ADN Polimerasa Gamma

7/26/2019 ADN Polimerasa Gamma

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LA ADN

POLIMERASA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAEY SU USO

COMO HERRAMIENTA BIOTECNOLGICA

INFORME TCNICO DE LA OPCIN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIN

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE INGENIERO BIOTECNLOGO

PRESENTA

RAYMUNDO MONDRAGN MARTNEZ

DIRECTOR EXTERNO: DR. LUIS G. BRIEBA DE CASTRO

Mxico D.F., Mayo de 2007


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Lugar de Realizacin del Proyecto:

Laboratorio de Bioqumica Estructural; Departamento de Bioqumica del Centro de

Investigaciones y Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional

Asesor Externo

(Director del proyecto) Dr. Luis G. Brieba de Castro

Asesor InternoM.C. Gloria Lpez Jimnez

Sinodal

M.C. Patricia Vzquez Lozano

Alumno sustentante

Raymundo Mondragn Martnez


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AGRADECIMIENTOS

A mis padres Rafael y Beatrizpor ser los padres que han sido, porcreer siempre en mi y por haberme dado la educacin ms slida junto con losmejores fundamentos para no flaquear y as poder mantenerme siempre a la altura de mis sueos

A cada una de mis tas, -Vicky, Shofiy Luz-por haber sido cadauna como una madre ms en toda mi vida, ya que sin

ustedes es un hecho que no lo hubiera logrado

A los que ya no estn a mi lado

A mis abuelitos Benjay Elena, simplemente porque al A mi to Quiqueporque estoy seguro que lerecordarlos, el nico sentimiento que me hubiera encantado ver como terminabaembriaga, es el amor con xito

A la que parece que siempre estar conmigo, Mi Beatricita

A mis hermanos Rafay Rochy, por ser los hermanos que han sidoya lo logramos los 3!!

A mis amigos

A Mario, simplemente mi hermano para siempre, por abrirme las puertasde su casa, as como a sus padres, por tratarme comoa un hijo ms, es algo que jams olvidar

A Cuau, por hacer parecer que la escuela era tan sencillay de igual forma, por abrirme las puertas de su

casa y tambin a sus padres

A mi muy querido hermano Leo , por ensearme esa leve actitudde omnipotencia jaja y por siempre animarme y ensearmelo que necesitaba sin necesidad de hablar

A Paquito, por ensearme lo verdadero Merol

Al buenAlex Fernndezpor ser un hermanitoy por demostrarme la verdaderanobleza en alguien

A mi ltimo amigo adquirido, DanyOlgunel chavito,por demostrarme su sincera amistad

tan rpido

A mis dudes de la infancia Pablo, Robert y Jorge

Y a todos los que me faltan disclpenme pero solo dej est hoja

Al Dr. Luis G. Brieba, ya que a pesar de ser una personamuy exitosa, me hizo sentir bien y me ayud siempre

en lo que necesit

A la que se rob mi corazn y me dijo que siempre lo querr para ella, la queme enamor con una ida a comer y de quien me enamor como

siempre dese enamorarme de alguien, en un conciertode U2 Para ti, mi preciosa Virginia D. Osorio A.

Gracias por todo tu amor y apoyo


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NDICE

1.RESUMEN 12.INTRODUCCIN 23.ANTECEDENTES 4

3.1. Replicacin de cidos nucleicos 43.2. Replicacin mitocondrial 5

3.2.1. Mecanismos de replicacin del ADN mitocondrial 63.3. ADN polimerasas 73.4. Expresin recombinante de ADN polimerasas mitocondriales 8

3.4.1. Caractersticas de las ADN polimerasas mitocondriales 93.5. Investigaciones previas en la elaboracin de quimeras 10

4.JUSTIFICACIN 125.OBJETIVOS 13

5.1Objetivo General 13

5.2 Objetivos Especficos 136.ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 147.MATERIALES Y MTODOS 15

7.1. Obtencin del ADN genmico de S. cerevisiae 15

7.2. Diseo in silico de las construcciones a realizar del ADN polimerasa 15

7.3. Diseo de los iniciadores para amplificar las tres construcciones de la

ADN polimerasa 16

7.4. Amplificacin por Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) del

gen completo y las dos deleciones de la ADN polimerasa 16

7.5 Obtencin de los cassettes 18

7.6 Obtencin del vector 187.7. Subclonacin de la ADN polimerasa de Saccharomyces cerevisiae

en el plsmido pET28a(+) 197.8. Obtencin de clones positivos conteniendo el gen de la ADN

polimerasa de S. cerevisiae en vectores de expresin de procariontes 19

7.9 Corte con enzimas de restriccin 207.10 Electroforesis de ADN en gel de agarosa 20

7.11 Expresin recombinante de la ADN polimerasa de S. cerevisiae

en Echerichia coli 218.RESULTADOS Y DISCUSIN 22

8.1. Diseo de construcciones 228.2. Diseo de oligonucletidos 238.3. Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de delecin de

la ADN polimerasa de S. cerevisiaepor medio de la PCR 24

8.4. Reaccin de ligacin del gen completo y de las mutantes de delecin

de la ADN polimerasa de S.cerevisiaeen el vector pET28a(+) 25

8.5. Identificacin de clones positivos 26


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v

8.6. Expresin recombinante de la ADN polimerasa en E. coli 27

9.PERSPECTIVAS DEL TRABAJO 2810.CONCLUSIONES 3111.REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 32ANEXOS


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NDICE DE CUADROS Y FIGURAS

Cuadro 1.Similitudes entre las ADN polimerasas que intervienen en la

replicacin 3

Cuadro 2.Reactivos y concentraciones finales para la amplificacin del gen

completo y las dos deleciones de la ADNpol 5

Cuadro 3.Programa para el termociclador 5

Cuadro 4.Proporcin inserto:vector en la subclonacin de la ADNpolen el

plsmido pET28a(+) 25

Figura 1. Similitudes estructurales entre laADN polimerasa y la T7 ADN

polimerasa 13

Figura 2.Dominio de sitio de unin de la tioredoxina en el bacterifago T7 y

la ausencia de ste en la ADN polimerasa I de E.coli 17

Figura 3.Superposicin del dominio del pulgar de la Taq ADN polimerasa

(azul) con la T7 ADN polimerasa (rosa). Las flechas indican el sitio de insercin

de la T3 TBD (amarillo). La secuencia primaria de aminocidos de la Taq ADN

polimerasa desde el residuo 470 507 se indica debajo (azul) con la secuencia

de la T3 TBD (amarillo) y la regin deletada en rojo. 18

Figura 4.Metodologa para la subclonacin y expresin de la ADNpolde

Saccharomyces cerevisiae 14

Figura 5.Diseo de construcciones a partir de la secuencia de aminocidos

de la ADNpoly el fragmento Klenow 22

Figura 6.Diseo de oligonucletidos para amplificar el gen de la ADNpoly

deleciones en el N-terminal 23

Figura 7.Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de delecin de

la ADNpolde S. cerevisiae. Lnea 1) gen completo de 3762 nucletidos,2) Delecin 102 de 3 456 nucletidos, 3) Delecin 124 de 3390 nucletidos.

El marcador de peso molecular de 1 kb (New England Biolabs) muestra que los

productos de amplificacin corresponden al tamao esperado 24


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Figura 8.Reaccin de ligacin de dos mutantes de delecin y el gen completo

de la ADNpol. Lnea 1) plsmido pET28a cortado con NheI y SacI, 2) plsmido

pET28a superenrrollado, 3) marcador de peso molecular de 1 kb NEB, 4) producto

digerido de la delecin II, 5) producto digerido de la delecin I, 6) producto digerido

del gen completo de la ADNpolde S. cerevisiae 25

Figura 9. Doble digestin con NheIy SacI de la mutante de delecin II

de la ADNpolde S. cerevisiae. Lneas 1 a la 6 representan 6 colonias

(en este caso todas positivas), se observan dos bandas, una inferior y

otra superior que corresponde al plsmido pET28a de 5 369 nucletidos

digerido. La banda ms intensa del marcador de peso molecular corresponde

a 3 kb y la inmediata superior a 4 kb 26

Figura 10.Gel SDS-PAGE que muestra la expresin recombinante de la

ADNpolde S. cerevisiae. Lneas 1 y 2 muestran la construccin completa,

lneas 3 y 4 construccin Nterm124. Lneas 2 y 4 despus de la induccin.

La expresin de la protena se muestra con dos asteriscos 27

Figura 11.Metodologa para la construccin de la quimera Taq ADN pol / 29

Figura 12.Esquematizacin ms detallada para la construccin de la

quimera Taq ADN pol / 30


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1.RESUMEN

Desde que Arthur Kornberg obtuvo de forma sinttica y describi por primera vez a la ADN

polimerasa de Escherichia coli, a la fecha se han descrito cinco tipos ms. Estas

polimerasas, aunque muy semejantes llevan a cabo diferentes funciones en lo que a la

sntesis del ADN respecta, ya que mientras unas sirven de iniciadores de este proceso (),

otras la llevan a cabo (), as como unas ms lo reparan (, ). Sin embargo se encontr

que ciertos organelos que llevan a cabo una funcin importante en la clula como la

respiracin celular y el metabolismo energtico en general, poseen su propio material

gentico. Uno de estos organelos es la mitocondria, que a su vez cuenta con la ADN

polimerasa como la encargada de la sntesis total de su material gentico en eucariontes.

Esta polimerasa se encuentra nicamente en humanos y levaduras, adems es una

enzima sumamente fiel. A diferencia de S. cerevisiae, la de humano necesita un factor de

procesividad para que funcione eficientemente, sin embargo esta polimerasa guarda una

gran similitud con la polimerasa del bacterifago T7, por lo cual es de gran inters nuestro

su comparacin para el anlisis funcional y estructural de nuestra polimerasa.

De lo anterior parte el inters acerca del estudio de esta polimerasa, ya que el modelo

tomado como estudio, el de Saccharomyces cerevisiae, es altamente procesivo y nonecesita de ningn factor extra para llevar a cabo la replicacin total. De esta forma es

importante comprender el funcionamiento de esta unidad enzimtica para as vislumbrar

las interacciones en el ncleo del resto de las polimerasas. Adems de que se tiene un

especial inters en la mitocondria ya que a ella se le atribuyen mltiples enfermedades en

humanos, como la diabetes tipo II, disfunciones cardiacas, as como el envejecimiento

mismo.

De esta forma el inters fue expresarla de forma recombinante en E. coli en la cepaBL21/DE3 Rosseta II para as producirla en grandes cantidades y facilitar su estudio futuro.


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2.INTRODUCCIN

En los organismos eucariticos la mayor parte de la extensa informacin gentica reside

en el ncleo, sin embargo poseen organelos con su propio material gentico, mismos que

cumplen el papel primordial de principales proveedores de energa para la clula, ya que

llevan a cabo reacciones de fosforilacin oxidativa en mitocondria o fotosntesis en

cloroplastos. El plan es contribuir en el entendimiento de cmo el metabolismo del ADN es

llevado a cabo en los organelos. Se tiene un especial inters en las transacciones llevadas

a cabo por el ADN mitocondrial (mtADN), usando como modelo a Saccharomyces

cerevisiae. La mitocondria es especialmente interesante ya que guarda una relacin con el

envejecimiento en humanos.

A pesar del tamao relativamente pequeo del material gentico en la mitocondria, debido

a la transferencia mitocondrial al ncleo, el mtADN est asociado a una multitud de

enfermedades, incluyendo diabetes tipo II, anormalidades musculares y cardiacas y

envejecimiento. Las transacciones del mtADN son realizadas por una sola subunidad

enzimtica la cual desplaza a las subunidades mltiples enzimticas bacterianas ms

complejas presentes en el endosimbionte original, levaduras y en humanos. Todas las

enzimas implicadas en las transacciones del ADN son codificadas en el ncleo e

importadas por la mitocondria. Entendiendo como trabaja una sola subunidad de las

polimerasas es importante para comprender estas transacciones del ADN que ocurren en

la mitocondria, pero tambin para entender el rol de las polimerasas en el ncleo, como

nuevos miembros de esta familia, como la ADN polimerasa Q y la ARN polimerasa IV que

se localizan en ste [1,2].

En el presente trabajo escogimos estudiar las funciones del mtADN usando como modelo

a la levadura S. cerevisiae por sus obvias ventajas, ya que puede crecer de forma

anaerobia adems de la enorme cantidad de herramientas genticas en levaduras. Pero

para el sistema bioqumico es un sistema particularmente atractivo ya que las enzimas

envueltas en estas funciones del ADN son similares a los sistemas clsicos que posee el

bacterifago T7. Para el caso, la transcripcin mitocondrial es realizada por una ARN

polimerasa similar a la ARN polimerasa del bacterifago T7, as como tambin posee

similitudes respecto a la replicacin. Este bacterifago tiene el replisoma ms simple

conocido a la fecha, con solo cuatro protenas implicadas para llevar a cabo la sntesis


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coordinada de ADN, por lo que supondremos varias similitudes entre ste y nuestra

levadura. En el cuadro 1 mostramos la similitud replicativa mitocondrial entre S. cerevisiae

y la humana, as como las del bacterifago.

Partiendo de lo anterior, se pretende estudiar las interacciones existentes en el mtADN as

como a la ADN polimerasa (ADNpol) de S. cerevisiae, la cual ser el centro de atencin

en el presente trabajo ya que es la encargada de llevar a cabo la replicacin del mtADN y

se ha estudiado que le confiere alta procesividad a este fenmeno.

Cuadro 1. Similitudes entre las ADN polimerasas que intervienen en la replicacin


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3.ANTECEDENTES

3.1 Replicacin de cidos nucleicos

Una vez que Watson y Crick elucidaron la estructura del ADN fue ms sencillo comprender

su funcionamiento. Una de las ideas que surgi inmediatamente debido a la

complementariedad de ambas hlices fue que si por medio de estas hebras se transmita

la informacin gentica, entonces cada una de las bases en su orden tan preciso y estricto

deban de funcionar como un cdigo, mismo que a mediados de los 50s ya se saba que

su informacin llevaba hacia las protenas.

Con el conocimiento de que las protenas se sintetizaban fuera del ncleo, fue entonces

que Crick hizo la interrogante de Cmo era posible eso? As es que propuso a un posible

intermediario llamado ARN que se encuentra en el citoplasma, el cual posea ciertas

caractersticas que cada vez lo llevaban a asegurar sus hiptesis, entre las cuales estaban

que posea un esqueleto de azcares y fosfato tomando en cuenta que en vez de ribosa

tena desoxirribosa, que usaban las mismas bases nitrogenadas solo que tena uracilo en

vez de timina, sin embargo ste se poda unir a la adenina como lo haca la timina y que

era de cadena sencilla. A toda esta idea condensada Crick le llam dogma centralde la

biologa, especificando que el ADN se traduca a ARN y a partir de ste se producan las

protenas. Lo que hoy en da conocemos perfectamente como la replicacin, transcripcin

y traduccin respectivamente.

El objeto de inters principal en este trabajo es la replicacin, por lo que es importante

sealar que sta no es un proceso espontneo y pasivo ya que se requiere que la doble

hlice se abra y se sinteticen las nuevas cadenas de ADN, as que es un proceso llevado a

cabo por un conjunto de enzimas especializadas.

En el inicio de la replicacin, las topoisomerasas son las enzimas encargadas de evitar el

superenrollamiento de las cadenas mientras las helicasas logran desenrollar la cadena

original doble rompiendo los enlaces de Hidrgeno, por lo que necesita de ATP para este

fin. Las protenas de unin de cadena sencilla (SSB) se unen a las cadenas sencillas

evitando que se unan de nuevo, mientras que la ADN polimerasa lleva a cabo la

elongacin de la cadena nueva mediante la unin de los dNTPs libres y colocndolos con


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5

sus complementarios formando un enlace fosfodiester. Existen varias ADN polimerasas,

donde la responsable de la procesividad en la sntesis de la cadena nueva es la ADN

polimerasa III. Tambin interviene la primasa que es parte de un agregado de protenas

llamado primosoma que fija un pequeo iniciador de ARN a la cadena sencilla de ADN

como sustituto de 3 OH para que inicie la sntesis la ADN polimerasa adems de la ligasaque cataliza la formacin de los enlaces fosfodiester.

Por supuesto que la explicacin anterior es muy vaga, sin embargo es suficiente ya que lo

que nos interesa aqu es el estudio de las polimerasas, en especial la ADN polimerasa

encargada de replicar el mtADN de S. cerevisiaeque se explicar a continuacin.

3.2 Replicacin mitocondrial

La ADN polimerasa es la nica ADN polimerasa mitocondrial en humanos y levaduras

[3,4], esta caracterstica es conservada en la mayora de las clulas eucariontes, con la

excepcin de la mitocondria de Tripanosomala cual contiene al menos 5 ADN polimerasas

[5]. En S. cerevisiaeel gen MIP1 expresa un polipptido de 1255 aminocidos compuesto

de dos subdominios: el dominio exonucleasa 3 5 y el dominio arquetipo (pulgar, palma y

dedos), en contraste con la ADN polimerasa en humanos que no necesita una protena

accesoria (subunidad p55) para realizar la procesiva sntesis de ADN.

A la fecha, la nica familia ADN polimerasa A trabaja como el replisoma T7 ADN

polimerasa. Sin embargo la delecin de seis aminocidos en su dominio exonucleasa de la

T7 ADN polimerasa produce un mejor cristal, que ser utilizado en experimentos

posteriores ajenos al presente. La reciente estructura del cristal de la doble mutacin

puntual (D5A, E7A) muestra una conservacin en la exonucleasa y confirma nocin de que

la tioredoxina le confiere procesividad (Brieba and Ellenberger, manuscrito en

preparacin).

En comparacin con la T7 ADN polimerasa, la polimerasa de S. cerevisiaecontiene una

extensin de alrededor de 170 aminocidos en su dominio amino terminal y una secuencia

de alrededor de 40 aminocidos en el subdominio del pulgar, que es anlogo al lazo de

unin de tioredoxina del T7 (Figura 1).


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3.2.1 Mecanismos de la replicacin del ADN mitocondrial

Las ADN polimerasas necesitan un iniciador (primer o cebador) para comenzar la

replicacin. Est bien documentado que en los bacterifagos, bacterias y humanos laactividad enzimtica de la primasa es la que comienza el iniciador para la sntesis de la

hebra discontinua, mientras que existe un mecanismo mltiple para la sntesis de la hebra

lder. Tambin est bien documentado que en la mitocondria de S. cerevisiae la ARN

polimerasa mitocondrial (mtARNP) transcribe un hbrido ARN:ADN en la secuencia ori/rep

que es usada como cebador inicial para la ADN polimerasa [6].

La ADN polimerasa humana es una transcriptasa reversa eficiente, as es capaz de usar

este hbrido ARN:ADN para iniciar la replicacin. La regin 5 rica en G:C en contraste con

la secuencia rica en A:T de levaduras mutantes sin secuencias transcripcionales ori/rep en

un origen secundario, conducen a la replicacin [7]. El sitio ories aproximadamente de 270

pares de bases y se divide en 3 partes (A, B y C). Un modelo propuso que la subunidad

Figura 1. Similitudes estructurales entre laADN polimerasa y la T7 ADNpolimerasa


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est implicada en ambos iniciadores recombinantes de la polimerasa completa, que tiene

poca expresin y es insoluble. Sin embargo el fragmento Nterm124 es soluble y puede

ser purificado con cromatografa de afinidad, y es activa en la extensin del iniciador.

Calculamos que se pueda obtener aproximadamente 1 mg de protena purificada por litro

de cultivo bacteriano.

3.3 ADN polimerasas

Las ADN polimerasas de la familia A conservan un mismo plegado y mecanismo, donde su

estructura se puede comprender mejor si lo comparamos con nuestra mano derecha, ya

que stas poseen esta forma, como ya se mostr en la figura 1, de esta forma conocemos

diversas ADN polimerasas entre las ms comunes tenemos a la ADN pol I (Klenow) y Taq

ADN polimerasa (TaqADNpol) que se encargan de los fragmentos de Okasaki, a la

ADNpoly la T7 ADN polimerasa (T7ADNpol) quienes se encargan de la replicacin total

de un genoma, as como la ADN polimerasa Q (ADNpolQ) que se encarga de reparar al

ADN.

Cuando nos referimos a polimerasas, la procesividad se refiere al nmero de nucletidos

que son adicionados a la cadena naciente durante un ciclo de unin/disociacin del

iniciador/templado o molde. La procesividad de las ADN polimerasas est ntimamente

ligado a su rol biolgico. Enzimas que copian genomas completos presentan una mayor

procesividad, la reparacin de largos huecos debe proceder con una menor procesividad

mientras que un modo distributivo de catlisis parece el adecuado para los huecos

pequeos [8].

El deslizamiento ocurre durante la sntesis de secuencias microsatlites repetidas y se

caracteriza por la expansin o delecin en el nmero de unidades repetidas. Un

mecanismo propuesto para este deslizamiento envuelve la disociacin de la cadena en

crecimiento y la formacin del lazo (loop) consistiendo de una o ms unidades repetidas en

cualquiera del templado como de la cadena naciente, la cual es estabilizada por puentes

de Hidrgeno con elementos adyacentes repetidos [9,10]. Ha sido previamente establecido

que la procesividad de la T7ADNpol se relaciona con la reduccin en el deslizamiento

durante la repetitiva copia de las secuencias de ADN, esto presumiblemente ya que sus


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resultados son de alta procesividad y baja probabilidad de la disociacin de la enzima

durante la replicacin de las secuencias nucleotdicas repetidas.

Ya que empezamos a hablar acerca de la procesividad de las ADN polimerasas, y

partiendo de que esta procesividad est en funcin de su rol biolgico como ya semencion, nos podramos preguntar el qu es lo que le confiere la procesividad a las

polimerasas as como el por qu varan estas si es que pertenecen a una misma familia de

polimerasas. La respuesta an para cada polimerasa es incierta, sin embargo nosotros

pensamos que lo que le confiere procesividad a la ADNpoles el subdominio que

pertenece al pulgar, permitiendo anclarse firmemente a la cadena de ADN, ya que no se

sabe otro motivo por el cual esta polimerasa sea tan fiel.

3.4 Expresin recombinante de ADN polimerasas mitocondriales

Uno de los problemas con los que se enfrenta un bioqumico es el poder contar con

grandes cantidades de enzima relativamente pura para realizar los ensayos. La primera

ADN polimerasa se obtuvo a partir de cientos de litros de cultivo para obtener microgramos

de polimerasa [16,17]. Esta era la forma clsica en la cual se obtena una protena, es

decir a partir de un cultivo (ya sea de clulas animales, vegetales, de levadura, de E. colio

de un tejido) se lograba fraccionar la protena por medio de cromatografa y precipitacin

en sales como sulfato de amonio.

Todo este tipo de trabajo cambio en 1977 (hace 30 aos) con la produccin recombinante

de la hormona somatostatina en E. coli. [18]. A lo largo de 30 aos la tcnica del ADN

recombinante ha cambiado muy poco, todo parte de la idea de poder contar con la versin

sinttica del gen a expresar y un vector de expresin. La primera polimerasa de cidos

nucleicos de la cual se obtuvo su secuencia completa de nucletidos y aminocidos

adems de su sobreexpresin de forma recombinante fue el fragmento Klenow de la ADN

polimerasa I de E. coli. Hasta la fecha se ha reportado la expresin recombinante de las

ADN polimerasas mitocondriales de Homo sapiens, Drosophila melanogaster y Xenopus

laevis, sin embargo esta expresin se basa en el sistema de baculovirus el cual es

sumamente costoso y difcil de manipular. Tambin se ha expresado a la ADN polimerasa

mitocrondrial de Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe sin embargo el


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sistema ha sido en levadura, siendo tambin un sistema costoso y no tan sencillo de

manipular como el sistema de expresin en E. coli.

3.4.1 Caractersticas de las ADN polimerasas mitocondriales

Las ADN polimerasas mitocondriales, como todas las polimerasas de la familia A,

presentan alta fidelidad. Sin embargo hay dos caractersticas que las hacen nicas, su alta

procesividad y la capacidad de desplazarhebras de ADN.

Respecto a la procesividad se sabe que las ADN polimerasas de S. cerevisiaey S. pombe

no necesitan de la unin de una protena accesoria para aumentar su afinidad al templado.

Lo anterior es en marcado contraste con las ADN polimerasas mitocondriales de H.

sapiens, DrosophilaoXenopus, las cuales necesitan de una protena accesoria para unirseal ADN con alta afinidad. Las ADN polimerasas mitocondriales de S. cerevisiaey S. pombe

tienen alrededor de 120 aminocidos extra en el subdominio del pulgar cuando se le

compara con polimerasas como el fragmento Klenow a la Taq DNA polimerasa. Nosotros

especulamos que debido a la localizacin de estos 120 aminocidos en el subdominio del

pulgar su funcin puede ser la de abrazar al ADN durante la replicacin.

Es til remarcar que lo que hace nica a esta secuencia es que no necesita de protenas

accesorias como es el caso del Thioredoxin Binding loop o lazo de unin a tioredoxinaque estabiliza la unin de la T7ADNpol con el ADN, pero solamente si el factor de

procesividad accesorio es decir la tioredoxina se encuentra presente, as como en el caso

de las ADN polimerasas de mitocondria deH. sapiens,Xenopuso Drosophilaque tambin

cuentan con una protena accesoria para estabilizar su unin al ADN.

Las ADN polimerasas de mitocondria en S. cerevisiae tambin tienen la capacidad de ir

desdoblando al ADN de cadena doble, esta caracterstica es sumamente deseada en el

mbito biotecnolgico, para lograr la meta de secuenciar un genoma completo con unasola enzima.


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3.5 Investigaciones previas en la elaboracin de quimeras

Investigaciones previas realizadas sobre lo que le confiere alta procesividad a la T7ADNpol

es que posee en su estructura un sitio de unin a la tioredoxina o TBD, de sus siglas en

ingls Thioredoxin Binding Domain, La unin de la tioredoxina a la T7ADNpol incrementasu afinidad por el iniciador/templado adems de conferir la habilidad de extender el

iniciador en la cadena sencilla de ADN por miles de nucletidos sin disociarse [10].

La estructura tridimensional del fragmento de E. coliADN polimerasa I (Fragmento Klenow)

es conocido. El sitio activo de la polimerasa y el dominio de unin al ADN se encuentran en

el carboxilo terminal (C-terminal), a la mitad de la molcula y la exonucleasa 3-5 con

actividad de correccin se localiza a la mitad del amino terminal (N-terminal). Comparando

ambas secuencias, la T7ADNpol y la E.coli ADN polimerasa I revela un segmento dealrededor de 76 aminocidos en la T7ADNpol (residuos 258 - 333) que no se encuentran

en la E.coli ADN polimerasa I. En la estructura de la E.coliADN polimerasa I, esta regin

corresponde a un inserto que se encuentre entre las hlices H y H1(Figura 2). Estas dos

hlices se localizan en la regin referida como el pulgar que se piensa es importante para

la interaccin del ADN de doble cadena [11].

A partir del conocimiento anterior, fue construida una quimera de E.coliADN polimerasa I

con el subdominio de la T7ADNpol, lo cual result positivo, ya que aument la procesividad

de esta ltima de forma excepcional [12].

Figura 2. Dominio de sitio de unin de la tioredoxina en el bacterifago T7 y laausencia de ste en la ADN polimerasa I de E.coli


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Otro trabajo que se ha realizado respecto al aumento de procesividad ha sido la insercin

de este mismo dominio de unin a la tioredoxina (TBD) de igual manera perteneciente al

subdominio del pulgar, pero en este caso del bacterifago T3, de la T3 ADN polimerasa

TBD a la TaqADN polimerasa en un sitio anlogo, aumentando su procesividad (Figura 3).

Este sitio de unin convierte la procesividad de la enzima de un valor 2 000 nucletidos, incrementando la afinidad del

iniciador/templado y aumentando el grado de elongacin [13,14].

Figura 3. Superposicin del dominio del pulgar de la Taq ADN polimerasa (azul) con la T7ADN polimerasa (rosa). Las flechas indican el sitio de insercin de la T3 TBD (amarillo). La

secuencia primaria de aminocidos de la Taq ADN polimerasa desde el residuo 470 507 seindica debajo (azul) con la secuencia de la T3 TBD (amarillo) y la regin deletada en rojo.


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4.JUSTIFICACIN

La ADNpol es una enzima altamente procesiva, sin embargo la obtencin de ADN

polimerasas se obtiene solamente a partir de cultivos celulares de levadura o en formarecombinante utilizando baculovirus. Como un punto de partida inicial deseamos construir

un vector de expresin en donde clulas de E. coli sinteticen a la ADNpol de S.

cerevisiae. Hasta la fecha no se ha reportado la expresin en bacteria de esta enzima ya

sea de levadura o de humano. Adems, debido a que en el diseo y construccin de

quimeras existe un proceso bastante establecido en protenas expresadas en bacteria,

deseamos ser los primeros en expresar a la ADNpolpara tener un modelo de estudio que

nos permita su modificacin.

A partir de ese modelo se tiene planeado a futuro la construccin de una quimera de la Taq

ADN polimerasa con los subdominios funcionales de la ADNpol. Partiendo del

conocimiento de que la ADNpol es altamente procesiva y que el factor que le confiere

esta procesividad es el subdominio del pulgar, pensamos que se pudiera construir una

quimera de la Taq polimerasa en la cual su subdominio del pulgar sea cambiado por el

subdominio del pulgar de la ADNpol, brindndonos una enorme ventaja sobre las

quimeras Klenow y Taq ADNpol/TBD, ya que stas necesitan forzosamente a la

tioredoxina para ser funcionales, al contrario de lo estudiado en la ADNpol, ya que se

sabe que sta es altamente procesiva y no utiliza tioredoxina u otro factor accesorio para

tener esa alta procesividad.

Respecto a la obtencin de un dominio mnimo de la ADNpol, as como la medicin de

sus parmetros cinticos podr brindar informacin muy til, ya que la delecin de

alrededor de 124 aminocidos en el extremo N-terminal posiblemente pertenezcan a una

regin aparentemente no conservada y posiblemente innecesaria para su funcin. Adems

se sabe que este dominio es indispensable para la actividad de la polimerizacin y se

especula que al truncarlo se aumentar la expresin de las protenas recombinantes,

siendo importante para futuros experimentos de cristalografa que nos permitirn conocer

la longitud mnima del polipptido que le confiere procesividad a la ADNpol de S.

cerevisiae.


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5.OBJETIVOS

5.1 Objetivo General:

Obtencin de la ADN polimerasa de S. cerevisiaede forma recombinante enE. coli

5.2 Objetivos Especficos:

5.2.1 Diseo in silico de dos construcciones recombinantes de la ADNpol

5.2.2 Amplificacin por PCR del gen completo y de las dos deleciones de la

ADNpol

5.2.3 Subclonacin de la ADNpoly de las dos construcciones recombinantes de

Saccharomyces cerevisiae en el plsmido pET28a(+)

5.2.4 Expresin recombinante de la ADNpol de S. cerevisiaeen E. coli


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6.ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Obtencin del ADN genmico de

S. cerevisiae

Diseo de oligonucletidos

Amplificar gen de la

ADNpol de S. cerevisiaeAmplificar construccin

124

Subclonar en vector de expresin

pET28a(+) (colita de histidinas)

Sitios de restriccin: NheI y SacI

Identificacin de clonespositivos

Identificar un sistema de

expresin

Analizar el sistemaBL21/DE3

Analizar el sistemaBL21/DE3/RossetaII

Comparar,analizar y concluir

Figura 4. Metodologa para la subclonacin y expresin de la ADNpoldeSaccharomyces cerevisiae


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15

7.MATERIALES Y MTODOS

7.1 Obtencin de ADN genmico deS. cerevisiae

EL ADN genmico se obtuvo a partir de 1 L de cultivo de S. cerevisiaecepa S288c (cepa

secuenciada originalmente) [15], usada como punto de referencia para trabajar con

levadura. El cultivo de levadura se realiz en medio lquido y se incub a 30 C. La pared y

membrana celular fue rota utilizando perlas de vidrio. En breve se crecieron en 5 mL de

medio de cultivo para levadura (medio YPD) y a partir de una sola colonia se crecieron a

30 C. Se transfiri el cultivo a un tubo de vidrio de 13 x100 mm. Las clulas se

centrifugaron durante 2 min en una centrifuga de mesa, desechndose posteriormente el

sobrenadante. Las clulas se lavaron con 5 mL de H2O, se centrifugaron durante 2 min

ms y se volvi a desechar el sobrenadante. stas se resuspendieron en 500 L de buffer

de lisis (0.1 M Tris pH 8.0, 50 mM EDTA, 1% SDS), a esta pastilla se le agreg perlas de

vidrio (400 - 500 m) hasta antes del menisco y se mezclaron en vortex por 30 s mientras

se aadan 25 L de una solucin 5 M de NaCl. Se centrifug por 2 min para disminuir la

espuma. El lisado fue removido con una pipeta de 1000 L y se transfiri a un tubo de

microcentrfuga de 1.5 mL. A este lisado se le aadi 400 L de buffer TE con fenol

saturado y se centrifug por 4 min. La fase superior se transfiri a un tubo de

microcentrfuga nuevo (400 L aprox.) y se aadieron 400 L de fenol:cloroformo (4:1), semezcl en vortex, se centrifug y se transfiri la fase superior a un tubo nuevo. Se aadi 1

mL de etanol al 95% y se mezcl. Se centrifug por 6 min y se decant el etanol. Se dej

secar al ambiente y se resuspendi en 50 L de buffer TE. La concentracin de cido

nucleico total fue determinada al medir la absorbancia a 260 nm.

7.2 Diseo in silico de las construcciones a realizar de ADN polimerasa

Con base a una alineamiento entre la secuencia de aminocidos de la ADN polimerasa de S. cerevisiaey la secuencia del fragmento Klenow se determin que las dos deleciones

a realizar eran de 102 y 124 aminocidos respectivamente. En el ANEXO I se observa una

superposicin de las secuencias de aminocidos del Fragmento Klenow y la ADN

polimerasa de S. cerevisiae. En esta superposicin es evidente que el Fragmento Klenow

tiene por los menos 120 aminocidos extras en el domino N-terminal en comparacin con


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el Fragmento Klenow. Nosotros suponemos que estos aminocidos no juegan un papel en

la catlisis adems de que no son importantes para interacciones protena - protena que

ocurren en el replisoma mitocondrial y por lo tanto son un buen punto de partida a eliminar.

7.3 Diseo de los iniciadores para amplificar las tres construcciones de la ADNpolimerasa

Los oligonucletidos tuvieron como base la secuencia del ADN genmico de S.cerevisiae.

Un anlisisin silicoindic la ausencia de intrones en el gen de la ADN polimerasa de S.

cerevisiae, por lo que la amplificacin directa del gen puede llevarse a cabo. Para disear

los oligonucletidos se utiliz una longitud de entre 18 y 26 nucletidos para as llegar a

una Tm superior a los 55 C. En el extremo 5 de los oligos se aadi el sitio Nhe I (5

gtcgac 3) dado que deseamos introducir los segmentos amplificados en el vector

pET28a(+) (el mapa del vector se encuentra en el ANEXO IV) y el sitio Nhe Iesta cercano

al 5 del sitio de clonacin mltiple. Lamentablemente no podemos utilizar el sitio de

restriccin Nde I porque nuestros segmentos a amplificar pueden ser digeridos por esta

enzima, principalmente hablando de nuestra delecin dos (ANEXO III).El oligo C-terminal,

el cual es un oligo consenso se dise para amplificar hasta el aminocido 1254 y se

incluy un codn de paro, adems del sitio de restriccin Sac I (5 aagctt 3). Los cuatro

oligonucletidos a utilizar se disearon con 5 nucletidos extra para asegura el corte con

las enzimas de restriccin (ANEXO II-B)

7.4 Amplificacin por Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) del gen completo

y las dos deleciones de la ADN polimerasa

Para llevar a cabo la PCR se mezclaron los siguientes reactivos en un tubo de 600 L en

el orden y proporciones marcadas en el cuadro 2.


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ReactivoCantidad

(L)

Concentracin final

Agua MiliQ 33 -------

Amortiguador 10X 5 1X

dNTPs 2,5 mM 4 0,2 mM

Iniciador N-terminal (12,5 pmol L-1) 2 0,5 M

Iniciador C-terminal (12,5 pmol L-1) 2 0,5 M

ADN genmico ~45 ngL-1 2 ~90 ng

Polimerasa Pfu 5 2,5 unidades

Los tubos se centrifugaron por 5 s y se colocaron en un termociclador MyCycler Biorad.

Para llevar a cabo la reaccin se utiliz el programa estipulado en el cuadro 3.

Paso Temperatura (C) Tiempo

1 95 3 min

2 55 1 min

3 72 1,5 min

4 94 45 s

Regresar al paso 2 y repetir por 28 veces

5 72 5 min

6 4

Posteriormente se tomaron 5 L de las PCRs y se corrieron en un gel de agarosa al 1%

con marcadores de 1 kb de New England Biolabs (NEB).

Cuadro 2. Reactivos y concentraciones finales para la amplificacin del

gen completo y las dos deleciones de la ADN pol

Cuadro 3. Programa para el termociclador


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7.5 Obtencin de los cassettes

Los productos de PCR presentaron una banda nica, por lo que solamente se limpiaron

con el PCR Cleanup Kit de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para laobtencin de las construcciones se realizaron reacciones de corte de los productos de

PCR de las 2 construcciones. Esta reaccin consisti en colocar en un tubo Eppendorf lo

siguiente:

44 L de la PCR

5 L de Buffer de Reaccin # 2 NEB

0,5 L (5 unidades) de enzima NheI

0,5 L (5 unidades) de enzima SacI

Dejndolo incubar toda la noche a 37 C.

Una vez realizado el corte, se eliminaron las enzimas de restriccin con el PCR Cleanup

Kit de Qiagen y se determin la concentracin de ADN por medio de la lectura a 260 nm en

un espectrofotmetro.

7.6 Obtencin del vector

El plsmido pET28a(+) se transform en la cepa de Escherichia coliDH5y las bacterias

se crecieron en un medio de LB/agar con Kanamicina. De esta transformacin se tom una

colonia de la placa y se creci un cultivo bacteriano de 10 mL en LB/kanamicina. El ADN

plasmdico del plsmido pET28a(+) necesita ser de alta calidad por lo cual se realiz su

extraccin utilizando el DNA Miniprep Kit de la compaa Qiagen de acuerdo a las

instrucciones del proveedor. A partir de 10 mL de cultivo celular obtuvimos

aproximadamente 5 g de ADN. Este ADN plasmdico fue linearizado de acuerdo al

siguiente protocolo:

85 L del miniprep


2,5 L (5 unidades) de enzima NheI

2,5 L (5 unidades) de enzima SacI


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Y se dej incubar toda la noche. Para separar las poblaciones digeridas versus las no

digeridas se procedi a preparar un gel preparativo de agarosa al 1%.

7.7 Subclonacin de la ADNpol de Saccharomyces cerevisiae en el plsmido

pET28a(+)

Para lograr una subclonacin eficiente es importante la proporcin de inserto/vector. En el

presente trabajo se realizaron diversas relaciones molares y llevadas a volmenes finales

de 20 L, incubndose a 16 C por 12 h, de acuerdo al cuadro 4.

Relacin Molar 1:3 1:6 1:12

Vector 12 ng 12 ng 12 ng

Inserto 12 ng 24 ng 48 ng

Buffer 2 L 2 L 2 L

Ligasa NEB 10 unidades 10 unidades 10 unidades

Temperatura de la reaccin - 16 C -

Se realiz una transformacin con vector sin ligasa como testigo negativo y uno de vector

superenrrollado como testigo positivo.

7.8 Obtencin de clones positivos conteniendo el gen de la ADNpol de

Saccharomyces cerevisiaeen vectores de expresin de procariontes

El proceso del aislamiento y purificacin de plsmidos o Miniprep consisti en transferir 1,5

mL del medio de cultivo bacteriano a un tubo Eppendorf estril y centrifugar a 12 000 rpm.

Se procedi a desechar el sobrenadante y se repiti la operacin hasta completar 3 mL de

medio de cultivo. La pastilla bacteriana se resuspendi en 100 L de solucin de lisado (50

mM de glucosa, 25 mM de Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA). Se incub por 5 min a

temperatura ambiente y se aadi 200 L de un solucin alcalina recientemente preparada

(0.2 N NaOH, 1% dodecil sulfato de sodio). El contenido del tubo se mezcl por inversin

de 5 a 6 veces hasta que la solucin se torn transparente y viscosa. Despus de 5 min se

Cuadro 4. Proporcin inserto: vector en la subclonacin de la

ADNpolen el plsmido pet28a(+)


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agregaron 150 L de una solucin 7.5 M de acetato de amonio a pH 7.8 y se mezcl el

tubo por inversin. Se procedi a centrifugar el tubo por 10 min a 14 000 rpm a

temperatura ambiente. El sobrenadante que contena el plsmido de inters se transfiri a

un microtubo limpio y se aadi 0,6 volmenes (250 L aproximadamente) de isopropanol.

Esta solucin se incub a temperatura ambiente por 10 min y posteriormente se centrifug

a 14 000 rpm por 10 min. Al decantar el sobrenadante se obtuvo una pastilla que contena

el plsmido y el ARN, sta se lav con etanol al 70% y se dej secar al aire. Esta pastilla

se disolvi en 100 L de agua miliQ estril y se agreg 1 L de RNAsa A en una

concentracin de 10 mg mL-1 y se incub por media hora a 37 C. La RNAsa A fue

eliminada por medio de una extraccin fenol/cloroformo y se procedi a precipitar el

plsmido con etanol. La pastilla obtenida fue resuspendida en 50 L de agua miliQ estril.

7.9 Corte con enzimas de restriccin

Para liberar los insertos de las construcciones de la DNA polimerasa gamma. Se utiliz el

ADN plasmdico y se realiz un corte con las enzimas de restriccin NheI y SacI, el cual

consisti en colocar en un tubo Eppendorf de 600 l los siguientes reactivos:

7 L de H2O MiliQ

10 L del miniprep


0,5 L (5 unidades) de enzima Nhe I

0,5 L (5 unidades) de enzimaSac I

7.10 Electroforesis de ADN en gel de agarosa

Para efectuar una electroforesis de ADN se mont la cmara de electroforesis con un

peine de 8 pozos, dejando un espacio de aproximadamente 0,2 cm entre el final del peine

y la cmara. Se agregaron aproximadamente 35 mL de agarosa al 1% en buffer TAE a la

cmara. Al alcanzar una completa gelificacin se removi cuidadosamente el peine as

como los sujetadores y se mont el gel en el tanque de electroforesis con suficiente buffer

para cubrir el gel. Se mezclaron las muestras de ADN con el buffer de carga y se carg la

mezcla en el gel sumergido utilizando una micropipeta. Se coloc la tapa del gel de


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21

electroforesis y se someti a un flujo elctrico de 90 V. Se corri el gel en relacin al

corrimiento del azul de bromofenol.

7.11 Expresin recombinante de la ADNpolde Saccharomyces cerevisiaeenE. coli

En este mtodo pondremos a crecer en matraces de 1L en caldo LB las cepas de E. coli

BL21DE3 y BL21DE3 Rosseta II a 37 C, cuando la densidad ptica alcanza 600 se aade

IPTG a una concentracin final de 0,5 mM y se deja incubar en hielo durante toda la

noche, proceso conocido como induccin.

Previamente a la induccin se toma una alcuota del cultivo bacteriano sin IPTG (cultivo sin

inducir). Una vez finalizada la induccin (aproximadamente 15 h) se centrfuga el cultivo

bacteriano en una centrifuga Sorvall utilizando un rotor JA-10. Se decanta el sobrenadantey se guarda la pastilla bacteriana a -20 C. La pastilla se resuspende en 25 mL de un buffer

de lisis conteniendo 25 mM Tris pH 8.0. 175 mM NaCl y 0.1 mM PMSF. Esta resuspensin

se somete a un proceso de sonicacin por 45 s y una pausa de 1 min. Este proceso se

repite 6 veces. Las clulas sonicadas se centrifugan por 30 min a 17 000 rpm en un rotor

Sorval JA-20. El sobrenadante se pasa a travs de un filtro de 0,2 m.

Previamente se estabiliza una columna de Hi-Trap con Nquel utilizando el mismo buffer de

lisis. Se hace pasar el sobrenadante a travs de la columna Hi-Trap y se lava con 15 mLde buffer de lisis. El primer lavado se realiza con 15 mL de buffer de lisis pero con 20 mM

de Imidazol pH 8 y el segundo con buffer de lisis con 50 mM de imidazol pH 8. Finalmente

se eluye con 2 mL de buffer de lisis y 500mM de imidazol. La elusin se dializa en un litro

de 25 mM Tris pH 8.0, 175mM NaCl y 50% glicerol y se almacena a -20 C.


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8.RESULTADOS Y DISCUSIN

8.1 Diseo de construcciones

El gen de la ADNpolde S. cerevisiaecodifica para una protena de 1254 aminocidos. La

ANDpoltiene alta homologa con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli,

tanto en el dominio con actividad exonucleasa como en el dominio con actividad de

polimerasa. En comparacin con el fragmento Klenow de aproximadamente 600

aminocidos, la ADNpol tiene el doble de tamao, como responsables de lo anterior se

encuentran dos extensiones en la parte amino y carboxilo terminal de cerca de 150

aminocidos respectivamente, as como una ms en el subdominio del pulgar que es

anlogo al dominio de unin a tioredoxina de la T7ADNpol. Previos estudios en otras ADNpolimerasas han indicado que la presencia de extensiones en las regiones amino o

carboxilo terminal son importantes para interacciones protena-protena e indispensables

para la funcin de polimerizacin.

Con base a este racional se disearon 2 deleciones en el N-terminal, la 102 y la 124. Ladelecin 124 es similar al sitio proteoltico del Fragmento Klenow y al sitio de inicio del

dominio N-terminal de la T7ADNpol.

Figura 5. Diseo de construcciones a partir de la secuencia

de aminocidos de la ADNpoly el fragmento Klenow


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8.2 Diseo de los oligonucletidos

Los oligonucletidos se disearon para amplificar el gen completo y las dos deleciones de

102 y 124 aminocidos respectivamente. stos se disearon en base a la secuencia de

nucletidos de la ADNpol(ANEXO II)

Dado que deseamos amplificar una zona especifica de ADN, los oligonucletidos son fijos,

es decir tienen un principio determinado. Lo nico con lo que podemos experimentar es

con la longitud de los mismos. El oligonucletido N-terminal completo y la delecin I tienen

una longitud de 20 nucletidos que se aparean a la secuencia de la ADNpol. El

oligonucletido N-terminal correspondiente a la delecin II tiene una longitud de 23

nucletidos. Fue necesario darle una extensin extra de 3 nucletidos debido a que la

secuencia de nucleotdica donde se ubica sta es muy poco heterognea. Los

oligonucletidos N-terminal fueron diseados para incorporar el sitio de restriccin NheIy

el C-terminal para incorporar el sitio de restriccin SacI (sitios subrayados) y una secuencia

extra de 5 nucletidos para hacer mas eficiente el corte con las enzimas de restriccin.

Figura 6. Diseo de oligonucletidos para amplificar el gen

de la ADNpoly sus deleciones en el N-terminal


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8.3 Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de delecin de la ADNpolde

S. cerevisiaepor medio de la PCR

Para llevar a cabo nuestros experimentos se decidi amplificar el gen completo as como a

dos deleciones N-terminal de la ADNpolpor medio de una PCR.

Entre las mltiples ADN polimerasas para llevar a cabo la amplificacin del gen se decidi

utilizar la enzima Pfu (Stratagene) ya que es superior a enzimas como la TaqADNpol,

primero porque tiene mayor fidelidad y segundo porque no tiene propiedad 3 terminal (es

decir no agrega poli-Adeninas de forma no especifica al final del templado). El producto de

la PCR se puede observar por medio de un gel de agarosa teido con bromuro de etidio.

En la lnea uno se observa una banda de 3762 nucletidos que corresponde al gen

completo de la ADNpol de S. cerevisiae, en la lnea 2 se observa una banda que

corresponde a un peso aproximado de 3456 nucletidos que corresponde a la Delecin I

( 102 aminocidos) y en la lnea 3 se observa una banda que corresponde a 3390

nucletidos que corresponde a la Delecin II (124 aminocidos). Los pesos relativos se

pueden deducir al comparar la migracin electrofortica en relacin a un marcador de peso

molecular de 1 kb (New England Biolabs).

Figura 7. Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de

delecin de la ADNpol de S. cerevisiae. Lnea 1) gen completo de3762 nucletidos, 2) Delecin 102 de 3 456 nucletidos, 3) Delecin

124 de 3390 nucletidos. El marcador de peso molecular de 1 kb(New England Biolabs) muestra que los productos de amplificacincorresponden al tamao esperado


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8.4 Reaccin de ligacin del gen completo y las dos mutantes de delecin de la

ADNpolde S. cerevisiaeen el vector pET28a(+)

Para llevar a cabo la ligacin de genes recombinantes en vectores de expresin es

necesario el obtener ADN plasmdico de forma pura (Figura 8, lnea 2), una vez obtenido el

plsmido de forma pura se procede a cortar con las dos enzimas NheI y SacI en las cuales

se desea subclonar, previamente se corri el ADN cortado en un gel de agarosa.

El peso molecular de un plsmido superenrrollado es relativamente menor a su peso real(el cual corresponde al plsmido linear), esto se puede observar al comparar la migracin

electrofortica de las lneas 2 y 1. Los insertos a ser subclonados se cortan con las

enzimas de restriccin NheI y SacI y se eliminan las enzimas por medio de una

precipitacin en etanol. Una vez obtenidos tanto el inserto como el vector de forma pura

se procedi a mezclarlos en diversas concentraciones molares. Es importante el

mencionar que tpicamente se necesita un concentracin de aproximadamente 10 veces

mas inserto que vector para lograr una ligacin eficiente. La reaccin de ligacin se llev a

cabo a 16 C debido a que se aumenta la formacin y estabilidad de enlaces de puente deHidrgeno dbiles entre los extremos cohesivos del inserto y del vector, esto puede ser no

muy intuitivo porque la ADN ligasa tiene una actividad optima a 37 C, pero de qu

servira que fuera ptima si no tiene sustrato?

Figura 8. Reaccin de ligacin de dos mutantes de delecin y el gen

completo de la ADNpol. Lnea 1) plsmido pET28a cortado conNheI y SacI, 2) plsmido pET28a superenrrollado, 3) marcador de

peso molcular de 1 kb NEB, 4) producto digerido de la delecin II,5) producto digerido de la delecin I, 6) producto digerido del gen

completo de la ADNpolde S. cerevisiae


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8.5 Identificacin de clones positivos

Una vez llevada a cabo la reaccin de ligacin se procedi a llevar a cabo una

transformacin, es decir pasar este ADN a una bacteria. En nuestro caso se decidi utilizar

a la bacteria DH5 que ha sido transformada por medio de un protocolo con CaCl2. Elplsmido pET28 confiere resistencia a la kanamicina, por lo cual solamente las bacterias

que hayan atrapado el plsmido lograran sobrevivir en un medio ambiente con el

antibitico Kanamicina. Como es de esperarse obtuvimos un mayor nmero de colonias en

la ligacin que tuvo una proporcin de 1:12 de inserto versusvector.

En las tres construcciones que obtuvimos procedimos a seleccionar colonias individuales ycrecerlas en 5 mL de medio LB suplementado con kanamicina. A partir de estos cultivos se

extrajo el ADN plasmdico y se digiri con las dos enzimas NheI y SacI, de esta doble

digestin se esperaba obtener fragmentos de entre aproximadamente 3 300 a 3 700 pares

de bases (lo anterior dependiendo de la clonacin de la enzima completa o las deleciones I

o II). Como se muestra en la figura 9, fuimos totalmente exitosos en lograr las

construcciones que buscamos. En esta figura presentamos un gel de agarosa

representativa de las 6 colonias que se ensayaron cuando buscamos clones positivos para

la Delecin II.

Figura 9. Doble digestin con NheI y SacIde la mutante de delecin

II de la ADNpolde S. cerevisiae. Lneas 1 a la 6 representan 6colonias (en este caso todas positivas), se observan dos bandas, unainferior y otra superior que corresponde al plsmido pET28a de 5 369nucletidos digerido. La banda ms intensa del marcador de pesomolecular corresponde a 3 kb y la inmediata superior a 4 kb


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8.6 Expresin recombinante de la ADN polimerasa en E. coli

Nosotros nos enfocamos a estudiar la expresin recombnate de la ADNpolcompleta y la

delecin 124 (Nterm124) utilizando dos cepas de E. coli, la cepa BL21/DE3 y la cepa

BL21/DE3 Rosseta II. Ambas cepas expresan genes que estn bajo el control del promotor

de la T7 RNA polimerasa. La cepa BL21/DE3 Rosseta II contiene un juego extra de

codones que por lo general mejora la expresin de protenas de eucariontes en E. coli. En

experimentos preliminares observamos una mejor induccin en la cepa BL21/DE3 Rosseta

II en comparacin a la BL21/DE3.

Se llev a cabo la expresin de la protena truncada (Nterm124) en la cepa E. coli

BL21/DE3 Rosseta II en un plsmido pET28a. En la figura 10 se muestra el gel SDS-PAGE

al 10%, donde la M indica el marcador de peso molecular, en el carril 1 y 2 se muestra la

protena completa sin inducir e inducida respectivamente y de igual forma en el 3 y 4

mostramos la protena truncada sin inducir e inducida.

Figura 10. Gel SDS-PAGE que muestra la expresin recombinante de la

ADNpolde Saccharomyces cerevisiae. Lneas 1 y 2 muestran la construccincompleta, lneas 3 y 4 construccin Nterm124. Lneas 2 y 4 despus de lainduccin. La expresin de la protena se muestra con dos asteriscos


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9.PERSPECTIVAS DEL TRABAJO

Una de las metas de este trabajo es construir una quimera de la Taq DNA polimerasautilizando las propiedades de la ADN pol

Construccin de la quimeraTaqADN pol /

Figura 11. Metodologa para la construccin de la quimera

Taq ADN pol /

Reaccin de PCR con los amplificados

Quimera TaqADN pol/

Amplificacin delsubdominio del pulgar

Amplificacin de los subdominiosflanqueantes de la TaqADN polcon colitas complementarias a la

pol

Gen de la ADNpol

Diseo del iniciador endireccin 5 - 3 y 3 - 5

del subdominio delpulgar

Gen de la TaqADN polimerasa

Diseo de iniciadores para losdominios flanqueantes con una colita

complementaria de el subdominio de la

ADN pol


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Figura 12. Esquematizacin ms detallada para la

construccin de la quimera Taq ADN pol /


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Como perspectivas del trabajo se tiene que la ADN polimerasa es una enzima altamente

procesiva (se enlaza muy fuertemente al cido nucleico sin necesidad de un factor de

procesividad Tabla 1). Es del inters del laboratorio de bioqumica estructural el

entender como la ADN polimerasa es altamente procesiva y evaluar si se puede conferir

esta caracterstica a la ADN polimerasa deThermus aquaticuso Taq polimerasa ya que es

una de las enzimas ms utilizadas en la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa

(PCR), interesndonos mucho ya que es una herramienta bsica en la investigacin

biotecnolgica debido a que es utilizada para amplificar de manera selectiva una regin de

ADN en la que tengamos especial inters.

Pese a que es una tcnica que revolucion en el mbito cientfico, como toda tcnica tiene

sus lmites, y uno de ellos es el tamao del fragmento que deseamos amplificar, por lo que

desearamos poder darle una posible solucin aplicando precisamente esta misma tcnicay apoyndonos de estudios previos parecidos respecto a la procesividad de la ADN

polimerasa y mezclarlos con los de la Taqpolimerasa para intentar construir una quimera

que satisfaga las necesidades de los pasos agigantados de la biologa molecular y por

ende los de la investigacin biotecnolgica.


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10.CONCLUSIONES

El diseo in silico de los iniciadores fue clave, ya que tuvimos la fortuna que hubiera

ausencia de intrones en el gen de la ADNpolde S. cerevisiaepor lo que la amplificacinpudo ser directa.

La expresin se llev a cabo en las cepas BL21DE3 y BL21DE3 Rosseta II, sin embargo

se decidi que fuera en esta ltima posterior a la realizacin de un anlisis, del cual se

concluy que esta cepa al poseer un juego extra de codones mejorara la expresin de

nuestra enzima en un procarionte.

Nos enorgullece el logro de haber expresado por primera vez en forma recombinante en E.

coli una ADN polimerasa mitocondrial, ya que slo se tienen reportadas expresiones de

polimerasas en baculovirus y levaduras, siendo ms difcil y costoso su manejo, adems

no son de origen mitocondrial.

Este trabajo representa la primera vez en la cual una ADN polimerasa mitocondrial se ha

expresado de forma recombinante en E. coli. Los logros obtenidos en esta tesis son un

avance en nuestro entender de cmo funcionan las polimerasas de cidos nucleicos

mitocondriales y esperamos que en un futuro cercano podamos utilizar este aprendizaje enel manipular las caractersticas de alta procesividad y desplazamiento de DNA de doble

cadena en la construccin de quimeras como herramientas biotecnolgicas.


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32

11.REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Seki, M; Masutani C; Yang, L. W; Schuffert A; Iwai S. and Bahar, I. and Wood, R. D.High-efficiency bypass of DNA damage by human DNA polymerase Q. Embo J, 2004.

23(22): p. 4484-4494.

2. Kravchenko, J. E; Rogozin, I. B; Koonin, E. V. and Chumakov, P. M. Transcription ofmammalian messenger RNAs by a nuclear RNA polymerase of mitochondrial origin.Nature, 2005. 436(7051): p. 735-739.

3. Foury, F. Cloning and sequencing of the nuclear gene MIPi encoding the catalyticsubunit of the yeast mitochondrial DNA polymerase. J Biol Chem, 1989. 264(34): p. 20552-20560.

4. Ropp, P. A. and Copeland, W. C. Cloning and characterization of the humanmitochondrial DNA polymerase, DNA polymerase gamma.Genomics, 1996. 36(3): p. 449-

458.

5. Klingbeil, M. M; Motyka, S. A. and Englund, P. T. Multiple mitochondrial DNApolymerases in Trypanosoma brucei. Mol Cell, 2002. 10(1): p. 175-186.

6. Xu, B. and Clayton, D. A.A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription ata phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Mol Cell Biol, 1995. 15(1): p.580-589.

7. Van Dyck, E. and Clayton, D. A. Transcription - dependent DNA transactions in themitochondrial genome of a yeast hypersupressive petite mutant. Mol Cell Biol, 1998. 18(5):p. 2976-2985.

8. John, F. D; Richard, F; Dawn, D. H; Sally, L. A. and Lawrence, A. L. Insertion of the T3DNA polymerase thioredoxin binding domain enhances the processivity and fidelity of TaqDNA polymerase. Nucleic Acid Research, 2003. 31(16): p. 4702.

9. Sia, E. A; Jinks, R. S. and Petes, T. D. Genetic control of microsatellite stability. Mutat.Res, 1997. 383: p. 61-70.

10. Kunkel, T.A. and Alexander, P.S, The base substitution fidelity of eucaryotic DNApolymerases. Mispairing frequencies, site preferences, insertion preferences and basesubstitution by dislocation. J. Biol. Chem., 1986. 261: p. 160-166.

11.

Beese, L. S; Derbyshire, V. and Steitz, T. A.Structure of DNA polymerase I Klenowfragment bound to duplex DNA.Science, 1993 Apr 16; 260(5106):p. 352355.

12. Ella, B; Stanley, T. and Charles, C. R.

The thioredoxin binding domain of bacteriophageT7 DNA polymerase confers processivity on Escherichia coli DNA polymerase I. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 1997. 94: p. 479-480.

13. Joyce, C. M. and Steitz, T. A. Function and structure relationships in DNA polymerases.Annu. Rev. Biochem., 1994. 63: p. 777-822.


41/48

33

14. Minnick, D. T; Astatke, M.; Joyce, C. M. and Kunkel, T. A.A thumb subdomain mutantof the large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I with reduced DNA bindingaffinity, processivity and frameshift fidelity. J. Biol. Chem., 1996. 271: p. 24954-24961.

15. Schacherer, J; Ruderfer, D. M; Gresham, D; Dolinski, K; Botstein, D. and Kruglyak, L.

Genome-Wide Analysis of Nucleotide-Level Variation in Commonly Used Saccharomycescerevisiae Strains., 2006. PLOS One.

16. Kornberg, A; Lehman, I. R; Bessman, M. J. and Simms, E. S. Enzymic synthesis ofdeoxyribonucleic acid.Biochim. Biophys., 1957. Acta 21: p. 197198.

17. Lehman, I. R; Zimmerman, S. B; Adler, J; Bessman, M. J; Simms, E. S. and Kornberg,A. Discovery of DNA Polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44: p. 11911196.

18. Itakura, K; Hirose, T; Crea, R; Riggs, A. D; Heyneker, H. L; Bolivar, F. and Boyer, H. W.Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormonesomatostatin. Science, 1977. Dec 9, 198(4321):p. 1056-1063.

19. Joyce, C. M; Kelley, W. S and Grindley, N. D. Nucleotide sequence of the Escherichiacoli polA gene and primary structure of DNA polymeraseI. J. Biol. Chem., 1982 Vol. 257,Issue 4, p: 1958-1964.


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ANEXO I.SUPERPOSICIN DE LAS SECUENCIAS DE AMINOCIDOS DEL FRAGMENTOKLENOW Y LA ADNPOLIMERASA DE S.CEREVISIAE


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ANEXO II.DISEO DE OLIGONUCLETIDOS DE LAS CONSTRUCCIONES N-TERMINALDE LA ADNPOLIMERASA DE S.CEREVISIAE.

A)DISEO BASADO EN LA SECUENCIA DE NUCLETIDOS

Completaatgacgaaattgatggttagatct gaatgcat gct gcgaat ggt gcggcggcggccgct gM T K L M V R S E C M L R M V R R R P L

cgtgt gcagt t t t gtgct cgat ggt t ct ccacaaagaagaataccgcagaagcacccaggR V Q F C A R W F S T K K N T A E A P R

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gt t t t cctgaaaaagt gt cctcatccagt t t cgt t t gcaggt t t aaagt cctt aagcaaaV F L K K C P H P V S F A G L K S L S K

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t ggatgt cagcaagggaaagaat ccaatcccaat t t gt agt ccccagt t gt aaatt ccct

Delecin I

Delecin II


44/48

W M S A R E R I Q S Q F V V P S C K F Paat gagt t ccagt ct t t gt ccgcaaaatcgt cgt t aaat aatgagaagacaaatgat ct tN E F Q S L S A K S S L N N E K T N D L

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aaaaaaat t gcgaat aagt t atat gaaaat acgaaaggtaaaacgaaaagat caaaat t aK K I A N K L Y E N T K G K T K R S K L

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aagaaaaatct gagggcgaat t cct t t ct acct t caagaatcaat t gggccatccagt caK K N L R A N S F L P S R I N W A I Q S

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N L E A R L C I S I H D E I R F L V S Eaaggacaaat acagagctgct atggct t t gcaaat cagcaacat atggacgagagcaatgK D K Y R A A M A L Q I S N I W T R A M

t t t t gccagcaaatggggataaatgaatt accgcaaaact gt gcct t t t t ct cgcaagt aF C Q Q M G I N E L P Q N C A F F S Q V

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accgccat t cct catggggaggcgctt gat atcaat caact gctagacaaat ccaat agtT A I P H G E A L D I N Q L L D K S N Saaat t gggt aaaccaaat ct cgatatcgacagcaaagt atcacaatatgcct ataact acK L G K P N L D I D S K V S Q Y A Y N Y

agagaacctgt at t t gaagaat at aat aaat ct t at act ccagagt t ct t aaaat at t t tR E P V F E E Y N K S Y T P E F L K Y F

ct t gcgatgcaagt ccagt cagataagcgcgatgtgaat cggctagaagat gagtat ct gL A M Q V Q S D K R D V N R L E D E Y L

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agaaaaaagaataccacgcct at ggaaaggaagt acaaaagagtgtat ggt ggcaggaagR K K N T T P M E R K Y K R V Y G G R K

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aaacaatt ct t t aat att cct at agat ggagt gatt gacgacgt t ct gaacgacaaat ctK Q F F N I P I D G V I D D V L N D K S

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t aaagat ct ct cat gat ct t ggt t gagct ggaaagggacat t act att t ct agagagt act agL V E L E R D I T I S R E Y -

Oligo C-terminal


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B)LISTA DE OLIGOS

N- t er mi nal

Compl et a5 ggaaggctagcatgacgaaattgatggttag 3

Del eci n I5 ggaaggctagc ctacaaggcaggtcgctaga 3

Del eci n I I5 ggaaggctagccgaccggcggaatggctgcggaag 3

C- t er mi nalConst ant e5 ggaag aagctt ctagtactctctagaaat 3


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ANEXO III.SITIO DE CORTE DE LA ENZIMA DE RESTRICCINNheI(catatg)ENNUESTRA CONSTRUCCIN (DELECIN II- 124)

Completa

atgacgaaattgatggttagat ct gaatgcat gctgcgaatggtgcggcggcggccgct gcgtgtgcagtt t t gtgct cgat ggt t ct ccacaaagaagaataccgcagaagcacccaggatt aat cctgt ggggatacagt att t aggt gagt ct t t gcaaagacaggt att t ggt agtt gcggtggt aaagat gaggt ggagcaaagcgacaaact t at ggagt t at cgaaaaagt cgct aaaggaccat gggtt gtgggggaagaagacgct cat cacggat ccaatat cgtt t cct

ct gccgccactacaaggcaggtcgctaga t gagcat t t ccagaagatt gggcgt t t caat

t ct gaaccgt acaagagtt t t t gcgaggacaagt t cacggagat ggt ggcacgaccggcggaatggctgcggaagccaggctgggtt aaat acgt acct ggaatggcacccgtcgaagt ggcatacccagacgaagagct ggt ggt gt t t gatgt agaaacact ct ataacgt ct ct gact atccgact t t ggccacggcctt gt cat cgacggcgt ggt acct t t ggt gt t cgccgt t catatgt ggt ggt gat gat cct gct gcactgatacccct aaacacatt gaataaagagcaagt aat aat t ggt cacaatgt t gcgt atgatagggcacgggtt ct cgaagaat acaactt cagggact cgaaggcgt t t t t cctcgacact caatct ct gcat att gcat ct t t cgggct gt gt t caagacaacgtccgat gt t cat gaagaat aacaagaaaaaagaggcagaagtggaat cggaagtacatccagaaat t t ccatagaagat t atgacgaccct t ggtt aaatgt gt ctgct t t aaactcgct aaaggatgt agcgaaatt t cactgcaagatagatct t gataagactgatagagatt t ct t t gct t ccacagataaatcaacgataat agaaaat t t ccaaaaactggt caact actgcgccact gacgt aacggccacaagccaagtgt t t gat gagatt t t ccctgt t t t cctgaaaaagt gt cctcat ccagt t t cgt t t gcaggt t t aaagt cctt aagcaaat gcat t ct gccgacgaagct aaacgactggaat gat t actt gaacagct ct gagt ct t t gt accaacagt ccaaagt ccagatagaatccaaaat t gtt caaatcataaaagatatcgt cct gt t gaaggacaaaccagatt t t t atct caaggatccct ggt t atcacaatt ggatt ggaccaccaaacct t t aagat t gacaaagaaaggtgtt cct gcaaagt gtcaaaagct gcccggct t t ccagaat ggt atagacaact t t t t ccct caaaggacactgt agaacct aagatcact att aaatcaagaat aat t ccgatt t t gt t caagt t atcgtgggagaat t cccccgt aat atggt cgaaggagtct ggat ggt gctt caacgt gccccat gaacaagtagaaacatacaaggctaaaaatt atgtt t t ggcagat agcgtatct caagaggaagaggaaataagaacgcataacctaggat t gcaat gcacaggtgt t ct t t t caaagt acctcat cccaatgggccgactt t t aat t gcactaat ctt t t aaccaaat cgt ataaccat t t t t t t gaaaagggcgt act aaaat ct gagt cagaat t ggct cat caggct t t acaaatt aact ct t cagggt ct t att ggatgt cagcaagggaaagaat ccaat cccaat t t gtagtccccagt t gt aaat t ccctaat gagt t ccagt ct t t gtccgcaaaatcgt cgt t aaataat gagaagacaaatgatct tgccat aatt at accgaaaatcgtccccat gggcacaatcact agaagagct gtggaaaatgcgt ggt t aaccgcat ccaatgcaaaagcaaataggat aggtt ccgaat t gaaaact caagt caaagct cct ccaggt t at t gt t t t gt t ggggcggacgt ggat agt gaggaat t gt ggatagcat ct t t agt cggt gact ccat t t t caatgt t cat ggt ggt accgccat t ggt t ggat gtgt t t agaaggcact aaaaacgaaggtacagat t t gcacacgaagact gctcaaat tt t ggggt gt t ct cgt aat gaggcgaaaat t t t t aat t atggt agaat t t acggcgct ggtgct aaat t t gcgagt cagt t actt aaaaggt t t aacccat ct ct aact gatgaagagacaaaaaaaat t gcgaataagtt at at gaaaat acgaaaggt aaaacgaaaagat caaaat t at t caaaaaatt t t ggt atggt ggatct gagt caatt ct att caataaatt agaaagcat cgcggaacaagaaact ccaaagacaccggt actgggat gt ggt at t acctat t cactt atgaagaaaaatct gagggcgaat t cct t t ct acctt caagaat caat t gggccatccagt cat ctggagt ggat t at ctacat ctt ctt t gt t gctccat ggaat at att at t aagaaat ataacct t gaggcaaggct t t gcatt t ccatccat gatgagat t agat t t t t ggt gagcgaaaaggacaaat acagagct gctatggct t t gcaaat cagcaacatatggacgagagcaat gt t t t gccagcaaatggggat aaatgaat t accgcaaaact gt gcct t t t t ct cgcaagt agatat t gat t ct gtcat acgt aaagaagt caat atggact gcataaccccctcgaacaaaaccgccatt cct catggggaggcgct t gatatcaat caact gct agacaaat ccaat agtaaatt gggt aaaccaaat ct cgatatcgacagcaaagt atcacaatatgcct ataact acagagaacctgt att t gaagaat ataataaatct t atact ccagagt t ct t aaaat att t tct t gcgat gcaagt ccagt cagat aagcgcgat gtgaatcggct agaagat gagtat ct gcgggagtgtacat ccaaagaat acgct agagat gggaacactgcagagt acagcct cct agact at at aaaggatgtcgagaagggcaaaaggact aaagtacgt at t atgggat ccaatt t t t t agatggt accaaaaat gccaaagct gatcaacgaat cagat t acctgt caat atgccagat t atcccacactt cataaaat t gct aacgat t cagcaat cccagaaaagcaat t gct ggagaacaggagaaagaaggaaaacaggat agatgacgaaaat aagaaaaaat t aaccagaaaaaagaataccacgcct at ggaaaggaagtacaaaagagtgtat ggt ggcaggaaggcatt t gaagcgt t ct atgaat gt gcaaataaaccgt t agactat act t t ggagacagaaaaacaat t ct t t aat att cctat agatggagt gatt gacgacgt t ct gaacgacaaatctaatt at aaaaagaaaccat cacaagcaagaacggcat cat cat cgccaataagaaagactgcgaaagcagtacatt ccaaaaaat t gccggcaaggaagt caagcact acaaat agaaat

t aaagatct ct cat gatct t ggt t gagct ggaaagggacat t actat t t ct agagagt actag

Delecin I

Delecin II

Oligo C-terminal


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ANEXO IV.MAPA DEL VECTOR pET28a(+)


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ADN Polimerasa Gamma

Documents

Transcript of ADN Polimerasa Gamma