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Bol. San. Veg. Plagas, 35: 453-467, 2009

Agentes fúngicos presentes en plantaciones de nísperos (Eriobotryajaponica Lindl.) con síntomas de decaimiento en la provincia deAlicante

E. GONZÁLEZ-DOMÍNGUEZ, A. PÉREZ-SIERRA, L. A. ÁLVAREZ, M. LEÓN, P. ABAD-CAMPOS, J.ARMENGOL, J. GARCÍA-JIMÉNEZ

España es el primer país productor de níspero japonés (Eryobotrya japonica Lindl.)del área mediterránea y el segundo país productor a nivel mundial después de China. Enlos últimos años se viene detectando un problema creciente caracterizado por el decai-miento y muerte de árboles. El problema afecta tanto a nuevas plantaciones como a lasya establecidas. Los objetivos del presente trabajo fueron tipificar la sintomatología dela afección y determinar los agentes fúngicos presentes en plantaciones de nísperos. Paraello se prospectaron un total de 31 parcelas situadas en el término municipal de Callosad’En Sarrià (Alicante). Mediante estas observaciones se caracterizó el síndrome, consis-tente en: clorosis y marchitez de hojas junto con la defoliación del árbol y seca de ramas,con formación de chancros en la base del tronco y pudrición de raíces con posible pre-sencia de micelio en ambos casos. Ocasionalmente, se produjeron exudaciones gomosasen el tronco. La muerte de árboles ocurrió de forma lenta en árboles de mayor edad orápidamente en plantones jóvenes. Se llevó a cabo la identificación tanto morfológicacomo molecular de los agentes fúngicos presentes. En las parcelas afectadas se detecta-ron: Armillaria mellea, Rosellinia necatrix, Phytophthora nicotianae, P. citrophthora, P.cambivora, P. cactorum y P. cryptogea. La especie predominante fue A. mellea (40,6%de las parcelas muestreadas) seguida de R. necatrix (34,4%) y Phytophthora spp.(18,7%). En más de la mitad de las parcelas (59,4%) se aisló un único patógeno.

E. GONZÁLEZ-DOMÍNGUEZ, A. PÉREZ-SIERRA, L. A. ÁLVAREZ, M. LEÓN, P. ABAD-CAMPOS,J. ARMENGOL, J. GARCÍA-JIMÉNEZ. Instituto Agroforestal Mediterráneo, UniversidadPolitécnica de Valencia, Camino de Vera s/n, 46022 Valencia. [email protected]

Palabras claves: Armillaria, Phytophthora, Rosellinia, hongos del suelo.

INTRODUCCIÓN

España es el primer país productor de nís-pero japonés (Eriobotrya japonica Lindl.)del área mediterránea y el segundo país pro-ductor a nivel mundial después de China(CALABRESE, 2006). La provincia de Alican-te concentra el 45% de la superficie total yun 60% de la producción (MAPA, 2007).Esta producción se centra en la comarca deLa Marina Baixa en los valles de los ríosAlgar y Guadalest, con pueblos como Callo-

sa d’En Sarrià, Polop o Altea que han desa-rrollado el cultivo en los últimos 30 años,consiguiendo altas producciones debido a sualto grado de tecnificación (CALABRESE,2006). El cultivar “Algerie” y sus mutacio-nes suponen alrededor del 98% de la pro-ducción total de níspero en esta zona (SOLER

et al.2007). Desde hace diez años se viene observan-

do en el término municipal de Callosa d’EnSarrià un problema grave de decaimientoprogresivo y muerte de árboles de níspero.

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Las pérdidas medias anuales estimadas debi-das a este síndrome se calculan en unas 900t y un millón de euros (E. SOLER, comunica-ción personal).

El decaimiento progresivo de árboles fruta-les puede estar asociado a los hongos delsuelo Armillaria mellea, Rosellinia necatrix oPhytophthora spp. La formación de chancrosen la base del tronco junto con la presencia deun micelio blanco-cremoso bajo su cortezason síntomas asociados a la infección causadapor A. mellea (MORRISON et al., 1991; RIZZO

et al., 1998; AGUÍN-CASAL, 2001; PÉREZ-SIE-RRA, 2003; BAUMGARTNER, 2004). La pudri-ción de raíces, junto con la presencia de unmicelio blanco algodonoso sobre la superficiede éstas, son síntomas de la colonización porR. necatrix (SZTEJNBERG et al., 1987; SZTEJN-BERG y MADAR, 1980; MARTIJN y KRAUSS,2005; PÉREZ-JIMÉNEZ, 2006; Beltrán-Paredes,2006). La formación de chancros descrita pre-viamente, pero en ausencia de micelio, se hareferenciado como un síntoma de la presenciade Phytophthora spp. (MATHERON et al. 1988;ÁLVAREZ et al., 2006). En la zona radicular, lapudrición de raíces sin formación de miceliovisible es otro de los síntomas descritos paraPhytophthora spp. (SÁNCHEZ-HERNÁNDEZ etal., 2001).

En las últimas décadas se han citadovarios de estos patógenos asociados a podre-dumbre de raíces, decaimiento y muerte deárboles de níspero: R. necatrix (SZTEJNBERG

y MADAR, 1980; LIN y DUAN, 1988), y dife-rentes especies de Phytophthora como P.cactorum (FRISULLO et al., 1997), P. parasi-tica (CHERN et al., 1998), P. palmivora(CHERN et al., 1998) e híbridos naturales deP. parasitica y P. cactorum (MAN IN ‘T VELD,2001; ARAGON-CABALLERO et al., 2006). EnEspaña, estos patógenos son frecuentes afec-tando a árboles frutales pero, hasta la fecha,no han sido descritos en plantaciones de nís-pero.

Con el presente estudio se propuso carac-terizar el síndrome de esta afección e identi-ficar los agentes fúngicos presentes en plan-taciones de nísperos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Prospección de parcelas y toma demuestras

Entre los años 2004 y 2007 se prospecta-ron un total de 31 parcelas de níspero (Cua-dro 1) situadas en el termino municipal deCallosa d’En Sarrià (provincia de Alicante)(Figura 1). En cada una de las parcelas seexaminaron todos los árboles afectados, seanotó su sintomatología y se tomaron foto-grafías. Se tomaron muestras de chancros detronco, raíces gruesas, raicillas y suelo de larizosfera de al menos tres árboles afectadospor parcela, aumentando el número en elcaso de que éstos presentaran diferente sin-tomatología. En cada árbol afectado, para latoma de muestra de suelo, se siguió elsiguiente proceso: se tomó suelo de cuatropuntos alrededor del tronco (100 g aproxi-madamente cada una), a una profundidad de10-20 cm. Estas cuatro muestras se mezcla-ron, procesándose 100 g para la detección dePhytophthora spp.

Procesado de muestrasLos tejidos afectados se desinfectaron en

un baño de hipoclorito sódico (1,5% de cloroactivo) durante 1 minuto seguido de dos

Figura 1. Mapa de localización del termino municipalde Callosa d’En Sarrià en la provincia de Alicante.


baños con agua estéril y se sembraron enmedio PDAS (39 g de patata-dextrosa-agar;0,5 g de sulfato de estreptomicina; 1 litro deagua destilada) y medio Russell modificado(10 g de extracto de malta; 15 g de agar; 0,05g de penicilina; 0,4 g de tiabendazol; 0,05 gde sulfato de estreptomicina; 0,025 g depolymyxina B sulfato; 1 litro de agua desti-lada) (RUSSELL, 1956; PÉREZ-SIERRA, 2003).En el caso de tejidos afectados en los que sesospechaba la posible presencia de oomice-tos, las muestras se sumergieron en un bañode alcohol al 70 % durante 1 minuto seguidode dos baños de agua estéril y se sembraronen medio selectivo para oomicetos PARBH(17 g de harina de maíz-agar; 0,4 g de pima-ricina; 0,125 g de ampicilina; 0,01g derifampicina; 0,02 g de benomilo; 0,069g dehimexazol; 1 litro de agua destilada) (JEF-FERS y MARTIN, 1986). Los medios de culti-vo se esterilizaron en autoclave a 121 ºCdurante 20 minutos. Las placas de aislamien-tos se incubaron en estufa a 25 ºC en oscuri-dad durante 2-3 días. De las colonias resul-tantes se extrajeron puntas hifales que serepicaron a medio PDA para su posterioridentificación.

Además, se realizaron cámaras húmedascon fragmentos de material vegetal proce-dentes de la base del tronco o de raíces demayor grosor, las cuales se incubaron a 25ºC durante una semana.

Para las muestras de suelo se utilizaronmanzanas verdes de las variedades GrannySmith o Golden Delicious como trampavegetal y se procesaron mediante la técnicade Hendrix y Campbell (1970). En las man-zanas se realizaron cuatro huecos con laayuda de un sacabocados (1 cm de diáme-tro), se rellenaron con suelo, se saturaroncon agua destilada estéril y se sellaron concinta adhesiva transparente. Las manzanas seincubaron a 25º C durante 3-4 días hasta laaparición de lesiones firmes y de colormarrón sobre la pulpa. Las manzanas se cor-taron por la mitad y se realizaron aislamien-tos tomando porciones del límite de lalesión, que se sembraron en medio PARBH.De las colonias resultantes se extrajeron

puntas hifales las cuales se repicaron amedio PDA para su posterior identificación.

Identificación de Rosellinia La identificación morfológica de los ais-

lados de Rosellinia se hizo a partir de los cul-tivos puros, comprobándose bajo el micros-copio la presencia de los hinchamientos hifa-les característicos de la especie R. necatrix.

La identificación molecular se llevó acabo a partir de ADN genómico del micelioobtenido con el kit comercial EZNA PlantDNA Miniprep (Omega). Mediante la técni-ca PCR se amplificó la región ITS (Espacia-dores Transcritos Internos) del ADN ribosó-mico con los cebadores específicos R2 (5´-CAA AAC CCA TGT GAA CAT ACC A-3´)y R8 (5´-CCG AGG TCA ACC TTT GGTATA G-3´) (SCHENA et al., 2002). Se utilizóel kit comercial MBL Taq DNA Polimerasa(Dominion). En cada reacción se utilizó unaunidad de Taq, dNTPs a una concentraciónde 800 µM, MgCL2 a una concentración de2,5 mM y los cebadores a una concentraciónde 0,4 µM, todo ello en el tampón de reac-ción suministrado por el proveedor. De cadaaislado se utilizó 1 µl de ADN genómico. Lareacción de PCR se llevó a cabo en un ter-mociclador programable (PTC 200, MJResearch), con un programa específico parael caso de R. necatrix consistente en 35ciclos de 30 seg a 95º C, 30 seg a 50º C y 1min a 72º C, seguidos de 10 min a 72º C deextensión final de los iniciadores (SCHENA etal., 2002).

Los productos de la amplificación sesometieron a electroforesis en un gel de aga-rosa al 1,5%, se tiñeron con bromuro de eti-dio y se observaron en un transiluminador deluz ultravioleta.

Identificación de ArmillariaInicialmente se realizó una identificación

morfológica a partir de las características decrecimiento de su micelio y la formación derizormorfos que permitieron encuadrar losaislados dentro del género Armillaria.

Para la identificación morfológica tradi-cional de los aislados se realizó un estudio

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de compatibilidad somática, enfrentando 9aislados de Armillaria spp. procedentes dedistintos árboles de níspero con los aisladoshaploides de referencia de cada una de lassiguientes especies del género Armillaria: A.cepistipes, A. gallica, A. mellea, A. ostoyae yA. tabescens. La confrontación se realizó enplacas de MEA al 2% (20 g de extracto demalta; 20 g de agar; 1 litro de agua destila-da). Para ello, se colocaron dos discos de 3mm de diámetro, uno de la especie de Armi-llaria a identificar y el otro del aisladohaploide de referencia, separados entre si 3mm. Se realizaron 2 repeticiones por enfren-tamiento y se mantuvieron en oscuridad a 24ºC durante 60 días. La identificación de losaislados se confirmó mediante la diploidiza-ción de los aislados de referencia, manifesta-da en el aspecto de la colonia, que pasó detener un aspecto algodonoso a costroso.

La identificación molecular de los aisladosde Armillaria se realizó utilizando la técnicaPCR-RFLP. El proceso de extracción delADN fue similar al descrito para Rosellinia.En este caso la PCR amplificó la región IGS(Espaciador Intergénico) del ADN ribosómi-co con los cebadores específicos LR12R (5´-CTG AAC GCC TCT AAG TCA GAA-3´) yO-1 (5´-AGT CCT ATG GCC GTG GAT-3´)

(Veldman et al., 1981; Duchesne y Anderson,1990). Las condiciones para la PCR fueronlas siguientes: 35 ciclos de 60 seg a 60º C, 120seg a 72 ºC y 60 seg a 95ºC, seguidos de 10min a 72º C de extensión final de los inicia-dores. La digestión del producto de PCRamplificado se llevó a cabo añadiendo 0,5 µldel enzima de restricción AluI (Roche Diag-nostics), e incubándolo a 37º C durante 1hora. Los fragmentos digeridos por el enzimase analizaron por electroforesis en un gel deagarosa al 2,4%.

Identificación de Phytophthora spp. Se llevó a cabo a partir de sus caracterís-

ticas morfológicas, fisiológicas y culturalesutilizando como referencia las claves deERWIN y RIBEIRO (1996). A partir de obser-vaciones microscópicas del micelio, seobservó la presencia de estructuras sexualespara confirmar su naturaleza homotálica oheterotálica. Para la observación de estruc-turas asexuales, a partir del margen de lacolonia de cada aislado crecido en medioagar jugoV8 (200 ml de zumo V8; 2 g deCaCO3; 15 g de agar; 800 ml de agua desti-lada), se extrajeron discos colonizados, quese colocaron en placas Petri con solución deextracto de suelo estéril. Tras 3 ó 4 días de


Figura 2. Síntomas de decaimiento general del árbol:amarilleo, seca de hojas y defoliación.

Figura 3. Producción abundante de frutos de pequeñotamaño que no llegan a desarrollarse.


incubación a 24 ºC y fotoperiodo de 12horas de luz, se observaron las característi-cas de los esporangios y otras estructurasasexuales inducidas.

En los aislados no homotálicos se indujo laproducción de estructuras sexuales medianteel método de los cultivos duales (ERWIN yRIBEIRO, 1996). En una placa Petri contenien-do medio agar jugo V8 se colocó un discocolonizado con el aislado a identificar y a 3cm de éste, un disco colonizado con el aisla-do de referencia de los grupos de apareamien-to A1 ó A2. Los aislados de referencia CBS-308.62 y CBS-307.62, pertenecientes a losgrupos de apareamiento A1 y A2 respectiva-mente, de P. cryptogea Pethbridge & Laffertyse utilizaron en los apareamientos. Como con-troles se cruzaron ambos aislados de referen-cia. Las placas se incubaron de 1 a 4 semanasen estufa a 24 ºC y en oscuridad. Aislados queprodujeron gametos sexuales con el aisladode referencia A1 se consideraron como A2, ylos aislados que los formaron con el A2 seconsideraron como A1.

La caracterización molecular de los ais-lados del género Phytophthora se llevó acabo mediante la secuenciación de la regiónITS. La metodología seguida para la extrac-

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Figura 4. Seca de ramas y muerte del árbol.

Figura 5. Síntomas sobre el tronco: formación dechancros en los que se observa placas de micelio bajo

la corteza.

ción del ADN fue idéntica a la descritaanteriormente. En este caso, los cebadoresutilizados en la reacción de PCR fueronITS4 e ITS6 (White et al., 1990; Cooke etal., 2000). Las condiciones para la PCRfueron las siguientes: 35 ciclos de 1 min a95 ºC, 1 min a 55 ºC y 1 min a 72 ºC, segui-dos de 10 min a 72º C de extensión final delos iniciadores.

La purificación de los fragmentos ampli-ficados por PCR se realizó con el “kit” “highpure PCR product purification” (Roche),siguiendo las instrucciones sugeridas por elproveedor. Los fragmentos purificados fue-ron secuenciados, utilizando los cebadoresITS4 e ITS6 y el “kit” ABI PRISM, que uti-liza terminadores marcados y como enzimase utilizó la Amplitaq ADN polimerasa (Per-kin Elmer). La secuenciación se realizó conel secuenciador automático ABI 373 ADNsequencer por el Servicio de Secuenciacióndel ADN del IBMCP (Instituto de BiologíaMolecular y Celular de Plantas) de la Uni-versidad Politécnica de Valencia.


RESULTADOS

SintomatologíaLos primeros síntomas de decaimiento

observados en los nísperos afectados fueronel amarilleo y la marchitez de las hojas, queposteriormente caían causando la defolia-ción del árbol (Figura 2). En muchos casosesta defoliación se produjo en tramos largosde las ramas, apareciendo penachos de hojasal final de éstas. En general, se observó pér-dida de vigor y seca de ramas. En algunoscasos, en árboles que presentaban un estadoavanzado de la enfermedad, se produjo unafuerte fructificación, no llegando los frutos acompletar su desarrollo y quedándose conun tamaño pequeño (Figura 3). Todos estossíntomas aumentaban en intensidad con eltiempo y los árboles finalmente morían(Figura 4).

En la base del tronco de bastantes árbolesse observó un descortezamiento y la produc-ción de chancros, los cuales podían exten-derse a lo largo del tronco y base de lasramas (Figura 5). En muchos casos, al des-prenderse la corteza, se observó debajo deésta la presencia de placas de micelio de


Figura 6. Placa de micelio bajo la corteza de la raízafectada.

Figura 7. Micelio algodonoso sobre raíces consíntomas de pudrición.

color blanco o crema, las cuales se extendíanen forma de abanico.

Al desenterrar las raíces, éstas presenta-ron pudriciones y, en algunos casos, apareciómicelio visible el cual podía encontrarsebajo la corteza en forma de placas (Figura 6)o sobre la superficie de la raíz, con texturaalgodonosa (Figura 7).

Durante las prospecciones también seobservó la muerte de plantones jóvenes,plantados en zonas en las que previamentehabían muerto árboles con los síntomas dedecaimiento descritos (Figura 8).

Identificación de los aislados de Rose-llinia

La especie de Rosellinia que se aisló con-sistentemente de los árboles afectados fue R.necatrix. Se identificaron 27 aislados proce-dentes de 11 parcelas distintas (Cuadro 1).Todos los aislados mostraron un crecimientosobre medio de cultivo PDA y cámara húme-da característico de R. necatrix: abundanteproducción de micelio blanco y algodonoso


(Figura 9), con crecimiento rápido que, trans-curridos unos días, adquiría una coloraciónoscura. En observaciones al microscopio, seobservaban los hinchamientos piriformesjunto a los tabiques hifales característicos deesta especie (Figura 10). La electroforesis delos productos de amplificación mostró en


todos los aislados una banda específica para R.necatrix de 493 pb.

Identificación de los aislados de Armi-llaria

En el caso de Armillaria se identificaron23 aislados procedentes de 13 parcelas dis-

Cuadro 1. Parcelas prospectadas y detección de R. necatrix, A. mellea y Phytophthora spp. en las mismas.

Phytophthora spp.

Fecha R. A. P. P. P. P. P.prospección Parcela necatrix mellea cactorum cambivora citrophthora cryptogea nicotianae

19/10/2004 1 - - + - - - -

2 - + - - - - -

3 + + - + - - +

4 - + - - - - -

5 - + - - - - -

30/05/2005 6 - + - - - - -

7 + - - - - - -

8 - + - - - - -

9 + + - - - - -

26/09/2006 10 + + - - - - -

11 - - - - - + -

12 + - - - - + -

13 - + - - - - -

14 + - - - - - -

15/11/2006 15 - - - - - - -

16 - - - - - - -

17 - - - - - - -

18 - + - - - - -

19 + - - - - - -

20 - - - - - - -

21 - - - - - - -

22 + - - - - - -

12/02/2007 23 - + - - - - -

24 - - - - - - -

25 - + - - - - -

26 + - - - - - -

27 + - - - - - -

18/04/2007 28 - - - - - - -

29 - - - - + - -

30 - + - - - - +

31 + - - - - - -

Total de parcelas de las que se aislaron los diferentes hongos 11 13 1 1 1 2 2

+/-: indica la presencia o ausencia de cada una de las especies fúngicas en las parcelas de níspero prospectadas


tintas (Cuadro 1). Sobre medio de cultivoPDA estos aislados mostraron un patrón decrecimiento lento, con la formación de unmicelio costroso, el desarrollo de rizomorfosy un progresivo oscurecimiento del medio decultivo (Figura 11).

Todos los aislados procedentes de nísperofueron compatibles con el aislado haploidede referencia de A. mellea, adoptando esteúltimo un aspecto costroso (Figura 12a), porlo que los aislados fueron identificadoscomo A. mellea. Además, la confrontaciónde todos los aislados procedentes del nísperocon el resto de especies fue incompatible,manteniendo los aislados haploides unaspecto algodonoso (Figura 12b).

El estudio molecular de los aisladosmediante PCR-RFLP con el enzima de restric-ción AluI, dio como resultado las bandas derestricción específicas para A. mellea. Diez delos aislados: AR-8, AR-9, AR-99, AR-104,AR-105, AR-106, AR-107, AR-108, AR-109y AR-110 mostraron tres bandas por encimade 100 pb (320, 180 y 155 pb), por lo que seidentificaron como A. mellea de patrón 2. Elresto de los aislados mostraron dos bandas porencima de 100 pb (320 y 180 pb), que identi-ficaron a la especie como A. mellea de patrón1 (Pérez-Sierra et al., 1999).

Identificación de los aislados de Phy-tophthora spp.

A partir de las prospecciones realizadas,se obtuvieron un total de 25 aislados de Phy-tophthora procedentes de 6 parcelas (Cuadro1). Sobre la base de las características mor-fológicas y fisiológicas de cada aislado seidentificaron 5 especies: P. cactorum, P.cambivora, P. citrophthora, P. cryptogea, yP. nicotianae. Los aislados de P. cactorum yP. cambivora procedían de aislamientos dematerial vegetal, mientras que los de P.citrophthora, P. cryptogea y P. nicotianaeprocedían de aislamientos de suelo utilizan-do manzanas como trampa vegetal.

Las características a partir de las cualesse identificaron estas especies se muestranla Cuadro 2. Los esporangios de P. nicotia-nae, P. citrophthora y P. cactorum se carac-terizaron por ser papilados, mientras quelos de P. cambivora y P. cryptogea fueronno papilados. En el caso de P. citrophthora,un 20% de los esporangios observados fue-ron bipapilados. Los aislados pertenecien-tes a P. cactorum se mostraron caducos(Figura 13), el pedicelo era corto prome-diando 4,3 µm de longitud. Hubo unaamplia variabilidad en la forma y el tamañode los esporangios de las diferentes espe-cies. Sólo los aislados de P. nicotianae pre-sentaron clamidosporas, con un di·metromedio de 30,7 mm. Por otra parte, tanto losaislados de P. cambivora como los de P.


Figura 8. Plantón con síntomas de defoliación ymarchitez junto a árboles sintomáticos y tocón de un

árbol muerto.Figura 9. Raíces en cámara húmeda con abundante

micelio de R. necatrix.


cryptogea se caracterizaron por formar hin-chamientos hifales con distintas formas(Figura 14).

Con respecto a las estructuras sexuales,los aislados de P. cambivora, P. cryptogea yP. nicotianae fueron heterotálicos, los de P.citrophthora fueron estériles y los de P. cac-torum homotálicos (Figura 15). Las especiesP. cambivora, P. cryptogea, y P. nicotianae

presentaron anteridios anfígenos. Las oospo-ras de P. cambivora y P. cryptogea fueronpleróticas mientras que P. nicotianae las pre-sentó apleróticas. P. cactorum presentó ante-ridios paraginos con oosporas pleróticas.Excepto P. cambivora, que presentó oospo-ras de superficie ornamentada (Figura 16),las demás especies de Phytophthora presen-taron oosporas de superficie lisa.


Figura 12 (a y b). Reacción de compatibilidad mostrada en la confrontación del aislado haploide de referencia de A.mellea con el aislado de A .mellea de níspero (a). Reacción de incompatibilidad mostrada en la confrontación del

aislado haploide de referencia de A. tabescens con el aislado de A .mellea de níspero (b)

a b

Figura 10. Hinchamientos hifales característicos de R.necatrix.

Figura 11. Micelio y rizomorfos de A. mellea sobremedio de cultivo PDA.


Se observaron diferencias en el patrón decrecimiento de las colonias en placa demedio de cultivo PDA entre las distintasespecies. P. citrophthora presentó un creci-miento tipo estelado, con micelio superficial;P. cactorum desarrolló un micelio superficialpulverulento; P. cambivora no siguió ningúnpatrón específico de crecimiento; el creci-miento de P. cryptogea fue de tipo petaloidey P. nicotianae desarrolló una colonia esto-lonífera (ERWIN y RIBEIRO, 1996).


Figura 13. Esporangio caduco perteneciente a laespecie P. cactorum.

Figura 14. Hinchamientos hifales de P. cambivora.

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Del ADN extraído y mediante la técnicade PCR se amplificó la región ITS una únicabanda entre 800 y 900 pb en cada aislado.Estos productos de PCR purificados fueronsecuenciados. Las secuencias ITS de los ais-lados se compararon con las secuenciasdepositadas en la base de datos GenBankmediante el programa BLAST del NCBI(Nacional Center of Biotechnology Informa-tion, USA). Los resultados mostraron unasemejanza del 100% entre los aislados de P.nicotianae, P. citrophthora, P. cactorum y P.cambivora y las accesiones correspondientesa estas especies incluidas en la base de datos.En el caso de los aislados de P. cryptogea, laconcordancia fue del 99%.

Frecuencia y distribución de los pató-genos

La frecuencia con que se detectó cada unode los patógenos de forma aislada y conjun-ta en las parcelas aparece en la Cuadro 3. Elpatógeno que se aisló con mayor frecuenciafue A. mellea representando un 40,6% deltotal, mientras que R. necatrix y Phytophtho-ra spp. representaron un 34,4% y un 18,7%respectivamente. En 8 de las parcelas pros-pectadas no se aisló ningún patógeno, lo querepresenta un 25% del total. Del total de par-celas muestreadas, más de la mitad (59,4%)

sólo tenían uno de los tres patógenos estu-diados, mientras que en el 15,5% de las par-celas prospectadas se aislaron dos o trespatógenos diferentes.

DISCUSIÓN

En el presente estudio se han caracteriza-do los síntomas del decaimiento del níspe-ro: clorosis, defoliación, seca de ramas, for-mación de chancros en la base del tronco,pudrición de raíces con presencia o ausen-cia de micelio y marchitez. La muerte deárboles ocurrió de forma lenta en árboles demayor edad o rápidamente en plantonesjóvenes.

En el tronco, raíces y/o suelo de los árbo-les afectados se detectaron los hongos delsuelo Rosellinia necatrix, Armillariamellea y Phytophthora spp., que son pató-genos frecuentes en cultivos leñosos. Laidentificación de estos patógenos se realizómorfológicamente y se utilizaron las técni-cas moleculares para confirmar esta identi-ficación.

En el caso de R. necatrix, los aisladosdesarrollaron los hinchamientos hifalescaracterísticos de la especie (PÉREZ-JIMÉNEZ,2006) y se confirmó molecularmente por eltamaño del producto de PCR obtenido que


Figura 15. Oospora de P. cactorum. Figura 16. Oospora de superficie ornamentada de P.cambivora.


coincidió con el descrito por SCHENA et al.(2002) como específico para R. necatrix.

A. mellea mostró un patrón de crecimien-to en medio de cultivo similar al descrito porPérez-Sierra (2003) y la identificación mole-cular de los aislados mediante la técnicaPCR con los cebadores 0-1 y LR12R y suposterior digestión con el enzima AluI iden-tificó a todos los aislados como A. mellea,tanto de patrón 1 como de patrón 2 descritospor PÉREZ-SIERRA et al. (1999). Esta varia-ción intraespecífica fue también observadapor Coetzee et al. (2000) tras la observaciónde diferencias morfológicas, culturales ymoleculares. Por otra parte, los estudios deconfrontación de los aislados con las cepashaploides de cinco especies de Armillariaconfirmaron la identificación de éstos comoA. mellea, al ser capaz de diploidizar única-mente el micelio de esta especie (GUILLAU-MIN et al., 1991).

En el caso de Phytophthora, se identifica-ron cinco especies distintas: P. nicotianae, P.citrophthora, P. cambivora, P. cactorum y P.cryptogea. En todos los casos, las caracterís-ticas de los esporangios de los aislados encuanto a caducidad, papilación, forma ymedidas coincidieron con las descritas porERWIN y RIBEIRO (1996) para cada una de lasespecies. Lo mismo ocurrió con el patrón decrecimiento del micelio, la presencia ydimensiones de las clamidosporas y con elcarácter homotálico o heterotálico de las

especies, así como con el tamaño de las oos-poras. Finalmente, el estudio molecular delos aislados de cada especie mostró una altaconcordancia entre la secuencia de ADN deéstos y las incluidas en la base de datos Gen-Bank. Estudios previos realizados por FRISU-LLO et al., (1997) en Italia, CHERN et al.(1998) y MAN IN `T VELD (2001) en Taiwán,y por ARAGÓN-CABALLERO et al. (2006) enPerú, encontraron aislados de Phytophthoraspp. asociados al decaimiento del níspero.FRISULLO et al., (1997) identificaron estosaislados como P. cactorum, CHERN et al.(1998) los identificaron como P. nicotianae,mientras que MAN IN `T VELD (2001) y ARA-GÓN-CABALLERO et al. (2006), tras el estudiode sus características morfológicas y el aná-lisis de la secuencia ITS, los identificaroncomo un híbrido interespecífico de P. nico-tianae y P. cactorum. En nuestro caso, selograron identificar tres especies de Phy-tophthora que no habían sido anteriormentecitadas en níspero: P. citrophthora, P. cambi-vora y P. cryptogea. Además, al contrarioque los aislados de MAN IN `T VELD (2001) yARAGÓN-CABALLERO et al. (2006), las carac-terísticas de los aislados de P. nicotianae y P.cactorum se correspondían con las descritaspor ERWIN y RIBEIRO (1996), para estas espe-cies, no tratándose por tanto, de híbridosinterespecíficos.

El estudio de la frecuencia y distribuciónde los patógenos en las diferentes parcelas


Cuadro 3. Distribución de R. necatrix, A. mellea y Phytophthora spp. en las parcelas afectadas.

Total %

Parcelas sólo con R. necatrix 7 21,9

Parcelas sólo con A. mellea 9 28,1

Parcelas sólo con Phytophthora spp. 3 9,4

Parcelas con R. necatrix y A. mellea 2 6,2

Parcelas con R. necatrix y Phytophthora spp. 1 3,1

Parcelas con A. mellea y Phytophthora spp. 1 3,1

Parcelas con R. necatrix, A. mellea y Phytophthora spp. 1 3,1

Total de parcelas con R. necatrix 11 34,4

Total de parcelas con A. mellea 13 40,6

Total de parcelas con Phytophthora spp. 6 18,7

Parcelas donde no se ha aislado ningún patógeno 8 25


mostró que la especie predominante fue A.mellea, seguida de R. necatrix, y finalmentePhytophthora spp. La menor frecuencia deestos oomicetos puede deberse a las dificul-tades para el aislamiento de Phytophthoratanto de material vegetal como de suelo,muy influenciado por aspectos como la tem-peratura, las fluctuaciones estacionales o elciclo biológico del cultivo. De un 25% de lasparcelas muestreadas no se consiguió aislarningún hongo. Este hecho puede ser debidoa la dificultad para aislar los patógenos des-critos. En otros casos la observación de unossíntomas generales de decaimiento puede noestar asociada a la presencia de patógenos enel suelo, sino a problemas ambientales o demanejo. La detección de un único patógenoocurrió en un 59,4% del total de parcelas,mientras que en únicamente el 15,5% seencontraron dos o tres patógenos a la vez. Labaja incidencia de parcelas con detecciónsimultánea de dos o tres especies fúngicas

sugiere que un mismo síntoma aéreo dedecaimiento general del árbol podría estarasociado a la presencia en el suelo de dife-rentes patógenos: A. mellea, R. necatrix oPhytophthora spp., siendo necesario verotros síntomas en raíces o base del tronco aparte del decaimiento.

Serían necesarios futuros estudios depatogenicidad de cada una de estas especiesen níspero a fin de determinar qué papeljuega cada uno de estos patógenos en eldesarrollo del síndrome de decaimiento delníspero.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Cooperativa deCallosa d’En Sarrià y en especial a EstebanSoler el apoyo para la realización de esteestudio y a Olga Aguín Casal de la EstaciónFitopatológica “Do Areeiro” el haber cedidolos cultivos haploides del género Armillaria.


ABSTRACT

GONZÁLEZ-DOMÍNGUEZ, E., A. PÉREZ-SIERRA, L. A. ÁLVAREZ, M. LEÓN, P. ABAD-CAMPOS, J. ARMENGOL, J. GARCÍA-JIMÉNEZ. 2009. Fungal agents detected in loquat(Eriobotrya japonica Lindl.) orchards showing decline symptoms in Alicante province.Bol. San. Veg. Plagas, 35: 453-467.

Spain is the first producer of loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) in the Mediterraneanarea and the second world’s producer after China. In the last years has been detected anincreasing problem characterized by the decline and death of the trees, affecting both neworchards and older ones. The objective of this study was to typify the symptomatology ofthe disease and determine the causal agents. For this, 31 loquat orchards were surveyedin the area of Callosa d’En Sarrià (Alicante province). Through these observations thesyndrome of the disease was characterized as: chlorosis and wilting of leaves joined tothe defoliation of the tree and dry of the branches. It was also observed the presence ofcanker in the base of the trunk and root rot, both sometimes covered by mycelium. Occa-sionally, gum exudations were produced in the trunk. The death of the trees occurs slow-ly in older trees or quickly in young ones. The causal agents were identified by morpho-logical and molecular techniques. From the affected orchards the following soilbornefungi were detected: Armillaria mellea, Rosellinia necatrix, Phytophthora nicotianae, P.citrophthora, P. cambivora, P. cactorum and P. cryptogea. The main species was A. mel-lea (40.6% of the sampled orchards) followed by R. necatrix (34.4%) and Phytophthoraspp. (18.7%). In more than half of the surveyed orchards (59.4%) only one pathogen wasisolated.

Key words: Armillaria, Phytophthora, Rosellinia, soil-borne fungi.



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(Recepción: 19 enero 2009)(Aceptación: 8 junio 2009)



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