AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA

M I C R O B I O L O G Í A A M B I E N T A L U T L A S E S O R A :

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ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

GRUPO

QU-301

MATERIA

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

TITULO

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA

ASESORA

Dra. ROSA RICO MATA

DATOS DE IDENTIFICACIÓN DE LOS ANALISTAS

Fecha de inicio del análisis: 1 de julio de 2015

Fecha de término: 10 de julio de 2015

Nombre Cargo

Martínez Chiquito Josué Neftalí de Jesús Responsable

Felipe Florido Mauricio Iván Administrador

Macías Jasso Luz Evelia Laboratorista 1

Rea Garcia Cesar Alejandro Laboratorista 2

Laboratorista 3

GENERACIÓN: 2014-2016


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DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO

1.- Breve descripción del estatus ambiental del sitio de estudio: Planta de tratamiento de agua residual con pasto y arboles a su alrededor, ubicada cerca del laboratorio de la universidad tecnológica de león.

SITIO DE MUESTREO

Nombre Ubicación /coordenadas GPS

Imagen de mapa satelital

Universidad Tecnológica de León

Blvd. Universidad tecnológica de león #225 col san Carlos CP.37670 / 101° 34' 45.08" W, 21° 3' 43.05" N

2. Evidencia fotográfica del sitio

Fecha: 7 de Julio 2015 Hora: 15:33 hrs

Fecha: 7 de Julio 2015

Hora: 15:33 hrs

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR

1. Identificación

Matriz ambiental: Agua Hora de toma de muestra: 15:30 hrs Hora de siembra:15:32 hrs

Punto de Muestreo (ubicación /coordenadas GPS):

Planta de tratamiento / 101° 34' 57.61" W, 21° 3' 47.15" N

Tiempo de exposición (aplica solo para muestra de aire) N/A

Nombre del/ los analistas que tomaron la muestra:

Martínez Chiquito Josué Neftalí de Jesús Felipe Florido Mauricio Iván

Nombre del/ los analistas que sembró la muestra:

Martínez Chiquito Josué Neftalí de Jesús Felipe Florido Mauricio Iván

2.Parámetros Fisicoquímicos

Color: Café Temperatura (oC) ambiental: 28°C pH:7.6

Olor: Desagradable Describir condiciones climatológicas: Nublado

3. Evidencia fotográfica del sitio de toma de muestra


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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

1. Justificación del proceso para la identificación bacteriana

Es importante conocer las especies de microorganismo que participan en el proceso de la degradación de la materia orgánica en una planta de tratamiento de agua residual, con la finalidad de saber la función que estas bacterias realizan en el sitio de estudio.

2. Dos medios de siembra (Nombre y Composición)

1) Agar Mc. Conkey

Gelatina digerida por enzimas pancreáticas: 17g

Caseína digerida por enzimas pancreáticas: 1.5g

tejido animal digerida por enzimas pancreáticas: 1.5g

Lactosa: 10g

Sales biliares: 1.5g

Cloruro de sodio: 5g

Rojo neutro: 0.03g

Violeta cristal: 0.001g

Agar: 13.5g

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)

Descripción En el agar mac conkey se obtendrá, Escherichia coli, rojas con halo turbio, Klebsiella pneumoniae, rosadas mucosas, salmonella typhimurium, shigella flexneri, Proteus mirabilis, incoloras/transparentes y enterococcus faecalis, diminutas, incoloras e opacas.

Descripción Klebsiella pneumoniae; rosadas mucosas, streptococcus sp; muy pequeañs, redondeadas, blancas,en Staphylococcus aureus y streptococcus suis; se observa con la hemólisis producida por esta especie, Corybacterium pyogenes; lisas, brillatens de color amarillo a naranja, , Corybacterium; blanquisa, con el tiempo se vuelven opacas y secas

Imagen

Imagen

2) Agar sangre

Peptonas 20

Extracto de levadura 3.5

Digerido tríptico de corazón de res 3

Almidón de maíz 1

Cloruro sódico 5

Colistina 0.01

Ácido nalidixico 0.015

Agar 15

Sangre de carnero, desfibrinada 5%


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3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y Composición)

1) Agar Mc. Conkey

Gelatina digerida por enzimas pancreáticas: 17g22r

Caseína digerida por enzimas pancreáticas: 1.5g

tejido animal digerida por enzimas pancreáticas: 1.5g

Lactosa: 10g

Sales biliares: 1.5g

Cloruro de sodio: 5g

Rojo neutro: 0.03g

Violeta cristal: 0.001g

Agar: 13.5g

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)

Descripción La morfología de la Klebsiella en agar Mc Conkey , es Colonias rosas, mucosas, bordes irregulares y

convexas

Descripción La morfología de la Klebsiella en agar chocolate , es Colonias café claro, mucosas, bordes irregulares y

Convexas.

Imagen Imagen

2) Agar chocolate

Peptona de carne 5.0 g

Tripteína 12.0 g

Extracto de levadura 5.0 g

Extracto de corazón 3.0 g

Almidón soluble 1.0 g

Cloruro de sodio 5.0 g

Agar 15.0 g Sangre

ovina50 ml

Suplemento Britalex 10 ml

Agua purificada 1000 ml


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4. Procedimiento de Aislamiento (describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)

Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizar Material

2 Caja Petri 1 charola de pesado 1 Espátula 1 Matraz Erlenmeyer 1 Probeta 1 Asa de platino 1 Mechero bunsen

Preparación de medios de cultivo: 1) Pesar aproximadamente 1.5g de agar Mc Conkey en una charola de pesado. 2) En un matraz Erlenmeyer disolver 1.5g de agar mc conkey en 30 mL de agua destilada. 3) Someter el matraz Erlenmeyer a esterilización en la autoclave a 115 ° C durante 15 min. 4) Dejar el matraz Erlenmeyer enfriar a una temperatura que se pueda soportar para el uso inmediato. 5) En la campana de flujo laminar verter el agar Mac Conkey en una caja Petri estéril. 6) Dejar solidificar para su uso. Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, selección de la colonia y resiembra): Siembra

1. Seleccionar el lugar a analizar, del cual se tomara la muestra. 2. Se realizara una asada con un asa previamente esterilizada en el sitio de estudio. 3. Se abrirá cuidadosamente la caja Petri, tratando de abrirla lo menos posible, en la caja Petri con el medio de

cultivo, se esparcirá el contenido de la asa en la caja Petri, e inmediatamente se cerrara. Selección de la colonia

1. Para la selección de la colonia, se escogerá una la cual este separada de las demás. 2. En la parte de debajo de la caja Petri señalar la colonia que se escogió para evitar confusión.

Resiembra 1. Dividir en cuadrantes el medio de cultivo puro de aislamiento dependiendo el número de colonias que se

desea aislar de las demás. 2. Encender un mechero bunsen y abrir la caja Petri cerca de la llama 3. Con un asa estéril recolectar la colonia seleccionada. 4. Cerrar la caja Petri 5. Resembrar en el nuevo medio de cultivo. 6. Extender formando estrías (ver figura 1) sobre la superficie del

medio selectivo. 7. Esterilizar un asa de platino con el mechero bunsen. 8. De la última estría realizada tomar una pequeña parte y extender

formando estrías sobre la superficie de otro sector del medio selectivo (Repetir dependiendo el número de sectores en el que se

dividió la caja Petri).

(Figura 1) técnica de estriado

Equipo

1 Autoclave

1 Campana de flujo

laminar

1 Balanza analítica

Reactivos

1 Agar Mac Conkey


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5. Esquema del Perfil bioquímico (metabólico ) para la identificación del microorganismo seleccionado

Bacterias

Motilidad

Catalasa

+

-

TSI

Tinción de Gram

A/A: Fermentación 3 azucares

K/A: Fermentación de la glucosa

K/K: No hay fermentación de los 3

Precipitado negro: Formación H2S

Rojo de metilo

Tinción Hiss

Tinción negativa

+ -

Capsula

- +

Citrato Indol


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RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)

Crecimiento bacteriano a las 24 hrs de la siembra en agar Agar Mac conkey.

Segunda foto del crecimiento bacteriano a las 24 hrs de la siembra en agar Agar Mac conkey.

2. MORFOLOGÍA COLONIAL OBSERVADA Tipo de colonia 1: Descripción

En esta imagen se puede apreciar un agar con una base de color rosa fuerte esférica y de color rosa claro con textura o viscosa.

FOTO 1

Tipo de colonia 2: Descripción

En esta imagen se puede aprecia una colonia de una textura lisa, de un color diferente a las demás colias que se encuentran en la caja Petri, se puede notar que esa siembra se desvanece.

FOTO 2

Tipo de colonia 3: Descripción

En esta imagen se puede apreciar colonias con una morfología de bordes irregulares y de color rosa claro con textura mucosa o viscosa y convexa.

FOTO 3


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3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO (RESIEMBRA)

FOTO 1

Resultado de la siembra la cual se usara para la resiembra en agar Mc Conkey

FOTO 2

Resultado de la resiembra en agar Mc Conkey

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

Descripción

En esta imagen se puede apreciar colonias con una morfología de bordes irregulares, esférica y de color rosa claro con textura mucosa o viscosa y convexas de acuerdo a las propiedades del agar y de las características de la siembra se espera presuntivamente Klebsiella pneumoniae o Escherichia coli

FOTO 1

FOTO 2

FOTO 3


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5. EVIDENCIA FOTOGRÁFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUÍMICO

Nombre de la

prueba Medio de cultivo

utilizado Resultado obtenido

(positivo/negativo)

Evidencia fotográfica

1.-

Tinción de Gram

N/A

Negativo

Fundamento de la prueba

Prueba con la que es posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen los cuales tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya desprendido. En el primer caso permanecería el color morado, y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un color rosado, y serían Gram negativas.

2.-

Motilidad

Medio SIM

Negativo


Permite determinar la capacidad de movimiento por parte de un microorganismo. La formación de desarrollo de turbidez hacia los lados de la estría de inoculación indica motilidad positiva.


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3.-

Capsula

N/A

Positivo


La capsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales, consiste en una acumulación de material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular. La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

4.-

Citrato

Citrato de Simmons

Positivo


Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. El medio incluye citrato de sodio, un anión como fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimático si la intervención de la coenzima A. esta enzima se denomina citrasa o citrato desmolasa. C4H4O5+ C4H6O2 C3H4O3 + CO2 PIRUVATO ACETATO + LACTATO + CO2

pH básico:

citrato CO2+ CH2O2+ 2 C2H4O2

pH acido:

2 piruvato acetato+ CO2+ lactato

2 piruvato acetoína+ 2CO2

C4H4O5: Ácido oxaloacético

C4H6O2: Ácido metacrilico

C3H4O3 : Ácido pirúvico


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5.-

Fermentación alcohólica / Voges-Proskauer (VP)

Caldo RM/VP

Negativo


Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final neutro (acetoina y 2,3 Butanodiol) a partir de la fermentación d ela glucosa. Los productos neutros formados en la presencia de oxigeno atmosférico, alcalisis (Hidróxido de Potasio al 40%) y peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el color producido en la reacción. El Alfa naftol actúa como catalizador para revelar un complejo color rojo.

6.-

Indol

Medio SIM

Negativo


EL indol es uno de los productos de la degradación del aminoácido triptófano que se encuentran en los caldos de triptona; por su base nutritiva, permite el desarrollo de diversas especies bacterianas, además debido a su alto contenido de triptofano, es un buen sustrato. El reactivo de Kovacs para detectar la producción de indol, producido debido a la fermentación de las bacterias con el medio lactosado. H2O+triptófano indol+ acido pirúvico+NH3


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7.-

Fermentación de glucosa / Rojo de metilo

Caldo RM/VP

Positivo


Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la producción de ácido( La formación de acetoína y butilenglicol es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico). La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la concentración de iones hidrógeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa (figura 2).

8.-

Catalasa

N/A

Negativo


La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva. 2H2O2 2H2O + O2

Figura 2. Fermentación de glucosa


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9.-

Detección de Sulfuro

Medio SIM

Negativo


La proteolisis de las proteínas en aminoácidos (aa.) individuales, algunas especies bacterianas son capaces de liberar azufre enzimáticamente de los diferentes aa. Que las contienen, produciendo el gas ácido sulfhídrico (SH2). La peptona, cisteína y tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o aa. que contienen azufre para producir SH2. La enzima responsable de ésta actividad es la cisteinasa. Primera etapa: La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. Este es un proceso de respiración anaeróbica donde el átomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidación de los sustratos orgánicos. El tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una fuente de azufre para el organismo. Segunda etapa: El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfuro ferroso. Bacteria (medio ácido) + tiosulfato de sodio gas SH2

SH2 + iones férricos sulfuro ferroso (pp. negro)


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10.-

Fermentación de glucosa

Fermentación de lactosa

Fermentación de sacarosa

Producción de ácido sulfhídrico

Triple azúcar de hierro

A/A


Utilización de glucosa sola: Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una reacción alcalina en la superficie (roja) sobre un fondo ácido (amarillo, k/a) debido a que realizan una degradación aeróbica de la glucosa en la superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18 a 24 horas de incubación como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberación de amoniaco y produciendo un pH alcalino (rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxígeno, se realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH ácido (amarillo). Utilización de lactosa y/o sacarosa: Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reacción ácida en la superficie (amarilla) y ácida en el fondo (amarilla, a/a). En este caso después de 18 a 24 hrs como la concentración de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces más que la de la glucosa presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo como en la superficie. En el caso de usar sacarosa la reacción sería la misma. Producción de ácido sulfhídrico: La producción de H2S se manifiesta por la aparición de un precipitado color negro debido a la reducción de la sal de hierro presente en el medio. Fermentaciones: Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K/K). No fermentación de hidratos de carbono. Característico de bacterias no fermentadoras como Pseudomonas aeruginosa. Pico de flauta alcalino / profundidad ácida (K/A). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada. Característico de bacterias no fermentadoras de lactosa como especies de Shigella. Pico de flauta alcalino / profundidad ácida (negra) (K/A/H2S). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada; producción de H2S. Característico de bacterias no fermentadoras de lactosa y productoras de H2S como: Salmonella, Arizona, Citrobacter y algunas especies de Proteus.y. Pico de flauta ácido / profundidad ácida (A/A). Glucosa y lactosa fermentadas. Característico de coliformes que fermentan lactosa como: Escherichia coli y grupo Klebsiella- Enterobacter. Anaranjado (color inicial del medio) a amarillo indica fermentación.


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Reacciones: Lactosa glucosa + galactosa Glucosa o galactosa CO2+H2O+energia anaerobio

s. El cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del medio) a amarillo indica

fermentación. Si se fermenta únicamente la glucosa el cambio de color del medio ocurre

solamente en el fondo debido a

Beta galactosidasa

Ciclo de krebs


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IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: ____________Agua___________________________

1.- Nombre científico del o los microorganismo identificado de acuerdo a los resultados del perfil bioquímico planteado ( genero y especie)

Klebsiella pneumoniae

2. Taxonomía del o los microorganismo identificados

Reino: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Gammaproteobacteria Orden: Enterobacteriales Familia: Enterobacteriaceae Género: Klebsiella Especie: K. pneumoniae

3. Características generales

Forma parte de las enterobacterias, son bacilos, Gram (-) negativos, son bacterias oportunistas, facultativos anaerobios, se reproducen mejor entre 30°C y 37°C. Tienen la enzima catalasa, ureasa, fermenta muchos carbohídratos como la lactosa, por lo tanto son capaces de formar ácidos fuertes en sus procesos metabólicos. Son bacterias de la flora normal gastrointestinal, se puede encontrar en humanos, caballos, cerdos, vacas, entre otros, principalmente en nasofaringe, tracto gastrointestinal, en las heces. También está presente de forma natural en muchos ambientes acuáticos y puede multiplicarse y alcanzar concentraciones elevadas en aguas ricas en nutrientes, como residuos de fábricas de papel, plantas de acabado textiles y operaciones de procesado de caña de azúcar. Estos microorganismos pueden proliferar en sistemas de distribución de agua, y se sabe que colonizan las arandelas de los grifos. También son excretados en las heces de muchas personas y animales sanos, y se detectan con facilidad en aguas contaminadas por aguas residuales

4. Ciclo(s) biogeoquímicos en el(los) que intervienen

Ciclo del nitrógeno

5. La función que juegan en la transformación de la materia orgánica a través

de los ciclos biogeoquímicos

En el ciclo del nitrógeno los organismos diazotrofos el cual se divide en tres grupos, y uno de esos grupos son las bacterias Gram negativas donde encontramos a microorganismos del genero klebsiella los cuales se encarga en la fijación biología del nitrógeno, debido a la habilidad metabólica que tiene para tomar el N2 y reducirlo a nitrógeno orgánico. La fijación biológica del nitrógeno atmosférico, consistente en la reducción de N2 a NH4

+ por la enzima nitrogenasa, es, después de la fotosíntesis, la ruta metabólica más importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera. Curiosamente, este proceso crucial sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos grupos de seres vivos, todos ellos procariotas (Sprent J. y Sprent P., 1990).


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Cabe destacar el beneficio de la Klebsiella pneumoniae en los suelos, gracias a la fijación del nitrógeno, el cual es necesario para el procesamiento de proteínas en raíces y suelos, separando los átomos de nitrógenos convirtiendo dos átomos separados de nitrógeno N1 cada átomo de N1 se junta con tres átomos de hidrogeno, volviendo se amoniaco y luego amonio, después las bacterias nitrificantes procesan el amonio oxidándolo a nitritos y luego en nitratos para poder ser absorbidos por las plantas.

6. Conclusión parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz estudiada y la importancia de la microbiología en el área ambiental

En estas pruebas microbiológicas realizadas en una muestra de agua se puede deducir la importancia de las pruebas bioquímicas, ya que cada microorganismo tiene un perfil específico, el cual se identifica mediante la implementación de estas pruebas. En casos como el nuestro donde se busca una bacteria en particular, es fundamental llevar a cabo una marcha bioquímica para conocer sus características y si no es así por medio de una investigación e interpretación de resultados se puede deducir una bacteria que pueda coincidir con los resultados obtenidos. Como impacto ambiental hay una gran variedad de microorganismos existentes en la matriz de agua, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, salmonella typhimurium, shigella flexneri, Proteus mirabilis, y enterococcus faecalis, que pueden crecer en diferentes caldos. Es importante tener en cuenta se encuentran microorganismos patógenos que son muy peligroso al contacto humano ya que promueven enfermedades. En los suelos agrícolas la klebsiella es útil para el procesamiento de proteínas en raíces y suelos, ya que esta bacteria es de gran beneficio ya que funciona como bacteria nitrificante, a causa de la fijación del nitrógeno que realiza en los suelos, separando los átomos de nitrógenos que es procesado en nitritos y luego en nitratos para poder ser absorbidos por las plantas y así estas procesar las proteínas que necesitan para su desarrollo

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA

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