Agua Potable NMP

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Instituto Tecnológico de Durango Manual de Prácticas de Aseguramiento de la Calidad Microbiológica de los

alimentos

M. en C. Patricia Rodríguez Briones

LABORATORIO DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

MICROBIOLÓGICA DE LOS ALIMENTOS

CURSO AGOSTO - DICIEMBRE DE 2010

P R Á C T I C A # 4

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE AGUAPOTABLE Y AGUA PURIFICADA

Nombre del Alumno y número de control




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INTRODUCCIÓN

Para los fines de control sanitario de la potabilidad de una

fuente de abastecimiento de agua, la frecuencia de los análisis está

en función de la población, por ejemplo, para una ciudad de cinco

millones de habitantes, se considera que la vigilancia sanitaria es

satisfactoria con la aplicación a 500 exámenes mensuales. Las

muestras de agua deben ser colectadas en lugares estratégicamente

distribuidos dentro de la ciudad. Decir que la vigilancia sanitaria es

satisfactoria, significa que los resultados obtenidos son válidos ya sea

que resulten o no positivos a la contaminación.

El proceso de la potabilización del agua involucra dos etapas

principales: su acondicionamiento físico y su acondicionamiento

microbiológico. Ocasionalmente se hace necesario eliminar o

disminuir la concentración de algunas sustancias químicas.

El análisis de laboratorio para el control de la potabilidad del

agua desde el punto de vista bacteriológico incluye tres pruebas: el

recuento de bacterias mesofílicas aerobias, la estimación del NMP

(número mas probable) de organismos coliformes y la valoración del

cloro residual.

El valor de la cuenta de colonias en placa a 35°C ha encontrado

apoyo y rechazo por diferentes autoridades. Generalmente se acepta

que las aguas protegidas contra la contaminación natural, contienen

bajo número de bacterias: menos de 100/mL. En consecuencia el

hallazgo de cifras elevadas se interpreta como una indicación de

exposición a cualquier tipo de contaminación. La técnica del NMP es,

incomparablemente, más sensible que el recuento en placa, ya que

pone de manifiesto unos cuantos gérmenes o uno solo, en un gran

volumen de muestra, teóricamente litros. Por esta razón encuentra

aplicación en el análisis del agua en donde la presencia de dos





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organismos coliformes en 100mL, ya reclama atención especial en su

sistema de abastecimiento. El hipoclorito de sodio o de calcio y el

cloro gaseoso por su efectividad, economía y facilidad de aplicación y

de control se utilizan ampliamente en la desinfección del agua. Una

concentración de 0.1 a 0.3 ppm de cloro residual en el agua

destinada para el consumo humano es satisfactoria.

Con el presente estudio se pretende evaluar los riesgos de

contaminación fecal reciente en el agua distribuida por Aguas de

Municipio en la ciudad de Durango así como evaluar la calidad

sanitaria de diferentes marcas comerciales de agua embotellada.

FUNDAMENTOS. (En la versión electrónica, comienza a teclear aquí

los fundamentos de la práctica)

M É T O D O.

Toma de la muestra.

Las muestras de agua que se destinan para examen

bacteriológico deben colectarse tomando las precauciones necesarias

para evitar el ingreso de microorganismos ajenos a la fuente de

abastecimiento de que se trate; por ejemplo, cuando se colectan

muestras de agua de la llave deberán limpiarse, previamente con

toda escrupulosidad frotando con papel absorbente limpio, el exterior

y el interior de esa llave y dejar salir el agua a toda capacidad

durante tres minutos. Se dispondrá por tanto de frascos estériles de

vidrio de tapón esmerilado de 500mL de capacidad, transparente y de

boca ancha. En su interior se colocarán, previo a la esterilización

0.4mL de solución de tiosulfato de sodio al 10% a fin de inactivar y

detener la acción del cloro que pudiera contener el agua. El frasco

con muestra que se va a usar para determinar cloro residual no

llevará tiosulfato.





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El agua de estanque o de río se colocará en frascos de los arriba

descritos, la boca del frasco se orientará de manera que reciba

directamente la corriente del agua.

En el caso del hielo se debe colectar la muestra con un picahielo y

cucharilla metálica estériles.

En todos los casos es indispensable evitar que el cuello o tapón

del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro

material. El tapón se retirará del frasco solamente el tiempo

necesario para colectar la muestra.

El frasco se llenará a los 2/3 de su capacidad. Esto deja un

espacio suficiente para homogenizar la muestra.

El examen de la muestra colectada debe iniciarse tan

rápidamente como sea posible a fin de evitar disminución o aumento

en el número de bacterias presentes. No es necesario refrigerar la

muestra, pero la recomendación se hace en el sentido de conservarla,

durante el transporte, a la temperatura a la que se encontraba en el

momento de la recolección. Cuando el examen se inicia 3 horas

después de colectada la muestra, los resultados empiezan a ser

inciertos.

En el momento mismo de la recolección debe determinarse la

concentración de cloro residual; si no se cuenta con equipo portátil,

transportar entonces la muestra lo más rápido posible al laboratorio.

M A T E R I A L E S Y M E D I O S D E C U L T I V O.

Para cada muestra se requiere:

1 Frasco estéril de vidrio de tapón esmerilado de 1 litro de

capacidad, transparente y de boca ancha. En su interior se

colocarán previo a la esterilización 0.4mL de solución de

tiosulfato de sodio al 10% con el fin de inactivar y detenerasí la acción del cloro que pudiera contener el agua.





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1 Frasco de dilución limpio (sin tiosulfato).

2 Cajas petri estériles para vaciar 15mL de agar para métodos

estándar (AME).

1 Tubo de ensaye limpio para la prueba de cloro residual.

5 Tubos con 10mL de caldo lactosado concentración 200% y

campana de fermentación.

2 Tubos con 10mL de caldo lactosado concentración sencilla y

campana de fermentación.

2 Pipetas de 10mL estériles.

3 Pipetas de 1mL estériles.

1 Pipetas de 2mL limpias.

7 Tubos con 10mL de caldo lactosado verde bilis brillante al

2%.

1 Caja de petri con agar eosina azul de metileno solidificado.

1 Picahielo estéril.

1 Cuchara estéril.

1 Colorímetro de Taylor y reactivo de ortotolidina.

P R O C E D I M I E N T O

Recuento de bacterias mesofílicas aerobias.

Para cada muestra analizada seguir los siguientes pasos:

a) Agua potable : Inocular por duplicado 1mL del agua de

muestra en el centro de una caja petri estéril agregar 15mL

de agar para métodos estándar (AME ) fundido y enfriado a

44 – 46°C. No debe transcurrir más de 20 minutos entre

estas dos operaciones.

Inmediatamente incorporar el inóculo al medio mediante 6

movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las

manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás

hacia delante. Evitar el derrame del líquido y su contacto

con la cubierta de la caja. Dejar solidificar e incubar a 37°C





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durante 48 horas. Contar las colonias desarrolladas en la

placa, incluso las puntiformes y reportar como UFC/mL.

b) Hielo : Dejar fundir la muestra completamente y

proceder como con el agua potable.c) Agua purificada : Limpiar escrupulosamente el exterior

de la botella o garrafón, abrir junto al mechero y proceder

como con el agua potable.

Número más probable de organismos coliformes (NMPOC )

a) Prueba presuntiva

- Inocular con 10mL de muestra cada uno de los 5 tubos de

fermentación con caldo lactosado de doble concentración

de 200%.- Inocular con 1mL de muestra un tubo de fermentación de

concentración sencilla.

- Inocular con 0.1mL de muestra un tubo de fermentación

de concentración sencilla.

- Incubar los 7 tubos a 35 – 37°C durante 48 +/- 3 horas.

- Observar cuidadosamente cada tubo. La presencia de gas

en cualquier cantidad dentro de la campana defermentación hace positiva la prueba. Además, el tubo

positivo mostrará denso desarrollo bacteriano. La

ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba.

b) Prueba confirmativa





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- Transferir individualmente de cada tubo positivo de 2 a 3

asadas del cultivo a un tubo de fermentación con caldo

verde brillante bilis al 2%.

- Incubar a 35 – 37°C durante 48 +/- 3 horas.

- La formación de gas en cualquier cantidad dentro de la

campana hace positiva la prueba. La ausencia de gas en

los tubos hace negativa la prueba.

- Determinar el NMP de organismos coliformes en la

muestra de acuerdo con la tabla 4.1

c) Prueba complementaria

- De los tubos que den positiva la prueba confirmativa se

toma una asada y se inoculan placas petri con agar EMB

previamente solidificado por el método de siembra en

estrías.

- Se incuban las cajas de 24 a 48 horas a 35 – 37°C.

- Observar el tipo de crecimiento. En el medio EMB, lascolonias típicas de coliformes crecen de color café

obscuro o azul obscuro con la porción central elevada y

usualmente aunque no siempre con un brillo metálico o

rosa pálido o gris y mucosas con o sin estrías de brillo

metálico.

Determinación del cloro residual

- Aplicar el ensayo de las fuentes de agua sujetas a

cloración que no hayan sido sometidas a la acción de

carbón activado.

- Efectuar la prueba en un tubo limpio enjuagando varias

veces con el agua por examinar.





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- A 1 – 2mL de la muestra adicionar 2 gotas de reactivo de

ortotolidina. Invertir el tubo y comparar el color

desarrollado con la escala del colorímetro de Taylor.

La tabla 4.1 da límites para varias combinaciones de resultados

positivos y negativos cuando son usados 5 tubos con 10mL, y 1 tubo

con 1mL y 1 tubo con 0.1mL.





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DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO PARA EL ANÁLISISMICROBIOLÓGICO DEL AGUA POTABLE

Agua potable + 0.4 mL de

tiosulfato de sodio al 10%

Cuenta estándar Organismos coliformes técnica NMP

Inocular 10mL de agua a c/tubo

Vaciado en placa: *

Inocular 1mL de agua e incorporar 15-20mL de

agar para métodos estándar con movimientos

rotatorios. Incubar a 35ºC por 48 horas

**Inocular 1mL de agua

**Inocular 0.1mL de agua

Incubar a 35 ºC / 48 horas

* Tubos con 10mL de caldo lactosado al 200%

**Tubos con 10mL de caldo lactosado al 100%


Prueba Presuntiva

Pasar a la prueba confirmativa:

Inocular 2 ó 3 asadas de los tubos

que muestren gas en la campana atubos con caldo verde brillante

bilis al 2%




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Tabla 4.1 Número más probable de organismos serie 5, 1, 1

Número de tubos positivos de:NMP/100m

L Límite de NMP5 tubos de

10mL1 tubo de

1mL1 tubo de

0.1mL Inferior Superior0 0 0 0 5.90 1 0 2 0.05 13 1 0 0 2.2 0.05 131 1 0 4.4 0.52 14 2 0 0 5 0.54 192 1 0 7.6 1.5 19

3 0 0 8.8 1.6 293 1 0 12 3.1 30 4 0 1 15 3.3 464 0 0 20 5.9 484 1 0 21 6 53 5 0 0 38 6.4 3305 0 1 96 12 3705 1 0 240 12 37005 1 1 88





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O B S E R V A C I O N E S


Fig 4.2 Morfología de las Bacterias

Mesofílicas aerobias (BMA) en Agarpara Métodos Estándar.

Número de colonias

encontradas en la placa con

agua potable:

Número de colonias


agua potable:

Número de colonias


agua purificada:

Número de colonias


agua purificada:




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Fig. 4.3 Prueba confirmativa del

Fig 4.5 Prueba complementariadel NMP. Observaci de la morfolog

僘 colonial de los organismoscoliformes en EMB

Comparaci de intensidad

del color de la muestra

muestra con el color匇

etro

de Taylor




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R E S U L T A D O S.

No. demuestr

a

DESCRIPCIÓN DELA MUESTRA

PROCEDENCIACUENTA

ESTANDAR NMPOC /100mLCALIFICACIÓN

SANITARIA

UFC /mL

A. de fresa " La michoacana " 7310 más 1,100

1 $16 / l Fijo

A. de horchata " Los molletes " ITD 290 3.6

2 con leche Fijo $18 / l

A. de horchata Fracc. La Forestal 7040 43

3 $24 / l Ambulante

A. de cebada Plazuela Baca Ortiz 910 15

4

5 $10 / l Ambulante

A. de horchata " Que Gorditas " 900 290

6 $16 / l Fijo

1. Recuento de bacterias mesofílicas aerobias.

Cuenta estándar de colonias incubadas a 37°C durante 48horas: _____________UFC / mL


Tabla 4.2. Resultados

Fig. 4.6 Escala del colorímetro de Taylor




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2. Estimación del número más probable ( NMP )de organismos coliformes:

Para la combinación: __________, ___________, ___________,de la tabla 4.1.

El NMP/100mL de organismos coliformes esde:_________________

3. Calificación sanitaria*: _____________________

*Consulta los siguientes documentos:MODIFICACION A LA NORMA Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994,Salud ambiental, agua para uso y consumo humano-Límitespermisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el aguapara su potabilización.

NORMA Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993.Agua purificadaenvasada. Especificaciones sanitarias.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS:(En la versión electrónica comienza a teclear en este renglón elanálisis que hiciste de tus resultados y su respectiva discusión)

CONCLUSIONES:

(En la versión electrónica comienza a teclear en este renglón tusconclusiones)

REFERENCIAS. (En la versión electrónica, anota en orden alfabético

las referencias bibliográficas y de recursos electrónicos que hayas





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consultado para tus fundamentos y para el análisis y discusión deresultados).

Fecha de realización de la práctica: ________________

Fecha de entrega de la práctica: ___________________

Firma del alumno: _________________________

Comentarios del profesor:

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Evaluación: ___________


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