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AISLAMIENTO Y CULTIVO DE DOS ESPECIES DE DIATOMEAS

BENTNICAS.

Yahima Almaguer, Elvira Alfonso y Sylvia Leal Centro de Investigaciones Marinas, Universidad de La Habana, Calle 16 No. 114, Playa, CP 11300, Ciudad Habana, Cuba. (*) Autor correspondiente:

RESUMEN Aislamiento de dos especies de diatomeas bentnicas pertenecientes al gnero Amphora con potencialidad para ser cultivadas y usadas posteriormente en la alimentacin de las postlarvas tempranas de los camarones marinos. Ambas especies, y una tercera trada de Brasil, fueron cultivadas en condiciones de laboratorio utilizando los medios Guillard y A-M para probar su factibilidad para el cultivo. Se calcularon las concentraciones de clorofilas a y c empleando la tcnica de extraccin con acetona y lectura de la absorbancia a 630 y a 664 nm para cada especie en cada medio de cultivo durante el perodo de crecimiento. La concentracin de clorofila a en los dos medios aument con la edad del cultivo, mientras que en el caso de la clorofila c ocurri lo contrario. Palabras clave: diatomeas bentnicas; microalgas; aislamiento; cultivo; Amphora. ABSTRACT In this study two benthic diatoms species to Amphoras genera, with potentials to be cultured and later used in the nutrition of early postlarvae stage of marine shrimps, were isolated. Both species and a third, brought from Brazil, were cultured under laboratory conditions using Guillard f/2 and A-M medium to prove their feasibility in culture conditions. Concentrations of chlorophyle a and c for each culture medium during growing phase were calculated. Results showed that concentrations of chlorophyle a in the two tested culture mediums raised with culture age, while in the case of chlorophyle c the opposite results were observed. Key words: benthic diatoms; microalgae; isolation; culture; Amphora.

Desde la dcada de los noventa del pasado siglo se ha venido realizando las primeras investigaciones y cultivos de diatomeas bentnicas en algunos pases de Latinoamrica con el objetivo de ser usadas en el maricultivo. Tambin se conoce que en laboratorios de produccin de larvas de camarones de Brasil se usan especies de este grupo como fuente de alimentacin para organismos de cultivo (Alfonso, comunicacin personal). En la actualidad se consideran un grupo poco estudiado y muy rico en diversas formas, gneros y especies, con un alto potencial para ser usado como fuente de alimento vivo para los organismos que se cultivan con inters comercial y que presenten hbitos bentnicos al menos en alguna fase de su ciclo de vida (mayormente representados por Navicula y Nitzschia, en proporciones similares, seguidas de Amphora con poco ms de la mitad de los taxa (Siqueiros, 1994). Con el objetivo de optimizar el cultivo del camarn en nuestro pas se han venido desarrollando experimentos para mejorar la seleccin y

produccin de especies fitoplanctnicas, pero hasta el momento no se ha estudiado la posibilidad de incluir microalgas bentnicas autctonas como suplemento alimentario de las primeras postlarvas. Los objetivos de este trabajo fueron aislar diatomeas bentnicas de aguas cubanas para su posible utilizacin en la alimentacin de las primeras postlarvas de camarn en cultivo, probar la factibilidad del cultivo de las especies aisladas siguiendo el aumento progresivo de volumen hasta los niveles intermedios y ensayar el comportamiento de las diatomeas aisladas en los medios de cultivo Guillard f/2 y A-M, relacionndolo con el de una diatomea bentnica trada de Brasil. MATERIALES Y MTODOS Aislamiento Las muestras de agua utilizadas en la bsqueda de microalgas bentnicas fueron tomadas de los estanques de engorde de camarn L. schmitti en la regin de Santa Cruz del Sur, Provincia Camaguey.

Almaguer et al.: Aislamiento y cultivo de dos especies de diatomeas bentnicas.

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El aislamiento de las cepas se llev a cabo por la combinacin de dos mtodos: diluciones sucesivas y aislamiento en placas. El mtodo de las diluciones fue el primero en aplicarse (Alfonso y Leal, 2000). Una vez que apareci coloracin en los tubos se seleccionaron aquellos cuya muestra estaba ms diluida, convirtindose en puntos de partida para la aplicacin del aislamiento en placas. El medio de cultivo utilizado para el desarrollo de las microalgas bentnicas fue el medio Guillard f/2 (Guillard, 1975): Para las diluciones sucesivas se utiliz el medio en forma lquida y la siembra en placa se logr con el mismo medio solidificado con agar-agar a razn de 20 g/L. Los cultivos se desarrollaron a temperatura controlada e iluminacin constante dentro del local del cepario. Una vez aisladas, las diatomeas fueron identificadas por especialistas en Taxonoma. Para la descripcin se observaron detalladamente al microscopio biolgico, se les hicieron micro-fotografas bajo el microscopio electrnico y se efectuaron mediciones de 30 clulas con micrmetro ocular determinndose la longitud promedio para cada especie en la fase exponencial del cultivo. Aumento progresivo de volumen. Para la determinacin de la factibilidad del cultivo de las dos especies aisladas se realizaron tres experimentos, dos de ellos siguiendo el desarrollo de las diatomeas aisladas y un tercero con una diatomea perteneciente al gnero Amphora trada del Laboratorio de Produccin de Postlarvas de Camarn AQUATEC Ltd., Rio Grande do Norte de Brasil a manera de comparacin. Para el desarrollo de los cultivos se utiliz el mtodo de aumento progresivo de volumen; partiendo de un inculo de 75 mL y aumentando progresivamente hasta 4,4 litros con aireacin e iluminacin constante, a temperatura ambiente. Comparacin de los medios de cultivo. Fueron aplicados dos tratamientos que consistieron en poner a crecer a las diatomeas en dos medios de cultivos diferentes: Medio Guillard f/2 (Guillard, 1975) y Medio A-M (Alfonso y Martnez, 1988).

La comparacin fue realizada en el ltimo paso del aumento progresivo de volumen donde se trabaj con tres rplicas en cada caso. El medio de cultivo utilizado para los pasos anteriores (75 y 800 mL) fue el Guillard f/2. El paso de un volumen a otro se hizo en la fase de crecimiento exponencial de estos cultivos para asegurar que las microalgas estuvieran en un estado fisiolgico ptimo. En la Tabla 1 se especifican las cantidades volumtricas utilizadas en cada paso del experimento. Tabla 1. Volmenes utilizados en el aumento progresivo de los cultivos.

VOLUMEN FRASCO

VOLUMEN INOCULO

VOLUMEN DE MEDIO CULTIVO

VOLUMEN TOTAL

100 mL 25 mL 50 mL 75 mL 2 litros 75 mL 725 mL 800 mL 5 litros 400 mL 4 litros 4,4 litros

La salinidad del agua para el caso de los volmenes de 75 mL y de 800 mL fue ajustada a 35 y para los de 4,4 litros (expuestos a temperatura ambiente) fue ajustada a 34, para amortiguar el aumento de la misma por evaporacin durante el transcurso del experimento Los cultivos se mantuvieron con iluminacin constante. La temperatura estuvo controlada dentro del cepario a 210C y se mantuvo un registro diario de la misma para los volmenes de 4,4 litros. El pH se registr en das alternos para los cultivos de 4,4 litros. Crecimiento de los cultivos. En estas especies de diatomeas, al ser bentnicas, resulta muy difcil conseguir una muestra homognea para cuantificar su crecimiento a travs de la numeracin directa en cmaras de conteos. Esto ha hecho que para conocer la evolucin del cultivo se haya implementado la tcnica de extraccin de pigmentos con acetona (Arredondo-Vega et al., 1997) la determinacin de la absorbancia por medio de espectrofotometra lo que permite la determinacin de las concentraciones de clorofilas a y c presentes en las diatomeas.

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La cuantificacin del crecimiento se tuvo en cuenta para la comparacin entre los dos medios de cultivo en los frascos de 4,4 litros de volumen, realizndose dos muestreos por cada rplica (seis muestreos por tratamiento) en das alternos durante una semana. A los valores de absorbancia se le aplic las frmulas propuesta por Arredondo-Vega et al. (1997) : Clorofila a = 11,43 (A 664 nm) 0.4 (A 630 nm) Clorofila c = 27.09 (A 630 nm) 3.73 (A 664 nm) para determinar las concentraciones ( g/mL) de clorofilas a y c para cada muestra por da. A los valores medios de clorofilas se les aplic una Prueba t con nivel de significacin de 0.05 para comparar las concentraciones de estos pigmentos por da de muestreo en los dos tratamientos aplicados y as conocer el comportamiento de cada especie en cada tratamiento. La cuantificacin del crecimiento se tuvo en cuenta para la comparacin entre los medios de cultivo en los frascos de 4,4 litros de volumen, tomndose dos muestras por cada rplica (seis muestras por tratamiento) en das alternos durante una semana. RESULTADOS Y DISCUSIN Aislamiento.

Como resultado del proceso de aislamiento fueron aisladas dos especies de diatomeas: Amphora cf. marina (Wm. Smith) Van Heurck 1880-1885 y Amphora cf. terroris Ehrenberg 1853 (Figs 1 y 2).

Fig 1. Amphora cf. marina (Wm. Smith) Van Heurck 1880-1885

Amphora cf. marina tiene una valva semilanceolada, margen ventral ligeramente arqueado y los pices ligeramente redondos con 13.83 m de longitud, Amphora cf. terroris tiene valva semilanceolada, margen ventral ligeramente arqueado y los pices ligeramente capitados con 18.46 m de largo.

Fig 2. Amphora cf. terroris Ehrenberg 1853

En relacin con la identificacin de las especies aisladas, no fue posible confirmar la clasificacin hasta especie, siendo nombradas Amphora cf. marina y A. cf. terroris. Al respecto, Siqueiros (1994) plantea que an cuando los taxa tienen una amplia distribucin geogrfica y temporal, a menudo resulta imposible una determinacin taxonmica completa. Esto se debe a que cada estudio debe revisar una flora particular, con variaciones morfolgicas y quizs subespecies, segn las condiciones propias de la localidad. En la mayora de los estudios son referidas solamente como grupo o en el mejor de los casos, solamente se determinan a nivel genrico. Aumento progresivo de volumen. Tanto las dos diatomeas aisladas como Amphora sp. importada de Brasil, crecieron en condiciones de cultivo en volmenes de hasta 4,4 litros, siguiendo el aumento progresivo desde tubo de ensayo. Las diatomeas aisladas manifestaron un comportamiento en cultivo similar a los que se obtienen en Brasil para Amphora sp. a travs de los pasos del aumento progresivo de volumen hasta los volmenes probados (Alfonso, comunicacin personal). Amphora sp. Los registros de temperatura para ambos tratamientos oscil entre 24 y 26 0C. Los valores de

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pH a lo largo del experimento estuvieron entre 8.38 y 8.99 para el tratamiento 1 y entre 8.17 y 8.75 para el tratamiento 2. En la Fig. 3 se muestran las curvas de concentracin de las clorofilas a y c en el tiempo. Como se puede observar las concentraciones de la clorofila a en ambos medios tienen un comportamiento muy similar durante el crecimiento del cultivo, las mismas se van incrementando en el tiempo.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1 2 3 4

Tiempo (das alternos)

Con

c (

g/m

l)

Clorofila a Guillard

Clorofila a A-M

Clorofila c Guillard

Clorofila c A-M

Fig. 3. Concentraciones de las clorofilas a y c en los medios Guillard f/2 y A-M para Amphora sp. La Tabla 2 muestra el resultado de la Prueba t para las medias de los dos medios de cultivo (Guillard y A-M) en cada da de muestreo. Tabla 2. Resultado de la Prueba t para las medias de los dos medios en cada da de muestreo.

DAS CLOROFILAS T P (UNA COLA)

a 0,25 n.s. 0,41 1ro c - 1,59 n.s. 0,09 a 3,35 ** 0,01 3ro c 1,61 n.s. 0,08 a 0,10 n.s. 0,46 5to c 0,65 n.s. 0,27 a 2,61 * 0,02 7mo c 2,89 * 0,02

A manera de resumen se puede decir que para esta especie de Amphora se van incrementando los valores de clorofila a en la medida que evoluciona el cultivo. Se encontraron diferencias entre los medios para este pigmento resultando los mayores valores de concentracin en el medio Guillard. Para la clorofila c podemos resumir que se mantiene en valores bajos durante todo el experimento tanto para un medio como para el

otro, y que de manera general no se encontraron diferencias entre los medios para las concentraciones de este pigmento excepto para el ltimo da. Amphora cf. marina Los registros de temperatura para ambos tratamientos oscilaron entre 28 y 30 0C. Los valores de pH para el tratamiento 1 estuvieron entre 8.55 y 9.46, para el tratamiento 2 fueron 8.22 y 8.76. En la Fig 4 se muestran las curvas de concentracin de las clorofilas a y c en el tiempo. Como se puede observar las concentraciones de la clorofila a en ambos medios tienen una tendencia a incrementarse en el tiempo.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1 2 3 4

Tiempo (das alternos)

Con

c (

g/m

l)

Clorofila a Guillard

Clorofila a A-M

Clorofila c Guillard

Clorofila c A-M

Fig. 4. Concentraciones de clorofilas a y c en los medios Guillard f/2 y A-M para Amphora cf. marina. Haciendo el mismo anlisis para la clorofila c vemos que de manera general tiene un comportamiento totalmente diferente a la clorofila a, se aprecia que la tendencia de las curvas a lo largo del experimento es a un decremento en las concentraciones de este pigmento correspondindose los valores ms bajos con los ltimos das de muestreo. La Tabla 3 muestra el resultado de la prueba t para las medias de los dos tratamientos (Guillard y A-M) en cada muestreo. En general, se puede decir que para esta especie de diatomea se produce en el inicio del cultivo una mayor cantidad de clorofila a en el medio de cultivo Guillard f/2que en el medio A-M, ahora bien, durante la evolucin del cultivo las mayores cantidades de clorofila a se obtienen en el medio A-

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M, aunque en ambos medios el crecimiento se evidenci de manera satisfactoria. Para la clorofila c, con concentraciones menores que la clorofila a y tendencia a disminuir en el tiempo, los mayores valores se obtuvieron en el Medio Guillard f/2en los primeros das del experimento. Tabla 3. Resultado de la Prueba t para las medias de los dos tratamientos en cada da de muestreo.

DAS CLOROFILAS T P (UNA COLA)

a 4,08 ** 0,005 1ro c 3,57 ** 0,008 a -1,41 n.s. 0,11 3ro c 2,28 *. 0,04 a -2,40 * 0,03 5to c -0,97 n.s. 0,19 a -2,81 * 0,02 7mo c -3,11 * 0,01

Amphora cf. terroris Los registros de temperatura para ambos tratamientos oscilaron entre 28 y 30 0C. Los valores de pH para el tratamiento 1 estuvieron entre 8.33 y 9.29, para el tratamiento 2 fueron 8.15 y 8.70.

La Fig. 5 nos muestra las curvas de concentracin de las clorofilas a y c en el tiempo. Las curvas de la clorofila a durante los siete das de duracin del experimento tienen un comportamiento similar ya que muestran una tendencia al incremento, claro est que una curva respecto a la otra tiene sus particularidades segn el medio de cultivo donde se desarrollaron las microalgas.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1 2 3 4

Tiempo (das alternos)

Con

c (

g/m

l)

Clorofila a Guillard

Clorofila a A-M

Clorofila c Guillard

Clorofila c A-M

Fig. 5. Concentraciones de las clorofilas a y c en los medios de cultivo Guillard f/2 y A-M para Amphora cf. terroris.

Analizando el comportamiento de la clorofila c, pigmento que se mantiene estable para ambos medios de cultivo, se encontr que los valores se mantienen en concentraciones muy bajas si se compara con los de la clorofila a para los mismos perodos de tiempo. Para esta especie no se observan diferencias significativas entre las dos curvas de la clorofila c para los medios de cultivo comparados durante los siete das de duracin del experimento. Aunque en el grfico se observa un ligero incremento de la clorofila c en los cultivos en el Medio Guillard para el sptimo da de muestreo, la prueba estadstica no arroj tampoco diferencia entre las medias ese da. La Tabla 4 muestra los resultados de la Prueba t para las medias de los dos tratamientos para cada da de muestreo. Tabla 4. Resultados de la Prueba t para las medias de los dos tratamientos para cada da de uestreo.

DAS CLOROFILAS T P (UNA

COLA) a 1,00 n.s. 0,18 1ro c 0,51 n.s, 0,31 a 8,10 ** 2,3E-04 3ro c -0,60 n.s 0,29 a -2,60 * 0,02 5to c -1,06 n.s. 0,17 a -2,59 * 0,02 7mo c 2,00 n.s. 0,05

Resumiendo, durante los primeros das de desarrollo del cultivo los mayores valores de clorofila a se encuentran en el medio Guillard y a medida que va evolucionando el cultivo los valores mayores de concentracin de clorofila a se observaron en el Medio A-M. La clorofila c, con poca variacin a travs del experimento, mostr que las concentraciones en el medio Guillard y en el A-M fueron muy similares. Una vez analizados los resultados de los tres experimentos, se considera en este trabajo que los niveles de clorofila a resultaron indicadores de crecimiento del cultivo, aunque no exista una relacin directa de la concentracin de clorofila a con la cuantificacin en trminos numricos de las clulas, es decir, no se puede establecer una relacin: concentracin de clorofila/

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concentracin celular. Se afirma que la correspondencia entre la concentracin celular y las determinaciones de la cantidad de pigmentos y otros componentes, no es constante ya que estos dependen de diferentes factores como el estado fisiolgico de la clula y la fase de crecimiento del cultivo, as como de las condiciones fsico-quimicas a que estn sometidas las clulas (Alfonso, 1999). Tambin Brown et al. (1997) ha planteado que la composicin bioqumica de las microalgas puede estar sustancialmente alterada por otras condiciones de los cultivos, tales como, la longitud de onda de la fuente de luz que se utilice y el fotoperodo al que se sometan as como por la fase de crecimiento del cultivo. Tratndose de un proceso productivo continuo y a gran escala, en nuestro pas debido a los problemas econmicos y la escases de recursos a la que se tiene que enfrentar no es prctico realizar determinaciones de pigmentos u otras tcnicas de colorimetra como fueron ejecutadas en este trabajo de investigacin para poder comparar el desarrollo de las especies en cultivo. Tampoco es prctico utilizar otras tcnicas ms sofisticadas para la dispersin de las clulas para despus contarlas, como la expuesta por Voltolina (1991) de aplicacin de ultrasonido de baja frecuencia que no daa las clulas, pero se hace incosteable a nivel comercial. Ante este reto de la cuantificacin de las microalgas bentnicas que forman grumos, consideramos que en la produccin de cultivos masivos para la alimentacin de larvas a nivel comercial el desarrollo de los mismos debe estimarse por la intensidad de la coloracin que van adquiriendo en el tiempo, realizando pruebas previas y con el correspondiente entrenamiento del cultivador, as como seguir probando e implementando nuevos mtodos que se ajusten a las necesidades reales del centro de produccin dnde sean utilizadas estas especies como alimento vivo para organismos de cultivo. Las tres especies estudiadas tuvieron un comportamiento diferente en el tiempo en las concentraciones de las clorofilas a y c,

respectivamente. Tambin se presentaron diferencias en los niveles de concentracin de ambas clorofilas entre los dos medios de cultivo utilizados. En el presente trabajo con el gnero Amphora se observ que al evolucionar el cultivo se fueron incrementando las concentraciones de clorofila a y disminuyendo las de clorofila c. Sin embargo, en un estudio realizado a una especie de diatomea planctnica, en este caso, Skeletonema costatum, se encontr que al avanzar la edad del cultivo fue decreciendo la concentracin de clorofila a, a la vez que aumentaba la de clorofila c (Castellv, 1963). Esta diferencia pudiera estar relacionada con el taxa o con las condiciones del cultivo, como pudiera ser la composicin del medio en trminos de tipos y cantidades de sus componentes, o quizs con la combinacin de estos y de otros factores. Las diferencias en los niveles de clorofila a y c que se establece como patrn en las tres especies cultivadas, as como las diferencias de cada pigmento entre los medios pueden deberse a muchos factores como son: iluminacin; composicin del medio del cultivo donde influyen tanto los componentes iniciales del mismo, como productos secundarios que se forman del propio metabolismo de las clulas; la edad del cultivo; las caractersticas de la especie en cuestin, as como la edad de la cepa en cultivo. Abalde et al. (1995) plantean que los diversos nutrientes tienen un marcado efecto sobre la formacin de clorofilas en microalgas y que deficiencias de hierro, nitrgeno y magnesio inhiben la sntesis y acumulacin de clorofila. La abundancia de carbono orgnico en el medio y la alta intensidad luminosa inhiben tambin la formacin de clorofilas en algunas microalgas. Aplicando el planteamiento anterior de Abalde et al. a este trabajo se debe considerar que algunas diferencias encontradas en las concentraciones de clorofilas en los dos medios de cultivo utilizados pudieran estar relacionadas con el hecho de que el medio Guillard contiene en su

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formulacin hierro y magnesio, mientras que el A-M slo tiene hierro como micronutriente. Guillard f/2 es mundialmente utilizado por ser un medio completo e idneo para el mantenimiento de las cepas en el laboratorio, e incluso para la produccin en grandes volmenes, mientras que el medio A-M no es tan completo como el Guillard aunque ha ofrecido buenos resultados en el crecimiento de los cultivos de diatomeas del plancton, siendo menos costoso. CONCLUSIONES

1. Las especies aisladas son factibles de cultivar en volmenes de hasta 4,4 litros, siendo viables para su uso potencial en la alimentacin de postlarvas de camarn en cultivo.

2. Tanto las dos especies aisladas como la importada de Brasil se desarrollaron exitosamente en los medios de cultivo (Guillard y A-M).

3. Las concentraciones de clorofila a tanto en el medio Guillard como en el medio A-M tienen una tendencia a aumentar a medida que envejece el cultivo, mientras que las concentraciones de clorofila c tanto en el medio Guillard como en el medio A-M tienen una tendencia a disminuir a medida que envejece el cultivo.

4. Los valores medios de concentracin de clorofila a fueron muy superiores a los de clorofila c independientemente del medio donde se cultiv.

5. Las concentraciones de clorofila a sirven como indicador para evaluar el crecimiento de estas especies, no ocurriendo lo mismo con las concentraciones de clorofila c.

AGRADECIMIENTOS Las autoras desean agradecer al Dr. Sergio Licea del Instituto de Ciencias del Mar y Limnologa de la UNAM, Mxico, el haber

realizado y facilitado las fotografas electrnicas de las especies. REFERENCIAS Abalde, J., A. Cid, P. Fidalgo, E. Torres y C. Herrero (1995): Microalgas: Cultivo y Aplicaciones. Espaa, Universidad de La Corua, Monografas 26, 210 pp. Alfonso, E. y L. Martnez (1988): Medio de cultivo para microalgas marinas. Rev. Invest. Mar. 9(1). 69-76 pp. Alfonso, E. (1999): Cultivo de Alimento Vivo: actualidad y perspectivas.Congreso NATURAMIGOS 99, Cancn, Mxico, del 24 al 27 de Junio de 1999 (Conferencia Magistral). Alfonso, E. y S. Leal (2000): Creacin y mantenimiento de un cepario de microalgas marinas. Universidad de la Habana, Centro de Investigaciones Marinas, 22 pp. Arredondo-Vega, B., B. Cordero, C. Herrero y J. Abalde (1997): Manual de tcnicas bioqumicas aplicadas a ficologa. CICESE, Universidad de la Corua, Espaa, 41 pp. Brown, M.R., S.W. Jeffrey, J.K. Volkman y G.A. Dunstan (1997): Nutritional properties of microalgae for maricuture. Aquaculture 151, pp: 315-331. Castellv, J. (1963): Pigmentos de la diatomea marina Skeletonema costatum (Grev.) en su dependencia de los factores ambientales y de la dinmica de las poblaciones. Inv. Pesq. 24:129-137. Guillard, R.R.L. (1975): Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Culture of Marine Invertebrates Animals (W.L. Smith and M.H. Chanley, eds.), pp: 29-60. Siqueiros, D. (1994): Asociaciones de Diatomeas Bentnicas Marinas; Anlisis de su estructura y aplicacin. Tpicos Selectos sobre Microalgas, Universidad Autnoma de

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Baja California Sur, Serie Cientfica. 2(1): 59-71. Voltolina, D. (1991): A Comparison of methods for the dispersion of cultures of benthic diatoms. Cryptogamie Algol. 12(3):183-187.

Aceptado: 15 de diciembre del 2003

RESULTADOS Y DISCUSINCONCLUSIONES