UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Departamento de Ciencias Biológicas Sección de Bioquímica y Farmacología Humana

Licenciatura en Bioquímica Diagnostica. Asignatura: Toxicológica Grupo: 2701 Equipo: 7

Fecha de realización de la práctica: 19/04/13 Fecha de entrega del reporte: 26/04/13

“Determinación cualitativa de alcaloides en orina mediante los métodos de precipitación, Dragendorff, Mayer,

Bouchardat y Mandelin”

Alvarado Mendieta, AngélicaBs,1., Arellano Ugalde, XochitlBs,2., Campos García, VictoriaBs,3.

Bs1,2,3. Bachelor Students of Biochemistry.Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán. Av. 1° de Mayo, Col. Sta.

María las Torres Cuautitlán Izcalli, Estado de México CP.54740.

RESUMEN:Los alcaloides son uno de los grupos de metabolitos secundarios más diversos encontrados en los organismos biológicos. Los alcaloides se han reportado en varias familias vegetalesdel orden Gentianales. Químicamente se definen como compuestos químicos heterocíclicos donde el nitrógeno se encuentra unido al anillo intracíclico, derivados del metabolismo de aminoácidos, de carácter más o menos básico, de distribución restringida, con propiedades farmacológicas importantes a dosis bajas y que responden a reacciones comunes de precipitación. Lamentablemente estas sustancias se han usado con fines de abuso, por lo cual se determinan éstos en muestras biológicas como la orina. Existen pruebas presuntivas(Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Mandelin) que orientan sobre la presencia de alcaloides en distintas muestras biológicas, basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos ácidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, vanadio formando precipitados en la presencia de un alcaloide. De acuerdo a estas pruebas la muestra dio positivo a 2C-B, alcaloide análogo a DOB, relacionado en la mescalina y anfetaminas con efecto alucinógeno. Las determinaciones cualitativas han sido remplazadas por metodologías más exactas y precisas (p. ej. HPLC), sin embargo dentro del laboratorio de análisis siguen siendo utilizadas debido a su practicidad. PALABRAS CLAVE: Alcaloides, muestra biológica de orina, reacciones de precipitación, extracción orgánica.

SUMMARY:Alkaloids are one of most diverse groups of secondary metabolites found inbiological organisms. Alkaloids are present in several family plants from the Gentiales order. Chemically defined as chemical compounds where the heterocyclic nitrogen ring is attached to intracíclico, derivatives of amino acid metabolism, of a more or less basic, restricted distribution, with important pharmacological properties at low doses and respond to common reactions of precipitation.Unfortunately these chemicals have been used for purposes of abuse, whereby these are determined in biological samples such as urine. Guiding presumptive evidence (Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Mandelin) of the presence of alkaloids in various biological samples, based on the ability of alkaloid salt status (acidic extracts), combined with iodine and heavy metals such as bismuth, mercury, vanadium precipitates forming about the presence of an alkaloid.According to these tests the sample tested was positive for 2C-B, which is similar to DOB, related to mescaline and amphetamine with hallucinogenic effect. Qualitative determinations have been replaced by more accurate and precise methodologies (eg. HPLC), however within the analytical laboratory are still used because of their practicality. Keywords:Alkaloids, urine biological sample, precipitation reactions, organic extraction.

INTRODUCCIÓN

Desde el punto de vista químico, todos los alcaloides son compuestos nitrogenados, estando en la mayoría de los casos el nitrógeno formando parte de un heterociclo y en algunas ocasiones formando parte de una cadena abierta. Están constituidos además por carbono e hidrógeno, muchos llevan oxígeno, lo que les confiere una serie de propiedades físicas (sólida, cristalizable), y raramente suelen contener azufre. Se

derivan del metabolismo de los aminoácidos(Evans, 2000).

De acuerdo a las características de esta definición, algunos autores han dividido a los alcaloides en cuatro clases (Ver Figura 1: Esquema de la clasificación de los

alcaloides).

• Alcaloides verdaderos

• Protoalcaloides

• Pseudoalcaloides

• Alcaloides imperfectos

Alcaloides Verdaderos cumplen estrictamente con las características de la definición de alcaloide: son formados a partir de aminoácidos, tienen siempre un nitrógeno intracíclico, son de carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal(Grau, 2005).

Protoalcaloides son aminas simples con nitrógeno extracíclico, de carácter básico y son productos del metabolismo de los aminoácidos(Grau, 2005).

Pseudoalcaloides presentan algunas de las características de la definición de alcaloide, pero no son derivados de aminoácidos (Huang 2006).

Alcaloides imperfectos son derivados de bases púricas, no precipitan con los reactivos específicos para alcaloides. No son alcaloides los aminoácidos, las betalaínas, los péptidos, los amino azúcares, las vitaminas nitrogenadas, las porfirinas, algunas bases como la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos y los alkil aminas de bajo peso molecular (Guinaudeau, 2005)

Figura 1: Esquema de la clasificación de los alcaloides (Grau, 2005).

En cuanto a su estado natural, los alcaloides son esencialmente sustancias presentes en todos los órganos de la planta, pueden encontrarse mayoritariamente en hojas (cocaína, nicotina, pilocarpina), en flores (escopolamina, atropina), en frutos (alcaloides del opio, peletiarina, coniina), en semilla (piperina, arecolina), en corteza (quinina, tubocurarina), en la raíz (emetina y cefalina).La función de los alcaloides en las plantas no es aun clara, existen

algunas sugerencias sobre el “rol” que juegan estas sustancias en los vegetales(Guinaudeau, 2005) como:

Sirven como productos de desecho o almacenamiento del nitrógeno sobrante, esta función es equivalente a la del ácido úrico o de la urea en los animales(Guinaudeau, 2005).

Debido a que en su mayoría, los alcaloides son asociados con ácidos orgánicos que le facilita el transporte en la planta, pueden servir como productos de almacenamiento del nitrógeno no metabolizado o para transporte del mismo; en el caso de las Solanaceas midriáticas, los ésteres del tropano se forman en las raíces y son transportados a las partes aéreas donde pueden ser hidrolizados(Guinaudeau, 2005), (Huang 2006).

Los alcaloides pueden servir de reguladores del crecimiento, se ha demostrado que los alcaloides derivados de la putrescina se incrementan notablemente durante la germinación de algunas plantas como la cebada, cuando se encuentran en suelos deficientes de potasio(Huang 2006).

De acuerdo a su propiedades fisicoquímicas, insolubles o muy poco solubles en agua, pero se disuelven bien en alcohol, éter, cloroformo u otros solventes orgánicos, se basa el método general de extracción orgánica(Cortes, 2007).

La extracción en ampolla es aplicable a material líquido o en general, toda sustancia líquida o posible de ser solubilizada fácilmente. En el extracto éter alcalino se encontrarán la mayoría de los alcaloides, mientras que en el extracto cloroformo alcalino se encontrarán a la morfina, estricnina, brucina y atropina(Pendell, 2002).

Las técnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos ácidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, vanadio y iones I2 formando precipitados; estos ensayos preliminares se pueden realizar en el laboratorio o en el campo(Cortes, 2007).

En el presente estudio se evalúo la presencia de alcaloides en una muestra biológica, orina, mediante su tratamiento previo de extracción orgánica con éter etílico para posteriormente someterla al análisis cualitativo de las reacciones de precipitación.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

Tabla 1:Resultados experimentales de las reacciones de precipitación presuntivas para alcaloides. (Los extractos son EE1=extracto etéreo 1, EE2=extracto etéreo 2 y EC=extracto

clorofórmico)

Figura 2. Muestra de orina, aspecto turbio, color: Voguel II, abundantes sedimentos.

Figura 3. Resultados de las pruebas de precipitación. EE1: Extracto Etéreo 1; EE2: Extracto Etílico 2 y EC:

Extracto clorofórmico

Pruebas presuntivas Extracto Dragendorff

+/- Mayer

+/- Boucharda

+/-t Mandelin

+/- Alcaloide

EE1 - - - + 2C-B

EE2 - - - + 2C-B

EC - - - + 2C-B

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Puesto que los alcaloides son compuestos de carácter básico, su solubilidad en los diferentes solventes varía en función del pH, es decir según se encuentre en estado de base o de sal(Pendell, 2002).

En forma de base, son solubles en solventes orgánicos no polares como benceno, éter etílico, cloroformo, diclorometano, acetato de etilo(Pendell, 2002).

En forma de sales, son solubles en solventes polares agua, soluciones ácidas e hidroalcohólicas(Pendell, 2002).

De una muestra de orina se realizaron extracciones con diferentes solventes y reactivos para obtener los alcaloides de manera libre y posteriormente poder identificarlos.

En primer lugar se realizó una extracción ácida. Con ésta se eliminan las proteínas del medio, los alcaloides quedan solubles en la fase etérea. La segunda extracción es de carácter básico.

Puesto que los alcaloides son compuestos de carácter básico, su solubilidad en los diferentes solventes varía en función del pH, es decir se encuentre en estado base o sal. Las bases se encuentran solubilizadas en éter etílico y cloroformo(Arango, 2008).

La extracción se basa en el carácter básico de los alcaloides y en el hecho de su existencia como sales de ácidos orgánicos o como recombinaciones solubles en otras sustancias (Arango, 2008).

Por último se realizó una purificación de la fase orgánica con la finalidad de eliminar todas las partículas que pudieran interferir con los resultados en las pruebas de precipitación, se llevó a cabo la

extracción con cloroformo y lo que se obtuvo de la fase acuosa se evaporó casi a sequedad.

Para la identificación de alcaloides se utilizaron 4 pruebas de precipitación con los extractos etéreos 1 y 2, y con la fase clorofórmica evaporada.

Las técnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos ácidos) de combinarse con el yodo y metales pesados (Arango, 2008).

El reactivo de Dragendorff es una mezcla de Yoduro de potasio y de nitrato de bismuto, se detecta el alcaloide al producirse una coloración naranja-rojiza (Marcano, 2002). No obtuvimos un precipitado de éstas características en los 3 extractos, lo que indica ser negativo para morfina y papaverina (entre otros) en el paciente (Wagner, 2009).

En la reacción de Mayer precipitan los alcaloides (los clorhidratos) en forma de sales en medio básico. El yoduro de potasio y el bicloruro de mercurio junto con el alcaloide forman un precipitado blanco que es soluble en ácido acético y etanol (Marcano, 2002). Para los tres extractos el resultado fue negativo; la prueba de Mayer se realiza para identificar morfina, cocaína, heroína, entre otros (Burgot, 2012).

El ión triyoduro presente en el reactivo de Bouchardart reacciona con los alcaloides formando un precipitado color rojo-naranja en medio ácido. Nuevamente obtuvimos resultados negativos al no presenciar la formación de éste precipitado podemos asegurar que el paciente no consume morfina (Bell, 2004)

Finalmente se sometieron los extractos obtenidos a la prueba de Mandelin para detectar anfetaminas (entre otras sustancias como la cocaína, heroína, codeína, quinina, etcétera), es una reacción óxido-reducción que se da en medio ácido con vanadato de amonio (vanadio), el color que se revele al agregar el ácido es para diferenciar los alcaloides (Bell, 2004).

La coloración que resultó fue amarillo canario, siendo esta tonalidad característica de la droga 2C-B (DanceSafe).

La 2C-B (4-bromo-2,5-dimetoxifenilanfetamina) es un análogo estructural del DOB (presente en anfetaminas y mescalina) conocido como “after Turner” “toonies” y “nexus”. Causa un efecto de relajación del pensamiento en dosis bajas, si es en altas se presenta los cuadros de alucinaciones y estados de agitación(Fernández,

2009). Esta droga se une con los receptores de serotonina lo cual explicaría las alucinaciones (Rozas, 2009).

Como todas las pruebas son presuntivas los resultados del color no es suficiente para identificar una droga por lo cual se llegan a utilizar otro tipo de técnicas instrumentales (Bell, 2004).

CONCLUSIONES

Se logró identificar el alcaloide 2C-B en una muestra de orina mediante la reacción presuntivas de precipitación Mandelin. Por otro lado, en las demás pruebas no se obtuvieron resultados positivos al no encontrarse en el tipo de sustancias que detectan.

Este tipo de análisis son aplicados con el fin de obtener resultados rápidos y relativamente confiables en cuanto a la consumo de alcaloides de diversa índole.

REFERENCIAS

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Pendell, Dale.(2002). Phytochemistry and Pharmakodynamis: Stimulating Plants, Potions and Herbcraft: Excitantia and Empathogenica. San Francisco: Mercury House.

Rozas, R. (2009). Adicciones: información de sustancias. [enlínea]. SP. Madrid. <<http://www.portalsolidario.net/docu/2campos2.php=1&nombd=adicciones_sustancias=1>> Consultado 23/04/13.

Wagner, H. (2009). Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas. 2a ed. Springer, London, 22pp.