Aislamiento y Caracterizacion de Hongos Nativos Con Capacidad Biotransformadora Sobre Cbr
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1 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE HONGOS NATIVOS CON CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA, SOBRE CARBON DE BAJO RANGO DE LA MINA “EL CERREJON” (LA GUAJIRA COLOMBIA). TRABAJO DE GRADO PILAR VANESA SALAS CORREA UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR TRABAJO DE GRADO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA VALLEDUPAR-CESAR 2010
Transcript of Aislamiento y Caracterizacion de Hongos Nativos Con Capacidad Biotransformadora Sobre Cbr
1
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE HONGOS NATIVOS CON
CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA, SOBRE CARBON DE BAJO
RANGO DE LA MINA “EL CERREJON” (LA GUAJIRA COLOMBIA).
TRABAJO DE GRADO
PILAR VANESA SALAS CORREA
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR
TRABAJO DE GRADO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA
VALLEDUPAR-CESAR
2010
2
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE HONGOS NATIVOS CON
CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA, SOBRE CARBON DE BAJO
RANGO DE LA MINA “EL CERREJON” (LA GUAJIRA COLOMBIA).
TRABAJO DE GRADO
PILAR VANESA SALAS CORREA
NELSON VALERO VALERO
Biólogo, M.sc Microbiología
ASESOR TECNICO Y METODOLOGICO
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR
TRABAJO DE GRADO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA
VALLEDUPAR-CESAR
2010
3
NOTA DE ACEPTACIÓN
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------------------------------------------------------------ Firma del presidente del jurado
------------------------------------------------------------ Firma del jurado
------------------------------------------------------------ Firma del jurado
Valledupar, Mayo 12, 2010
4
El presente trabajo se llevó a cabo dentro del desarrollo del proyecto de
investigación “Evaluación de carbones meteorizados generados en el
Cerrejón para su aprovechamiento como materia prima en la elaboración
de enmiendas orgánicas” Financiado por Carbones del Cerrejón Limited
y Colciencias, mediante convenio RC- 591 -2008 (Colciencias – Carbones
del Cerrejón- Universidad Popular del Cesar). Investigación desarrollada
por el grupo de investigación en microbiología agrícola y ambiental de la
Universidad Popular del Cesar.
5
DEDICATORIA
Al único ser capaz de entregar tantas bendiciones en una sola vida, Dios.
Gracias por ser y mostrarme tu omnipresencia, por llenarme de tus
bendiciones y tu protección. Por ser mi fuerza y descanso…
A mi madre Pilar Correa Maldonado y mi hermano quienes me han dado
todo su apoyo, confianza y amor, Para ser el motivo de mí luchar.
A mi padre Horacio Salas Carrasquilla que siempre está a mi lado,
aunque ya no lo pueda ver. A mi familia Correa Maldonado, por las
enseñanzas y apoyo.
A estas personas tan especiales en estos 3 últimos años que construyen
y forman parte en mi vida diaria con su apoyo y su presencia constante:
Arleth Caballero, Damián Orozco, Zulay Barrios, Isauro Alemán, Mildrys
Martínez incondicionales siempre. A mi compañero de bromas en los
laboratorios Yesid Almanza.
A Julián Ruiz por su apoyo constante, confianza y cuidado. Por poder
contar contigo siempre. Gracias por todo tu cariño y protección a pesar de
las circunstancias adversas.
A mis compañeros y amigos de batalla Manuel Pantoja Guerra y Karina
Fuentes con quienes compartí el trascurrir de mi carrera, a ellos
agradezco todos sus consejos, risas, preocupaciones y su amistad
sincera. Doy inmensas gracias a pesar de la distancia mi mejor amigo y
hermano Luis Carlos Aguilar, con quien forje una amistad inigualable,
gracias por estar en los mejores y en los momentos tristes de mi vida, tú y
tu familia hacen parte de lo que hoy soy y de lo que he logrado.
Erick Guevara, mil gracias por tu siempre confianza en mí y tu apoyo
veinticuatro siete…
A mi Alma Mater humilde pero llena de superación: Universidad Popular
del Cesar…
“Las gracias no bastarán, solamente mi vida pagará todas las
bendiciones”
6
AGRADECIMIENTOS
Carbones del Cerrejón Limited por la financiación
Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación
Colciencias por la financiación
Grupo de investigación en microbiología agrícola y ambiental
Universidad Popular del Cesar
Laboratorio de microbiología agrícola y ambiental, Laboratorio de
ingeniería ambiental y al profesor Luis Francisco Ramírez por
prestar las instalaciones.
A los Profesores Aracely García Cuan y Nelson Valero Valero
A los investigadores Luz Nidia Rodríguez, Liliana Gómez y Eric
Guevara.
Al grupo de investigación en microbiología Agrícola y Ambiental.
7
CONTENIDO
pág.
RESUMEN 13
ABSTRAC 15
INTRODUCCIO 17
PLANTEAMIENTO DE INVESTIGACION 19
2. JUSTIFICACION 21
3. OBJETIVOS 23
3.1 OBJETIVO GENERAL 23
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 23
4. MARCO TEORICO 24
4.1 GENERALIDADES Y NATURALEZA DEL CARBON 24
4.1.1 CARBON 24
4.1.2 CARBON DE BAJO RANGO 26
4.2 TRANSFORMACION MICROBIANA DEL CARBON DE
BAJO RANGO
28
4.2.1 MECANISMOS DE BIOTRANSFORMACION DEL
CARBON
31
5. METODOLOGIA 34
5.1 MUESTREO 43
5.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 43
5.2.1 AISLAMIENTO 43
5.2.1.1 TECNICA 1: Enriquecimiento en medio de cultivo liquido. 44
5.2.1.2 TECNICA 2: Inoculación de diluciones seriadas en agua
peptonada directamente de la muestra.
44
5.2.1.3 TECNICA 3: Inoculación directa de partículas de las
muestras (método impronta)
44
5.2.2 IDENTIFICACION DE LOS MORFOTIPOS FUNGICOS 45
5.3 PRUEBA CUALITATIVA DE SOLUBILIZACION DE 46
8
CARBON EN MEDIO SOLIDO
5.4 DETERMINACION DE SUSTANCIAS HUMICAS EN
MUESTRAS DE CARBON METEORIZADO PROCEDENTE
DEL CERREJON
46
6. RESULTADOS Y DISCUSION 48
6.1 AISLAMIENTO 48
6.1.1 SELECCIÓN Y DESCRIPCION DE MORFOTIPOS
FUNGICOS
53
6.2 SOLUBILIZACION DE CARBON EN MEDIO SOLIDO 54
6.3 EXTRACCION DE SUSTANCIAS HUMICAS A PARTIR DE
CARBON METEORIZADO DEL CERREJON
60
7. CONCLUSIONES 61
8. RECOMENDACIONES 63
BIBLIOGRAFIA 64
ANEXOS 72
9
LISTA DE GRAFICOS Y TABLAS
pág.
TABLA 1. Hongos reportados con capacidad biotransformadora
de carbones de bajo rango.
29
TABLA 2. Número de morfotipos fúngicos aislados por en
relación a las técnicas de aislamiento ensayadas.
48
GRAFICO 1. Número de morfotipos fúngicos aislados en
relación a las muestras y las técnicas de aislamiento
ensayadas.
49
GRAFICO 2. Porcentaje de morfotipos fúngicos aislados en
relación
a las muestras procesadas.
51
TABLA 3. Actividad biotransformadora y referencias de las 37
cepas obtenidas a partir del aislamiento en Medio agar Carbón.
58
10
LISTA DE FIGURAS
pág. Fig. 1 Carbonificación, diagénesis y metamorfismo 25
Fig. 2 Localización mina El Cerrejón, tajo “Patilla” manto
cuarenta
de la mina el Cerrejón
36
Fig. 3. Muestra 1. a) Tajo Patilla, b) Manto 40 y c) Muestra de
carbón
37
Fig. 4 Muestra 2: Zona de recolección de muestra SC00111.
Fig. 4b: Acercamiento de la recolección de la muestra de suelo
conservado.
37
Fig. 5 Muestra 3: Muestra del interior de un tronco. 38
Fig. 6 Muestra 4: Área de suelo deforestado por excavación. 38
Fig. 7 Muestra 5: Área de suelo de Banco. 39
Fig. 8 Muestra 6: Área de suelo de Rizósfera en proceso de
Rehabilitación
39
Fig. 9 Muestra 7: Área de suelo rehabilitado. 40
Fig. 10Muestra 8: Suelo con área de botadero 40
Fig. 11 Muestra 9: Patio de almacenamiento de carbón. 11a
submuestra SC00621. Y 11b submuestra SC00611
41
Fig. 12 Muestra10: Muestra de lodo carbonoso. 42
Fig. 13 Muestra 11: Pila de carbón que es lavado. b. Gramíneas
creciendo sobre lodo carbonoso
42
Fig. 14 Montaje de la técnica Impronta para el aislamiento de
hongos
a partir de las muestras
45
Fig. 15 Cultivo por enriquecimiento. Desarrollo de
actinomicetos inhibiendo crecimiento de morfotipos fúngicos.
50
Fig. 16 Crecimiento de las cepas aisladas en MCM: a)
abundante,
54
11
b) medio
Fig. 17 Utilización de las partículas de carbón morfotipo HC23:
Cladosporium sp.
55
Fig. 18 Utilización de las partículas de carbón morfotipo HC25:
Mucor sp.
55
Fig. 19 Utilización y Solubilización de partículas de carbón, (Cs2
carbon tipo 2, Trat: seco) por morfotipo HC09: Paecilomyces sp.
56
Fig. 20 Solubilización de partículas de carbón, (carbón tipo 2,
Trat: seco) por morfotipo HC27 (Trichoderma sp.).
56
12
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo1: Análisis próximo, último, mineral y elementos traza de
carbón oxidado o de bajo rango extraído de la mina El cerrejón
– Guajira
73
ANEXO 2: Descripción de los morfotipos fúngicos aislados a
partir del crecimiento en Medio selectivo con Carbón.
75
13
RESUMEN
En el proceso de minería de carbón a cielo abierto se producen y
acumulan altas cantidades de carbones de bajo rango (CBR), una
importante característica de estos materiales es su naturaleza orgánica, lo
que hace posible que bajo ciertas condiciones puedan ser susceptibles al
ataque de ciertos hongos y bacterias, esta característica puede
aprovecharse para potenciar la producción de sustancias orgánicas
solubles útiles como acondicionadores en suelos deteriorados. A nivel
internacional es bien conocida y documentada la transformación de
carbón mediada por microorganismos, sin embargo a nivel nacional no se
ha investigado en este tema. Teniendo en cuenta el anterior contexto, se
desarrollo el presente trabajo cuyo propósito central fue la búsqueda y
evaluación del potencial metabólico de hongos nativos con capacidad
biotransformadora CBR generados en la mina “El Cerrejón”. El trabajo se
desarrollo en 3 etapas: aislamiento de hongos nativos a partir de
muestras de suelo influenciados por la presencia de carbón, identificación
y caracterización de hongos capaces de crecer en un medio de cultivo
con CBR como única fuente de carbono y finalmente evaluación de la
actividad biotrasformadora de carbón (ABC). Se obtuvieron 137
morfotipos de hongos con ABC a partir de 11 muestras de carbón y suelo
influenciado por residuos de carbón, de los cuales 37 géneros de hongos
presentaron buen crecimiento en el agar carbón, 3 de estos hongos
lograron solubilizar partículas de carbón, con producción de sustancias
líquidas de color marón semejantes a las sustancias húmicas. A partir de
lo anterior se seleccionaron las cepas que presentaron mejor utilización y
solubilización del carbón, el morfotipo HC27 correspondiente a
Trichoderma sp., HC09: Paecilomyces sp., y HC19: Penicillium sp. Dentro
de este contexto la investigación logro demostrar que en zonas
influenciadas por la extracción de Carbón, en el área geografía el
Cerrejón, existen hongos nativos con capacidad biotransformadora de
14
carbones de bajo rango, utilizables para procesos de extracción de
sustancias húmicas aplicables al mercado de enmiendas orgánicas.
Palabras claves: Carbón de bajo rango, sustancias húmicas,
microorganismos, utilización, Solubilización.
15
ABSTRAC
In the process of extracting coal open pit mines are produced and
accumulate high amounts of low rank coals (CBR), an important
feature of these materials is their organic nature, which makes it
possible that under certain conditions may be susceptible to attack
by certain fungi and bacteria, this feature can be used to boost the
production of soluble organic substances in soil conditioners useful
as damaged. At the international level is well known and
documented the transformation of coal by microorganisms, but
nationally has not been investigated in this topic. Considering the
above context, this paper was developed, whose main objective was
the search and evaluation of the metabolic potential of native fungi
biotransformed CBR capacity generated in the mine "The Cerrejon.
The work took place in 3 stages: isolation of native fungi from soil
samples influenced by the presence of carbon, identification and
characterization of fungi capable of growing in a culture medium with
CBR as the sole source of carbon and finally assessment
biotrasformadora activity of carbon (ABC). Through three different
techniques of isolation were 137 fungal morphotypes with ABC, from
11 samples of soil influenced by coal and coal waste, of which 37
genera of fungi showed good growth in the Coal Agar, 3 of these
fungi were able to solubilize coal particles, producing color liquid
substances Maron like humic substances. From the above were
selected strains showed better solubilization of coal use and the
morphotype HC27: Trichoderma sp., HC09: Paecilomyces sp., And
HC19: Penicillium sp. Within this context, research can show that in
areas influenced by coal mining in the area the Cerrejón geography,
native fungi are capable biotransformations low rank coals, usable
16
and extraction of humic substances amendments applicable to the
markets organic.
17
INTRODUCCION
El carbón es un combustible fósil de consistencia sólida, su proceso de
formación constituye una fosilización incompleta puesto que su estructura
es básicamente materia orgánica. La extracción de carbón ha sido de
gran importancia desde hace muchos siglos, con el inicio de la revolución
industrial su uso se elevó al ser utilizado como fuente de energía, dada la
disminución de reservas de petróleo y gas natural, sin embargo, las
aplicaciones sugieren que se puede ir más allá del procesamiento de
metales y producción de químicos, el uso y desarrollo de mecanismos
para transformar el carbón desde su forma nativa hasta productos
gaseosos o líquidos, a través de una vía no contaminante y
económicamente factible. El diseño de nuevos procesos de conversión,
especialmente para carbones que presenten bajo poder calorífico
requiere de conocimiento frente a las condiciones orgánicas, las vías por
medio de las cuales se puede llevar a cabo la transformación y las
propiedades del carbón, que dependen del grado de Carbonificación lo
que determinara el uso más eficiente.
Numerosos estudios han demostrado que los carbones de bajo rango,
son un importante material para la obtención de sustancias húmicas,
compuestos de gran importancia para la agricultura utilizados como
abonos de origen natural. Las sustancias húmicas juegan un papel
primordial en la fijación de nutrientes en suelos disponibles para las
plantas, son responsables por la agregación de las partículas de suelo,
contribuyen notablemente como agentes químicos en la meteorización de
rocas, ayudan en la transferencia de micronutrientes del suelo de la planta
y como coadyudantes en procesos de fitorremediacion. Diferentes
estudios han evaluado el potencial del uso de carbón para la obtención
industrial de estos compuestos, se ha probado el uso de tratamientos
químicos con agentes oxidantes como ácido nítrico, peróxido de
18
hidrógeno y permanganato de potasio. Alternativamente, otras
investigaciones han recopilado numerosas experiencias en procesos de
transformación biológica del carbón mediante la actividad
biotransformadora de hongos y bacterias, proceso viable debido al
contenido orgánico, presencia de espacios porosos, contenido de
elementos importantes para la nutrición y principalmente su origen a partir
de material vegetal.
Lo anterior hace posible que el carbón sea un sustrato para la
colonización y crecimiento por parte de microorganismos cuya capacidad
metabólica haga posible utilizarlo como fuete de energía y alimento.
19
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACION
El carbón es uno de los recursos más importantes en la economía del
país, específicamente el Cesar y la Guajira, su extracción se realiza a
gran escala, esta actividad genera grandes cantidades de carbón
comercial de alto poder calorífico, sin embargo, al realizarse el proceso de
extracción, se producen y acumulan cantidades significativas de un tipo
de carbón con bajo poder calorífico, conocido como carbón de bajo rango.
Se estima en Colombia una producción anual de 49.5 millones de
toneladas de carbón, de las cuales se exportan 45.6, es decir 3.9 millones
de toneladas de carbón, no se exportan debido a su baja calidad y otros
factores (Ministerio de Minas y Energía, INGEOMINAS, 2007). Este
carbón es entonces considerado como un subproducto a partir del cual se
podrían generar usos alternos con valores agregados.
A nivel mundial se han explorado diferentes vías de aprovechamiento de
estos materiales, por una parte esta ampliamente documentada la
presencia de altos porcentajes de sustancias húmicas en carbón de bajo
rango, de tal forma que las sustancias húmicas extraídas químicamente a
partir del carbón constituyen gran parte del mercado de abonos y
enmiendas orgánicas para la agricultura y el manejo de suelos
deteriorados. (Senesi, 1996; Chassapis, 2008).
Se han demostrado procesos de transformación biológica de carbón
de bajo rango por medio de diferentes hongos y bacterias que actúan
sobre el carbón como sustrato y liberan fracciones solubles, entre las que
se encuentran sustancias húmicas. Esta aproximación ha motivado el
estudio en torno a procesos biotecnológicos que conlleven a la
conversión del carbón en productos de valor agregado que
posteriormente puedan ser utilizados en síntesis biotecnológica. (Martin
20
et al, 2004). Desde comienzos de los años 80 se ha investigado la
biotransformación del carbón mediada por hongos y bacterias, se han
dilucidado algunos de los mecanismos bioquímicos y factores que
favorecen el proceso. Fakoussa, (1981) fue el primero que reporto la
actividad de ciertos microorganismos capaces de utilizar carbones
bituminosos de Alemania, Cohen y Gabriele (1982) demostraron por
primera vez que los hongos basidiomicetes (Polyporus versicolor y Poria
montícola) tienen la capacidad de degradar carbón (lignito triturado) en
medios mínimos, adicionando lignito como única fuente de carbono. Años
más tarde el reporte de hongos con capacidad biotransformadora de
carbón aumento, deuteromicetes como Penicillium sp. Asperguillus sp.
(Stewart, 1990); Fusarium sp., (Hölker et al. 1995) Neurospora sp., (Patel
et al., 1996), Paecilomyces sp. (Ward 1985, Scott et al. 1986),
Trichoderma sp., (Hölker et al. 1997) y zigomycetes como Mucor sp.
(Ward 1995).
Teniendo en cuenta el anterior contexto y bajo el marco de la magnitud de
la minería del carbón en la región del Cesar y la Guajira, se plantean
interrogantes que direccionan el desarrollo de investigación básica en
estos aspectos en Colombia. En el presente trabajo de investigación se
aborda la existencia de microorganismos nativos en áreas influenciadas
por la extracción carbonífera, los cuales posiblemente presenten
actividad biotransformadora del carbón. Por tal razón es necesario iniciar
trabajos básicos de bioprospección para determinar el potencial de uso
de la microbiota nativa para el aprovechamiento de carbones de bajo
rango. Así se plantea la siguiente pregunta de investigación:
¿En zonas influenciadas por la extracción de Carbón, en el área
biogeográfica del “Cerrejón”, existen hongos nativos con capacidad
biotransformadora de carbones de bajo rango?
21
2. JUSTIFICACIÓN
En la actualidad la extracción y uso de carbón mineral representa un
importante factor para la economía energética de muchos países.
Colombia es un importante productor y exportador de este recurso
(Calderón, 2008).
Para la obtención de carbón mineral en Colombia se utilizan como
mecanismos de extracción la minería de socavones y la remoción de
suelo a cielo abierto, este último es método de explotación utilizado en la
mina “El Cerrejón” en el departamento de La Guajira (Calderón, 2008).
El carbón meteorizado se localiza en los mantos más superficiales, de tal
manera que para extraer el carbón de alto rango que se encuentra a
mayor profundidad es necesario remover también los mantos superiores,
generando así el carbón de bajo rango o meteorizado como subproducto.
A nivel mundial es común el uso de carbones de bajo rango como materia
prima para la obtención de sustancias húmicas mediante la extracción
con álcali lo cual ha conllevado a una dinámica significativa en la
producción y comercialización de extractos húmicos para aplicaciones en
agricultura (Giannouli et al 2008). A pesar del importante papel de las
sustancias húmicas para el manejo sostenible del suelo, sumado al
importante contenido de este tipo de sustancias reportado en la mayoría
de carbones residuales de bajo rango (hasta un 60%) y la actividad de
biosolubilización por parte de ciertos microorganismos transformadores de
materia orgánica del suelo, no se ha investigado la posibilidad de
biotransformación del carbón en el suelo, mediada por microorganismos
con la consecuente liberación de sustancias húmicas; hecho que puede
constituir una estrategia en procesos de rehabilitación de suelos
22
degradados o el mejoramiento de la fertilidad en aquellos que presenten
bajo contenido de materia orgánica.
Por lo anterior y con la intención de buscar un aprovechamiento biológico
de este tipo de residuos de la minería el carbón en Colombia, se hace
necesario y conveniente iniciar estudios básicos de aislamiento y
caracterización de microorganismos con capacidad biotransformadora de
carbón, generando las bases de futuras investigaciones que lleven a una
evaluación más selectiva de microorganismos biotransformadores, que
puedan ser objeto de desarrollos biotecnológicos para aplicaciones a nivel
de campo, para mejorar el contenido de materia orgánica en suelos
deteriorados por manejo agrícola inadecuado, suelos afectados por la
explotación minera o suelos en proceso de rehabilitación. Principalmente
en la región del Caribe seco colombiano, donde la mayoría de los suelos
presentan cierto grado de deterioro y donde además se desarrolla la
mayor actividad de la minería del carbón
23
3. OBJETIVOS:
3.1 GENERAL
Aislar y caracterizar hongos con capacidad transformadora de carbón de
bajo rango generado en la mina “El Cerrejón” Guajira.
3.2 ESPECIFICOS
Desarrollar técnicas de aislamiento microbiano, que permitan la
recuperación de hongos nativos con capacidad transformadora de
carbón de bajo rango.
Identificar hongos aislados a partir de carbón de bajo rango y
muestras ambientales de suelo adyacente a mantos carboníferos y
suelos con material vegetal en descomposición.
Realizar ensayos cualitativos respecto a la transformación de
carbón de bajo rango, mediada por los hongos aislados.
24
4. MARCO TEORICO
4.1 GENERALIDADES Y NATURALEZA DEL CARBON:
4.1.1 CARBON
El carbón es un combustible fósil de consistencia sólida y de color oscuro,
su formación data de la era carbonífera (entre 280 y 345 millones de años
aproximadamente), su proceso de formación constituye una fosilización
incompleta; su estructura es básicamente materia orgánica. (World Coal
Institute, 2005).
El carbón se formó a partir de material vegetal maderable que se
encontraba junto a cuerpos de agua o zonas litorales. En la evolución del
planeta se presentaron cataclismos y fenómenos naturales, que incidieron
en el cubrimiento de esta gran cantidad de material vegetal por procesos
de formación geológica. Después de estos eventos, se generó el proceso
de carbonificación, dando origen a dos grandes etapas: la diagénesis, en
la que tiene lugar la descomposición de la materia orgánica por las
bacterias, hasta formar la turba, el segundo proceso es metamorfismo, en
el que se continúa la carbonificación por la acción del calor y la presión.
La diagénesis consta de una primera etapa de descomposición aerobia
posteriormente una etapa de descomposición anaerobia, en esta etapa se
genera gran cantidad de ácidos húmicos que fueron acumulándose, de
esta forma se formo la turba, a su vez fue nuevamente cubierta por
sedimentos (arcilla y limo), en conjunto con el aumento de la temperatura,
la presión y un largo proceso de evolución geológica se formaron los
tipos de carbón que hoy se conocen. (World Coal Institute, 2005).
25
La extracción de carbón ha sido de gran importancia desde hace muchos
siglos, sin embargo, con el inicio de la revolución industrial su uso se
elevó al ser utilizado como fuente de energía. En la actualidad las
reservas de carbón se encuentran distribuidas en setenta países con
yacimientos aprovechables, sus principales usos están destinados a la
producción energética en centrales termoeléctricas, seguida de su
utilización como potencial calorífico en calderas y en la industria de
fundición del hierro y del acero, otra pequeña cantidad es usada en
industrias varias. Algunas investigaciones sugieren que se puede ir más
allá de este uso actual, su aprovechamiento depende del desarrollo de
técnicas para transformar el carbón desde su forma compleja hasta
productos gaseosos o líquidos, de manera que se puedan utilizar a través
de una vía no contaminante y económica. (Bumpus 1998; Hofrichter et al,
2000; Zagal et al, 2002; Contreras 2004; Hongli et al, 2006).
Fig. 1. Carbonificación. Diagénesis y Metamorfismo. Fuente: Menéndez, 2006
26
El carbón está clasificado dentro de unos rangos dependiendo de su
porcentaje de carbono compacto, porcentaje de humedad y poder
calorífico. De esta manera se encuentran los tipos de carbón con mayor
poder calorífico: antracita, bituminosos (contienen elevado porcentaje de
carbono, menos del 8% de materias volátiles y bajo contenido de
humedad.); y los carbones de menor poder calorífico, que poseen
potencias caloríficas bajas y elevado contenido de humedad (30-45%) y
cenizas: (lignito, turba, leonardita). (World Coal Institute, 2006).
4.1.2 CARBÓN DE BAJO RANGO (CBR)
Los carbones de bajo rango, son aquellos cuyo poder calorífico bruto, en
base húmeda sea menor a 6.390 Kcal/Kg., denominados sub bituminosos
y los lignitos, son típicamente más blandos, fácilmente desmenuzables,
opacos y con apariencia de tierra; se caracterizan por tener altos niveles
de humedad y bajo contenido de carbono, y por consiguiente, poca
energía. Los carbones de alto rango son típicamente más duros y
resistentes. (Franco, 2004).
En consecuencia de lo anterior los carbones de bajo rango son
considerados residuos de los procesos de extracción carbonífera, pero
gracias a la naturaleza orgánica y física, constituyen una fuente rica en
sustancias húmicas. (Peña, 2005).
Las sustancias húmicas son utilizadas como abonos de origen natural,
contribuyen al aumento de la capacidad de intercambio de iones del
suelo; constituye parte fundamental del complejo absorbente regulador de
la nutrición de la planta, asimismo a la conversión de formas no
asimilables; (Chen et al 1990) juegan un papel primordial en la fijación de
nutrientes en suelos, disponibles para las plantas (Piccolo et al 1999),
contribuyen notablemente como agentes químicos en la meteorización de
27
rocas (Tejada et al 2007), ayudan en la transferencia de micronutrientes
del suelo de la planta, aumenta la retención de agua, aumenta las tasas
de germinación de las semillas y los porcentajes, como coadyuvantes en
procesos de fitorremediación de suelos contaminados y estimulan el
desarrollo de poblaciones microbianas en los suelos.( Nutranetics, 2000;
Yuan 2004; Sim Siong et al 2007).
Pocas experiencias en el estudio de la obtención de sustancias húmicas a
través de carbones sub-bituminosos u oxidados, han resultado exitosas
debido al costo del proceso y la variabilidad en los porcentajes que se
logran extraer, (generalmente bajas cantidades), alrededor del 20% de
material húmico extractable; por esta razón se ha probado el uso de
tratamientos químicos como peróxido de hidrogeno hidrógeno (H2O2) y
permanganato de potasio (KMnO4), cuyos resultados no son promisorios,
alternativamente se ha evaluado ácido nítrico, lo cual ha mejorado el
porcentaje de sustancias húmicas que se pueden extraer, sin embargo
sigue siendo un tratamiento costoso. (Sim Siong et al, 2007)
El diseño de nuevos procesos de conversión, esencialmente para carbón
de bajo poder calorífico, requiere un conocimiento de las alternativas
experimentales por las cuales se puede llevar a cabo la transformación
del carbón para la obtención de sustancias húmicas, las cuales mediante
parámetros correctos de aplicación pueden actuar como enmiendas
orgánicas para el mejoramiento de las características físicas, químicas y
biológicas del suelo. (NutraNetics Inc. 2000).
28
4.2 TRANSFORMACION MICROBIANA DEL CARBON DE BAJO
RANGO
Existe una gran diversidad microbiana con características fisiológicas que
permiten el uso del carbón como fuentes energéticas, dentro de los que
sobresalen algunos hongos que producen un conjunto de enzimas
extracelulares capaces de metabolizar la lignina, de la misma forma
permiten degradar un diverso numero de compuestos orgánicos de
composición similar. (Montero et al, 2004), por ejemplo se han aislado
microorganismos a partir de hidrocarburos, DDT (Carrillo et al, 2004),
aplicando esta sustancia como única fuente de carbono, obteniendo un
limitado número de microorganismos capaces de degradar dicho
compuesto, (Rivera et al, 2000).
La conversión biológica del carbón de bajo rango por acción de
microorganismos ha ganando recientemente la atención científica y un
interés sustancial por los procesos biológicos que resultan en la
biosolubilización. El origen a partir de material vegetal del CBR,
contenido de elementos importantes para la nutrición microbiana,
elementos como nitrógeno, azufre, hierro, carbono, oxigeno e hidrogeno y
elementos trazas, el contenido orgánico y acuoso, hacen que el carbón
sea un sustrato para la colonización y crecimiento de microorganismos,
cuyos procesos biológicos puedan utilizarlo como fuente de energía.
(Holker et al, 2002; Yin et al 2009;)
Existían pocos estudios en la transformación de carbones sub-
bituminosos, mediada por microorganismos (Hofrichter et al, 2000).
Fakoussa (1981) fue el primero que reporto microorganismos capaces
de utilizar carbones bituminosos de Alemania como único recurso de
carbono y energía, el mismo en 1990 evaluó levaduras y mohos
enriquecidas con carbón tipo hulla como fuente de carbono, observando
29
un crecimiento exponencial lento y la fijación de la hulla en las hifas
jóvenes del hongo (Bumpus 1998; Fakoussa et al, 1999; Hofrichter et al,
2000; ), Cohen y Gabriela (1982) encontraron dos hongos: Trametes
versicolor y Poria monticola, capaces de solubilizar cantidades
sustanciales de carbón lignito la estructura del lignito y la lignina poseen
algunas semejanzas y se sugería que la solubilización observada del
lignito era responsabilidad del sistema enzimático de estos hongos,
reportados como degradadores de lignina. (Cohen y Gabriele, 1982;
Pyne, 1987; Bumpus, 1998). Posteriormente se han reportado nuevos
hongos y bacterias capaces de solubilizar carbones seleccionados,
Stewart et al, (1990), reportaron dos géneros de hongos Cuninghamella
sp. Y Penicillium sp. con actividad sobre carbones sub-bituminosos
pretratados en placas de agar.
Existen varios microorganismos que generalmente no son asociados con
la capacidad de degradar lignina, (Tabla 1) pero si capaces de solubilizar
carbones de bajo rango como el lignito, por ejemplo: Aspergillus sp.,
Penicillium sp. y Candida sp. Mucor sp. Paecilomyces sp., Alternaria sp.,
Phoma sp. fueron aislados de lignito, expuesto y no a pretratamientos
químicos. (Scott et al, 1986; Stewart et al, 1990).
TABLA 1. HONGOS REPORTADOS CON CAPACIDAD
BIOTRANSFORMADORA DE CARBONES DE BAJO RANGO
Tipo De Carbón Microorganismo Referencias
Carbón tipo lignito
Dakota del Norte
Trametes versicolor Cohen & Gabrielle
(1982)
Torzilli & Isbister
(1994)
Carbón tipo lignito
Dakota del Norte
Candida sp.
Aspergillus sp.
Paecilomyces sp.
Penicillium waksmanii ML20
Sporothrix sp.
Trametes versicolor
Scott et al, (1986)
30
Carbón tipo lignito
Mississippi
Aspergillus sp.
Candida sp.
Penicillium waksmanii ML20
Trametes versicolor
Scott et al, (1986)
Carbón tipo lignito Cunninghamella sp. Stewart et al, (1990)
Carbon sub-
bituminosos
Pennsylvania
Penicillium sp.
Cunninghamella sp.
Stewart et al, (1990)
Carbon sub-
bituminosos
Penicillium sp.
Cunninghamella sp.
Stewart et al, (1990)
Carbones sub-
bitumuminosos
Nigerian
Phanerochaete
chrysosporium
Achi (1993)
Carbón tipo lignito
Alemania
Alternaria sp. Hofrichter et al, (1997)
Carbon tipo lignito
Alemania
Trichoderma viride Reiss, (1992)
Carbones sub-
bituminosos y lignitos
Alemania
Aspergillus terreus
Paecilomyces spp.
Mucor lausannesis
Ward (1985)
Carbones sub-
bituminosos y lignitos
Fusarium oxysporum
Trichoderma artroviride
Hölker et al, (1997,
1995, 1999)
Carbón tipo lignito Penicillium decumbens Hongli et al, (2005)
Carbón tipo lignito Trichoderma sp.,
Cladosporium sp.,
Penicillium sp.
Pokorny et al, (2005)
Tao et al, (2009)
Carbón tipo lignito Paecilomyces inflatus Kluczek et al, (2005)
Carbón tipo lignito Paecilomyces lilacinus
Phoma sp.
Alternaria sp.
Rezacova et al, (2006)
31
4.2.1 MECANISMOS DE BIOTRANSFORMACIÓN DEL CARBÓN
Los mecanismos por los cuales los microorganismos transforman el
carbón de bajo rango han sido objeto de atención considerable. Informes
iniciales concluyen que los principales mecanismos de transformación
biológica del carbón están asociados a procesos enzimáticos, no
enzimáticos, la acción de alcalina y agentes quelantes estos dos últimos
actividad en la mayoría de bacterias y actinomicetos. (Cohen et al, 1987,
Pyne et al, 1987; Steinbüchel 2001)
Actualmente se conocen 2 mecanismos importantes que implican la
transformación del carbón de bajo rango: la solubilización y la
depolimerización. La solubilización del carbón es un proceso que conlleva
a la formación de un líquido de color oscuro, a partir de carbón en estado
sólido, es un proceso que disuelve el carbón preferiblemente a valores de
pH (7- 10) y se ha sugerido que se debe a la formación de microbiana de
sustancias alcalinas, agentes quelantes o surfactantes liberados al medio
extracelular (Willmann, 1997; Iffet et al, 2006). Se ha comprobado que
ciertas enzimas hidroliticas pueden desencadenar procesos de
solubilización, mediados principalmente por peroxidasas, lacasas, fenol-
oxidasa y Mn peroxidasa. (Wondrack 1989), se ha demostrado que
diversos hongos degradadores de lignina, principalmente los
basidiomicetos, producen estas enzimas extracelulares que participan en
el proceso de solubilización de carbón de bajo rango. (Pyne et al 1987;
Bumpus, 1988; Wise, 1990; Steinbüchel 2001). (Wondrack, 1989).
Generalmente, la solubilización del carbón no resulta en una disminución
sustancial del peso molecular de las sustancias húmicas del carbón,
evidenciado en la no presencia de monómeros en los productos de la
solubilización; por lo contrario, se ha observado que puede estar
32
acompañada con reacciones de polimerización como el mecanismo de
disminución del peso molecular del carbón. (Bumpus, 1998).
Agentes quelante como el ion de oxalato rompen los enlaces iónicos entre
las macromoléculas del carbón de bajo rango, tornándolas solubles al
agua. Hongos como Aspergillus sp. Y Penicillium sp. Son géneros que
secretan iones de oxalato, por lo cual muestran actividad solubilizadora de
carbón (Bumpus 1998; Cohen et al, 1990; Fredrickson et al, 1990). Los
biosurfactantes son surfactantes producidos extracelularmente o como
parte de la membrana celular de bacterias y hongos. Se ha observado
que la producción de biosurfactantes está relacionada con la
solubilización de carbón (Yuan et al, 2006). La solubilización del carbón
mediada por sustancias alcalinas ionizan los grupos funcionales ácidos
del carbón de bajo rango, generando la solubilización. (Ralph et al, 1997).
La solubilización microbiana del carbón se encuentra condicionada al
rango del carbón y el grado de oxidación. Se ha demostrado que
carbones como el lignito y la leonardita son más susceptibles a la
solubilización que carbones de alto rango como el subbituminoso y
bituminoso, debido a que a medida que aumenta el rango del carbón
disminuye el contenido de oxigeno dificultando la acción microbiana sobre
el carbón. (Wise, 1990).
Otros estudios han demostrado que tras la solubilización ocurre una
reducción en el tamaño molecular de los compuestos solubilizados, a este
fenómeno se ha descrito como depolimerización aplicándolo tanto al
carbón como a las macromoléculas derivadas (ácidos húmicos), se ha
comprobado que este es un proceso exclusivamente enzimático que por
el contrario de la solubilización ocurre a valores bajos de pH( 3-6) y da
como resultado el clivaje de los enlaces de las macromoléculas,
permitiendo la formación de sustancias de colores amarillentos (similares
33
a ácidos fúlvicos) con bajo peso molecular (Bumpus, 1998; Hofrichter,
2000).
La intervención de enzimas en los procesos de depolimerización fueron
reportados inicialmente por Wondrak (1989), informo que la lignino
peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium inhibe la capacidad para
mediar una sustancial desaparición de macromoléculas inicialmente
solubilizadas del carbón sólido, (Bumpus, 1998). Más recientemente
Ralph et al, (1999) reporto dos hongos Tremellosus merulis y Tephropora
erenniporia, polimerizadores de la macromolécula de carbón, por acción
de las enzimas Mn peroxidasa y lacasa. (Willmann, 1997; Iffet et al, 2006)
Existe otro fenómeno llamado utilización, por el cual microorganismos
(bacterias hongos filamentosos y levaduras) presentan la capacidad para
crecer sobre el carbón utilizándolo como sustrato, aprovechando
compuestos biodisponibles ya sea liberados espontáneamente desde las
partículas de carbón o tomados mediante procesos oxidativos, para su
crecimiento; en algunos casos la utilización del carbón generalmente esta
acompañada por procesos de solubilización. (Hofrichter, 2000). Esta
capacidad se ha observado en hongos como Trametes versicolor y Poria
monticola (Ralph et al, 1997)
Además de procesos de solubilización y depolimerización, algunos
hongos tiene la capacidad de tomar los productos solubles y
metabolizarlos en el interior de las células generando en el medio
extracelular una pérdida en la cantidad de material solubilizado, en este
caso el proceso de es llamado biodegradación. (Ralph, 1997)
34
5. METODOLOGIA
Para la obtención de microorganismos biotransformadores de carbón
meteorizado, se recolectaron muestras de carbón, suelos adyacentes a
mantos carboníferos y suelos con material vegetal en descomposición y
diferentes muestras ambientales caracterizadas por presentar alta
influencia y aportes de material carbonoso generado en diferentes
procesos, como lavado, almacenamiento, extracción y transporte de
carbón, de la mina El Cerrejón.
Para el aislamiento de hongos en general Se probaron 3 técnicas: 1)
Enriquecimiento previo en medio de cultivo líquido (contenido: extracto de
levadura (2g/l), extracto de malta (3g/l), glucosa (1.5g/l) , medio mínimo de
nutrientes inorgánicos y carbón (1g/l)), inoculación en medio carbón
modificado (MCM), 2) inoculación de diluciones seriadas en agua
peptonada directamente de la muestra, sin previo enriquecimiento y 3)
Inoculación directa de partículas de suelo o carbón (método de impronta)
en la superficie MCM. Se probaron dos medios de cultivo selectivos con el
carbón de bajo rango procedente del Cerrejón como única fuente de
carbono: 1) medio mínimo de nutrientes inorgánicos de composición:
((NH4) SO4: 0.5g/L; KH2 PO4: 10g/L; MgSO4:7H2O: 0.2g/L; CaCl2:0.1g/L).
(Rivera et al, 2000) con Carbón mineral, para este medio se probaron
concentraciones de carbón en polvo al 1% y 5%. 2) medio agar lignito de
composición: 1% p/Vol. agar-agar, 7% p/Vol. lignito pulverizado, agua
destilada, el carbón pulverizado fue disuelto con el agar fundido. (Cohen
et al, 1982). Para todos los medios se ajusto el pH a 5.5 con acido
clorhídrico 0.1M. Se realizaron ensayos preliminares de las diferentes
técnicas y medios de cultivo y se seleccionó la técnica y el medio que
permitió recuperar mayor diversidad de morfotipos de colonias fúngicas
para el proceso definitivo de aislamiento de hongos a partir de las
muestras de suelo y carbón.
35
Los hongos aislados en los medios selectivos con carbón como única
fuente de carbono (MCM) fueron sometidos a pruebas de solubilización
de 2 tipos de partículas de carbón (CT1- CT2), las partículas fueron
sometidas a 3 tipos de tratamiento (esterilización en seco, esterilización
en húmedo y tratamiento químico con ácido nítrico al 0.8M).
Fueron identificados mediante el uso de claves taxonómicas de Barnett;
a partir de los cultivos puros se examinaron características microscópicas
y macroscópicas. Para el análisis macroscópico se tuvo en cuenta textura,
borde, color, topografía y pigmentación en el reverso. Para el examen
microscópico de las características estructurales del hongo se realizaron
montajes en azul de lactofenol y observación en el microscopio
compuesto y teniendo en cuanta el tipo de hifa y el tipo de estructura
reproductiva (Franco 2005; Gonzales 2005).
5.1 MUESTREO
El muestreo se realizó en la mina “El Cerrejón” situado en la península
de la Guajira parte nororiental de Colombia, con una extensión de 69.000
hectáreas, en uno de los cinco frentes de extracción de carbón de la mina
denominado “Tajo Patilla” localizado a 11º05´45.54´´ latitud norte y
72º40´66.55´´ longitud oeste en el departamento de la Guajira (Figura 2).
El relieve de esta zona ica es plano y ondulado y un poco menos árido,
que el extremo norte de la península, de altas temperaturas tropicales que
oscilan entre 27 y 30ºC, alteradas por los vientos marinos que llegan del
norte del Caribe. (Calderón, A. 2008).
36
De cada sitio de muestreo se tomó una muestra integrada de 3 Kg.
conformada por tres submuestras de1Kg, tomadas entre los 5 y 20 cm de
profundidad, a una distancia de 20 metros entre sí, llas muestras
colectadas fueron tomadas con una pala metálica de jardinería
previamente esterilizada, las 3 submuestras fueron mezcladas
conformando una muestra integrada, almacenadas en bolsas plásticas de
cierre hermético, rotuladas y transportadas en una nevera de icopor con
hielo, hasta el laboratorio de microbiología agrícola y ambiental de la
Universidad Popular del Cesar, donde fueron almacenadas a temperatura
de refrigeración (0 - 5ºC) para su posterior procesamiento.
A continuación se describen en detalle las once muestras colectadas:
Fig 2. Lugar: Localización mina El Cerrejón, tajo “Patilla” manto cuarenta de la mina el Cerrejón
37
Muestra 1 (Carbón)
Código de muestra: SC000
Muestra colectada en el frente de extracción de carbón llamado “Tajo
Patilla”, en el manto 40 (Fig. 3a -3b) que corresponde a una capa de
carbón de bajo rango o carbón meteorizado (Fig. 3c).
Muestra 2 (Suelo conservado)
Código de muestra: SC00111
Muestra correspondiente al horizonte O de un suelo conservado
adyacente al frente de extracción “Tajo patilla”, con vegetación nativa de
bosque seco tropical de aproximadamente 2 hectáreas (ha) (Fig. 4a), de
color café oscuro con presencia de material orgánico de origen vegetal y
actividad evidente de mesofauna. (Fig. 4b)
Fig. 4a: Zona de recolección de muestra SC00111. Fig. 4b: Acercamiento de la recolección de la muestra de suelo conservado.
Fig. 4a Fig. 4b
Fig. 3a: Lugar: Tajo
Patilla.
Fig. 3b: Detalle del manto
40.
Fig. 3c: Muestra de
carbón.
38
Muestra 3 (Área interior tronco)
Código de muestra: SC00112
Muestra correspondiente al interior de un tronco en descomposición. (Fig.
5) No se evidencia la presencia de raíces, textura esponjosa, de color
café claro característico del humus.
Muestra 4: (Área de suelo deforestado para excavación)
Código de muestra: SC00121
Muestra integral correspondiente al suelo en el borde del área
conservada, de aproximadamente 2 ha, bajo el efecto de la
mecanización. Color café oscuro. Con características de horizonte O. (Fig.
6)
Fig. 5: Muestra del interior de un tronco
Fig. 6: Área de suelo deforestado
por excavación
39
Muestra 5: (suelo de Banco)
Código de muestra: SC00201
Muestra integrada correspondiente al horizonte O de un suelo de Banco
intervenido sin vegetación y de uso agrícola hace 20 años atrás, con
aproximadamente 20 ha, material de color café oscuro, con presencia de
raíces, algo de mesofauna y relativamente húmedo. (Fig. 7)
Muestra 6: (Área de suelo de Rizósfera en proceso de rehabilitación)
Código de muestra SC00301
Muestra de Rizósfera de Bledo (Amaranthus blitoides), verdolaga
(Portulaca oleracea) y gramínea (Pogonatherum paniceum), de color café
claro amarillento, compacta, con presencia de pocas raíces, sin materia
orgánica y poca o nula mesofauna, en zona de rehabilitación de 1 año.
(Fig. 8)
Fig. 7: Área de suelo de Banco
Fig. 8: Área de suelo de Rizósfera en proceso de
rehabilitación
40
Muestra7: (suelo rehabilitado)
Código de muestra: SC00401
Suelo de bosque rehabilitado de hace 15años, extensión de 40 ha, con
presencia de restos de materia orgánica seca en descomposición y
vegetación. (Fig. 9)
Muestra 8: (suelo influenciado por carbón en área de botadero de
material estéril)
Código de muestra: SC00501
Suelo húmedo con área de botadero estéril, pero sin rehabilitación, solo
regeneración natural 10 a 15 años. Color café amarillento. Se observan
fragmentos de materia orgánica vegetal, con flora dominante de
gramínea. Superficie de 15 ha y una profundidad de la muestra de 15 cm.
(Fig. 10)
Fig. 9: Área de suelo rehabilitado.
Fig. 10: Suelo con área de botadero
41
Muestra 9: (Material estéril con partículas de carbón)
Código de muestra: SC00611+SC00621
Muestra colectada en un talud donde esta dispuesto un material mineral
compuesto por rocas pulverizadas y fragmentos sólidos de diferente
tamaño denominado “Estéril”, extraído en el proceso de excavación y
acumulado para ser utilizado como base para la rehabilitación posterior
del suelo. Se encuentra localizado frente a un patio de almacenamiento
de carbón (Fig. 11) recibiendo constantemente partículas de carbón de
diferente tamaño; se ha desarrollado un sustrato sobre el cual pueden
crecer plantas de pasto Buffel (Cenchrus ciliaris).
Se tomaron submuestras del material localizado en el límite entre el
patio de almacenamiento de carbón y el talud de suelo en rehabilitación
(SC00621) (Fig. 11a) y submuestras suelo adyacente y rizósfera de
plantas del Pasto Buffel (Cenchrus ciliaris) que está creciendo (SC00611)
(Fig. 11b). Las muestras fueron mezcladas para obtener una muestra
homogénea (SCOO611- 621).
Fig. 11: Patio de almacenamiento de carbón. 11a submuestra
SC00621. Y 11b submuestra SC00611.
Fig. 11a
Fig. 11b
42
Muestra 10 (Lodo carbonoso)
Código de muestra: SC00701
Corresponde a fango de color negro, denso, textura plástica y
anaerobio. Este lodo se forma mediante el proceso de sedimentación de
materiales suspendidos en el agua residual utilizada en un patio de
lavado de carbón, con apariencia de “Humedal”. Sobre este material se
desarrollan poblaciones de plantas gramíneas enea (Typha latifolia) y
Pasto Buffel (Cenchrus ciliaris).
Muestra 11 (Rizósfera de gramíneas Enea (Typha latifolia)
desarrolladas sobre lodo carbonoso)
Código de muestra: SC00702+ SC00703
Muestra recolectada de área de sedimentos procedente de lavado de
carbón, un “semihumedal” con predominio de plantas gramíneas Enea
(Typha latifolia), con textura de plastilina, de aproximadamente 15 ha. Se
tomaron porciones de raíces y sustrato adherido fuertemente a las raíces.
Fig. 12: Muestra de lodo carbonoso.
43
5.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
5.2.1 AISLAMIENTO
Para el aislamiento de hongos se probaron 3 técnicas: 1. Enriquecimiento
previo en medio de cultivo líquido, 2. inoculación de diluciones seriadas
en agua peptonada directamente de la muestra, sin previo
enriquecimiento y 3. Inoculación directa de partículas de suelo o carbón
(método de impronta) en la superficie MCM.
5.2.1.1 Técnica 1: Enriquecimiento en medio de cultivo líquido
En frascos con 100ml de medio cultivo líquido enriquecido se sembró 1 g
de cada muestra, más un control (100 ml del medio de cultivo liquido sin
inoculo). Estos cultivos se mantuvieron en agitación a 300 r.p.m. por 8
días a 25ºC. (Observación diaria durante y después de los ocho días
hasta observar crecimiento micelial). Posteriormente se realizaron
diluciones 10-5 y 10-6, adicionando 0.1ml de las diluciones en MCM solido
Fig. 13a: Pila de carbón que es lavado y hacia el frente los sedimentos depositados por el agua residual proveniente del lado y sobre ellos creciendo parches de gramíneas (Typha latifolia). Fig. 13b: Gramíneas creciendo sobre
lodo carbonoso
44
al 5%. Incubación a 25ºC por ocho días (hasta observar colonias
fúngicas).
5.2.1.2 Técnica 2: Inoculación de diluciones seriadas en agua
peptonada, directamente de la muestra
Por la técnica de diluciones seriadas se procesaron 11 muestras:
observándose crecimiento de colonias fúngicas.
Se tomó 0.1 g de las muestras, para la realización de una serie de
diluciones hasta 10-6 (agua peptonada al 1%), adicionando 0.1ml de las
diluciones 10-2 10-4, 10-6, por ser las más representativas en los ensayos
preliminares, con tres replicas en medio especifico Agar MCM al 1% y 5%.
Se incubó a 25ºC por 8 días (Observación diaria, durante y después de
los ocho días hasta observar crecimiento fúngico.
5.2.1.3Técnica 3: Inoculación directa de partículas de las muestras
(método de impronta).
Con la ayuda de una pinza estéril se tomaron pequeñas partículas de las
11 muestras y se inocularon en cajas de Agar MCM al 1% y 5% (Fig. 14).
Se incubaron a 28ºC por ocho días más los controles negativos de cada
Agar (1-5% de carbón sin inoculo). (Observación diaria durante y
después de los ocho días hasta observar crecimiento fúngico)
45
Identificación
Prueba de transformación de carbón
5.2.2 IDENTIFICACION DE LOS MORFOTIPOS FUNGICOS
De las tres técnicas de aislamiento utilizadas se seleccionaron las
colonias más representativas, teniendo en cuanta su crecimiento (escaso,
moderado, abundante) de las muestras ambientales procesadas. Las
colonias seleccionadas fueron repicadas hasta obtener cultivos axenicos
en medio Saboreaud Dextrosa Agar. A partir de los cultivos puros se
examinaron características microscópicas y macroscópicas, teniendo en
cuenta textura, borde, color, topografía y pigmentación en el reverso Y
para el examen microscópico de las características estructurales del
hongo se realizaron montajes en azul de lactofenol para hongos
miceliares, teniendo en cuanta el tipo de hifa y el tipo de estructura
reproductiva y para hongos levaduriformes tinción de GRAM. (Franco
2005; Gonzales, 2005).
Fig. 14: Montaje de la técnica Impronta para el aislamiento de hongos a partir
de las muestras.
Carbón 1%
Carbón 5%
46
5.3 PRUEBA CUALITATIVA DE SOLUBILIZACION DE CARBÓN EN
MEDIO SOLIDO
En Agar extracto de malta se inocularon esporas o micelio de los hongos
seleccionados del aislamiento, se incubaron a temperatura de 28ºC por
ocho días. Pasados los ocho días, y observado un crecimiento de la
colonia por toda la caja, con ayuda de una pinza estéril se colocaron
sobre la superficie partículas de carbón (CT1-CT2), tamizadas a través de
un tamiz 2.36mm de diámetro de poro, las partículas fueron sometidas a
tres pretratamientos: 1) Esterilización a vapor (121ºC/15lb por 15
minutos), con el fin de hidratar las partículas de carbón. (Pyne et al,
1987). 2) Esterilización en seco (a 100ºC por 2 horas), conservando su
estado natural. 3) Pretratamiento con un compuesto químico (ácido nítrico
0.8M) por 10 minutos y posterior lavado con agua destilada estéril, hasta
obtener en el agua producto del lavado un pH 7.0 (Modificaciones wise
2001). Como control se colocaron partículas de carbón (1 y 2) con los 3
pretratamientos en una placa de Agar malta sin crecimiento fúngico. Las
cepas con las partículas de carbón pretratadas y el control se incubaron a
28ºC por 15 días, observando cada tres días la presencia de gotas de
color café oscuro, que evidencian el proceso de solubilización
transformando el carbón de estado sólido a líquido.
5.4 DETERMINACIÓN DE SUSTANCIAS HÚMICAS EN MUESTRAS DE
CARBÓN METEORIZADO PROCEDENTE DEL CERREJÓN
Para proceder a realizar los ensayos de biotransformación del carbón por
parte de los microorganismos asilados, es conveniente comprobar la
presencia de sustancias húmicas solubles en el carbón que se desea
utilizar para los ensayos, con este propósito se realizó la extracción de
sustancias húmicas, tomando como base el procedimiento de la
Internacional Humic Substances Society, se probaron dos extractantes
47
(KOH y NaOH) en diferentes concentraciones (0,1M, 0,5M y 1M), se
probaron diferentes relaciones entre el volumen de extractantes y
cantidad de carbón, tiempos de extracción y temperaturas.
48
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 AISLAMIENTO A partir de las siembras por las tres técnicas de aislamiento y las 11 muestras procesadas se aislaron 137 morfotipos fúngicos, 42 morfotipos procedentes de la técnica por enriquecimiento, 80 morfotipos procedentes de la técnica diluciones seriadas y 15 morfotipos a partir de la técnica impronta. En la tabla 2 se detalla el número de morfotipos aislados para cada muestra, teniendo en cuenta la técnica de aislamiento utilizada.
Muestra Técnica de aislamiento
Enriquecimiento Diluciones Impronta Total
SC000 7 12 3 22
SC00111 6 15 4 25
SC00112 2 12 1 15
SC00121 3 4 0 7
SC00201 2 3 2 7
SC00301 4 5 0 9
SC00401 4 10 0 14
SC00501 5 3 2 10
SC00611+621 1 7 1 9
SC00701 5 5 0 10
SC00702+703 3 4 2 9
Tabla 2: Numero de morfotipos fúngicos aislados por en relación a las técnicas de aislamiento ensayadas
49
En el grafico 1 se observa que entre las técnicas empleadas
(preenriquecimiento, diluciones seriadas e impronta) la técnica de
diluciones seriadas fue más eficiente, para aislar morfotipos fúngicos con
actividad biotransformadora de carbón. Esto se relaciona con las
condiciones nutricionales del medio adicionado a los frascos y la agitación
constante de los mismos en la técnica preenriquecimiento al aumentar el
desarrollo de actinomicetos, que inhibieron el crecimiento de los hongos,
observado en las placas de Agar Carbón inoculadas con alícuotas del
cultivo (Fig. 15). Es ampliamente conocido que los actinomicetos
producen una gran diversidad de metabolitos antifuncos (matanólicos,
clorofórmicos), que inhiben el crecimiento de morfotipos fúngicos.
(Tanaca et al, 1996).
Al realizar la siembra por la técnica diluciones seriadas la cual permite
reducir la carga microbiana de una muestra, permitió el aislamiento de
02468
10121416
MO
RFO
TIP
OS
FUN
GIC
OS
NUMERO DE MORFOTIPOS FUNGICOS VS TECNICAS DE AISLAMIENTO
Tec. Preenriquecimiento
Tec. Diluciones seriadas
Tec. Impronta
Grafico1: Numero de morfotipos fúngicos aislados en relación a las muestras y técnicas de aislamiento ensayadas
Muestras
NUMERO DE MORFOTIPOS FUNFICOS CON RELACION A
LAS MUESTRAS Y LA TECNICA UTILIZADA
50
morfotipos fúngicos separados, reduciendo el crecimiento de
actinomicetos en el medio, esto relaciona el mayor aislamiento de
morfotipos de hongos.
El bajo número de morfotipos aislados por la técnica de impronta puede
relacionarse a la falta de enriquecimiento antes de su siembra en placa y
a la competencia que se genera en su mayoría por hongos filamentosos,
que crecen en la superficie de la caja e inhiben el crecimiento de otros
géneros, además esta técnica es para micelio activo, así que las esporas
no se expresan lo que si ocurre cuando se trabaja con diluciones.
Fig. 15: Cultivo por preenriquecimiento. Desarrollo de actinomicetos inhibiendo crecimiento de morfotipos fúngicos.
51
Los 137 morfotipos fúngicos aislados corroboran lo planteado por Lieske
en 1982; al describir una amplia gama de microorganismos en zonas
mineras. En el grafico 2 se observan los porcentajes correspondientes
al número de morfotipos aislados por muestra, de las cuales las que
mayor numero de morfotipos fúngicos aportaron corresponden a las
muestras: SC000 (muestra de carbón), de la cual se obtuvo 22
morfotipos fúngicos correspondientes al 16%; SC00111 (suelo
conservado), 25 morfotipos fúngicos correspondientes al 18%; SC00112
(interior de un tronco), 15 morfotipos fúngicos correspondientes al 11% y
SC00401 (suelo rehabilitado), 14 morfotipos fúngicos correspondientes al
10%.
En la muestra de suelo rehabilitado (SC00401) y suelo conservado
(SC00111), con vegetación y materia orgánica, es natural la presencia de
microorganismos. La obtención de mayor cantidad de morfotipos fúngicos
en las muestras anteriores se puede explicar por varios factores. La
presencia de plantas en las zonas de muestreo crea una relación
microorganismo y planta al está ser la principal fuente de sustratos
energético al suelo, del que los microorganismos su aprovechan cuando
16%
18%
11%5%5%7%
10%
7%
7%
7% 7%
PORCENTAJE DE MORFOTIPOS FUNGICOS AISLADOS VS MUESTRAS PROCESADAS
SC000 SC00111 SC00112 SC00121
SC00201 SC00301 SC00401 SC00501
SC00611+621 SC00701 SC00702+703
Grafico2: Porcentaje de morfotipos fúngicos aislados en relación a las muestras procesadas.
52
se encuentran en áreas próximas a las raíces (Acuña et al, 2006). En
segundo lugar la descomposición y mineralización de materia orgánica
por microorganismos, que de una u otra forma se incorpora al suelo
dando lugar a reserva de nutrientes para el desarrollo de vida vegetal y
metabolismo microbiano. (Bautista et al, 2004).En relación a lo anterior,
factores físico como la temperatura, contenido de humedad y zonas con
influencia de los procesos de extracción mineras pueden favorecer el
desarrollo de microorganismos con actividad transformadora de carbón.
En la muestra procedente del interior de un tronco (SC00112), de acuerdo
a su descripción presenta características semejantes a humus, además
del contenido lignolitico del tronco. Esto se puede relacionar con el
número de morfotipos aportados por esta muestra, teniendo en cuenta
que el humus es el producto de procesos de transformación de la materia
orgánica con la acción de una intensa actividad microbiana. El área donde
se encontraba el tronco, existe presencia de vegetación, representada por
el crecimiento de plantas superiores, lo que favorece el crecimiento de
microorganismos, además los procesos relacionados con la degradación
de la lignina, permitieron el desarrollo de morfotipos fúngicos que lograran
utilizar su capacidad al degradar lignina, para utilizar el carbón como
fuente de energía.
La muestra correspondiente a Carbón de bajo rango (SC000), aporto
morfotipos fúngicos, relacionado a su origen a partir de material vegetal,
contenido de elementos importantes para la nutrición, y elementos trazas,
el espacio poroso y contenido acuoso, hacen que el carbón sea un
sustrato para la colonización y crecimiento de microorganismos altamente
adaptados a las condiciones del carbón, cuyos procesos biológicos
pueden utilizarlo como fuente de energía. (Holker et al, 2002; Yin et al,
2009)
53
Las muestras a partir de las cuales se aislo el mayor porcentaje de
morfotipos de hongos contienen reservas orgánicas, material vegetal,
propiedades físicas como humedad y elementos nutricionales mas
disponible de acuerdo a las características visibles para su descripción
(en comparación con las muestras restantes), a partir de los cuales
poblaciones fúngicas afectadas directa o indirectamente por la actividad
minera, obtienen nutrientes y condiciones necesarias para activar su
metabolismo, en procesos de transformación del carbón de bajo rango,
además los hongos representan el 70% de la población microbiana y
constituyen el segundo de los dos grandes grupos de microorganismos
del suelo (Will, 1992).
6.1 SELECCIÓN Y DESCRIPCION DE MORFOTIPOS FUNGICOS
De las 137 colonias obtenidas a partir de las muestras de carbón y
ambientales fueron seleccionadas 37 cepas, de acuerdo a su crecimiento
en MCM (abundante y medio), incluyeron géneros: Asperguillus sp,
Mucor sp, Cladosporium sp, Trichoderma sp, Paecilomyces sp y
levaduras evidenciaron porcentajes más altos de crecimiento y utilización
de carbón como fuente carbono para desarrollar su metabolismo
enzimático, reiterando lo descrito por Fakoussa (1981; 1988; 1990), al
reportar hongos filamentosos y levaduras capaces de utilizar carbón tipo
hulla.
54
Las características macroscópicas observadas en los morfotipos fúngicos
aislados consisten en colonias con crecimiento micelial abundante, de
texturas pulverulenta, algodonosa y aterciopelada y topografía aplanada,
verrucosa, umbonada, con color del micelio amarillas, blancas, verdes y
grises. (Ver anexo 2).
6.2 SOLUBILIZACION DE CARBON EN MEDIO SOLIDO De las 37 cepas seleccionadas por presentar crecimiento en MCM
utilizando el carbón como fuente única de carbono y energía; 24
morfotipos de hongo transformaron el carbón mediante el mecanismo de
utilización (Fig. 17a y b; Fig. 18a y b); y solo 3 morfotipos fúngicos
solubilizaron las partículas de carbón, evidenciado por la presencia de
exudados color café en las zonas de crecimiento del hongo sobre las
partículas de carbón. (Fig. 19a y b; Fig.20a y b).
Fig. 16: Crecimiento de las cepas aisladas en MCM: a) abundante, b)
medio.
a
b
55
Sobre los mecanismos de transformación del carbón evaluado a las 37
cepas aisladas, (utilización y solubilización), los resultados asimilan con
cepas biotransformadoras reportadas en experiencias anteriores, de las
cuales se identificaron morfotipos como: Aspergillus sp. Penicillium sp. y
Mucor sp. Con la capacidad para crecer sobre el carbón utilizándolo
como sustrato para la obtención de moléculas orgánicas para su
crecimiento, reportados por científicos como: Scott et al, (1986), primero
en reportar los géneros de hongos, por la observación del crecimiento
micelial en las partículas de carbón; Stewart et al, (1990) observación de
Fig. 17: Utilización de las partículas de carbón morfotipo HC23: Cladosporium sp.
Partícula de carbón (2.36
mm)
Fig. 18: Utilización de las partículas de carbón morfotipo HC25: Mucor sp.
56
colonización de carbón sometido previamente a temperatura de
180ºC/7dias usando microscopia electrónica; géneros como Mucor sp.
reportados por Fischer et al, (1997) identificando su crecimiento micelial
sobre carbón lignito.
Fig. 20: Solubilización de partículas de carbón, (carbón tipo 2, Trat: seco) por morfotipo HC27 (Trichoderma sp.), presencia de exudados color café.
Fig. 19: Utilización y Solubilización de partículas de carbón, (Cs2 carbon tipo 2, Trat: seco) por morfotipo HC09: Paecilomyces sp. Presencia de exudados color café.
Cs1
Cs2
Cs2
57
Entre las cepas aisladas tres géneros diferentes HC: 27 Trichoderma sp.,
HC 09: Paecilomyces sp., HC: 19 Penicillium sp., subsiguiente a sus
procesos de crecimiento y utilización del carbón formaron gotas de color
oscuro a partir de las partículas de carbón pretratadas, característico del
proceso de solubilización, reportado en estudios con especies de estos
géneros Trichoderma artroviride (Ward (1985), Scott et al. (1986)),
Paecilomyces spp. (Polman et al, (1994)) Y Penicillium citrinum (Hölker
et al, (1997, 1999)), como solubilizadores de las partículas de carbón,
mediante la formación microbiana de sustancias alcalinas, agentes
quelantes o surfactantes que son liberados al medio extracelular.
A diferencia de morfotipos ya referenciados en estudios anteriores el
presente trabajo permitió determinar nuevos géneros de hongos con un
potencial en cuanto al crecimiento y utilización de carbón en medio solido,
las cepas correspondientes a los códigos HC29, HC31, HC39, HC43;
además 3 morfotipos basidiomicetes HC18, HC28, HC30, aislados
presentaron un abundante crecimiento en Agar MCM y utilizaron las
partículas de carbón como sustrato para la obtención de moléculas
orgánicas para su crecimiento.
La formación de gotas de color oscuro se observó solamente en la
muestra de carbón tipo 2 expuesta a esterilización en seco, esto puede
estar relacionado con la textura del carbón más blanda y fácilmente
desmoronadle, lo que hace posible inferir, que el carbón tipo 1 presenta
mayor grado de carbonificación, por lo que su estructura química es más
compleja dificultando el crecimiento fúngico. Resis (1992) pudo observar
la solubilización más eficiente por parte de microorganismos en carbones
geológicamente más jóvenes (lignito).
La tabla 3 relaciona los géneros fúngicos aislados, la actividad transformadora de carbón de bajo rango y estudios previos que dan soporte.
58
Tabla 3. Actividad biotransformadora y referencias de las 37 cepas obtenidas a partir del aislamiento en Medio Agar Carbón
Genero Actividad Referencias de hallazgos en estudios previos
Aspergillus sp. (morfotipos HC 01, HC32; HC35; HC37; HC41) A. flavus (morfotipos HC06; HC08). A. terreus (morfotipos HC13.)
CU Scott et al, (1986); primero en reportar el género de hongo, por la observación del crecimiento micelial en las partículas de carbón. Dutton et al (1993) presencia de iones de oxalato excretados por Penicillium sp. Y Aspergillus sp.
Penicillium sp. (morfotipos HC03; HC15; Hc19; HC36; HC44)
CU; HC19 CUS
Scott et al, (1986); primero en reportar el género de hongo, por la observación del crecimiento micelial en las partículas de carbón. Stewart et al, (1990) observación de: colonización de carbón sometido previamente a temperatura de 180ºC/7dias usando microscopia electrónica; oxidación del 10% de carbón mediante análisis gravimétrico Dutton et al, (1993) presencia de iones de oxalato excretados por Penicillium sp. Y Aspergillus sp. Laborda et al, (1997 - 1999) Determinaron la actividad de las enzimas oxidativas e hidroliticas de Trichoderma sp. Y Penicillium sp. (Fenoloxidasas, peroxidasas, esterasas) en la biotransformación de la hulla. Polman et al (1994) evaluó el crecimiento y metabolismo de Penicillium citrinum, determinando la capacidad de modificar carbones, produciendo compuestos de menor pero molecular que el carbón original, causando una reducción del 52% de azufre.
Cladosporium sp.(morfotipos HC05; HC11; HC23)
CU: cepa HC 23; las cepas HC05 –
Aislamiento de dos especies fúngicas Cladosporium oxysporium and C. tenuissimum a partir de carbón lignito recién excavado, identificadas mediante PCR.
59
11 solo C
Trichoderma sp. (morfotipos HC07; HC27)
CU: Cepa HC07; CUS: Cepa HC27
Laborda et al, (1997 - 1999) Determinaron la actividad de las enzimas oxidativas e hidroliticas de Trichoderma sp. Y Penicillium sp. (Fenoloxidasas, peroxidasas, esterasas) en la biotransformación de la hulla. Hölker et al (1997- 1999) determino la actividad alcalina y quelante alta, además dos clases de actividad enzimática: hidrolitica de solubilización del carbón y lignolitica de la degradación de los ácidos húmicos por parte de T. atroviride
Paecilomyces sp. (morfotipos HC09;HC24)
CU: Cepa HC24; CUS: Cepa HC09
Kluczek et al, (2005) reporto la identificación de Paecilomyces infltus, detectando la activida de enzimas lacasas, indicadas por la modificación de las estructuras del carbón expuesto.
Basidiomicetes (HC18; HC28;HC30)
CU Cohen et al, (1982-1986-1987) reportaron 2 hogos Poria montícola y Trametes versicolor, Solubilización de carbón lignito por acción de un complejo enzimático. (Enzimas extracelulares). Pyne et al, (1987). Wondrak et al, (1989) Actividad enzimática (lignina peroxidasa ) para mediar la dispersión de la macromolécula de carbón sub-bituminoso y lignito monitoreado por cromatografía
Levaduriformes (HC34;HC39)
C Cohen y Gabrielle (1990) evaluaron géneros de levaduras en medios enriquecidos con polvo de hulla.
Mucor sp.(HC25; HC26) CU Fischer et a,l (1997) identificación del crecimiento micelial de Mucor sp. sobre carbón lignito.
Morfotipos: HC4; HC14; HC20; HC34; HC38; HC42, HC43
C Los 7 morfotipos de hongos en cuanto a su crecimiento en Agar Carbón fue óptimo, pero al evaluar
60
el mecanismo de solubilización, los morfotipos no utilizaron las partículas de carbón.
6.3 EXTRACCIÓN DE SUSTANCIA HÚMICAS A PARTIR DE CARBÓN
METEORIZADO DEL CERREJÓN:
Las mejores condiciones para la extracción se obtuvieron con NaOH
0,5M en una relación 1/10 (peso de carbón/volumen de extractantes) con
un tiempo de extracción de 4 horas a 95ºC alcanzando un rendimiento
del 23%. Así se comprueba que el carbón con el que se trabajo
efectivamente contenía sustancias que pueden ser solubilizadas.
61
7. CONCLUSIONES
Se lograron aislar y caracterizar a partir del protocolo de aislamiento y
las muestras recolectadas de áreas influenciadas por la extracción minera
de “EL CERREJON” Guajira- Colombia, 3 morfotipos de hongos con
capacidad solubilizadora de carbón de bajo rango, correspondientes a
Paecilomyces sp., Trichoderma sp., y Penicillium sp.
A partir de las 11 muestras ambientales obtenidas de las zonas con
influencia de la mina “El Cerrejón” se aislaron 137 morfotipos fúngicos, las
muestras con predominio de materia orgánica, desarrollo de cubierta
vegetal, aportaron mayor número de morfotipos fúngicos.
De las técnicas de aislamiento utilizadas, la técnica diluciones seriadas
fue más efectiva aportando 80 morfotipos fúngicos.
A través del crecimiento en Medio Carbón se lograron seleccionar 37
morfotipos fúngicos con crecimiento abundante y medio, lo que indica que
presentan capacidad de utilizar el carbón como fuente de carbono y
energía. logrando identificar géneros: Aspergillus sp., Penicillium sp.,
Mucor sp., Trichoderma sp., Paecilomyces sp., Cladosporium sp.,
morfotipos levaduriformes y Basidiomicete.
Los morfotipos correspondientes a: HC09 Paecilomyces sp., HC19
Penicillium sp., HC27 Trichoderma sp., lograron solubilizar la partícula de
carbón, evidenciado en la presencia de gotas de color café en las zonas
del crecimiento fúngico en contacto con el carbón.
De las prueba de solubilización de carbón de bajo rango la muestra de
carbón tipo 1 presento mayor resistencia al ataque fúngico, relacionado
con la textura (más dura en relación a la muestra de carbón tipo 2),
mayor grado de carbonificación y estructura química más compleja.
62
24 morfotipos fúngicos lograron utilizar el carbón como sustrato para la
obtención de moléculas orgánicas para su crecimiento.
63
8. RECOMENDACIONES
Para la obtención de mayor diversidad de morfotipos fúngicos es
importante utilizar técnicas de aislamiento por preenriquecimiento
y diluciones seriadas, para muestras ambientales influenciadas por
la actividad minera.
Al evaluar la solubilización de carbón de bajo rango en solido
utilizar partículas con rangos de tamaño diferentes, evaluando las
condiciones que favorecen la transformación de las partículas de
carbón y realizar un lavado eficiente de las partículas de carbón
pretratadas con acido nítrico.
Realizar investigaciones posteriores para determinar la capacidad
de transformación del carbón de bajo rango mediante procesos
diferentes a la solubilización determinando la capacidad de
producción de sustancias húmicas.
64
BIBLIOGRAFIA
1. Becerril, J. M., Especies nativas de suelo contaminados por
metales: Aspectos ecofisiologicos y su uso en fitorremediacion.
Ecosistemas revista científica y técnica de ecología y medio
ambiente. 2007-2.
2. Bumpus J. Regulation of coal polymer degradation by fungi.
Departamento de química, Universidad de Northern lowa. 1998. p
7- 11.
3. Burbano, O. H. La materia Orgánica: Origen, propiedades y su
relación con la calidad/salud del suelo. Memorias, Noveno
congreso colombiano de la ciencia del suelo. p. 161-186. Paipa
Colombia. 1998.
4. Cabrera, A. Producción, caracterización y pruebas agronómicas de
ácidos húmicos producidos con carbones Colombianos. Industrias
Tecsl Ltda. Santa fe de Bogotá. Colombia. 1998.
5. Calderón, A. Presidencia carbones Colombianos del Cerrejón S.A.
Proexport Colombia. 2008.
6. Carrillo, E. Aislamiento, identificación y evaluación de un cultivo
mixto de microorganismos con capacidad de degradar DDT.
Revista Internacional de Contaminación Ambiental. Departamento
de ingeniería y metalurgia, Universidad De Sonora. Sonora Mexico.
p. 69-75, 2002.
7. Campbell, J. A., Fredrickson, J. K., Stewart, D. L., Pyne, J. W.,
Wilson, B. W., Bean, R. M., and Cohen, M. S., Application of model
compounds to the study of microbial degradation, Abstracts of the
ACS Meeting, New Orleans, Aug. 30Sept. 4, 1987.
65
8. Cohen, M. S., and Gabriele, P. D., Degradation of coal by the fungi
Polyporous versicolor and Poria monticola, Appl. Environ. Microbiol,
p 44, 23 (1982).
9. Cohen, M. S., Aronson, H., and Gray, E. T., Jr., Degradation of
lignite coal by Polyporus versicolor: initial characterization of
products, in Proceedings of the Direct Liquefaction Contractor's
Review Meeting, U.S. Department of Energy, Washington, D.C.,
1986, p. IV48.
10. Cohen, M. S., Liquefaction of coal by Polyporus versicolor, in
Proceedings of the Biological Treatment of Coals Conference,
Idaho National Engineering Laboratory and U.S. Department of
Energy, Washington, D.C., 1987.
11. Chung, K. E., and Goldberg, I. B., Chemical structural differences
between two low-rank coals, in Proceedings of the EPRI 11th
Annual Conference on Clean Liquid and Solid Fuels, Electric Power
Research Institute, Palo Alto, Calif., 2, 83121, 1988
12. Díaz M. Aislamiento de hongos resistentes a metales pesados a
partir de desechos mineros y su capacidad de remoción de metales
y flúor en solución. Centro de investigaciones y de estudio de
postgrado. Facultad de ciencias químicas. San Luis potosí, mexico.
2000.
13. Elbeyli, I., Palantoken, A., Piskin, S., Kuzu, H. y Peksel, A.
Liquefaction/Solubilization of Low-Rank Turkish Coals by White-Rot
Fungus (Phanaerochete chrysosporium). Energy Sources, 2006. p
28 :1063-1073.
14. Faison, B. D., and Kuster, T. A., Localization of ligninase protein in
Phanerochaete chrysosporium, in Proceedings of the 8th
66
Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals (C. D. Scott,
ed.), Wiley, New York, 1986, p. 261.
15. Fakoussa R. y Frost, P. In vivo-decolorization of coal-derived humic
acids by laccase-excreting fungus Trametes versicolor. Appl
Microbiol Biotechnol, 1999. p 52: 60-65,
16. Fakoussa, R. M., Coal as a substrate for microorganisms:
investigation with microbial conversion of national coals, Ph.D.
thesis, Freidrich-Wilhelm Universität, Bonn, 1981.
17. Gokcay, C., Kolankaya, N. y Dilek, F. Microbial solubilization of
lignites. Turquia. 2001, p 80:1421-1433.
18. Gonzales, G. Métodos básicos en el laboratorio de micología,
Identificación de hongos filamentosos. Departamento de
microbiología, Facultad de Medicina. Universidad Autonoma de
Nueva león. México D.F. 2005.
19. Grinhut, T., Hadar, Y. y Chen, Y. Degradation and transformation of
humic substances by saprotrophic fungi: processes and
mechanisms. Fungal Biology Reviews, Israel, 2007. p 2I: 179-189.
20. Hofrichter, M., Fritsche, W. Depolymerization of low-rank coal by
extracellular fungal enzyme systems. II. The ligninolytic enzymes of
coal-humic-acid-depolimerizing fungus Nematoloma frowardii b19.
Appl Microbiol Biotechnol, 1997. p 419-424.
21. Hofrichter, M., Fritsche, W., Bublitz F. II solubilization of low-rank
coal by filamentous fungi. Alemania, 1997. p 55-64.
22. Hofrichter M., Fakoussa R., Microbial degradation and modification
of coal. Departamento de química y microbiología, Universidad de
Helsinki. Finlandia. 2000. p 393- 407.
67
23. Holker. U., Schmiers H., Grobe S., Winkelhofer M., Polsakiewicz
M., Ludwig S., Dohse J., Hofer M. Solubilization of low-rank coal by
Trichoderma atroviride: evidence for the involvement of hydrolitic
and oxidative enzymes by usig 14C- labelled lignite. 2002. p 207-
212.
24. Laborda, F., Fernandez, M., Luna, N y Monistrol, Lf. “Study of the
mechanisms by which mircoorganisms solublilize and/or liquefy
Spanish coals”. Fuel Processing Technology, 1997. p 35-107.
25. Machnikowska, H., Pawelec, A. and Podgorska, A. Microbial
degradation of low rank coals. Fuel Processing Technology 2002. p
77– 78:17–23.
26. Martín C., Linares L. Tratamientos Biológicos De Suelos
Contaminados: Contaminación Por Hidrocarburos. Aplicaciones De
Hongos En Tratamientos De Biorrecuperación. Revista
Iberoamericana De Micología. 2004. Departamento De
Microbiología Molecular-CIB-CSIC. p 103-120.
27. Ministerio de Minas y Energía. Instituto Colombiano de Geología y
Minería. El carbón colombiano recursos, reservas y calidad. p 5-7.
Santafé de Bogotá D.C., Colombia.
28. NutraNetics, Inc. Humic Acid Structure and Properties. Nutranetics
ProBio Systems. Junio 2000.
http://www.phelpstek.com/resources/pdfs/humic_acid.pdf
29. Oboirien B., Burton S., Cowan D., Harrison S. The effect of the
partuculate phase on coal biosolubilisation mediated by
Trichoderma Atroviride in a slurry bioreactor. 2008. p 123-130.
68
30. Polman J., Stoner D., Delezene K. Bioconversion of coal, lignin,
and dimethoxybenzyl alcohol by Penicillium citrinum. Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology. 1994. Vol. 13 Number 5,
p 292-299
31. Pyne F., Stewart, D., Fredrickson, J. y Wilson, B. Solubilization of
leonardite by an Extracellular fraction from Coriolus versicolor.
1987. Vol. 53, nº 12, p 2844-2848.
32. Pokorný R., Olejíková P., Balog M., Zifcák P., Holker U., Janssen
M., Bend J. Characterization of microorganisms isolated from lignite
excavated from the Záhorie coal mine (southwestern Slovakia).
Eslovaquia, 2005. p 932- 943.
33. Ralph, J. y Catcheside, D. Transformations of low rank coal by
Phanerochaete chrysosporium and other wood-rot fungi. Fuel
Processing Technology. 1997. p 79-93.
34. Reiss, J. Studies on the solubilization of German coal by fungi.
Appl Microbiol Biotechnol., Alemania. 1992. P 37(6): 830-832.
35. Rivera M., Ferrera R., Volke V., Rodriguez R., Fernandez L.
Adaptación Y Selección De Microorganismos Autóctonos En
Medios De Cultivos Enriquecidos Con Petróleo Crudo. Publicado
En Terra, Instituto Mexicano Del Petróleo. México D.F. 2002. p
423-434.
36. Scott, C. D., and Strandberg, G. W., Microbial coal liquefaction, in
Proceedings of the Direct Liquefaction Contractor's Review
Meeting, U.S. Department of Energy, Washington, D. C., 1986, p.
IV65.
69
37. Silva M., Caryn J., Burton S., Cowan D. degradation of low Rank
coal by Trichoderma atroviride ES11. Society for industrial
microbiology. 2007 p 625-631.
38. Strandberg, G. y Lewis, S. Microbial Solubilization of Coal. United
States of America. 1990.
39. Tao, X., Pan, L., Shi, K., Chen-H., Yin, S. y Luo, Z. “Bio-
solubilization of Chinese lignite I: extra-cellular protein analysis”.
Mining Science and Technology, 2009. p19: 358-362.
40. Ward, B., Lignite-degrading fungi isolated from a weathered
outcrop, Syst. Appl. Microbiol., 1985. Vol. 6, Nº 2 Pag. 236 - 238.
41. Ward, B., Coal solubilizing fungi, in Proceedings of the EPRI First
Annual Workshop on Biologic Processing of Coal, Electric Power
Research Institute, Palo Alto, California. 1998. p. 1316.
42. Wengel M., Polman J. Degradation of organic matter from black
shales and charcoal by the wood-rotting fungus Schizophyllum
commune and release of DOC and heavy metals in the aqueous
phase. 2006. p 383–393.
43. Willmann G., Fakoussa R. Extracellular oxidative enzymes of coal
– attacking fungi. Alemania. 1997 p 27- 41.
44. Willmann, G. y Fakoussa, R. Biological bleaching of water-soluble
coal macromolecules by a basidiomycete strain. Appl Microbiol
Biotechnol. 1997. p 95-101.
45. Wilson, B. W., Bean, R. M., Franz, J. A., Thomas, B. L., Cohen, M.
S., Aronson, H., and Gray, E. T., Jr., Microbial conversion of low-
70
rank coal: characterization of biodegraded product, Energy Fuels.
1987.
46. Wilson, B. W., Pyne, J. A., Bean, R. M., Fredrickson, J. A., Stewart,
D. L., Sass, E., Burnside, M., and Cohen, M. S., Microbial
beneficiation of low-rank coals, in Proceedings of the EPRI 11th
Annual Conference on Clean Liquid and Solid Fuels, Electric Power
Research Institute, Palo Alto, California, 1988.
47. Wise, D. Bioprocessing and Biotreatment of Coal. CRC Press, New
York, 1990. Primera edición, p1-23
48. Yuan, H., Yang, J. y Chen, W. Production of alkaline materials,
surfactants and enzymes by Penicillium. Science Direct, 2006. p
85(10-11): 1378-1382.
71
72
