UNIDAD DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE ALIMENTOS   UNIDAD DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE ALIMENTOS   MaestríaenCienciasenIngenieríaBioquímica

Aislamiento y Selecciónde Levaduras para la Producción de Etanol durantela Fermentación Espontánea de Jugo de Sorgo Dulce

Presenta:Dra. Ma. Guadalupe Aguilar Uscanga

Colaboradores:Díaz‐Nava L.E., Partida‐Sedas G.,

Uribe‐Gómez S., Rebolledo‐García R.E.,Gómez‐Rodríguez J., Montes‐García N.

3erCongresoNacionaldeInvestigacióndelCambioClimáticoenMéxico

Sitúan a los biocombustibles líquidoscomo una alternativa energética renovable

Almodares et al ., 2008

Fuente alternativa de energía por contribuir a lareducción del efecto invernadero

Bioetanol, alcohol derivado de materialesbiológicos, actualmente empleado directamentecomo combustible o como un añadido a la gasolinaen distintas concentraciones.

El bioetanol constituye alrededor del 90% delbiocombustible producido a escala mundial.

Almodares et al ., 2008 ; SAGARPA, 2011

Número de octanosy promueve una mejorcombustión

Emisiones contaminantes

Glucosa Glicolisis

2 ADP 2 ATP

2 Piruvato

Piruvato Descarboxilasa

2 CO2

2 Acetaldehído

2 NAD+ 2 NADH + H+

Alcohol Deshidrogenasa

2 Etanol2 Piruvato

Y P/S = 0.51 g/g

Bioquímica 3ª Edición. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educación S.A.

Diferentes materias primas ricas en:• Azúcares (caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo dulce)•Almidones (trigo, maíz, cebada, yuca)•Celulosa (desechos agrícolas, forestales y municipales)

Bueno et al. , 2009

Familia Gramíneas

Altura aprox. De 1 a 3 metros(dependiendo subespecie)

Cultivo Comparable con la Caña deAzúcar

Alto contenido de azúcares

Cosechar varias veces al año

Más resistentes a la sequía, salinidade inundaciones

Almodares et al. 2009

Sorgo UsoSorgo grano Alimento para humanos

y animales domésticos

Sorgo forrajero Forraje para Ganado

Sorgo Dulce(Jugo)

Producción de etanol, azúcar, jarabes

Sorgo de alta biomasa Biomasa lignocelulósicapara la producción deetanol

Bueno et al.  2009 ; Mamma et al., 1996 y Phowchinda et al., 1997

Tallo rico en azúcares fermentables (16-23%)

Tiene un periodo corto de crecimiento de alrededor 4-5 meses

Crece en zonas templadas

Toda la planta se puede utilizar (grano, tallo y jugo de biomasa

lignocelulósica)SacarosaGlucosaFructosa

53-85%

6-21%

9-33 %Composición de azúcares

simples en el jugo de sorgo dulce

Material BiológicoBacteriasHongosLevaduras

Modo de OperaciónLoteLote AlimentadoContinuos

Medio de CultivoFuente de CarbonoFuente de NitrógenoP,S,K,Mg

Condiciones AmbientalesTemperaturapHAireaciónAgitación

Y P/S Productividad

Productos Secundarios

Inhibición por Sustrato (altas concentraciones de azúcar)Inhibe el crecimiento celular y la actividad fermentativa

Incremento de la presión osmótica , disminuye la producción de Etanol

[ Glucosa ] 160 g/L

Ortiz Zamora, 2006;Martin et al, 2008; Ortiz Muñiz, 2010

Kyyper, 2006

Son capaces de utilizar una gran variedadde sustratos (glucosa, fructosa, sacarosa)

Son mas resistentes al etanol y presentanmayores rendimientos.

Ricas en esteroles, por lo que mantienenpor más tiempo su actividad fermentativa

Menos probable la contaminación porbacterias acido lácticas

Fácil propagación Acido TolerantesGenéticamente estables Tolerantes a EtanolResistentes a compuestos Tóxicos OsmotolerantesCapaz de utilizar varios sustratos Termotolerantes

Resistentes a bajos pH Actividad killerDeficiencia Respiratoria

Panchal, 1990 y Hutter y Oliver, 1998

Reed et al. 1998; Walker, 1998

Osmotolerancia

Capacidad que tienen las levaduras para crecer en unmedio con altas concentraciones de azúcares

[ Azúcares ] 250 g/L Vel. De Producción de Etanol

Salcedo, 2008

Levaduras Aisladas de Melaza de Caña de Azúcar

Velocidad de CrecimientoOsmotolerancia Tolerancia EtanolProducción de Etanol

9 Cepas

[ Etanol ] 5-10 % v/v[ glucosa ] 24 % p/v

Aislamiento y Selección

Ortiz-Zamora, 2006

Criterios de Selección

Osmotolerancia Tolerancia EtanolProducción de EtanolActividad Killer

5 Cepas

[ Etanol ] 5-7 % v/v[ glucosa ] >20% p/v

Aislamiento e Identificación

Fuente de Aislamiento

Método de Identificación de Levaduras Microorganismos Referencia

Cacao Amplificación de las regionesITS1-5.8S-ITS2

•Saccharomyces spp.•Pichia spp.

•Candida spp.Modad en curso

Agave Amplificación de las regionesITS1-5.8S-ITS2 •Saccharomyces cerevisiae Segura et al. 2010

Vinos austriacos Secuenciación de la región D1/D2 del gen 26 S rRNA •Saccharomyces cerevisiae

•Saccharomyces bayanusLopandic et al. 2008

Cerveza de sorgo Secuenciación de la región D1/D2 del gen 26 S rRNA

•Saccharomycescereviseiae

•Kluyveromyces maxianusMaoura et al. 2005

Caña de azúcar Taxonomía convencional•Schizosaccharomyces pombe

•Saccharomyces cerevisiae•Kluyveromyces maxianus

Fundora et al. 2005

Microorganismo usado en la Fermentación

Rendimiento de Etanol(g/g )

Eficiencia(%) Referencia

Saccharomyces cerevisiae CFTR 01 y SG 0.39-0.48 76-94 Ratnavathi et

al. 2010

Saccharomyces cerevisiae 0.42-0.45 82-90 Balint Sipos et al. 2009

Saccharomyces cerevisiae TISTR5048 0.42-0.48 82-94 Laopaiboon et

al. 2007Saccharomyces cerevisiae (Nanyang) 0.43-0.46 84-91 Liu et al. 2008

Rendimiento Teórico Y P/S = 0.51 g/g

Producción de etanol a partir de jugo de sorgo dulce

• Fermentaciones alcohólicas espontáneas no se deben a una única cepa delevadura, sino que es el resultado de la acción combinada de diversas especies deestas.

•Se sabe que es mas efectivo el uso de cultivos autóctonos de levaduras ya que seencuentran adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima afermentar

•Debido a la problemática que existe en el proceso de fermentación alcohólica : lainhibición por sustrato; aislar y seleccionar levaduras procedentes de lafermentación del jugo de sorgo dulce que contrarresten estos efectos, permitiráoptimizar e impulsar a una mejora progresiva en el rendimiento y productividad delproceso.

Aislar y Seleccionar Cepas de Levaduras Productoras de Etanol Durante la Fermentación

Espontánea del Jugo de Sorgo Dulce

Aislar cepas de levaduras productoras de etanol durante la fermentación espontánea de jugo de sorgo dulce

Seleccionar las cepas de levaduras que presenten osmotolerancia para la producción de etanol

Caracterizar el jugo, obtenido a partir de las diferentes variedades de sorgo dulce

21 variedades de Sorgo dulce de ALTA y BAJA densidad

poblacional

•Volumen de jugo•pH•°Brix•Azúcares totales

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

9 ml H2O

1x 10 -4 mL1x 10 -5 mL

Componente g/L

Extracto de Levadura 10

Glucosa 20Agar 25

Antibiótico 0.1

Medio Cultivo Sintético de Aislamiento

Diferentes variedades de sorgo dulce

36 h30°C

250 rpm

Selección PrimariaEtanol Y P/S > 0.35 g/g

Eficiencia 70%

Selección SecundariaOsmotolerantes ( 100,150, 200, g/L )

Glucosa

Componente g/LExtracto de Levadura 1

Glucosa 50KH2PO4 (fosfato monobásico) 5

(NH4)2SO4 (sulfato de amoniaco) 2MgSO4·7H2O (sulfato de

magnesio) 0.6

Medio Cultivo Sintético

Caracterización

21 Variedades De Alta Densidad

Tratamiento Variedades de Sorgo dulce

Volumen de Jugo (mL) Alta Densidad

Azúcares totales (g/L)

Volumen de Jugo (mL) Baja Densidad

Azúcares totales (g/L)

T2 RB- CAÑERO 378.3 27.3 303.3 26.9T3 ETANOL-1 926.7 87.2 686.7 85.1T4 ETANOL-2 933.3 96.7 730.0 66.2T5 DALE 893.3 138.5 620.0 78.8T9 SBA-25 610.0 81.2 546.7 48.3T10 SBA-22 390.0 51.0 240.0 31.7T11 SBA-25XURJA 670.0 79.4 660.0 56.6T12 SBA-25XSUREÑO 800.0 61.4 593.3 27.2T13 SBA-25XTAN-1 686.7 92.3 495.0 41.9

T14 SBA-25XCAÑERO 566.7 24.5 450.0 15.4

T15 SBA-25XDALE 596.7 73.8 765.0 39.0T16 SBA-25XTOPPER 793.3 74.9 576.7 41.6T17 SBA-25XTHEIS 770.0 56.8 615.0 63.5T19 SBA-22XTAN-1 970.0 85.6 536.7 105.6T20 SBA-22XDALE 725.0 89.4 590.0 81.8T21 SBA-22XCAÑERO 766.7 32.7 466.7 29.8T22 SBA-22XTAN-2 760.0 57.3 570.0 50.5T23 SBA-22XDULCE 560.0 47.6 373.5 30.5T24 SBA-22XSUREÑO 695.0 20.9 405.0 67.7T25 NORTEÑO 390.0 25.7 480.0 13.4T26 HUASTECO 575.0 47.6 470.0 56.0

Azúcares Totales 50-140 g/LVolumen 600-900 mL

pH 5.45-5.55

AISLAMIENTO

60 CEPAS

Fermentación Espontánea De Jugo De Sorgo Dulce

[Etanol] 6 g/L a partir de 20g/L de glucosa

SELECCIÓN

60 CEPAS Etanol Y P/S > 0.35 g/gEficiencia 70% 22 CEPAS

SELECCIÓN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

S1 S2 S5 S6 S8 S11 S16 S17 S18 S19 S23 S26 S27 S30 S35 S41 S42 S43 S44 S49 S51 S64

Y P/

S (g

/g)

CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL

Etanol Y P/S = 0.35-0.38 g/g

Etanol Y P/S = 0.4 g/g6 CEPAS

OSMOTOLERANCIA

CEPA% Conversión de Glucosa

CEPA% Conversión de Glucosa

100g/L 150 g/L 200 g/L 100g/L 150 g/L 200 g/L

S1 74.28 52.62 32.85 S26 71.49 49.65 32.41

S2 95.49 49.76 32.20 S27 74.20 50.18 30.02

S5 75.31 52.46 31.09 S30 74.01 50.19 32.56

S6 70.61 53.92 31.47 S35 71.37 49.81 31.90

S8 73.25 53.26 29.50 S41 75.87 51.27 33.45

S11 71.64 51.47 29.67 S42 76.04 52.53 36.36

S16 74.14 51.14 34.94 S43 72.10 51.22 32.33

S17 72.93 49.98 31.51 S44 71.51 50.62 29.97

S18 75.55 54.41 33.03 S49 27.47 18.77 21.65

S19 73.09 53.06 29.50 S51 24.35 29.27 17.31

S23 38.51 46.92 16.29 S64 54.77 35.13 22.08

18 CEPAS

OSMOTOLERANCIA

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

S1 S2 S5 S6 S8 S11 S16 S17 S18 S19 S23

QP

(g/L

h)

CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

S26 S27 S30 S35 S41 S42 S43 S44 S49 S51 S64

QP

(g/L

h)

CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL

Efecto de la concentración inicial de glucosa sobre la productividad de etanol

Glucosa (g/L): 100 (), 150 (), 200 ()

QP (g/Lh) ≈ 0.8 g/g [GLUCOSA] QP

Ortiz-Zamora et al. (2007)

•El jugo de las variedades de alta densidad de sorgo dulce evaluado, contiene altasconcentraciones de azúcares fermentables (50-140 g/L), pH que se encuentran entre los5.45-5.55 los cuales favorecen el proceso de fermentación alcohólica además de poseeruna gran fuente de cepas con potencial para utilizarse en la producción de bioetanol

•60 cepas se aislaron ,de las cuales 22 de ellas obtuvieron rendimientos por arriba del0.35 g/g en cuanto a la producción de etanol

•Se evaluó la osmotolerancia en las 22 cepas seleccionadas a diferentes concentracionesde glucosa, 18 cepas presentaron características osmotolerantes hasta los 200 g/L desustrato inicial, lo cual resulta de gran interés para la producción biotecnológica debioetanol, sin embargo se deben realizar otros trabajos para el mejoramiento del proceso.