ADN libre fetal en sangre materna: una nueva técnica de ... · LMP 4w 6w 8w 10w 12w 14w Birth...

ADN libre fetal en sangre materna: una nueva técnica de diagnóstico

genético prenatal no invasivo.

ADN libre fetal en sangre materna: una nueva técnica de diagnóstico

genético prenatal no invasivo.

Lucas OtañoServicio de Obstetricia

Instituto de Ciencias Básicas y Medicina ExperimentalUnidad de Medicina Fetal

Lucas OtañoServicio de Obstetricia

Instituto de Ciencias Básicas y Medicina ExperimentalUnidad de Medicina Fetal

www.hospitalitaliano.org.ar/obstetriciawww.hospitalitaliano.org.ar/obstetricia

Posgrado Bianual InterdisciplinarioPerinatología y Salud Materno-Infantil.Universidad Autónoma de Entre RíosAsociación Argentina de PerinatologíaParaná, Entre Ríos, 9 de abril de 2010

Posgrado Bianual InterdisciplinarioPerinatología y Salud Materno-Infantil.Universidad Autónoma de Entre RíosAsociación Argentina de PerinatologíaParaná, Entre Ríos, 9 de abril de 2010

Diagnóstico genético prenatal Diagnóstico genético prenatal

Aspiración de vellosidades coriónicas

Cordocentesis

Amniocentesis

0,5 a 1% riesgo de pérdida de embarazo

A partir de las 11 semanas

0,5 a 1% riesgo de pérdida de embarazo

A partir de las 11 semanas

Células fetales en circulación maternaCélulas fetales en circulación materna

Schnorl 1893 Trofoblasto en pulmón de eclámpticas

Walknowska 1969 Metafase XY en sangre materna

Confirmado por otros

Células con Y en embarazos de XX

Herzenberg 1979 Enriquecimiento con citometría de flujo

Lo y col. 1989 Métodos moleculares: FISH y PCR

Bianchi y col 1990 Análisis eritroblastos nucleados

Bianchi y col 1992 47,XY,+21 en sangre materna

NIH 1994 NIFTY trial

Bianchi y col 2002 Resultados del NIFTY

Sexing: 41% Detección aneuploidías: 74%

Schnorl 1893 Trofoblasto en pulmón de eclámpticas

Walknowska 1969 Metafase XY en sangre materna

Confirmado por otros

Células con Y en embarazos de XX

Herzenberg 1979 Enriquecimiento con citometría de flujo

Lo y col. 1989 Métodos moleculares: FISH y PCR

Bianchi y col 1990 Análisis eritroblastos nucleados

Bianchi y col 1992 47,XY,+21 en sangre materna

NIH 1994 NIFTY trial

Bianchi y col 2002 Resultados del NIFTY

Sexing: 41% Detección aneuploidías: 74%

Células fetales en circulación materna para diagnóstico prenatal

Células fetales en circulación materna para diagnóstico prenatal

• Raras

• Difícil de aislar

• Difícil de identificar

• Metodología cara

• Exactitud diagnóstica inaceptable

• Persistencia de células en el tiempo

• Hoy: inaplicable en diagnóstico prenatal

• Raras

• Difícil de aislar

• Difícil de identificar

• Metodología cara

• Exactitud diagnóstica inaceptable

• Persistencia de células en el tiempo

• Hoy: inaplicable en diagnóstico prenatal

Células fetales en circulación materna Agenda futura


• ¿Mujer “quimera” luego de embarazo?• ¿Mujer “quimera” luego de embarazo?

Células fetales en tejido maternoMicroquimerismo

Células fetales en tejido maternoMicroquimerismo

Srivasta et al. Lancet 2001;358:2034Srivasta et al. Lancet 2001;358:2034

Cromosoma Y

Cromosoma X



• ¿Mujer “quimera” luego de embarazo?

• ¿Rol del microquimerismo fetal en la mujer?

• ¿Asociación con enfermedades autoinmunes?

• Capacidad de “stem cell” de las células fetales

• ¿Propiedades beneficiosas de las “stem cell fetales luego de años? ¿Ayuda inmunológica?

• ¿Diagnóstico prenatal en el futuro?

• ¿Mujer “quimera” luego de embarazo?

• ¿Rol del microquimerismo fetal en la mujer?

• ¿Asociación con enfermedades autoinmunes?

• Capacidad de “stem cell” de las células fetales

• ¿Propiedades beneficiosas de las “stem cell fetales luego de años? ¿Ayuda inmunológica?

• ¿Diagnóstico prenatal en el futuro?

ADN libre en plasma y sueroADN libre en plasma y suero

Stroun y col. 1977 ADN libre circulante en plantas y animales

Leon y col. 1977 Poco ADN libre en suero de individuos normales (13 ng/ml)

Mucho ADN libre en pacientes con cáncer (280 ng/ml)

Cheu y col 1996 ADN tumor-específico en plasma y suero de pacientes con cáncer (¿Diagnóstico, pronóstico y seguimiento?)

Lo y col. 1997 ADN fetal en suero y plama materno

Stroun y col. 1977 ADN libre circulante en plantas y animales

Leon y col. 1977 Poco ADN libre en suero de individuos normales (13 ng/ml)

Mucho ADN libre en pacientes con cáncer (280 ng/ml)

Cheu y col 1996 ADN tumor-específico en plasma y suero de pacientes con cáncer (¿Diagnóstico, pronóstico y seguimiento?)

Lo y col. 1997 ADN fetal en suero y plama materno

ADN libre en plasma y sueroADN libre en plasma y suero

• Cáncer

• Trauma

• LES

• Envejecimiento

• Transplantados

• Cáncer

• Trauma

• LES

• Envejecimiento

• Transplantados

Situaciones con ADN libre aumentadoSituaciones con ADN libre aumentado

Marcador de muerte o daño celularMarcador de muerte o daño celular

Diagnóstico prenatal No invasivoDiagnóstico prenatal No invasivo

Células fetales en sangre mat.

•Técnicamente complejo y costoso

•Nº de cél fetales en sangre es bajo

•A partir de las 15 sem

•Vida media : 25-35 días.

•Pueden persistir por décadas

DNA fetal libre en plasma mat.

•Técnicamente más simple

•2 a 6 % del ADN libre

•A partir de las 6 sem

•Vida media: 16 min

•“Real time-PCR”

Ácidos nucleicos fetales libres en plasma materno

Ácidos nucleicos fetales libres en plasma materno

• ADN: permite evaluar genotipo

• mARN: permite evaluar expresión génica

• ADN: permite evaluar genotipo

• mARN: permite evaluar expresión génica

Condiciones asociadas a mayor cantidad de ADN libre

Condiciones asociadas a mayor cantidad de ADN libre

• Trisomía 21 fetal (2 veces)

• Trisomía 13 fetal

• Hiperemesis gravídica

• Polihidramnios

• Preeclampsia (5 veces)

• HELLP

• RCIU

• Acretismo placentario

• Trisomía 21 fetal (2 veces)

• Trisomía 13 fetal

• Hiperemesis gravídica

• Polihidramnios

• Preeclampsia (5 veces)

• HELLP

• RCIU

• Acretismo placentario

UM Parto6s 8s 10s 14s4s

Fertilización

16s 18s 20s 28s

Obtención de muestras para diagnóstico prenatalObtención de muestras para diagnóstico prenatal

Diagnóstico preimplantación

Vellosidades coriónicas

Biopsia deplacenta

Amnio

12s

Cordocentesis

UM Parto6s 8s 10s 14s4s

Fertilización

16s 18s 20s 28s

Obtención de muestras para diagnóstico prenatalObtención de muestras para diagnóstico prenatal

Diagnóstico preimplantación

Vellosidades coriónicas

Biopsia deplacenta

Amnio

12s

Cordocentesis

Ácidos nucleicoslibres en

sangre materna

Aplicaciones clínicas del ADN fetal libre en plasma materno


Determinación de alelos paternos o ausentes en la madre

• Sexo

• Rh fetal

• Mutaciones paternas

• Mutaciones fetales “de novo”

Determinación de alelos paternos o ausentes en la madre

• Sexo

• Rh fetal

• Mutaciones paternas

• Mutaciones fetales “de novo”

Boletin de Medicina Fetal 2008. www.medicinafetal.or.ar Boletin de Medicina Fetal 2008. www.medicinafetal.or.ar

Mutaciones génicas detectadas por ADN fetal libre en plasma materno

Mutaciones génicas detectadas por ADN fetal libre en plasma materno

• Acondroplasia 2004

• ß-talasemia 2005

• Hiperplasia suprarenal congénita 2002

• Fibrosis quística 2002

• Enfermedad de Huntington 2003

• Distrofia miotónica 2000

• Hb lepore 2006

• Acondroplasia 2004

• ß-talasemia 2005

• Hiperplasia suprarenal congénita 2002

• Fibrosis quística 2002

• Enfermedad de Huntington 2003

• Distrofia miotónica 2000

• Hb lepore 2006

Norbury & Norbury, Semin Fetal Neonatal Med 2008;13:76Norbury & Norbury, Semin Fetal Neonatal Med 2008;13:76



Determinación de sexo

• Enfermedades ligadas al X (Duchenne, hemofilia, Hunter, etc.

• Embarazos en riesgo de hiperplasia suprarrenal congénita

• Manejo de malformaciones: megavejiga, persistencia de cloaca, extrofia, etc.

Determinación de sexo

• Enfermedades ligadas al X (Duchenne, hemofilia, Hunter, etc.

• Embarazos en riesgo de hiperplasia suprarrenal congénita

• Manejo de malformaciones: megavejiga, persistencia de cloaca, extrofia, etc.


Hiperplasia Suprarrenal CongénitaDiagnóstico y tratamiento prenatal

Objetivos:

• Prevenir la virilización prenatal de las niñas afectadas

• Prevenir la crisis de pérdida de sal y muerte

• Prevenir la virilización progresiva en recién nacidos y niños afectados

First trimester prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) in 20 at-risk pregnancies. L. Otaño, H. Aiello, L. Igarzábal, E.C. Gadow, I. Bergadá, J. Heinrich, A. Dardis, R. Marino, M. Rivarola,A. Belgorosky. International Society for Prenatal Diagnosis, 2002

LMP 6w 8w 10w 12w 14w Birth4w

Fertilization

1st trimester 2st and 3st trimesterPreconception

• Comienza dexamethasone20 µg/kg/día



Fertilization


AVC para cariotipoy estudio molecular




Fertilization


• Varón o mujer no-afectada,suspende dexa.

• Mujer afectada: dexa porel resto del embarazo

AVC para cariotipoy estudio molecular

• Reasesoramiento genéticocompleto




Fertilization


ADN fetal en circulación materna: Determinación de sexo fetal en sangre materna a las 6 semanas de gestación.Bartha et al. Obstet Gynecol 2003;101:1135Chiu RW et al. ClinChem 2002;48778Rijdners et al. Obstet Gynecol 2001;98:374 (from 8 wks)

Puede prevenir el tratar fetos masculinos




Determinación de Rh fetal en mujeres Rh negativas con pareja Rh positiva heterocigota

• Prevención 1ria: Uso racional y eficiente de la inmunoglobulina

• Prevención 2ria: Asesoramiento y manejo prenatal del embarazo sensibilizado

Determinación de Rh fetal en mujeres Rh negativas con pareja Rh positiva heterocigota

• Prevención 1ria: Uso racional y eficiente de la inmunoglobulina

• Prevención 2ria: Asesoramiento y manejo prenatal del embarazo sensibilizado


Genotipo de RhGenotipo de Rh

+/-+/-

+/-+/-

-/--/-

-/--/-

Seguimiento del embarazo Rh sensibilizado


Seguimiento actual

Basado en métodos no invasivos

• Pico sistólico de la arteria cerebral media (PS-ACM)

• RhD fetal en plasma materno

Seguimiento actual


• Pico sistólico de la arteria cerebral media (PS-ACM)

• RhD fetal en plasma materno



Seguimiento actual


• No pone en riesgo al embarazo

• Se pueden repetir ante cualquier duda

• Mejor valor predictivo

Seguimiento actual


• No pone en riesgo al embarazo

• Se pueden repetir ante cualquier duda

• Mejor valor predictivo



Diagnóstico de Rh fetal por análisis de ADN fetal en plasma materno.

• Padre Rh pos heterocigota

• 50% de probabilidad de feto Rh negativo.

• Factible desde las 7-8 semanas de amenorrea

• Se puede repetir

• Si el feto es negativo: no más estudios

• Sin riesgos para el embarazo

Diagnóstico de Rh fetal por análisis de ADN fetal en plasma materno.

• Padre Rh pos heterocigota

• 50% de probabilidad de feto Rh negativo.

• Factible desde las 7-8 semanas de amenorrea

• Se puede repetir

• Si el feto es negativo: no más estudios

• Sin riesgos para el embarazo

Diagnóstico Prenatal No Invasivo: Determinación de Rh Fetal a través del análisis de ADN

Fetal libre en plasma materno

Sesarini C1, Giménez ML2, Redal M1, Izbizky G2, Aiello H2, Argibay P1, Otaño L2.

(1) Unidad de Medicina Molecular y Genómica, ICBME

(2) Unidad Medicina Fetal, Servicio de Obstetricia

Hospital Italiano de Buenos Aires

SOGIBA 2008. XXVI Jornadas de Obstetricia y Ginecología13,14 y 15 de Julio de 2008

Buenos Aires Sheraton Hotel & Convention Center

www.hospitalitaliano.org.ar/medicinafetal

Determinación No Invasiva del Sexo Fetal a través del análisis de ADN Fetal libre en plasma

materno

Giménez ML1 , Sesarini C2, Redal M2, Izbizky G1, Aiello H1, Argibay P2, Otaño L1.

(1) Unidad Medicina Fetal, Servicio de Obstetricia

(2) Unidad de Medicina Molecular y Genómica, ICBME

Hospital Italiano de Buenos Aires

SOGIBA 2008. XXVI Jornadas de Obstetricia y Ginecología13,14 y 15 de Julio de 2008

Buenos Aires Sheraton Hotel & Convention Center

www.hospitalitaliano.org.ar/medicinafetal

Diagnóstico prenatal no invasivoDiagnóstico prenatal no invasivo

Sesarini y col. Arch Argent Pediatr 2009 (en prensa)Sesarini y col. Arch Argent Pediatr 2009 (en prensa)


Sesarini y col. Arch Argent Pediatr 2009 (en prensa)Sesarini y col. Arch Argent Pediatr 2009 (en prensa)

Objetivo . Evaluar la factibilidad y desempeño diagnóstico de la determinación del genotipo RhD y del sexo fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en plasma de embarazadas mediante reactivos de uso general en biología molecular.

Objetivo . Evaluar la factibilidad y desempeño diagnóstico de la determinación del genotipo RhD y del sexo fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en plasma de embarazadas mediante reactivos de uso general en biología molecular.

• Extracción de sangre (5 ml) de embarazadas

• Separación del plasma y extracción del ADN

• Amplificación del ADN del marcador DYS14 presente en el cromosoma Y: Real Time-PCR

• Resultado: Asignación de sexo masculino (DYS14 positivo)Asignación de sexo femenino (DYS14 negativo)No concluyente

• Se compararon con el sexo del recién nacido

• Exactitud, Sensibilidad, Especificidad.

Material y Métodos

Giménez ML, y col. Determinación No Invasiva del Sexo Fetal a través del análisis de ADN Fetal libre en plasma materno. SOGIBA 2008 www.hospitalitaliano.org.ar/medicinafetal

Material y Métodos

Curva de Amplificación

DYS14 neg

DYS14 pos

Giménez ML, y col. Determinación No Invasiva del Sexo Fetal a través del análisis de ADN Fetal libre en plasma materno. SOGIBA 2008 www.hospitalitaliano.org.ar/medicinafetal

Daniels et al. Prenat Diagn 2009;29:101Daniels et al. Prenat Diagn 2009;29:101

Diagnóstico de RhD fetal en ADN fetal en plasma maternoDiagnóstico de RhD fetal en ADN fetal en plasma materno

Gen RhD:Secuencias del Exon 7

C Sesarini y col. Arch Argen Pediatr 2009 (en prensa)

Asignación de Rh positivo: Exon 7 positivoAsignación de Rh negativo: Exon 7 negativoNo concluyente

La asignación de RhD fetal en ADN libreSe comparó con el RhD del recién nacido

Material y Métodos

Material y Métodos

Curva de Amplificación

Rh neg

Rh pos

Sesarini C, y col. Determinación de Rh Fetal a través del análisis de ADN Fetal libre en plasma materno. SOGIBA 2008. www.hospitalitaliano.org.ar/medicinafetal

ResultadosSexo de los RN

Masc. Fem.

DYS14 en plasma materno

Positivo 33 2 35

Negativo 1 20 21

34 22 56

Exactitud: 94,6% (IC95% 85,4 – 98,2) (53/56)

Sensibilidad: 97,1% (IC95% 85,1 – 99,5) (33/34)

Especificidad: 90,9% (IC95% 72,2 – 97,5) (20/22)

Valor predictivo de sexo masc.: 94,3% (IC95% 81,4 – 98,4) (33/35)

Valor predictivo de sexo fem.: 95,2% (IC95% 77,3 – 99,1) (20/21)

Sesarini C, Giménez ML, Redam MA, Izbizky G, Aiello H, Argibay P, Otaño L.: Diagnóstico genético prenatal no invasivo a través del análisis de ADN Fetal libre en plasma materno. Archivos Argentinos de Pediatría, 2009 (En prensa)

Resultados

Rh de los RN

Positivo Negat

Rh en plasma materno

Positivo 34 6 40

Negativo 2 18 20

36 24 60

Exactitud: 86,7% (IC95% 75,8 – 93,1) (52/60)

Sensibilidad: 94,4% (IC95% 81,8 – 98,5) (34/36)

Especificidad: 75% (IC95% 55,1 - 88) (18/24)

Valor predictivo de RhD positivo: 85% (IC95% 70,9 – 92,9) (34/40)

Valor predictivo de RhD negativo: 90% (IC95% 79,9 – 97,2) (18/20)

Sesarini C, Giménez ML, Redam MA, Izbizky G, Aiello H, Argibay P, Otaño L.: Diagnóstico genético prenatal no invasivo a través del análisis de ADN Fetal libre en plasma materno. Archivos Argentinos de Pediatría, 2009 (En prensa)


Sesarini y col. Arch Argent Pediatr 2009 Sesarini y col. Arch Argent Pediatr 2009

Conclusiones . La determinación no invasiva del RHD y sexo fetal en plasma materno mediante reactivos de uso general en biología molecular fue factible en la mayoría de los casos, con un desempeño diagnóstico similar al descripto en la bibliografía.

Conclusiones . La determinación no invasiva del RHD y sexo fetal en plasma materno mediante reactivos de uso general en biología molecular fue factible en la mayoría de los casos, con un desempeño diagnóstico similar al descripto en la bibliografía.

Exon 7 Sensibilidad 94 %Especificidad 75 %

C Sesarini y col. Arch Argen Pediatr 2009 (en prensa)C Sesarini y col. Arch Argen Pediatr 2009 (en prensa)


N = 60

Exon 7

Exon 5

Sensibilidad 94 %Especificidad 75 %



N = 60

Exon 7

Exon 5





N = 60

N = 86*

*Datos no publicados*Datos no publicados

Exon 7

Exon 5Sensibilidad 100 %Especificidad 100 %



N = 25

…El descubrimiento del ADN y ARN fetal en plasma

materno introduce nuevas posibilidades no

invasivas para la pesquisa, diagnóstico prenatal y

seguimiento de enfermedades fetales y maternas

que podrían ser utilizadas en forma rutinaria en

el futuro…

…El descubrimiento del ADN y ARN fetal en plasma El descubrimiento del ADN y ARN fetal en plasma

materno introduce nuevas posibilidades no materno introduce nuevas posibilidades no

invasivas para la pesquisa, diagninvasivas para la pesquisa, diagnóóstico prenatal y stico prenatal y

seguimiento de enfermedades fetales y maternas seguimiento de enfermedades fetales y maternas

que podrque podríían ser utilizadas en forma rutinaria en an ser utilizadas en forma rutinaria en

el futuroel futuro……

El futuroEl futuro

• Diagnóstico de aneuploidías

• Diagnóstico en enfermedades génicas

• Rol de los ácidos nucleicos en el manejo de las complicaciones obstétricas

• Diagnóstico de aneuploidías

• Diagnóstico en enfermedades génicas

• Rol de los ácidos nucleicos en el manejo de las complicaciones obstétricas

Lo y col. Nat Med 2007;13:218-23Lo y col. Nat Med 2007;13:218-23

Muchas graciasMuchas gracias www.hospitalitaliano.org.ar/obstetricia

Unidad de Medicina Fetal Unidad de Medicina Molecular, H Aiello C Kanter ICMBEML Giménez G Izbizky P ArgibayP Marantz L Otaño M RedalM Pietrani R Sod C SesariniA Wojakowsky

Unidad de Medicina Fetal Unidad de Medicina Molecular, H Aiello C Kanter ICMBEML Giménez G Izbizky P ArgibayP Marantz L Otaño M RedalM Pietrani R Sod C SesariniA Wojakowsky

ADN libre fetal en sangre materna: una nueva técnica de ... · LMP 4w 6w 8w 10w 12w 14w Birth...

Documents

Transcript of ADN libre fetal en sangre materna: una nueva técnica de ... · LMP 4w 6w 8w 10w 12w 14w Birth...