajos el día 56 de muestreo sin observarse signos

clínicos, lo que concuerda con Cuesta et al., (2011) quienes observaron valores promedio de 13.19

μmol/L inferiores al límite más bajo para la especie con un 87.5 % de los animales por abajo del rango

inferior sin observarse animales físicamente enfermos.

111

Cuadro 15. Medias (± EE) de la concentración de zinc (μmol/L) en suero sanguíneo de becerros

alimentados con tres dietas diferentes

Día de muestreo Tratamientos1

T1 T2 T3

1 31.38±2.77x 31.65±2.81x 31.15±2.90x

28 30.03±2.77x 36.75±2.81x 29.62±2.90x

56 11.14±2.77y 10.56±2.81z 12.30±2.90y

84 29.05±2.77x 22.29±2.81y 24.76±2.90x

x,y,z Medias con diferente literal en columna, son diferentes (P<0.05) entre día de muestreo. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de manzana fermentado (BMZN); T3 = HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL).

112

Spears (2000) reportó que la deficiencia de zinc en corderos disminuye el porcentaje de

linfocitos e incrementan los neutrófilos en la circulación sanguínea; de acuerdo a lo publicado por este

autor, en nuestro estudio la disminución de Zn el día 56 propició una reducción en la cantidad de

linfocitos e incrementan los neutrófilos en la circulación sanguínea; de acuerdo a lo publicado por este

autor, en nuestro estudio la disminución de Zn el día 56 propició una reducción en la cantidad de

linfocitos pero no un incremento en el número de neutrófilos, lo que coincide con lo publicado por

(Hambridge et al., 1986). Cerone et al., (2000) reportaron que la deficiencia de Zinc y Cobre provoca en

bovinos atrofia del bazo y del timo, linfopenia, monocitosis y disminución de la capacidad fagocítica de

los neutrófilos, afecta a las células T y B y por tanto la producción de anticuerpos.

Manganeso. La mayor (P<0.05) concentración de Mn que presentaron los tratamientos fue al

inicio y al final de la prueba (Cuadro 16), sin embargo, el día 28 se observaron las concentraciones más

bajas (P<0.05) con 4.97±2.15, 4.29±2.11 y 7.28±2.22 µmol/L para T1, T2 y T3, respectivamente.

Excepto para el T1 con niveles similares el día 28 y 56 (P>0.05).

La absorción de Mn es influenciada por muchos factores tales como la forma química e

interacciones entre diferentes micronutrientes (Sanchez-Morito et al., 1999). Así mismo, el Mn es otro

antagonista potencial del Cu que afecta su absorción a nivel intestinal (Grace, 1973), limitados estudios

han examinado el efecto antagónico que ejerce el Mn sobre el Cu en dietas de rumiantes. Arredondo et

al., (2003) sugirieron que el Mn y Cu pueden compartir la misma ruta en la absorción y transporte a nivel

intestinal, por medio de la proteína transportadora 1 de metales divalentes lo que los hace competir

entre ellos. En su estudio Ivan y Grieve (1976) encontraron que la adición de 50 mg Mn/kg MS a una

dieta que contenía 12 mg Mn/kg MS resulto en una disminución en la absorción de Cu en el tracto

gastrointestinal de becerros Holstein; sin embargo, la dinámica del antagonismo en rumiantes no está

muy clara.

113

Cuadro 16. Medias (± EE) de la concentración de manganeso (μmol/L) en suero sanguíneo de

becerros alimentados con tres dietas diferentes.

Día de muestreo Tratamientos1

T1 T2 T3

1 22.57±2.15x 21.10±2.11x 21.81±2.22x

28 4.97±2.15y 4.29±2.11z 7.28±2.22z

56 8.50±2.15y 12.56±2.11y 14.92±2.22y

84 22.30±2.15x 23.71±2.11x 23.37±2.22x


114

En el presente estudio, la disminución de Mn y Cu el día 28 de muestreo tal vez se debió a la

alta concentración de Zn que ocurrió el mismo día, siendo el Cu para el día 56 quien propicio la menor

cantidad de Mn y Zn.

Aunque existen otros minerales que pueden provocar su disminución tal como la deficiencia de

Mg puede modificar indirectamente la absorción de Mn por la alteración de la disponibilidad de otros

cationes divalentes tales como Ca, Zn (Planells et al., 1994) y Cu (Jimenez et al., 1997). Sanchez-

Morito et al., (1999) asumieron que la disminución en la concentración de Mn estuvo relacionada a un

incremento en la actividad metabólica en la medula ósea, como un mecanismo para incrementar la

eritropoyesis e intentar compensar la hemolisis inducida por la deficiencia de Mg (Piomelli et al., 1973).

Por otra parte, Jenkins y Hiridoglou (1991) publicaron que el exceso de Mn afecta negativamente el

metabolismo de Fe en bovinos, resultando en una disminución del volumen del paquete celular y de la

hemoglobina, reduciendo la capacidad de unión de Fe en suero.

Cobre. La concentración de Cu de los tres tratamientos sobrepasó el nivel máximo dentro de la

especie durante la prueba (Cuadro 17), excepto en el día 28, este mismo día los tres tratamientos

fueron inferiores (P<0.05) al resto de los días de muestreo (8.04±2.34, 8.32±2.34 y 9.76±2.47 µmol/L

para el T1, T2 y T3, respectivamente). Sin embargo, los tres tratamientos el día 56 revelaron la más alta

(P<0.05) concentración que el resto de los días de muestreo, excepto el día 56 y 84 del T3 los cuales

fueron similares (P>0.05). El rango de valores de referencia para Cu en suero de bovinos es de 11.0 a

18.0 μmol/L (McDowell y Arthington, 2005).

Castillo et al., (2012) mencionaron que el Cu es un elemento traza esencial para los procesos

de respuesta inmune, juega un rol de cofactor para muchas enzimas (citocromo oxidasa,

ceruloplasmina y superóxido dismutasa), por lo que puede realizar varias funciones en el sistema

inmune de las cuales el mecanismo directo de acción no está muy claro (Solaiman et al., 2007).

115

Cuadro 17. Medias (± EE) de la concentración de cobre (μmol/L) en suero sanguíneo de becerros

alimentados con tres dietas diferentes.

Día de muestreo

Tratamientos1

T1 T2 T3

1 22.17±2.34y 24.48±2.34y 23.83±2.47y

28 8.04±2.34z 8.32±2.34z 9.76±2.47z

56 33.36±2.34x 38.06±2.34x 31.29±2.47x

84 23.16±2.34y 20.96±2.34y 29.29±2.47x


116

Se ha observado que animales con deficiencias de Cu pueden tener cupremias dentro de

rango, ya que en los tejidos donde se acumula sigue enviando sus reservas a la circulación (Quiroz-

Rocha y Bouda, 2001). Asimismo, animales con intoxicación crónica por Cu pueden tener acumulación

excesiva principalmente en hígado y los niveles séricos encontrarse dentro de rangos de referencia

(Wikse et al., 1992).

En este estudio, el día 28 de muestreo los tres tratamientos presentaron niveles inferiores a los

límites fisiológicos de la especie, esto tal vez debido al incremento de Zn que haya competido en la

absorción de Cu y repercutido en su concentración, o posiblemente porque el Cu fue incorporado a la

SOD en las células rojas durante la hematopoyesis y vida útil de eritrocitos la cual es alrededor de 150

días (Suttle y McMurray, 1983).

En otro estudio, Cuesta et al., (2011) diagnosticaron valores promedio de Cu de 11.5 μmol/L y el

40 % de sus bovinos presentaron valores inferiores al límite crítico de 11.0 μmol/L sin presentar signos

clínicos. Los rumiantes en su mayoría, excepto el ovino, tienen alta capacidad de almacenar Cu en el

hígado (Mertz y Davis, 1987), esto se debe a su capacidad de síntesis de metalotioneínas que ayudan a

retener al Cu y otros minerales en el hepatocito (Gooneratne et al., 1989). Durante la hipocuprosis

disminuye la actividad de enzimas Cu dependientes como la citocromo oxidasa, que es necesaria para

la actividad fagocítica y de la superóxido dismutasa (SOD), lo que reduce la vida media de los

leucocitos al ser estas células dependientes de esta enzima y todo ello causa predisposición de

enfermedades infecciosas y virales afectándose negativamente el sistema inmunológico del animal y

con ello la capacidad de respuesta a la infección (Spears, 2003).

Actividad Antioxidante

La mayor AA (P<0.05) se observó al inicio del experimento en los tres tratamientos, mostrando

un incremento significativo (P<0.05) el T2 (15.99±0.03 µmol/L) al compararse con el T1 y T3, sin

117

embargo, el T1 el día 84 fué inferior (P<0.05) al T2 y T3 (15.62±0.03 µmol/L). Así también, el día 28 y

56 el T2 y T3 fueron similares entre sí, pero inferiores (P<0.05) al día 1 y 84 de la prueba (Cuadro 18).

Tanaka et al., (2008) mencionaron que el estrés por calor estimula la producción de radicales libres y

especies reactivas de oxigeno (ROS). Por otra parte, el estrés oxidativo corresponde a un desequilibrio

entre la tasa de producción de oxidantes y la de su degradación (Sorg, 2004).

Los resultados del presente estudio, mostraron que al exponer los becerros al frío en los

primeros días del experimento, los niveles de los minerales y BMZN del T2 ejercieron efecto sobre las

enzimas antioxidantes, disminuyendo la liberación de ROS en los becerros, pudiendo protegerlos de un

estrés oxidativo, mostrando el mismo patrón el día 84 para los T2 y T3. Lo que coincide con Prior y Cao

(1999) quienes publicaron que un incremento en la producción de ROS puede causar una disminución

en la capacidad antioxidante total in vivo. Rodríguez (2008) reportó que ovinos engordados con una

dieta con manzarina, presentaron un incremento de AA con respecto al grupo testigo (24.34 y 21.79

μmol/L). En otro estudio Gallegos (2007) publicó que vacas Holstein en producción alimentadas con

manzarina, mostraron mayor AA (22.52 μmol/L) con respecto al grupo control (18.65 μmol/L) al final de

la prueba reportaron que los bovinos requieren alrededor de 3 o 4 días después de iniciado un cambio

calórico para disminuir totalmente los efectos de la carga calórica, seguido de una recuperación del

poder total antioxidante en su cuerpo (Worapol et al., 2011).

Biometría hemática

El Cuadro 19 y 20 muestran los niveles hematológicos y los parámetros de referencia. Los

leucocitos (Leu), linfocitos (Lin), volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media

(HCM) y plaquetas (Pq) presentaron efecto (P<0.05) del día de muestreo; los neutrófilos (Neu) en % y

µL presentaron diferencia (P<0.05) entre tratamientos.

118

Cuadro 18. Medias (± EE) de la actividad antioxidante (μmol/L FeSO4)2 en plasma sanguíneo

de becerros alimentados con tres dietas diferentes.

Día de muestreo

Tratamientos1

T1 T2 T3

1 15.73±0.03b x 15.99±0.03a x 15.81±0.03b x

28 15.62±0.03a y 15.64±0.03a z 15.62±0.03a z

56 15.58±0.03a y 15.61±0.03a z 15.62±0.03a z

84 15.62±0.03b y 15.72±0.03a y 15.71±0.03a y

ab Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. x,y,z Medias con diferente literal en columna, son diferentes (P<0.05) entre día de muestreo.

1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de manzana fermentado (BMZN); T3 = HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL).

2 µmol/L FeSO4 (micromolar de actividad reductiva de FeSO4), por litro de plasma sanguíneo.

119

Leucocitos y linfocitos. Las concentraciones de Leu y Lin el día 84 de muestreo presentaron

aumento significativo (P<0.05) en el T1 y T2 mostrando 9.82±0.95 y 11.11±0.95 x 103/µL para Leu y

7.30±0.92 y 8.73±0.92 x 103/µL para Lin, respectivamente.

Cabe mencionar que el T2 y T3 superaron el nivel máximo dentro de la especie en Lin (Cuadro

19). Los becerros que recibieron IL en su dieta mantuvieron la cantidad de Leu y Lin cerca del nivel

máximo para estas variables, sin mostrar variaciones significativas a través del tiempo.

El día 56 de muestreo fue donde se observó la menor cantidad de Leu y Lin, tal vez debido a la

presencia de un cuadro de estrés, provocado por las bajas temperaturas promedio registradas durante

los días 1, 28 y 56 (- 7.3, -3.0 y 0.9 ºC) del experimento seguido por la disminución en la concentración

de Zn, Mn y AA lo que repercutió en la disminución de estas células exponiendo a los becerros a una

liberación de ROS. Sin embargo, el día 84 incrementaron la cantidad de células blancas, minerales y

AA, lo cual puede relacionarse con la recuperación de su confort, superando el desafío de estrés

térmico sin haber mostrado signos clínicos adversos.

Gupta et al., (2007) mencionaron que existe una estrecha relación entre el perfil de leucocitos y

el nivel de glucocorticoides plasmáticos durante el estrés fisiológico; estas hormonas pueden actuar

incrementando el número y porcentaje de neutrófilos, mientras que disminuyen los linfocitos (Blanco et

al., 2009). Buckham et al., (2008) publicaron que los linfocitos circulantes se adherían a las células

endoteliales que cubren las paredes de los vasos sanguíneos como respuesta al incremento de los

glucocorticoides durante el estrés, y posteriormente pasan de la circulación a tejidos como los ganglios

linfáticos, médula ósea, bazo y piel donde son retenidos, produciendo por lo tanto una disminución del

número de linfocitos circulantes.

120

Cuadro 19. Medias (± EE)2 de células blancas de biometría hemática de becerros alimentados con tres dietas diferentes.

Células Día de

muestreo

Tratamientos1 Valores de

BH3 T1 T2 T3

Leucocitos (103/µL) 56 7.58±0.95y 8.18±0.95y 9.65±1.00y

4-12 84 9.82±0.95x 11.11±0.95x 10.80±1.00y

Neutrófilos (%) 56 3.22±0.76b 6.67±0.76a 5.87±0.80a

15-45 84 4.44±0.76a 4.22±0.76a 5.00±0.80a

Linfocitos (%) 56 65.00±4.69 73.00±4.69 74.00±4.97

45-75 84 74.44±4.69 76.89±4.69 71.50±4.97

Cél. Mixtas (%) 56 31.78±4.51 20.33±4.51 20.12±4.78

2-20 84 21.11±4.51 18.89±4.51 23.50±4.78

Neutrófilos (103/µL) 56 0.24±0.08b 0.53±0.08a 0.61±0.09a

0.6-4 84 0.43±0.08a 0.48±0.08a 0.56±0.09a

Linfocitos (103/µL) 56 4.84±0.92y 5.99±0.92y 7.12±0.98y

2.5-7.5 84 7.30±0.92x 8.73±0.92x 7.75±0.98y

Cél. mixtas (103/µL) 56 2.49±0.40 1.65±0.40 1.91±0.42

0-2.4 84 2.09±0.40 1.90±0.40 2.49±0.42

ab Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. xy Medias con diferente literal en columna, son diferentes (P<0.05) entre día de muestreo. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de manzana fermentado (BMZN); T3 = HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL). 2 Medias sin literal en fila y columna, no mostraron diferencia (P>0.05). 3 Valores de biometría hemática de bovinos.

121

Cuadro 20. Medias (± EE)2 de células rojas de biometría hemática de becerros alimentados con tres dietas diferentes.

Células Día de

muestreo

Tratamientos1 Valores

de BH3 T1 T2 T3

Eritrocitos (106/µL) 56 5.14±0.41 5.40±0.41 5.32±0.44

5-10 84 5.51±0.41 6.54±0.41 5.92±0.44

Hemoglobina (g/dL) 56 11.45±0.50 11.33±0.50 11.72±0.53

8-15 84 11.20±0.50 12.62±0.50 11.60±0.53

Hematocrito (%) 56 38.42±2.41 34.02±2.41 33.77±2.56

24-46 84 33.60±2.41 37.87±2.41 34.80±2.56

VCM (fL) 56 73.78±3.26x 63.51±3.25x 64.09±3.45x

40-60 84 61.87±3.26y 59.69±3.25x 59.31±3.45x

HCM (Pg) 56 22.50±0.86x 21.15±0.86x 22.36±0.91x

11-17 84 20.17±0.86y 19.89±0.86x 19.77±0.91y

CHCM (g/dL) 56 31.47±1.07 33.29±1.07 35.35±1.14

30-36 84 33.30±1.07 33.30±1.07 33.30±1.14

Plaquetas (105/µL) 56 5.69±0.37x 5.67±0.37x 4.35±0.40x

1-8 84 2.41±0.37y 2.70±0.37y 2.06±0.40y

xy Medias con diferente literal en columna, son diferentes (P<0.05) entre día de muestreo. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de manzana fermentado (BMZN); T3 = HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL). 2 Medias sin literal en fila y columna, no mostraron diferencia (P>0.05). 3 Valores de biometría hemática de bovinos.

122

En otra investigación, Rodríguez (2008) reportó que ovinos engordados con manzarina en su

dieta, presentaron un incremento de leucocitos (9.49 y 8.78 103/μL) al finalizar la prueba. Gallegos

(2007) publicó que vacas Holstein en producción alimentadas con y sin manzarina, no presentaron

efecto (P>0.05) en la cantidad de leucocitos en sangre.

Neutrófilos. Los tres tratamientos durante la prueba estuvieron por abajo del límite inferior de

Neu en porcentaje y concentración, excepto el T3 al día 56. A pesar de este comportamiento, el T1

presentó la menor (P<0.05) cantidad de Neu el día 56 (3.22±0.76 % y 0.24±0.08 x 103/µL), con

respecto al resto de los tratamientos (Cuadro 19).

La baja cantidad de Neu tal vez se debió a la baja concentración de Zn y Mn el día 56, sin lograr

alcanzar la cantidad óptima al final de la prueba a pesar del incremento de los minerales en mención.

Por otra parte, aún y cuando estuvieron por abajo del límite inferior, el T1 el día 56 fue el más

perjudicado con respecto al T2 y T3. Aunado a esto, se observó que los animales del T2 y T3 mostraron

mayor nivel de Neu que el T1 durante la prueba. Rodríguez (2008) reportó efecto de sexo en ovinos

alimentados con manzarina, donde las hembras que recibieron manzarina tuvieron mayor cantidad de

neutrófilos que los machos (59.2 y 50.2 %, respectivamente) del grupo control. Por otro lado, Gallegos

(2007) no encontró diferencia en vacas Holstein en producción alimentadas con y sin manzarina (34.27

y 35.98 %). Romero et al., (2011) mencionaron que los neutrófilos proliferan en la circulación como

respuesta a infecciones, inflamaciones y al estrés; disminuyendo en ciertas infecciones y estados de

anafilaxia. Por otro lado, los glucocorticoides de animales estresados estimulan el flujo de neutrófilos

desde la médula ósea hacia la sangre y reducen el paso de estos hacia otros compartimentos,

generando un incremento de neutrófilos maduros e inmaduros en la circulación sanguínea (Buckham et

al., 2008).

123

Volumen corpuscular medio. Los valores de VCM de los tres tratamientos el día 56 superaron

el nivel máximo dentro de la especie, así mismo, el VCM del T1 el día 84 aún y cuando fué inferior

(61.87±3.26 fentolitros (fL) al día 56, sobre pasó el nivel máximo (Cuadro 20).

La alta cantidad de VCM que se observó el día 56 y 84 de la prueba en el T1, tal vez le

perjudicó la baja cantidad de Zn, Mn y AA, lo que pudo haber incrementado una reacción inflamatoria y

anemia macrocítica. El incremento del VCM es un indicador de anemia macrocitica, mientras los

eosinófilos disminuyen ante el aumento a la reacción inflamatoria (Rodostitis et al., 2000). En este

estudio puede ser que haya existido una disminución de la concentración de Fe por efecto de los

niveles altos de Mn y Cu mostrados en esta investigación, lo que coincidió con lo publicado de Reeves

et al., (2004). Así mismo, Jenkins y Hiridoglou (1991) mencionaron que altas concentraciones de Mn

afectan el metabolismo de Fe en bovinos, resultando en una disminución del volumen del paquete

celular y de la hemoglobina, lo que reduce la capacidad de unión de Fe en suero. Por otro lado,

Rodríguez (2008) encontró un comportamiento similar al adicionar manzarina en la dieta de ovinos,

donde los animales suplementados disminuyeron la cantidad de VCM en comparación con el grupo

testigo (32.99 y 33.57 fL) pero sin desviarse de los valores normales dentro de la especie. En otro

estudio, Coppo y Mussart (2006) no encontraron efecto significativo al suplementar vaquillas con orujo

de citrus en época invernal durante 90 días con respecto al grupo control (46.5 y 47.0 fL).

Hemoglobina corpuscular media. Los niveles de HCM de los tres tratamientos en los dos días

de muestreo superaron el nivel máximo de referencia (Cuadro 20), el día 84 el T1 y T3 disminuyeron

(P<0.05) con respecto al día 56 (20.17±0.86 y 19.77±0.91 picogramos (Pg), respectivamente), pero

superaron lo reportado por Aiello y Mays, 2000. Existen reportes que la HCM indica la concentración de

hemoglobina en base a la cantidad de glóbulos rojos, de manera similar a lo que indica la concentración

de hemoglobina corpuscular media (CHCM), aunque esta última es la que se considera más adecuada.

124

Rodríguez (2008) encontró diferencia significativa entre sexo de ovinos y muestreo, donde los machos

fueron superiores a las hembras (12.74 y 12.10 Pg), así mismo, superaron el rango mayor dentro de la

especie. En otro estudio, Coppo y Mussart (2006) encontraron efecto significativo al suplementar

vaquillas con orujo de citrus en época invernal durante 90 d con respecto al grupo control (16.6 y 14.5

fL, respectivamente).

Plaquetas. La cantidad de Pq de los tres tratamientos (Cuadro 20) fue mayor (P<0.05) el día 56

con respecto al día 84 (5.69±0.37, 5.67±0.37 y 4.35±0.40 x 105/µL para el T1, T2 y T3,

respectivamente). Las Pq presentaron efecto de muestreo, el día 56 fué donde se observaron las

mayores cantidades, lo que pudo deberse al incremento de anticuerpos que se observaron durante la

prueba, como lo han indicado otros estudios. Aiello y Mays (2000) mencionaron que la disminución en la

producción de plaquetas puede deberse a fármacos, toxinas y en algunos casos a la actividad

inmunológica, debido a la producción de anticuerpos que se pueden unir a la superficie de las mismas.

Los tres tratamientos mostraron la menor cantidad de Pq el día 84, debido tal vez al incremento

numérico de glóbulos blancos observados. Rodríguez (2008) reportó un efecto entre sexo de ovinos y

muestreo, donde los machos en el segundo muestreo fueron superiores que las hembras mostrando

valores de 7.6 y 5.4 x 103/μL. Por otro lado, Gallegos (2007) no encontró diferencia (P>0.05) en la

cantidad de plaquetas al suplementar vacas Holstein en producción con y sin manzarina (4.5 y 3.8 x

103/μL).

125


Bajo las condiciones en las que se realizó este trabajo, se concluye que la adición de un inoculo

de levaduras en la dieta de becerros en crecimiento aumentó el CDA y CA.

A temperaturas ambientales bajas se observó la mayor concentración de Zn en suero

sanguíneo, disminuyendo el Mn y Cu el día 28. Así mismo, los becerros que recibieron BMZN e IL

tuvieron mayor AA al final de la prueba. Sugerimos que este comportamiento se debió a que

favorecieron a las enzimas antioxidantes y por lo tanto disminuyeron la liberación de ROS.

Los leucocitos, linfocitos, VCM, HCM y plaquetas mostraron diferencia a través de los días de

muestreo. Así mismo, el T1 presentó menor cantidad de Neu en % y en µL el día 56. Estos cambios

indican a que el estrés térmico ocurrido en los animales, perjudicó a las células blancas disminuyendo

su cantidad e incrementando el número de células rojas.

Es recomendable que se realice más investigación con los suplementos de BMZN e IL,

exponiendo a los becerros precozmente destetados a temperaturas menos estresantes.

127

RESUMEN

El objetivo fue evaluar el efecto en la fermentación in vitro de dietas con la adición de un inóculo

de levaduras y bagazo de manzana fermentado para becerros en crecimiento. Los tratamientos

consistieron en: T1 (testigo): heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2: HA + EM

+ concentrado + bagazo de manzana (BMZN) y T3: HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL).

Las variables evaluadas fueron, determinar la digestibilidad de materia seca (MS), fibra detergente

neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA) y el contenido de lignina detergente ácido (LDA), el volumen

de producción de gas, la concentración de ácido acético, propiónico y butírico, nitrógeno amoniacal (N-

NH3), ácido láctico y pH. La digestibilidad in vitro se realizó a las 48 h, en tanto que para el resto de las

variables a las 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h. Se realizó un diseño completamente al azar, las variables de

la digestibilidad de la fibra se analizaron con un modelo estadístico que incluyó como efecto fijo el

tratamiento, la concentración de ácidos grasos volátiles, N-NH3, ácido láctico y pH fueron analizadas

con un modelo que incluyó como efectos fijos tratamiento y hora. Para producción de gas se

consideraron como efectos fijos tratamiento, hora y su interacción. La mayor digestibilidad (P<0.05) de

MS (72.02 y 72.49 %), FDN (70.77 y 70.25 %), FDA (64.07 y 64.56 %) y el menor contenido de LDA

(4.25 y 4.14) lo mostraron el T2 y T3. El T3 fue superior (P<0.05) en el volumen de producción de gas

con valores de 4.20, 5.93, 6.73 y 7.33 mL/0.2 g de MS a la hora 24, 48, 72 y 96, respectivamente. La

mayor concentración (P<0.05) de AGV la presentaron el T2 y T3 (con valores para acético, propiónico y

butírico de 16.00 y 17.19, 6.54 y 6.13, 2.63 y 2.67 mmol/L, respectivamente). El T2 y T3 mostraron un

incremento (P<0.05) al finalizar la fermentación in vitro en la concentración de N-NH3 (0.21 y 0.22

mM/mL) y una disminución (P<0.05) de ácido láctico (1.46 y 1.37 mM/mL), en tanto que el T3 presentó

un incremento (P<0.05) del pH (6.74). Se concluye que el adicionar BMZN e IL a la dieta de becerros en

128

crecimiento favorece la digestibilidad de MS, FDN y FDA, disminuyendo el contenido de LDA,

incrementan la concentración de AGV y N-NH3, provocando una disminución de ácido láctico.

129



Esta investigación fue realizada en las instalaciones de la Facultad de Zootecnia y Ecología de

la Universidad Autónoma de Chihuahua, Chih., México, ubicada en las coordenadas 28º 35' 07'' latitud

norte y 106º 06' 23'' longitud oeste, con una altitud de 1,517 msnm, según el sistema de

posicionamiento global (GPS por sus siglas en inglés, MAGELLAN®, MobileMapper-Pro). La

temperatura media anual es de 18.2 ºC, con una media máxima de 37.7 ºC y una media mínima de -7.4

ºC. La precipitación promedio anual es de 387.5 mm, con 71 días de lluvia al año y una humedad

relativa del 49 %; predominando un clima semiárido extremoso (INAFED, 2008).

Descripción de los Tratamientos

Para el desarrollo de este experimento se utilizaron las tres dietas ofrecidas a los becerros en

crecimiento como se mencionó en el Experimento IV.

T1 (testigo): heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2: HA + EM +

concentrado + bagazo de manzana fermentado (BMZN); T3: HA + EM + concentrado + inóculo de

levaduras (IL).

Análisis Químico de las Dietas

Con la finalidad de obtener los valores compuestos de la digestibilidad de la materia seca (MS),

fibra detergente neutra (FDN), fibra detergente ácido (FDA) y contenido de lignina detergente ácido

(LDA), se analizó la composición química de las fracciones de las dietas antes mencionadas. Se

colectaron muestras de las dietas cada 15 d para formar muestras compuestas mensualmente. Las

muestras fueron secadas a 60 ºC por 48 h en una estufa de aire forzado y molidas a 1 milímetro (mm)

en un molino Wiley (Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA), estas muestras fueron secadas a 105 ºC

durante 8 h en una estufa de aire forzado para determinar MS absoluta y secuencialmente fueron

130

incineradas a 600 ºC por 4 h en una mufla para determinar cenizas (AOAC, 2000). En las muestras

compuestas de forraje y concentrado se determinó la concentración de FDN, FDA (Van Soest et al.,

1991) y LDA (Goering y Van Soest, 1970). En el análisis de FDN se utilizó sulfito de sodio (Na2SO3) y α-

amilasa termo estable (Ankom Technology) para remover la materia nitrogenada y el almidón.

Digestibilidad in vitro de la MS, FDN, FDA y el Contenido de LDA de la Dieta

Previo a la incubación, las bolsas fueron sumergidas en acetona para eliminar el surfactante de

las mismas que inhiben la digestión microbiana, y posteriormente fueron secadas a temperatura

ambiente. En seguida, se pesaron las muestras compuestas de las dietas (0.45 g ± 0.05) en bolsas filtro

ANKOM® F57 (25 μm de poro y dimensiones de 5 x 4 cm) identificadas y selladas con calor e incubadas

in vitro de acuerdo a la metodología DaisyII (ANKOM Technology Corp., Fairport, NY-USA), la cual

involucra soluciones búfer A y B e inóculo ruminal.

El medio de cultivo se preparó de acuerdo al procedimiento de ANKOM Technology®. La

solución búfer A estuvo compuesta de 10 g/L de KH2PO4, 0.5 g/L de MgSO4·7H2O, 0.5 g/L de NaCl, 0.1

g/L de CaCl2·2H2O y 0.5 g de urea en un litro de agua destilada. La solución búfer B estuvo conformada

por 15 g de Na2CO3 y 1.0 g de Na2S·9H2O en un litro de agua destilada. Para preparar el inóculo, las

dos soluciones fueron precalentadas a una temperatura de 39 ºC y mezcladas en una relación de 5:1

(1330 mL solución A y 266 mL solución B) ajustando el pH a 6.8 a 39 ºC. A esta mezcla de soluciones

se le adicionaron 400 mL de líquido ruminal para obtener una cantidad de 2000 mL, la cual se repartió

en las cuatro jarras del digestor DAISYII (500 mL por jarra), posteriormente, se colocaron las bolsas de

cada muestra por triplicado, agregando un estándar y una bolsa blanco (sin muestra) y se procedió al

análisis de digestibilidad verdadera in vitro durante 48 h a 39 ºC (± 0.5).

Después de la incubación, las bolsas se extrajeron de las jarras y se lavaron con agua de la

llave hasta que el agua saliera clara. Las bolsas se secaron en una estufa de aire forzado durante tres

131

horas a 105 ºC para determinar la digestibilidad de la MS. Posteriormente, se determinó

secuencialmente la FDN y FDA en el aparato ANKOM200 (Ankom Technology Corp., Fairport, NY) de

acuerdo a la metodología descrita por Van Soest et al., (1991) y LDA siguiendo el procedimiento de

Goering y Van Soest (1970).

Obtención del Líquido Ruminal

El líquido ruminal se colectó 15 min antes de la alimentación de los animales, para lo cual se

utilizaron dos vacas Herford provistas de cánula como donadores de inóculo. Estos animales estuvieron

alimentados con una dieta para mantenimiento a base de silo de maíz, teniendo agua fresca a libre

acceso. El inóculo ruminal se adquirió directamente del rumen, con ayuda de 3 pliegues de gasas para

colectar contenido ruminal y depositarlo en un recipiente (2 L) térmico atemperado a 39 ºC adicionando

un puño de digesta ruminal de cada semoviente. Posteriormente se transportó al laboratorio de

Nutrición Animal, donde fue filtrado a través de dos capas de tela filtro, retirando la parte solida de la

tela y depositándola a una licuadora junto con líquido ruminal, licuándolos por 30 s, aplicando bióxido de

carbono (CO2) constantemente para garantizar condiciones de anaerobiosis. La solución licuada junto

con el resto de líquido ruminal fueron filtrados nuevamente y depositados a un recipiente mantenido en

baño maría a 39 ºC y saturado continuamente con CO2. Este procedimiento avala que el inóculo esté

compuesto por microorganismos en el líquido y en la fibra. Finalmente un total de 400 mL de inóculo

ruminal fue depositado a cada una de las jarras de digestión, donde estaba la mezcla de las soluciones

búfer y fueron gaseadas por 30 s con CO2.

Producción de Gas in vitro

La producción de gas (PG) in vitro se realizó mediante el protocolo de Menke y Steingass

(1988), abordando las modificaciones mencionadas por Muro (2007). Esta técnica es ampliamente

132

utilizada para determinar la cantidad de gas producido de un alimento en un periodo de incubación, la

cual está relacionada con la degradación del alimento.

El arreglo de la muestra implica el molido del sustrato en una malla de 1 mm (Menke et al.,

1979). El medio ruminal in vitro estuvo conformado por una solución A (micromineral) con 13.2 g

CaCl2·H2O, 10.0 g MnCl2·4H2O, 1.0 g CoCl2·6H2O y 8.0 g FeCl3·6H2O aforados en 100 mL de agua

destilada; solución B (solución búfer) con 39.0 g NaHCO3 aforado en 1 L de agua destilada; solución C

(macromineral) con 5.7 g Na2HPO4, 6.2 g KH2PO4 y 0.6 g MgSO·7H2O aforados en 1 L de agua

destilada; solución de rezasurina (100 mg de rezasurina) aforado en 100 mL de agua destilada, utilizada

como indicador de anaerobiosis; y finalmente la solución reductora con 4.0 g 1N NaOH y 0.625 g

Na2S·9H2O aforados en 100 mL de agua destilada.

Las soluciones A, B, C y resazurina se agregaron a un frasco con agua destilada, el cual se

introdujo al incubador rotatorio Shaker a 39 ºC, posteriormente se agregó la solución reductora y se

gaseó con CO2 hasta que el color de la mezcla (saliva artificial) se tornó de azul a rosa claro.

La incubación de las muestras se realizaron por triplicado más un blanco en cada una de las

horas, se utilizaron frascos de vidrio de 50 mL, sellados con tapón de goma; a estos se le adicionaron

0.2 g de muestra, 10 mL de líquido ruminal y 20 mL de saliva artificial. Los frascos con muestra, líquido

ruminal y saliva artificial se sellaron y se colocaron en la incubadora (Shaker I2400) a 39 ºC con

agitación constante (67 revoluciones por minuto; rpm), protegiéndolos de la luz durante las 96 h que

duró la prueba. La presión interna de los frascos producto de la degradación del alimento, se midieron

con un transductor de presión (FESTO®) a las 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h de incubación, mediante la

punción de los frascos, registrándose la presión acumulada (Theodorou et al., 1994). Los resultados se

expresaron en mL de PG por cada 0.2 g de MS (mL PG/0.2 g MS).

133

Producción y Perfiles de AGV

Se colectó una muestra de 20 mL de los frascos de PG para determinar ácidos acético,

propiónico y butírico, a las 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h, las cuales fueron filtradas con dos capas de gasas

para separar el contenido sólido y líquido. A este último, se le determino el pH inmediatamente, usando

un potenciómetro (Combo, HANNA instruments® Inc., Woonsocket, RI), así mismo, se tomó una

submuestra de 10 mL la cual fue centrifugada al momento a 3,500 xg a 4 ºC por 10 min. Posteriormente

el sobrenadante se depositó en viales color ámbar previamente marcados, acidificando la muestra con

0.2 mL de H2SO4 al 50 % y congelándola a - 20 ºC hasta realizar su análisis. Previo a su medición

fueron descongeladas en refrigeración a 4 ºC, adicionándole ácido metafosfórico al 25 % y

centrifugando nuevamente con las características antes mencionadas y preservándolas en refrigeración

hasta realizar su análisis mediante cromatografía de gases (Brotz y Schaefer, 1987).

Los ácidos grasos volátiles (AGV) fueron analizados por medio de un cromatógrafo de gases

(SRI 8610, SRI Instruments, CA), con una columna Alltech ECONO-CAPTM ECTM de las siguientes

dimensiones: 15 m de largo, diámetro externo (0.53 mm) y 0.25 mm de diámetro interno. Se inyecto 0.6

μL a temperatura del inyector de 230 ºC y detector de flama 250 ºC, la rampa de temperatura del horno

fue de 100 ºC, 20 ºC por min y 190 ºC por 1 min, con un tiempo promedio de lectura de 1.51, 1.92 y 2.48

min para ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico, y un tiempo de lectura neta de 6.83 min.


Se obtuvo una muestra de 20 mL de los frascos de PG para analizar N-NH3, a las 3, 6, 12, 24,

48, 72 y 96 h, las cuales fueron filtradas con dos capas de gasas para separar el material sólido y

líquido; determinando el pH de la misma manera que la muestra para AGV. Enseguida se colecto una

submuestra de 10 mL la cual fue centrifugada de la misma forma que la muestra para AGV.

Posteriormente el sobrenadante se decantó en recipientes de plástico de capacidad de 20 mL

134

previamente rotulados, congelándose a - 5 ºC para su conservación hasta el momento de su análisis;

previo a su medición se descongelaron a 4 ºC y su concentración se determinó por colorimetría según la

técnica de Broderick y Kang (1980).

La ecuación de predicción para calcular la concentración de N-NH3, se obtuvo del análisis por

triplicado de soluciones estándar con niveles de 0, 5, 10, 15, 20 y 25 μL de N-NH3/mL, utilizando agua

destilada como blanco en el punto cero (0 μL). El procedimiento para medir la absorbancia de las

muestras, la solución estándar y los blancos, se desarrolló de la siguiente manera: en tubos de ensayo

se adicionaron 920 μL de agua destilada y 80 μL de la muestra concentrada para completar 1 mL, se

mezclaron en vórtice (Vortex Genie II) posteriormente se tomaron 50 μL de la muestra diluida para cada

repetición y se depositaron en tubos de ensayo, añadiéndole 2.5 mL de fenol y se mezcló en vórtice,

enseguida se adicionó 2 mL de hipoclorito, mezclándose nuevamente; para el estándar o blanco se

agregó 50 μL de agua destilada, 2.5 mL de fenol y 2 mL de hipoclorito, las soluciones obtenidas se

mezclaron en vórtice y se incubaron por 5 min en baño maría (90 a 100 ºC).

A continuación, las muestras se dejaron enfriar por 5 min a temperatura ambiente para después

tomar lectura de la absorbancia de cada muestra, se midió a una longitud de onda de 630 nanómetros

(nm), previamente el valor de la absorbancia fue ajustado a 0 utilizando blancos como referencia. Con

los resultados obtenidos de la absorbancia, la ecuación de predicción obtenida con la solución estándar

y el porcentaje de dilución de las muestras líquidas, se calculó la concentración de N-NH3 en milimolar

por mililitro de muestra (mM/mL).

Ácido Láctico

Se colectó una muestra de 20 mL de los frascos de PG para analizar ácido láctico, a las 3, 6,

12, 24, 48, 72 y 96 h; siendo el procedimiento del manejo de la muestra similar a la variable de N-NH3

hasta el momento de su análisis. La concentración de ácido láctico se determinó por colorimetría según

135

el procedimiento de Taylor (1996). Para el estándar se usaron alícuotas de 5, 10, 15, 20 y 25 μL de

ácido láctico/mL y agua destilada como blanco (0 μL de ácido láctico/mL). El análisis se realizó por

triplicado, se añadieron 3 mL de H2SO4 concentrado y 0.5 mL de la muestra diluida en tubos de ensayo,

del estándar (blanco), las soluciones obtenidas se mezclaron en vórtice (Vortex Genie II) y se incubaron

por 10 min en baño maría (95 a 100 ºC). Posteriormente, se adicionaron 100 μL de solución de CuSO4

al 4 % y 200 μL de solución de 1.5 % de p-fenilfenol en etanol al 95 % en cada tubo, mezclándose

nuevamente y se dejaron reposar por 30 min a temperatura ambiente (no menos de 20 ºC). La

absorbancia del contenido de cada tubo se midió a una longitud de onda de 570 nm. Con la

concentración de ácido láctico y la ecuación de predicción obtenida con las soluciones estándar y el

porcentaje de dilución de las muestras, se calculó la concentración de ácido láctico en milimolar por

mililitro de muestra (mM/mL).


Para el análisis de la digestibilidad de MS, FDN, FDA y LDA se utilizó un modelo estadístico que

incluyó como efecto fijo el tratamiento en un diseño completamente al azar. Por otra parte, para las

variables de ácido acético, propiónico, butírico, N-NH3, ácido láctico y pH, se utilizó un modelo

estadístico que incluyó como efecto fijo el tratamiento y hora. Así también, la producción de gas se

analizó con un modelo similar que incluyó como efectos fijos tratamiento, hora y su interacción. Para

analizar los parámetros A, B y C del modelo de regresión no lineal ajustados se utilizó como efecto fijo

el tratamiento. Se utilizó la prueba de Tukey para establecer las posibles diferencias entre las medias de

los tratamientos (Steel y Torrie, 1997).

Las cantidades de PG acumulada in vitro se ajustaron al modelo no lineal monofásico de Groot

et al., (1996), calculando los parámetros de fermentación A, B y C con el procedimiento NLIN del SAS

9.0 (SAS, 2004).

136

G = A / (1 + (B / t) c)

Dónde:

G.- Media de la producción de gas (mL 0.2 g de MS) para un tiempo de incubación dado.

A.- Asíntota de producción de gas (mL 0.2 g de MS).

B.- Tiempo (h) después de la incubación en el cual la mitad de la producción de gas ha sido alcanzada.

C.- Constante que determina la forma y las características del perfil de la curva y, por lo tanto, la

posición del punto de inflexión.

t.- Variable predictora que representa el tiempo de incubación en horas.

Para analizar los parámetros A, B y C se restó la PG del blanco a cada una de las muestras

(triplicado) para obtener la cantidad total acumulada en cada una de las horas de fermentación in vitro.

Posteriormente, los valores acumulados de cada repetición en su hora de muestreo se analizaron con el

modelo de Groot et al., (1996) para obtener dichos parámetros, estos mismos fueron analizados con

PROC GLM para establecer mediante Tukey las posibles diferencias entre las medias de los

tratamientos, declarando efecto significativo cuando los valores de P fueron < 0.05.

137



Digestibilidad de la materia seca. El (Cuadro 21) muestra la digestibilidad de la MS, FDN,

FDA y el contenido de LDA por tratamiento. La mayor digestibilidad de la MS se observó en el T2 y T3

con valores de 72.02 y 72.49 %, siendo superiores (P<0.05) al T1 cuyo valor fué de 64.57 %. Esta

respuesta ha sido asociada con la mejora en la digestibilidad de la fibra, específicamente FDN y FDA

que mostraron ambos tratamientos, así también, en el menor contenido de LDA.

Sauvant et al., (2004) observaron una tendencia a incrementar la digestibilidad de la materia

orgánica (MO; 0.5 %) en vacas Holstein en el periodo seco que recibieron un cultivo de levadura en su

dieta con respecto al grupo control. Por otra parte, el mismo año publicaron que la suplementación con

cultivos de levadura de Sc (0, 2.5 y 5 g/d) en cabritos de la raza Nubia incrementaron la digestibilidad de

la MO en su dieta por 12.1 y 10.1 % y la digestibilidad de la FDN por 13.3 y 10.5 % para 2.5 y 5 g/d con

respecto a la dieta control (Fadel El-seed et al., 2004). En otro trabajo, reportaron que la digestibilidad

de MS, FDN y FDA de heno de bersín fue mayor cuando se adicionó inóculo de levadura de Sc (22.5

g/d), al contrastarse con la adición de 11.25 g/d en la dieta basal de corderos en engorda (El-Waziry y

Ibrahim, 2007).

En este estudio se observó mayor digestibilidad de la MS en el T2 y T3, mostrando un

incremento de 11.54 y 12.27 % con respecto al T1, esto tal vez debido a que el BMZN e IL mejoraron

el ambiente microbial de las bacterias celulolíticas y como consecuencia aumentaron la

digestibilidad de la MS.

Lo que coincide con otros autores, quienes reportaron que la suplementación con levadura

incrementa la digestibilidad de nutrientes debido a que estimulan el crecimiento de la población

microbial del rumen (Harrison et al., 1988).

138

Cuadro 21. Medias (± EE) de la digestibilidad in vitro de las fracciones de la fibra de dietas conteniendo bagazo de manzana fermentado y un inóculo de levaduras.

Digestibilidad (%)

Tratamiento1

EE (±) T1 T2 T3

MS 64.57b 72.02a 72.49a 0.82

FDN 67.32b 70.77a 70.25a 0.82

FDA 60.53b 64.07a 64.56a 0.82

LDA 5.55a 4.25b 4.14b 0.04

ab Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de

manzana fermentado (BMZN); T3 = HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL).

139

También se ha sugerido que las levaduras consumen el oxígeno disponible en la superficie de

la ingesta fresca de alimento para mantener la actividad metabólica y así reducir el potencial redox en el

rumen (Chaucheyras-Durand et al., 2008). Estos cambios establecen mejores condiciones para el

crecimiento de bacterias anaeróbicas estrictas como las celulolíticas, estimulando su unión a las

partículas de forraje provocando un incremento en la tasa inicial de degradación de la fibra (Roger et al.,

1990), produciendo factores de crecimiento tales como ácidos orgánicos y vitaminas (Chaucheyras et

al., 1995).

Por otro lado, Ahmed y Salah (2002) desarrollaron un experimento con dos niveles de cultivo de

levaduras (0, 4, 8 g/d) en la dieta de corderos en engorda, y reportaron que el coeficiente de digestión

de MS mejoró en ambos niveles de levadura al compararse con la dieta control, mientras que la

digestibilidad de la PC fue solamente significativa entre el control y el grupo alimentado con 8 g/d.

Así también, se ha mencionado que el tipo de dieta puede determinar el efecto de las levaduras

sobre la digestibilidad. Tang et al., (2008) estudiaron el efecto de cultivos de levaduras sobre las

características de fermentación in vitro de rastrojos de arroz, trigo y de maíz, y reportaron que el cultivo

de levadura (0, 2.5 y 7.5 g/kg de MS) incrementó la digestibilidad de MS in vitro para cada tipo de

rastrojo. Por otra parte, al adicionar un cultivo de levadura de Sc (10 g/d) en tres dietas de novillos que

consistieron en 75 % de silo de alfalfa y 25 % de cebada, 96 % de silo de maíz y 4.0 % de pasta de

soya, 75 % de grano rolado de cebada y 25 % de heno de alfalfa, reportaron que el coeficiente de

digestibilidad de las dietas para MS, PC, FDA y FDN no difirieron en la inclusión de levadura, excepto

para la dieta alta en grano, en la cual el cultivo de levadura incremento la digestibilidad de la MS y PC

(Mir y Mir, 1994).

Digestibilidad de la FDN y FDA. El mayor porcentaje en la digestibilidad de la FDN lo

presentaron el T2 y T3 con valores de 70.77 y 70.25 %, siendo superiores (P<0.05) al T1 cuyo valor fué

140

de 67.32 %. Así mismo, ambos tratamientos también mostraron la mayor digestibilidad de FDA

alcanzando 64.07 y 64.56 % para el T2 y T3 con respecto al T1 con valor de 60.53 %.

Estos resultados coinciden con Kholif y Khorshed (2006) quienes reportaron un efecto positivo

en la suplementación con levadura a búfalas lactantes sobre la digestibilidad de la FDN, FDA, celulosa,

hemicelulosa y PC. Por otra parte, otros autores mencionaron que la digestibilidad de PC y FDA fué

significativamente mayor por la adición de cultivo de levadura de 10 y 20 g/d en vacas frescas

alimentadas con una dieta basal de silo de maíz, la digestibilidad de PC con 0, 10 y 20 g/d mostró

valores de 78.5, 80.8 y 79.5 % y la digestibilidad de la FDA de 54.4, 60.2 y 56.8 %, respectivamente

(Wohlt et al., 1998).

En el presente estudio, el tratamiento con BMZN y al que se le adicionó IL tuvieron mayor

digestibilidad de la FDN y FDA. Esto tal vez debido a que estimularon el ambiente microbial

incrementando el número de bacterias celulolíticas mejorando la degradación de la fibra. Lo que

coincidió con Koul et al., (1998) quienes observaron un incremento en el número total de bacterias,

bacterias celulolíticas y proteolíticas cuando se adicionó un cultivo de levadura a vacas Holstein no

lactantes. Así mismo, Harrison et al., (1988) comentaron que la digestibilidad de nutrientes incrementa

al utilizar cultivos de levadura en la dieta de rumiantes, lo que se atribuye a la estimulación del

crecimiento en número de la población microbial en rumen. Teniendo un efecto directo con los

componentes fibrosos de la dieta, siendo aquellos fermentados pero con lento avance del retículo

rumen al tracto digestivo posterior, tienen gran efecto en el tiempo de llenado del rumen (Allen, 1996).

Por otra parte, Fadel El-seed et al., (2004) publicaron que el incremento en la digestibilidad de la FDN

puede disminuir el efecto de llenado del rumen, lo cual puede aumentar el consumo de alimento.

Digestibilidad de la LDA. El mayor contenido (P<0.05) de LDA lo reveló el T1 con 5.55 % con

respecto al T2 (4.25) y T3 (4.14). Estos últimos fueron similares entre sí. Esta respuesta ha sido

141

asociada a la baja digestibilidad de la MS, FDN y FDA lo que provocó el incremento de LDA. La lignina

es el componente principal de la estructura de la pared celular de las plantas, incrementando a través

de la madurez (Guo et al., 2001), lo que afecta la digestibilidad del tejido vegetal (Van Soest, 1994), ya

que generalmente se encuentra adherida a los carbohidratos estructurales de las paredes celulares

proporcionando soporte a la planta (Whetten y Sederoff, 1995), lo cual está negativamente

correlacionado con la calidad y digestibilidad del forraje por los rumiantes (Sewalt et al., 1996).


La producción de gas in vitro acumulado se presenta en la Gráfica 1, donde se observa que el

T3 mostró el mayor (P<0.05) volumen de gas producido (1.6 mL/0.2 g de MS) a partir de la hora 6 de

incubación con respecto al T1. Sin embargo, a la hora 24 el T3 fué superior (P<0.05) al T1 y T2

observándose un volumen de gas de 4.20, 3.40 y 1.97 mL/0.2 g de MS, respectivamente. Siguiendo la

misma tendencia hasta la hora 96. La importancia de esta variable establece, que los alimentos con una

alta producción de gas durante las horas iniciales de fermentación incrementará el consumo voluntario,

resultado de una alta tasa de digestión (Fadel El-seed et al., 2004). La degradación de un substrato

iniciará con las fracciones fácilmente digestibles como es el caso de carbohidratos altamente

fermentables como el almidón. Por lo cual, el comportamiento observado en este experimento puede

ser explicado por la menor cantidad de FDN, FDA y LDA en los tratamientos que se le adicionó BMZN e

IL, por lo que podemos asumir que favorecieron la colonización microbial en ambos tratamientos y por

ende mejoraron la digestibilidad de la dieta.

Parámetros de la Fermentación in vitro

El (Cuadro 22) presenta los parámetros de la cinética de fermentación. Donde el parámetro (A)

representa la asíntota de producción de gas (mL), siendo el T2 y T3 quienes obtuvieron la mayor

(P<0.05) producción de gas (9.11 y 9.45 mL) al compararse con el T1 el cual presento 6.27 mL.

142

Gráfica 1. Medias (± EE) de la producción de gas del T1 (heno de avena, ensilaje de maíz y concentrado), T2 (heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado y bagazo de manzana fermentado) y T3 (heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado e inóculo de levaduras) durante la fermentación ruminal in vitro.

143

Cuadro 22. Parámetros de la degradabilidad ruminal de MS de tres dietas diferentes.

Parámetro

Tratamiento1

EE(±) T1 T2 T3

A 6.27b 9.11a 9.45a 0.32

B 45.03a 39.9a 29.13a 4.48

C 0.94a 0.89a 1.02a 0.04

ab Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. A = Asíntota en producción de gas (mL 0.2 g de MS). B = Tiempo (h) al cual se alcanza la mitad de la producción asintótica. C = Tasa de producción de gas (mL h). 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado +

bagazo de manzana fermentado (BMZN); T3 = HA + EM + concentrado + inóculo de levaduras (IL).

144

Lo anterior implica que el T2 y T3 tendrán menor tiempo de residencia ruminal obteniendo un mayor

volumen de producción de gas.

Esto tal vez debido a que los ingredientes de los tratamientos en mención estimularon el

ambiente microbial provocando un incremento en la tasa de fermentación disminuyendo numéricamente

el tiempo necesario para alcanzar la mitad de la producción asintótica.

El parámetro (B), expresa el tiempo durante la incubación (h) que es requerido para alcanzar la

mitad de la asíntota en la producción de gas, el cual no presentó diferencia significancia (P>0.05) entre

tratamientos. El T2 y T3 presentaron el menor tiempo numéricamente (39.9 y 29.13 h) con respecto al

T1 (45.03 h). Este parámetro explica el tiempo de fermentación ruminal debido a la mejora en la

composición química de la dieta, esto tal vez debido a que el BMZN e IL mejoraron el ambiente

microbial propiciando un incremento en la digestibilidad de la fibra y por ende, un aumento en la

concentración de substratos disponibles para los microorganismos (Cone et al., 1998). La función

biológica de este parámetro señala que las dietas que incluyeron BMZN y el IL requerirán 5.13 y 15.90 h

menos de fermentación en rumen comparados con el T1 para alcanzar la mitad de la asíntota en

producción de gas, lo cual es igual a una mayor velocidad de digestión ruminal, permitiendo que estas

dietas favorezcan el consumo de alimento.

El parámetro (C), indica la tasa de producción de gas (mL/h), el cual no mostró diferencia

significativa (P>0.05) entre tratamientos. Sin embargo, el T3 presentó numéricamente una mayor tasa

de producción de gas revelando 1.02 mL h comparado con el T1 y T2 los cuales presentaron 0.94 y

0.89 mL/h. Este comportamiento sugiere que el T3 tiene mayor velocidad de fermentación que el resto

de los tratamientos, lo cual se ve marcado en que esta dieta requiere menor tiempo de fermentación

(parámetro B) para alcanzar la mitad de la asintótica de producción de gas (parámetro A).

145


El (Cuadro 23) muestra la producción y perfiles de AGV entre tratamientos, donde se observa

que el T2 y T3 presentaron mayor (P<0.05) concentración de ácidos acético (16.00 y 17.19 mmol/L),

propiónico (6.54 y 6.13 mmol/L) y butírico (2.63 y 2.67 mmol/L) al compararse con el T1 el cual tuvo

valores de 12.06, 3.52 y 1.21 mmol/L, respectivamente.

Se ha mencionado que el patrón de fermentación en los rumiantes se lleva a cabo en el

ambiente ruminal que está influenciado por la interacción entre la dieta, la población microbiana y el

propio animal (Allen y Mertens, 1988). Así mismo, Rodríguez y Llamas (1990) reportaron que la

producción de AGV se relaciona con la producción de metano y debe mantenerse el balance

fermentativo en todo momento, debido a que el metano y el propionato sirven como captores del exceso

de equivalentes reductores que se producen a nivel ruminal. La adición de cultivos de levadura en la

alimentación de rumiantes, han mostrado efectos contradictorios sobre la concentración de AGV en

rumen. Corona et al., (1999) reportaron que novillos y corderos suplementados con 7.5 y 3 g/d de un

cultivo de levadura de Sc, mostraron baja concentración total de AGV y en la proporción molar de ácido

butírico, respectivamente. Por otro lado, publicaron que la concentración total de AGV en rumen y la

proporción de ácidos acético, propiónico y butírico no fueron afectados por la adición de cultivos de

levadura (Pinos-Rodríguez et al., 2008).

Sin embargo, Harrison et al., (1988) encontraron una disminución en la proporción molar de

ácido acético incrementándose la concentración molar de ácido propiónico en el líquido ruminal de

vacas Holstein suplementadas con 114 g/d de un cultivo de levadura que contenía Sc.

146

Cuadro 23. Comportamiento en la producción y perfiles de AGV entre tratamientos durante la fermentación in vitro.

Variable Tratamientos1

EE(±)

T1 T2 T3

Ácido acético (mmol/L) 12.06b 16.00a 17.19a 0.90

Ácido propiónico (mmol/L) 3.52b 6.54a 6.13a 0.75

Ácido butírico (mmol/L) 1.21b 2.63a 2.67a 0.41

ab Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de


147

En la presente investigación, se observó un incremento en la concentración de ácidos acético,

propiónico y butírico en la dieta que se le adicionó BMZN y un IL, esto tal vez debido a que mejoró el

ambiente ruminal y por consiguiente incrementó el número de bacterias celulolíticas provocando una

mayor digestibilidad de la MS, FDN y FDA como se muestra en el (Cuadro 21).

Koul et al., (1998) publicaron que se incrementó el total de AGV en el rumen de terneros búfalos

alimentados con 5 g/d de un cultivo de levadura que contenía Sc al compararse con el grupo control

(132.2 y 122.4 mmol/L). En otro estudio, Dolezal et al., (2005) observaron un incremento en la

producción de AGV al incrementar la dosis del cultivo de levadura de Sc (cepa SC-47) en la

alimentación de vacas Holstein en producción.

Concentración de N-NH3, Ácido Láctico y pH

El (Cuadro 24) presenta la concentración de N-NH3, ácido láctico y pH entre tratamientos. La

mayor (P<0.05) concentración de N-NH3 lo mostró el T2 y T3 revelando valores de 0.21 y 0.22 mM/mL

al cotejarse con el T1. Así mismo, ambos tratamientos fueron diferentes (P<0.05) en la concentración de

ácido láctico (1.46 y 1.37 mM/mL) con respecto al T1. Por otro lado, se observó un pH (6.74) superior

(P<0.05) en el T3 al compararse con el T1 y T2. Este último mantuvo el pH (6.56) más alto (P<0.05) al

compararse con el T1.

Nitrógeno amoniacal (N-NH3). Varias fuentes de nitrógeno contribuyen a la producción de

amoniaco, tales como, el nitrógeno no proteico (NNP) de la dieta, nitrógeno salival y posiblemente

pequeñas cantidades de urea que penetran a través del epitelio del rumen (Moloney y Drennan, 1994).

En el presente trabajo, se observó un incremento en la concentración de N-NH3 (0.21 y 0.22

mM/mL) en las dietas que se adicionó BMZN y un IL, esto tal vez debido a que mejoró el ambiente

ruminal y por consiguiente incrementó la digestibilidad de la dieta, lo que coincide con Newbold et al.,

(1995) donde observaron un aumento en la concentración de N-NH3 en la fermentación ruminal in vitro,

148

atribuyendo el resultado a mayor disponibilidad de sustrato para los microorganismo. El pH bajo inhibe

la producción de N-NH3 in vitro porque afecta a las bacterias metanogénicas (Methanobacterium

bryantii, M. formicicum y Metanosarcina barkeri) y protozoarios en la degradación de la fibra (Nagaraja y

Titgemeyer, 2007).

Ácido láctico y pH. Williams et al., (1983) observaron que el pH bajo del rumen reduce la

viabilidad de las bacterias celulolíticas (Ruminococcus albus y Fibrobacter succinogenes) y por lo tanto,

se reduce la actividad sobre los carbohidratos estructurales.

En otro estudio concluyeron que en condiciones ruminales de pH bajo, el ataque bacteriano a

las paredes celulares se disminuye y por consiguiente se reduce su digestión (Cheng et al., 1984), por

lo que se considera que un pH ruminal superior a 6.2 es el óptimo para obtener una buena digestión de

la celulosa (Rodríguez y Llamas, 1990).

En esta investigación se observó, que a los tratamientos que se les adiciono BMZN y un IL

disminuyeron la concentración de ácido láctico, mientras que el T3 incremento el pH, esto tal vez se

debió a que estimularon a las bacterias que consumen lactato (Megasphaera elsdenii y Selenomonas

ruminantium) y por ende el IL estimuló el ambiente microbial para mantener un pH óptimo, lo que

coincide con lo reportado por Robinson (2010), quien observó que la modulación del pH del rumen es

uno de los efectos de la adición de levaduras en la dieta, ejerciendo un incremento promedio del pH (1.6

%), un incremento global del total de AGV (5.4 %) y una disminución general en la concentración de

lactato (8.1 %).

149

Cuadro 24. Medias (± EE) del comportamiento en la concentración de N-NH3, ácido láctico y pH de tratamientos durante la fermentación in vitro

Variable

Tratamientos1

EE(±) T1 T2 T3

N-NH3 (mM/mL) 0.18b 0.21a 0.22a 0.01

Ácido láctico (mM/mL) 2.30a 1.46b 1.37b 0.20

pH 6.19c 6.56b 6.74a 0.06

abc Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado; T2 = HA + EM + concentrado + bagazo de


150

En esta investigación se observó, que a los tratamientos que se les adiciono BMZN y un IL

disminuyeron la concentración de ácido láctico, mientras que el T3 incremento el pH, esto tal vez se

debió a que estimularon a las bacterias que consumen lactato (Megasphaera elsdenii y Selenomonas

ruminantium) y por ende el IL estimuló el ambiente microbial para mantener un pH óptimo, lo que

coincide con lo reportado por Robinson (2010), quien observó que la modulación del pH del rumen es

uno de los efectos de la adición de levaduras en la dieta, ejerciendo un incremento promedio del pH (1.6

%), un incremento global del total de AGV (5.4 %) y una disminución general en la concentración de

lactato (8.1 %).

Sauvant et al., (2004) no observaron ningún efecto del cultivo de levaduras sobre la

concentración de AGV y pH ruminal, revelando solamente una tendencia a incrementar la digestibilidad

de la MS (+0.5 %) en vacas Holstein en periodo seco. El estudio de meta análisis de Desnoyers et al.,

(2009) sugirieron que la suplementación con levaduras incrementó la concentración de AGV (2.1

mmol/L) y el pH ruminal, aunado a una tendencia a disminuir la concentración de lactato de vacas

Holstein en transición. Estos mismos autores, reportaron que las levaduras son capaces de limitar la

reducción del pH en rumen lo que usualmente se relaciona a un incremento en la concentración de

AGV. Por otra parte, las levaduras son capaces de limitar la producción de ácido láctico o su

acumulación en el rumen (Desnoyers et al., 2009), probablemente porque Sc puede competir con

bacterias que fermentan almidón (Lynch y Martin, 2002), previniendo la acumulación de lactato en el

rumen (Chaucheyras et al., 1995).

151


La adición de BMZN y un IL en la dieta de becerros destetados mejoraron la digestibilidad de la

MS, FDN y FDA, aunque no se determinó si estas mejoras pudieran llegar a promover un mejor

desempeño productivo de los animales. Igualmente, la adición de estos ingredientes resultó en un

incremento de la producción de gas y AGV producto del incremento de la digestibilidad en comparación

con la dieta testigo.

Así mismo, la adición de bagazo de manzana fermentado y el inóculo de levaduras en la dieta

incrementaron la concentración de N-NH3 y pH, disminuyendo la concentración de ácido láctico.

En base a los resultados obtenidos en este estudio se recomienda desarrollar más investigación

con los suplementos de BMZN y un IL, considerando la prioridad que representa maximizar la digestión

de la fibra, es necesario evaluar estos suplementos bajo diferentes niveles de inclusión a fin de alcanzar

una mejor respuesta animal.

153

RESUMEN

El objetivo fue evaluar el efecto de la fermentación in vitro de dietas para becerros en

crecimiento adicionadas con cuatro cepas de levaduras. Los tratamientos consistieron en: T1 (Sc6):

heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado + cepa Sc6; T2 (Kl2): HA + EM +

concentrado + cepa Kl2; T3 (Kl11): HA + EM + concentrado + cepa Kl11 y T4 (Io3): HA + EM +

concentrado + cepa Io3. Las variables medidas fueron digestibilidad de la materia seca (MS), fibra

detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA), y el contenido de lignina detergente ácido (LDA),

el volumen de producción de gas, concentración de ácido acético, propiónico, butírico, nitrógeno

amoniacal (N-NH3), ácido láctico y pH. La digestibilidad in vitro de las dietas se realizó a las 48 h, en

tanto que para el resto de las variables se realizaron muestreos a las 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h. Se

realizó un diseño completamente al azar, utilizando para la digestibilidad de la fibra un modelo que

incluyó como efecto fijo tratamiento. Para ácidos grasos volátiles (AGV), N-NH3, ácido láctico y pH, se

incluyó como efectos fijos tratamiento y hora. La producción de gas se analizó con un modelo similar

que incluyó como efectos fijos tratamiento, hora y su interacción. Para analizar los parámetros A, B y C

del modelo de regresión no lineal ajustados se utilizó como efecto fijo el tratamiento. Se observó efecto

de tratamiento (P<0.05) en la digestibilidad de MS, siendo superior los T2, T3 y T4 con valores de

63.01, 63.11 y 63.05 %, con respecto al T1 (61.30 %). Así mismo, el T4 fue mayor (P<0.05) en

digestibilidad de FDN (56.69 %) al compararse con el T1 y T2 (48.22 y 53.98 %), el T2 y T3 tuvieron

mejor (P<0.05) digestibilidad de FDA (58.78 y 58.94 %) al cotejarse con el T1 (56.39 %), por lo tanto, el

menor (P<0.05) contenido de LDA fue para T2, T3 y T4 (4.54, 4.42 y 4.46). A las 96 h el T3 mostró

mayor (P<0.05) volumen de producción de gas (11.50 mL/0.2 g de MS). La mayor concentración

(P<0.05) de AGV lo presentó el T2 con valores de 37.30 y 19.25 mmol/L para ácido acético y

propiónico. Así mismo, el T1, T2 y T4 fueron superiores (P<0.05) en la concentración de ácido butírico

154

(7.45, 7.74 y 6.73 mmol/L). El T4 mostró un incremento (P<0.05) en la concentración de N-NH3 y ácido

láctico (5.34 y 0.69 mM/mL), siendo el T1 quien presentó un incremento (P<0.05) del pH (7.00). Se

concluye, que las cepas Kl2, Kl11 e Io3 favorecieron la digestibilidad de MS, FDN y FDA, respecto a la

Sc6, así mismo, Kl2 incrementó la concentración de ácidos acético y propiónico durante la fermentación

in vitro de las dietas para novillos en crecimiento.

155



Esta investigación se realizó en las instalaciones de la Facultad de Zootecnia y Ecología de la

Universidad Autónoma de Chihuahua, Chih., México, ubicada en las coordenadas 28º 35' 07'' latitud

norte y 106º 06' 23'' longitud oeste, con una altitud de 1,517 msnm, según el sistema de

posicionamiento global (GPS por sus siglas en inglés, MAGELLAN®, MobileMapper-Pro). La

temperatura media anual es de 18.2 ºC, con una media máxima de 37.7 ºC y una media mínima de -7.4

ºC. La precipitación promedio anual es de 387.5 mm, con 71 días de lluvia al año y una humedad

relativa del 49 %; predominando un clima semiárido extremoso (INAFED, 2008).

Descripción de los Tratamientos

Para el desarrollo del presente experimento se utilizó la dieta del tratamiento T1 (testigo): heno

de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado, ofrecido a los becerros destetados como se

mencionó en el Experimento IV. Los tratamientos experimentales fueron cuatro inóculos preparados con

las siguientes cepas: T1: Saccharomyces cerevisiae cepa 6, T2: Kluyveromyces lactis cepa 2, T3:

Kluyveromyces lactis cepa 11 y T4: Issatchenkya orientalis cepa 3, para lo cual se utilizaron 4 matraces

Erlenmeyer (Kimax)® de 1,000 mL agregando 3.1 x 108 células vivas de levaduras de cada cepa por

matraz, así mismo, se adicionaron al cultivo los ingredientes que se muestra en el (Cuadro 25). Una vez

terminado el tiempo de fermentación se realizó el conteo de levaduras siguiendo el procedimiento de

Díaz (2006) como se indicó en el Experimento IV, encontrando la cantidad de 3.4 x 109 cel/mL para

posteriormente ajustar la cantidad de células de levaduras por tratamiento, tomando como base 26 mL

adicionados en la dieta diaria que recibió cada animal.

156

Cuadro 25. Diseño de tratamientos para la preparación de los inóculos con las cuatro cepas de levaduras

Ingredientes

Tratamientos1

T1 T2 T3 T4

Cepa de levadura Sc6 Kl2 Kl11 Io3

Melaza de caña (g) 100 100 100 100

Urea (g) 1.2 1.2 1.2 1.2

Minerales (g) 0.5 0.5 0.5 0.5

Sulfato de amonio (g) 0.2 0.2 0.2 0.2

Aforados (mL) 1000 1000 1000 1000

1T1 = Saccharomyces cerevisiae cepa 6; T2 = Kluyveromyces lactis cepa 2; T3 = Kluyveromyces lactis cepa 11 y T4 = Issatchenkya orientalis cepa 3.

157

Análisis Químico de las Dietas

Con la finalidad de obtener los valores compuestos de la digestibilidad de la materia seca (MS),

fibra detergente neutra (FDN), fibra detergente ácido (FDA) y el contenido de lignina detergente ácido

(LDA), se analizó la composición química de las fracciones de la dieta con la adición de las cepas antes

mencionadas. Se colectaron muestras de la dieta cada 15 d para formar muestras compuestas por mes,

utilizando 1 kg de MS (ración completa) por tratamiento. Las muestras fueron secadas a 60 ºC por 48 h

en una estufa de aire forzado y molidas a 1 milímetro (mm) en un molino Wiley (Arthur H. Thomas Co.,

Philadelphia, PA), estas muestras fueron secadas a 105 ºC durante 8 h en una estufa de aire forzado

para determinar MS absoluta y secuencialmente fueron incineradas a 600 ºC por 4 h en una mufla para

determinar cenizas (AOAC, 2000). En las muestras compuestas se determinó la concentración de FDN,

FDA (Van Soest et al., 1991) y LDA (Goering y Van Soest, 1970). En el análisis de FDN se utilizó sulfito

de sodio (Na2SO3) y α-amilasa termo estable (Ankom Technology) para remover la materia nitrogenada

y el almidón.


A la ración completa (1 kg de MS) molida de cada tratamiento, se le adicionó la cantidad

ajustada de inóculo de levaduras mezclándose manualmente en una charola de plástico. Previo a la

incubación, las bolsas fueron sumergidas en acetona para eliminar el surfactante de las mismas que

inhiben la digestión microbiana, y posteriormente fueron secadas a temperatura ambiente. En seguida,

se pesaron las muestras compuestas de las dietas (0.45 g ± 0.05) en bolsas filtro ANKOM® F57 (25 μm

de poro y dimensiones de 5 x 4 cm) identificadas y selladas con calor e incubadas in vitro de acuerdo a

la metodología DaisyII (ANKOM Technology Corp., Fairport, NY-USA), la cual involucra soluciones búfer

A, B e inóculo ruminal como se indicó en el Experimento V.

158

Obtención del Líquido Ruminal

Para obtener el líquido ruminal se siguió el mismo procedimiento señalado en el Experimento V.


La producción de gas (PG) in vitro se realizó mediante el protocolo de Menke y Steingass

(1988), abordando las modificaciones mencionadas por Muro (2007). La incubación de las muestras se

realizó por triplicado y se agregó un blanco en cada una de las horas de muestreo. Se utilizaron 112

frascos de vidrio de 50 mL, sellados con tapón de goma; a estos se le adicionaron 0.2 g de muestra, 10

mL de líquido ruminal y 20 mL de saliva artificial siguiendo el mismo procedimiento indicado en el

Experimento V.

La presión interna de los frascos producto de la degradación del alimento, se midió con un

transductor de presión (FESTO®) a las 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h de incubación, mediante la punción de

los frascos, registrándose la presión acumulada (Theodorou et al., 1994). Los resultados se expresaron

en mL de PG por cada 0.2 g de MS (mL PG/0.2 g MS).


Se colectaron muestras de 20 mL de los frascos de PG para determinar la producción de ácido

acético, propiónico y butírico, a las 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h, las cuales fueron filtradas con dos capas

de gasas para separar el contenido sólido y líquido. A este último, se le determino el pH

inmediatamente, usando un potenciómetro (Combo, HANNA instruments® Inc., Woonsocket, RI). Así

mismo, se tomó una submuestra de 10 mL la cual fue centrifugada al momento a 3,500 xg a 4 ºC por 10

min. Posteriormente el sobrenadante se depositó en viales color ámbar previamente marcados,

acidificando la muestra con 0.2 mL de H2SO4 al 50 % y congelándola a - 20 ºC hasta realizar su

análisis. Previo a su medición fueron descongeladas en refrigeración a 4 ºC, adicionándole ácido

metafosfórico al 25 % y centrifugando nuevamente con las características arriba mencionadas y

159

preservándolas en refrigeración hasta realizar su análisis mediante cromatografía de gases (Brotz y

Schaefer, 1987), siguiendo el mismo procedimiento indicado en el Experimento V.


Se obtuvo una muestra de 20 mL de los frascos de PG para analizar N-NH3 a las 3, 6, 12, 24,

48, 72 y 96 h por medio de colorimetría siguiendo la técnica de Broderick y Kang (1980) como se

mencionó en el Experimento V.

Ácido Láctico

Se colecto una muestra de 20 mL de los frascos de PG para analizar el contenido de ácido

láctico a las 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h por colorimetría según el procedimiento de Taylor (1996)

siguiendo el mismo procedimiento que se describió en el Experimento V.


Para el análisis de la digestibilidad de MS, FDN, FDA y LDA se ajustó un modelo estadístico

que incluyó como efecto fijo el tratamiento en un diseño completamente al azar. Por otra parte, para las

concentraciones de N-NH3, y ácidos acético, propiónico, butírico y láctico, así como para pH se ajustó

un modelo similar, considerando como efectos fijos el tratamiento y la hora de muestreo. Para la

producción de gas el modelo estadístico incluyó los efectos fijos de tratamiento y hora, así como su

interacción. Para analizar los parámetros A, B y C del modelo de regresión no lineal ajustados se utilizó

como efecto fijo el tratamiento. Se utilizó la prueba de Tukey para establecer las posibles diferencias

entre las medias de los tratamientos (Steel y Torrie, 1997).

Las cantidades de PG acumulada in vitro se ajustaron al modelo no lineal de Gompertz

(Lavrencic et al., 1997), calculando los parámetros de fermentación A, B y C; con el procedimiento NLIN

de SAS (SAS, 2004).

Y = A * (exp (- B * (exp (- C * t)))

160

Dónde:

Y.- Volumen de producción de gas (mL 0.2 g de MS) para un tiempo de incubación dado.

A.- Volumen de gas correspondiente a la completa digestión del substrato (hora al punto de inflexión).

B.- Tasa constante de producción de gas (mL de gas al punto de inflexión).

C.- Tasa máxima de producción de gas (mL/h).

t.- Tiempo de incubación (h).

Para analizar los parámetros A, B y C se restó la PG del blanco a cada una de las muestras

(triplicado) para obtener la cantidad total acumulada en cada una de las horas de fermentación in vitro.

Posteriormente, los valores acumulados de cada repetición en su hora de muestreo se analizaron con el

modelo de Gompertz et al., (1996) para obtener dichos parámetros, estos mismos fueron analizados

con PROC GLM para establecer mediante Tukey las posibles diferencias entre las medias de los

tratamientos, declarando efecto significativo cuando los valores de P fueron < 0.05.

161



Digestibilidad de la materia seca. El (Cuadro 26) muestra la digestibilidad de la MS, FDN,

FDA y el contenido de LDA por tratamiento. La mayor digestibilidad de la MS se observó en los T2, T3 y

T4 (63.01, 63.11 y 63.05 %, respectivamente) siendo superiores (P<0.05) al T1 (61.30 %). Esta

tendencia ha sido asociada con el incremento en la digestibilidad de la fibra, principalmente FDN y FDA

que mostraron los tres tratamientos, así también, al menor contenido de LDA.

Sauvant et al., (2004) observaron una tendencia a incrementar la digestibilidad de la materia

orgánica (MO; 0.5 %) en vacas Holstein en el periodo seco que recibieron un cultivo de levadura en su

dieta con respecto al grupo control. Por otra parte, se ha sugerido que las levaduras vivas son

metabólicamente activas en el rumen, por lo que modifican la fermentación y estimulan el crecimiento

microbial (Erasmus et al., 2005). Tales cambios son asociados con un incremento en la digestibilidad de

la fibra, lo cual puede aumentar la tasa de pasaje y por lo tanto mejorar el consumo de MS y

productividad del animal (Guedes et al., 2008).

Existe muy poca o nula información sobre la adición de levadura de las cepas Kluyveromyces

lactis e Issatchenkya orientalis en la alimentación de rumiantes. En el presente trabajo, el mejor

comportamiento en la digestibilidad de la MS se observó en el T2, T3 y T4, por lo que estos resultados

sugieren que las cepas Kl2, Kl11 e Io3 favorecieron el ambiente microbial de las bacterias

celulolíticas y como consecuencia incrementaron la digestibilidad de la fibra, así mismo se plantea que

estas cepas incrementaron la digestibilidad de nutrientes debido a que estimulan el crecimiento de la

población microbial del rumen como lo indicaron Harrison et al., (1988). Chaucheyras-Durand et al.,

(2008) mencionaron que las levaduras consumen oxigeno disponible en la superficie de la ingesta

fresca de alimento para mantener la actividad metabólica y así reducir el potencial redox en el rumen.

162

Cuadro 26. Digestibilidad in vitro de las fracciones de las fibras entre tratamientos

Digestibilidad (%)

Tratamientos1

EE(±) T1 T2 T3 T4

MS 61.30b 63.01a 63.11a 63.05a 0.51

FDN 48.22c 53.98b 55.80ab 56.69a 0.67

FDA 56.39b 58.78a 58.94a 57.83ab 0.57

LDA 5.11a 4.54b 4.42b 4.46b 0.05

abc Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. 1.T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado + Saccharomyces cerevisiae cepa 6; T2 = HA + EM + concentrado + Kluyveromyces lactis cepa 2; T3 = HA + EM + concentrado + Kluyveromyces lactis cepa 11 y T4 = Ha + EM + concentrado + Issatchenkya orientalis cepa 3.

163

Así mismo, publicaron que estos cambios establecen mejores condiciones para el crecimiento

de las bacterias anaeróbicas estrictas como las celulolíticas, favoreciendo su unión a las partículas del

alimento y por consiguiente aumentar la tasa de degradación de la fibra (Roger et al., 1990).

Digestibilidad de la FDN y FDA. El mayor porcentaje (P<0.05) en la digestibilidad de la FDN lo

presentó el T4 revelando 56.69 %, siendo superior al T1 y T2 los cuales mostraron 48.22 y 53.98 %,

respectivamente. Sin embargo, este último fué superior (P<0.05) al T1. Por otro lado, el T2 y T3

manifestaron mayor (P<0.05) digestibilidad de la FDA (58.78 y 58.94 %) con respecto al T1 cuyo valor

fué 56.39 %, en tanto que el valor de T4 fué de 57.83 %.

Kholif y Khorshed (2006) publicaron un efecto positivo en la suplementación con levadura a

búfalas lactantes sobre la digestibilidad de la FDN, FDA, celulosa, hemicelulosa y proteína cruda (PC).

En otra investigación, mencionaron que la adición de cultivos de levadura en dietas de borrego en

engorda incrementaron el número de bacterias celulolíticas como Fibrobacter succinogenes (F.

succinogenes), Ruminococcus albus (R. albus) y Ruminococcus flavefaciens (R. flavefaciens) en el

rumen, lo que favorece la degradación de la celulosa (Newbold et al., 1995).

En el presente experimento, el T4 presentó la mayor digestibilidad de FDN (56.69 %), mientras

que el T2 y T3 mostraron el porcentaje mayor de digestibilidad de la FDA (58.78 y 58.94 %), siendo el

T1 inferior en FDN y FDA (48.22 y 56.39 %) con respecto a los demás tratamientos. Este

comportamiento propone que las cepas Io3, Kl2 y Kl11 pudieron estimular el ambiente microbial

incrementando el número de bacterias celulolíticas mejorando la degradación de la fibra con respecto a

Sc. Lo que coincide con Koul et al., (1998) quienes observaron un incremento en el número total de

bacterias celulolíticas y proteolíticas cuando se adicionó un cultivo de levadura a vacas Holstein no

lactantes. Así mismo, Williams et al., (1991) reportaron que la estimulación en la degradación de

celulosa por cultivo de levadura está asociada con la disminución en el tiempo de retrazo, lo cual resulta

164

en un incremento en la tasa inicial de digestión pero no un aumento en la digestión total por los

microorganismos del rumen.

Chaucheyras-Duran y Fonty (2001) encontraron que los microorganismo que se adhieren a la

digesta representan más del 75 % de la microflora total en el rumen, siendo F. succinogenes, R. albus y

R. flavefaciens las bacterias más activas en la degradación de la fibra por la presencia de numerosas

celulasas (glucanasas, glucosidasas) y hemicelulasas (xylanasas, xylosidasas y fucosidasas).

Digestibilidad de la LDA. El mayor contenido (P<0.05) de LDA lo presentó el T1 obteniendo

5.11 % al compararse con el T2, T3 y T4 los cuales mostraron 4.54, 4.42 y 4.46 %, siendo estos últimos

similares entre sí. El incremento en el contenido de LDA ha sido asociado a la baja digestibilidad de la

MS, FDN y FDA. Noguera et al., (2004) mencionaron que en las primeras horas de fermentación una

parte del sustrato, principalmente los azúcares solubles son rápidamente fermentados, sin embargo

ellos solo constituyen una pequeña parte del material potencialmente digestible, y a medida que el

proceso fermentativo continua una menor cantidad de material es hidratado y colonizado por los

microorganismos ruminales, lo que origina diferentes tasas de degradación dependiendo de la

concentración de carbohidratos estructurales, contenido de lignina y estado de madurez de la planta. La

lignina es el componente principal que afecta la digestibilidad del tejido vegetal (Van Soest, 1994), ya

que generalmente se encuentra adherida a los carbohidratos estructurales de las paredes celulares

proporcionando soporte a la planta (Whetten y Sederoff, 1995), lo cual está correlacionado

negativamente con la calidad y digestibilidad del forraje por los rumiantes (Sewalt et al., 1996).


La producción de gas in vitro acumulado se presenta en la (Gráfica 2), donde se observa que

los T3 y T4 mostraron el mayor (P<0.05) volumen de gas producido (5.77 y 5.50 mL/0.2 g de MS) a

partir de las 24 h de incubación con respecto al T1 y T2 (3.53 y 3.40 mL/0.2 g de MS), siguiendo la

165

misma tendencia hasta las 72 h. A las 96 h el T3 fue superior (P<0.05) con valores de 11.50 mL/0.2 g

de MS al compararse con el T1, T2 y T4 los cuales tuvieron 7.10, 9.10 y 10.40 mL/0.2 g de MS,

respectivamente; siendo el T1 el que tuvo menor volumen de gas al cotejarse con el resto de los

tratamientos.

La importancia de esta variable radica en que la tasa de producción de gas es proporcional a

la actividad microbiana, pero la proporcionalidad disminuye con el tiempo de incubación, por lo que

puede ser interpretado como la perdida de la eficiencia en la tasa de fermentación con el tiempo

(Lavrencic et al., 1997).

Una mayor actividad microbiana predispone un incremento en la digestibilidad de la fibra,

provocando una alta producción de gas durante las horas iniciales de fermentación y por ende aumenta

el consumo voluntario de alimento (Fadel El-seed et al., 2004). La degradación de un substrato se inicia

con las fracciones fácilmente digestibles como es el caso de carbohidratos altamente fermentables

como el almidón. Por lo tanto, el comportamiento observado en este experimento, sugiere que los datos

obtenidos con mayor digestibilidad de la MS, FDN y FDA, así mismo, el menor contenido de LDA en el

T2, T3 y T4 proponen que tal vez favorecieron la colonización microbial mejorando la digestibilidad de la

dieta.

166

Gráfica 2. Medias (± EE) de la producción de gas durante la fermentación ruminal in vitro del T1, T2, T3 y T4 conteniendo todos los tratamientos heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado y su respectiva cepa de levadura.

abc Medias con diferente literal en hora, son diferentes (P<0.05) entre tratamientos.

167

Parámetros de la Fermentación in vitro

El (Cuadro 27) muestra los parámetros de la cinética de fermentación. Donde el parámetro (A)

representa la hora al punto de inflexión, siendo el T2, T3 y T4 quienes obtuvieron el punto de inflexión

mayor (P<0.05) revelando 11.53, 11.6 y 10.42 h al compararse con el T1 el cual presentó 8.05 h. Lo

anterior indica que las cepas de los tratamientos con mayor punto de inflexión, tal vez favorecieron la

colonización microbial de la fibra provocando un incremento en la tasa de fermentación y substrato,

prolongando el punto de inflexión lo que refleja un mayor volumen de producción de gas.

El parámetro (B), representa los mL de gas al punto de inflexión, donde se observó diferencia

significativa entre tratamientos (P<0.05). El T2, T3 y T4 presentaron la mayor cantidad de gas al punto

de inflexión (2.21, 2.10 y 2.17 mL) al compararse con el T1 el cual reveló 1.68 mL. Este parámetro

explica un incremento en la producción de gas, producto de la fermentación ruminal debido a la mejora

en la composición química de la dieta, esto tal vez debido a que las cepas Kl2, Kl11 e Io3 mejoraron el

ambiente microbial en comparación de Sc6, propiciando un incremento en la digestibilidad de la fibra y

por lo tanto, un aumento en la concentración de substrato disponible para los microorganismos (Cone et

al., 1998). La función biológica de este parámetro sugiere que las cepas Kl2, Kl11 e Io3 producirán 0.53,

0.42 y 0.49 mL más de gas que la Sc6 para alcanzar el punto de inflexión, lo cual indica que contienen

mayor cantidad de substrato para los microorganismos.

El parámetro (C), representa la tasa máxima de producción de gas (mL/h), donde se puede

observar que el T3 y T4 mostraron la mayor (P<0.05) tasa de producción de gas, ambos con 0.05 mL/h

mientras que en T1 y T2 las estimaciones fueron 0.03 y 0.02 mL/h, respectivamente. Este

comportamiento indica que el T3 y T4 tienen mayor habilidad de colonizar las partículas de la dieta que

el resto de los tratamientos, lo que ocasiona una mayor digestibilidad de la fibra y un incremento en el

volumen de gas producido.

168

Cuadro 27. Parámetros de la digestibilidad ruminal de MS entre tratamientos

Parámetros

Tratamiento1

EE(±) T1 T2 T3 T4

A 8.05b 11.53a 11.6a 10.42a 0.68

B 1.68b 2.21a 2.10a 2.17a 0.10

C 0.03b 0.02b 0.05a 0.05a 0.00

ab Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamiento. A = Hora al punto de inflexión. B = mL de gas al punto de inflexión. C = Tasa máxima de producción de gas (mL/h). 1.T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado + Saccharomyces cerevisiae cepa 6; T2 = HA + EM + concentrado + Kluyveromyces lactis cepa 2; T3 = HA + EM + concentrado + Kluyveromyces lactis cepa 11 y T4 = HA + EM + concentrado + Issatchenkya orientalis cepa 3.

169

El parámetro (C), representa la tasa máxima de producción de gas (mL/h), donde se puede

observar que el T3 y T4 mostraron la mayor (P<0.05) tasa de producción de gas, ambos con 0.05 mL/h

mientras que en T1 y T2 las estimaciones fueron 0.03 y 0.02 mL/h, respectivamente. Este

comportamiento indica que el T3 y T4 tienen mayor habilidad de colonizar las partículas de la dieta que

el resto de los tratamientos, lo que ocasiona una mayor digestibilidad de la fibra y un incremento en el

volumen de gas producido.


El (Cuadro 28) muestra la producción y perfiles de AGV entre tratamiento, donde se observó

que el T2 presentó mayor (P<0.05) concentración de ácido acético, propiónico y butírico (37.30, 19.25 y

7.74 mmol/L) al compararse con el T1, T4 y T3. Así mismo, el T4 fué superior (P<0.05) en ácido

propiónico al T1 (16.59 y 12.52 mmol/L respectivamente). Por otro lado, en cuanto al ácido butírico los

T1, T2 y T4 fueron superiores (P<0.05) al T3 (7.45, 7.74, 6.73 y 4.51 mmol/L, respectivamente).

Allen y Mertens (1988) mencionaron que el patrón de fermentación en los rumiantes está

influenciado por la interacción entre la dieta, la población microbiana y el propio animal.

170

Cuadro 28. Comportamiento en la producción y perfil de AGV entre tratamientos durante la fermentación in vitro

Variables Tratamientos1

EE(±)

T1 T2 T3 T4

Ácido acético (mmol/L) 24.87c 37.30a 32.84ab 29.91bc 2.03

Ácido propiónico (mmol/L) 12.52c 19.25a 17.73ab 16.59b 0.89

Ácido butírico (mmol/L) 7.45a 7.74a 4.51b 6.73a 0.52

abc Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamientos. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado + Saccharomyces cerevisiae cepa 6; T2 = HA + EM + concentrado + Kluyveromyces lactis cepa 2; T3 = HA + EM + concentrado + Kluyveromyces lactis cepa 11 y T4 = HA + EM + concentrado + Issatchenkya orientalis cepa 3.

171

La adición de cultivos de levadura en la alimentación de rumiantes ha mostrado efectos

contradictorios sobre la concentración de AGV en rumen. Por otra parte, se ha publicado que la

tendencia a incrementar la proporción molar de acetato en el rumen de animales suplementados con

cultivos de levaduras, puede estar relacionado a que se mejora el ambiente ruminal, favoreciendo el

crecimiento y actividad de los microorganismos que degradan la fibra (Chaucheyras et al., 1995).

En esta investigación, el T2 presentó la mayor concentración de ácido acético, propiónico y

butírico, este comportamiento propone que la cepa Kl2 favoreció el ambiente microbial incrementando el

número de bacterias celulolíticas provocando una mayor digestibilidad de la MS y FDA, disminuyendo el

contenido de LDA como se muestra en el (Cuadro 26). Dolezal et al., (2005) observaron un incremento

en la producción de AGV al incrementar la dosis del cultivo de levadura Sc (cepa SC-47) en la

alimentación de vacas Holstein en producción. Koul et al., (1998) mencionaron que se incrementó el

total de AGV en el rumen de terneros búfalos alimentados con 5 g/d de un cultivo de levadura que

contenía Sc al compararse con el grupo control (132.2 y 122.4 mmol/L). Sin embargo, Harrison et al.,

(1988) encontraron una disminución en la proporción molar de ácido acético incrementándose la

concentración de ácido propiónico en el líquido ruminal de vacas Holstein suplementadas con 114 g/d

de un cultivo de levadura que contenía Sc.

Concentración de N-NH3, Ácido Láctico y pH

El (Cuadro 29) muestra las concentraciones de N-NH3 y ácido láctico, así como el pH entre

tratamientos. La mayor (P<0.05) concentración de N-NH3 lo mostró el T4 en comparación con T1, T2 y

T3 (5.34, 3.06, 3.28 y 3.63 mM/mL, respectivamente). De igual manera, el mismo tratamiento tuvo

mayor (P<0.05) concentración de ácido láctico (0.69 mM/mL) en comparación al resto de los

tratamientos (0.44, 0.52 y 0.63 mM/mL para el T1, T2 y T3). Por otro lado, el pH en el T1 fue mayor

(P<0.05) en comparación con T3 y T4 (7.00, 6.83 y 6.59, respectivamente).

172

Cuadro 29. Comportamiento en la concentración de N-NH3, ácido láctico y pH entre tratamientos durante la fermentación in vitro

Variable

Tratamientos1

EE(±) T1 T2 T3 T4

N-NH3 (mM/mL) 3.06b 3.28b 3.63b 5.34a 0.39

Ácido láctico (mM/mL) 0.44c 0.52bc 0.63ab 0.69a 0.06

pH 7.00a 6.97ab 6.83b 6.59c 0.05

abc Medias con diferente literal en fila, son diferentes (P<0.05) entre tratamientos. 1 T1 = Heno de avena (HA) + ensilaje de maíz (EM) + concentrado + Saccharomyces cerevisiae cepa 6;

T2 = HA + EM + concentrado + Kluyveromyces lactis cepa 2; T3 = HA + EM + concentrado +

Kluyveromyces lactis cepa 11 y T4 = HA + EM + concentrado + Issatchenkya orientalis cepa 3.

173

Nitrógeno amoniacal (N-NH3). La digestión de las proteínas está relacionada con su

solubilidad dentro del rumen, cuando la solubilidad es menor disminuye la liberación de amoniaco.

Moloney y Drennan (1994) reportaron que varias fuentes de nitrógeno contribuyen a la producción de

amoniaco, tales como, el nitrógeno no proteico (NNP) de la dieta, nitrógeno salival y posiblemente

pequeñas cantidades de urea que penetran a través del epitelio del rumen.

En el presente estudio la mayor concentración de N-NH3 se observó en el T4, esto tal vez se

debió a que la cepa Io3 mejoró el ambiente microbial provocando una mayor actividad de los

microorganimos, incrementando la digestibilidad de la MS y FDN aumentando la concentración de N-

NH3 producto de la fermentación. Fonty y Chaucheyras-Durand (2006) mencionaron que el efecto del

cultivo de levaduras en la concentración de N-NH3 es muy variable, lo cual depende de factores

abióticos (la dieta) y bióticos (microorganismos del rumen). En otro estudio, Williams et al., (1991)

reportaron que la disminución en la concentración de N-NH3 en rumen de animales suplementados con

cultivos de levaduras puede resultar en un incremento en la incorporación de amonia a la proteína

microbial, lo cual puede provocar mejor actividad de los microorganismos del rumen, otra posible razón,

puede ser por la reducción de la actividad de bacterias proteolíticas del rumen, como fue reportado en el

estudio in vitro por Chaucheyras-Durand et al., (2005). Díaz (2011) reportó similar comportamiento de la

cepa Io3 la cual incremento la concentración de N-NH3 en inóculos de levaduras durante la producción

de gas in vitro.

Ácido láctico y pH. Martin y Nisbet (1992) mencionaron que la incorporación de cultivos de

levadura en la dieta de rumiantes, ayuda a disminuir la concentración de lactato en el rumen por

consecuencia de estimular a las bacterias que fermentan lactato como Selenomonas ruminantium (Sel.

ruminantium) y Megasphaera elsdenii (M. elsdenii), previniendo efectos asociados a una acidosis

láctica. Otros estudios, han demostrado que Aspergillus oryzae (A. oryzae) y Saccharomyces cerevisiae

174

(Sc) adicionados en la dieta de rumiantes, disminuyen la concentración de lactato por estimulo de las

bacterias que lo utilizan, tales como Sel. ruminantium y M. elsdenii (Waldrip y Martin, 1993). En este

experimento, la mayor concentración de ácido láctico lo presentó el T4, esto tal vez debido a que la

cepa Io3 no estimula en gran medida a las bacterias acido lácticas que lo utilizan, tal como es indicado

por varios autores. Díaz (2011) encontró similar comportamiento de la cepa Io3 la cual incrementó la

concentración de ácido láctico en inóculos de levaduras durante la producción de gas in vitro. Por

otro lado, el pH ruminal refuerza el balance entre la capacidad amortiguadora y la acidez de la

fermentación, aún y cuando no puede definirse un pH óptimo en el medio ruminal, los microorganismos

presentan cierto intervalo en el cual se reproducen mejor y su metabolismo es más eficiente (Wales et

al., 2004). El pH bajo inhibe la producción de N-NH3 in vitro provocando un efecto negativo a las

bacterias metanogénicas (Methanobacterium bryantii, M. formicicum y Metanosarcina barkeri) y

protozoarios en la degradación de la fibra (Nagaraja y Titgemeyer, 2007).

En la presente investigación el T1 presentó el pH más alto al cotejarse con el T3 y T4, pero fué

similar al T2, esto tal vez debido a que la cepa Sc6 optimizó el ambiente microbial manteniendo la

neutralidad del pH provocando una disminución en la concentración de ácido láctico. La reducción de la

cantidad de ácido láctico resulta en un incremento del pH ruminal que favorece el crecimiento de las

bacterias celulolíticas, favoreciendo un incremento en la digestibilidad de la fibra y en la producción de

AGV (Chaucheyras-Durand y Fonty, 2001). Sin embargo, bajo las condiciones en las que se desarrolló

esta investigación, la cepa Sc6 no favoreció la concentración de AGV ni mejoró la digestibilidad de la

fibra al compararse con las cepas Kl2, Kl11 e Io3. La adición de Sc en la dieta de rumiantes, resulta

frecuentemente en un incremento en el número de bacterias celulolíticas (F. succinogenes, R. albus),

tanto in vitro como in vivo (Lila et al., 2004).

175


La adición de las cepas de levadura en el T2 (Kl2), T3 (Kl11) y T4 (Io3) en la dieta testigo de

becerros destetados, favoreció la digestibilidad de la MS, siendo el último tratamiento quien mostró un

incremento en la digestibilidad de la FDN.

La adición de Kl (cepa 2 y 11) en la dieta evaluada, aumentaron el porcentaje de digestibilidad

de la FDA, y junto con Io3 mostraron una marcada disminución en el contenido de LDA.

La cepa Kl11 presentó el mayor volumen de gas a las 96 h de incubación in vitro. Así mismo,

aunada a Io3 aumentaron la tasa máxima de producción de gas durante la fermentación ruminal. Siendo

Kl2 quien mayor incremento tuvo en la concentración de ácidos acético y propiónico. Por otro lado, Kl2,

Sc6 e Io3 aumentaron la producción de ácido butírico.

Por otra parte, Io3 presentó un incremento en la cantidad de N-NH3 y ácido láctico, siendo Sc6

quien mostró un claro aumento de pH durante la fermentación in vitro.

En base a los resultados y el comportamiento observado en este estudio de las cepas Kl2, Kl11

e Io3 se recomienda desarrollar más investigación, bajo diferentes niveles de inclusión a fin de alcanzar

una mejor respuesta animal.

176

DESARROLLO DEL ADITIVO DE LEVADURAS

177

DISEÑO Y USO DEL FERMENTADOR

Piezas Concepto Precio unitario Total

2 Tinaco Plastinack de 1, 100 Lts 1,100 2,200

1 Motor de 1/2 H.P. Evans 1,080 1,080

1 Venturi 1" 450 450

6 Llaves de 1" Bronce 99 594

12 Codos 1" PVC 5 60

8 Mts. Tubo PVC hidráulico 13.5 108

2 Conectores para tinaco de 1" 40 80

1 Nudo de 1" 25 25

1 Cruceta de 1" 20 20

1 Temporizador 95 95

4 Tee de 1" 7 28

Total con IVA $4,800.00

178

Piezas Concepto Precio unitario Total

2 Tinaco Industrial de 10,000 Lts 17,000 34,000

2 Motor de 1 H.P. Evans 1,550 3,100

2 Venturi 1" 450 900

6 Llaves de 1" Bronce 99 594

12 Codos 1" PVC 5 60

24 Mts. Tubo PVC hidráulico 13.5 324

2 Conectores para tinaco de 1" 40 80

2 Nudo de 1" 25 50

2 Temporizador 95 190

6 Tee de 1" 7 196

Total con IVA $39,494.00

179

TRABAJO DE CAMPO

189

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