Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram negativa capaz de infectar plantas a través de heridas, e inducir la formación de “tumores” en las plantas infectadas.

CARACTERISTICAS DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Contiene un plásmido de una 200 000 pb. denominado plásmido Ti (inductor de tumores).

A. tumefaciens es una bacteria en forma de bacilo, flagelada, habitante del suelo. Penetra a la planta a través de heridas frescas producidas durante las labores de trasplante o mantenimiento o por insectos y nematodos del sistema radical.

ADN-T, que es lo único que se transfiere. Posee borde izquierdo, borde derecho, gen de biosíntesis de hormona vegetal, gen de síntesis de opina.Genes vir que provocan la transferencia del segmento T. Genes de catabolismo de opinas (que permiten que la bacteria se nutra de estas sustancias).

ESTRUCTURA DEL PLASMIDO Ti

MECANISMO DE INFECCION :Un fragmento de 23 000 pb del plásmido Ti (DNA-T) se transfiere desde el plásmido y se integra al azar en uno de los cromosomas de la célula vegetal.1.-La bacteria entra en contacto con la célula dañada.2.-Las celulas dañadas de la planta producen y liberan el compuesto fenolico, acetosiringona.3.-Agrobacterium detecta este compuesto y se expresan los genes de virulencia (vir)4.-Los genes vir codifican las enzimas necesarias para introducir el segmento de DNA-T del plasmdo Ti en el genoma de las celulas vegetales vecinas.5.- Se sintetiza una monocadena de DNA-T.6.- La cadena monocatenaria de DNA-T entra en la celula vegetal.7.- La cadena monocatenaria entra al nucleo de la celula vegetal y se hace duplex. 8.- La cadena duplex se integra en el cromosona de la planta.

MECANISMO DE INFECCION

Formación del callo:

• El callo es una masa de células no diferenciadas.

• El cultivo se hace en medios de geles y deben contener agar, macronutrientes y micronutrientes.

• En especial (nitrógeno, fosforo y potasio)

La transferencia del DNA- T y de los productos de los genes de Agrobacterium al cromosoma de la célula vegetal, dependen de dos repeticiones de 25 pb que flanquean el DNA-T y de los productos de los genes de virulencia vir del plásmido Ti.

El DNA-T codifica enzimas que convierten metabolitos del a planta en dos clases de compuestos beneficiosos para la bacteria la primera clase consiste en hormonas de crecimiento de la planta(auxinas y citocininas) que estimula el crecimiento de las células de la planta transformadas, que forman el tumor de agalla en corola.

• La segunda clase consiste en una serie de aa. poco frecuentes llamados opinas que sirven d nutrientes de la bacteria. Las opinas se producen en grandes cantidades en las células tumorales que las segregan al entorno, donde solo pueden ser metabolizadas por Agrobacterium mediante enzimas codificadas en otras regiones del plasmido Ti. De este modo las bacterias desvían recursos de la planta convirtiéndolos en forma que solo ella puede aprovechar.

ESTRATEGIA DE CLONACIÒN:

• Construcción de un vector con una secuencia de ADN que codifique y exprese el transgen en un organismo vegetal superior(eucariota).

• Selección de líneas células vegetales exitosamente transformadas y cultivo para obtener grandes cantidades de la proteína recombinante.

• Recuperación y purificación de la proteína recombinante.

• Caracterización del producto final.

TRANSFORMACION DE PLANTAS POR AGROBACTERIUM

Ventajas:• Puede introducir nuevos

caracteres en la planta mucho mas rápidamente que los métodos tradicionales de cruzamiento, como resistencia a herbicidas, virus y plagas de insectos.

Desventajas:• Aparición de malas hierbas

resistentes a herbicidas.• Difusión de plantas

recombinantes difíciles de controlar.

Algunos organismos transformados genéticamente.

•Debe existir una relación entre el vector y el tejido de la planta.• Los cultivos agronómicos surgieron hace unos 10.000 años cuando los primeros hombres civilizados comenzaron a ser sedentarios e iniciaron la domesticación de ciertas especies.

• Para el caso variedad “soja Asgrow 5403RR” se inició el programa demejoramiento en varias etapas en la década del ´90. La primera fue la obtención de la variedad sojera Asgrow 5403 por mejoramiento tradicional.• Esta variedad fue obtenida a partir del cruzamiento de dosvariedades americanas de elite: Essex, del grupo V y Williams del grupo III.•La variedad comercializada tenía un alto potencial de rendimiento con resistencia marcada a nemátodes de agalla.

Transformación genética de la fresa• Se utilizan explantes de peciolo y

hojas de plantas cultivadas in vitro que se colocan en medios de cultivos que induzcan callos a partir de los cuales se pueden regenerar plantas.

• Se introducirán genes que den ventajas a los productores como pueden ser genes que confieran tolerancia a herbicidas como el gen bar que codifica la fosfinotricina acetil-transferasa, enzima que inactiva a la fosfinotricina, componente activo del herbicida Basta.

aislaron el gen para la enzima luciferasa de las luciérnagas.

• El sustrato para la enzima luciferasa es una proteína llamada luciferina. En presencia de oxígeno, la luciferina junto con luciferasa y ATP producen bioluminiscencia, como se ve en el destello de la luciérnaga.

El gen de la luciferasa fue clonado en E. coli y luego empalmado en el cromosoma de un virus vegetal, lo cual le suministró una secuencia regulatoria.

El cromosoma viral modificado se insertó luego en plásmidos Ti, los plásmidos fueron transferidos a las bacterias y las bacterias se incubaron con células foliares del tabaco. Las células formaron una masa de tejido, conocido como callo, a partir del cual se obtuvieron nuevas plantas en medio de crecimiento adecuado.

Las nuevas plantas fueron regadas con una solución que contenía luciferina y al cabo de un tiempo las plantas resplandecían.

Un procedimiento para producir una planta de algodón transgénica que comprende las etapas de:

• (a)obtener explantes de pecíolo de algodón,

(b) exponer los explantes de pecíolo a un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que alberga un vector que comprende un gen exógeno y un gen marcador seleccionable, siendo el Agrobacterium capaz de efectuar la transferencia estable del gen exógeno y el gen marcador seleccionable al genoma de las células del explante de pecíolo,

(c) cultivar los explantes de pecíolo en un medio que contiene ácido 2,4-diclorofenoxiacético a una concentración que varía de más de 0 a 0,5 mg/l y quinetina a una concentración que varía de más de 0 a 1 mg/l para inducir la formación de callos,

(d) seleccionar el callo transformado que expresa el gen exógeno,

• (e) cultivar el callo seleccionado en cultivo de suspensión en medio de diferenciación que no contiene hormona vegetal durante menos de 20 días para inducir la formación de embrioides,

(f) germinar los embrioides en un medio que tiene una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en asparagina, glutamina o tanto asparagina como glutamina y que no contiene hormona vegetal, para producir plantas de algodón transgénicas jóvenes, y

(g) cultivar las plantas de algodón transgénicas jóvenes en un medio que tiene 10 g/l de glucosa y 10 g/l sacarosa como fuente de carbono y que no contiene hormona vegetal, para producir plantas de algodón transgénicas,

en el que los medios de cultivo usados en las etapas (b)-(f) tienen glucosa como única fuente de carbono y en el que la etapa (e) se realiza a un pH entre 5,8 y 7,5