Alineamiento de secuencias O (m × n). Alineamiento de secuencias Dot-plot (Gibbs and McIntyre,...

Alineamiento de secuenciasO (m × n)

Alineamiento de secuencias

Dot-plot (Gibbs and McIntyre, 1970)


2.- Se escribe la secuencia A en la fila superior y la secuencia B (longitud = n) en la columna de la izquierda.

El algoritmo

3.- Se construye una matriz con m columnas y n filas (m n).

4.- Se compara cada letra de la secuencia A con cada letra de la secuencia B. Si coinciden los caracteres se marca esa posición con un punto. Si no, se deja en blanco.

1.- Se necesitan dos secuencias: A (de longitud = m) y B (de longitud = n).


Construcción de la matriz


Rellenado de la matriz


Características del dot plot

- Es un método visual que detecta todas las coincidencias posibles entre dos secuencias. Es tarea del investigador determinar cuáles son relevantes.

- No proporciona un alineamiento de las secuencias pero nos da una idea de qué regiones deberían estar alineadas después de utilizar cualquiera de los otros métodos y nos puede ayudar a decidir cuál es el alineamiento óptimo.

- Detecta relaciones entre las secuencias, o dentro de una misma secuencia que, de otra forma, serían muy difíciles de encontrar

Alineamiento de secuenciasSecuencia horizontal: gen/proteína c2 del fago P22Secuencia vertical: gen/proteína cI del fago

Como sólo hay 4 nucleótidos, aparecen muchas coincidencias por mero azar que generan ruido

DNA

Como hay 20 aminoácidos, hay muchas menos coincidencias por

azar y presenta mucho menos ruido

Proteína

DNA vs. proteína


Filtrado de los datos

Se puede eliminar el ruido mediante un filtrado- Secuencia horizontal: gen c2 del fago P22- Secuencia vertical: gen cI del fago

Sin filtrar Tras aplicar un filtro


Reducción del ruido: filtrado mediante ventanas deslizantes

Se colocará un punto en la posición correspondiente al centro de la ventana cuando entre ambas

ventanas exista, como mínimo, el número de coincidencias indicado

por el parámetro r.

La ventana deslizante se define mediante dos parámetros:

- TAMAÑO (t): es el número de símbolos que abarca la ventana. Suele ser 15 en el caso del DNA y 2 ó 3 en el caso de proteínas.

- RIGOR (r): es el mínimo número de coincidencias que debe haber entre las dos ventanas para colocar un punto en la matriz

(t = 11 y r = 7)

Ventanas deslizantes


Ejemplo de la reducción del ruido

Secuencia horizontal: gen c2 del fago P22

Secuencia vertical: gen cI del fago

(t = 1 y r = 1)

(sin filtrado)

(t = 11 y r = 7) (t = 23 y r = 15)


Valores apropiados para los parámetros de filtrado

En general, hay que utilizar una ventana del tamaño del elemento que quiero localizar

- Al comparar secuencias de ácidos nucleicos:

- Se utilizan ventanas largas y con rigor elevado (t = 15 y r = 10, por ejemplo)

- Al comparar secuencias de proteínas:

- Muchas veces no se filtra la matriz (t = 1 y r = 1).

- Si intento buscar dominios cortos con similitud parcial en secuencias largas usaré una ventana larga y un rigor medio (t = 20 y r = 5, por ejemplo)

- A la hora de filtrar se pueden utilizar matrices de puntuación o se puede tener en cuenta la similitud entre las cadenas laterales de los aminoácidos.

- Si se filtra, se utilizan ventanas cortas con un rigor muy pequeño: (t = 2 y r = 2), (t = 3 y r = 2)

Alineamiento de secuenciasSe coloca la secuencia A en la parte superior y la secuencia

B en el costado izquierdo. Se coloca un punto allí donde ambas coordenadas contengan un mismo símbolo.

Es un método visual que detecta rápidamente todas las coincidencias

- Las regiones similares aparecen como diagonales (puede haber más de una)

- Los indel provocan desplazamientos de la diagonal (en sentido vertical u horizontal)

- Las transposiciones y las secuencias repetidas aparecen como diagonales paralelas a la principal

- Las repeticiones inversas y las secuencias palindrómicas aparecen como líneas perpendiculares a la diagonal principal

- Las regiones con poca complejidad aparecen como regiones con una elevada densidad de puntos

Lo que se puede detectar con un dot-plot


Comparación de dos secuencias similares

(de DNA o de proteína), pero no idénticas


Dominios conservados

- La diagonal principal corresponde a las regiones similares que pueden alinearse

- Los huecos corresponden a las regiones que no son similares y que no podrían alinearse

Diagonal principal

Huecos- Con frecuencia, estas regiones corresponden a dominios proteicos conservados


Indels (insertion/deletions)

- Un indel provoca un desplazamiento de la diagonal

- El desplazamiento de la diagonal es paralelo a la secuencia que presenta la inserción

- Comparando cDNA con el DNA genómico, se pueden identificar los intrones y los exones

Región insertada


Secuencia repetida en tándem

Región repetida

Región repetida

Región repetida

- Una región repetida provoca un solapamiento en las diagonales


Repetición invertida o secuencia palindrómica

- Una repetición invertida o una secuencia palindrómica provoca una línea perpendicular a la diagonal


Comparación de una secuencia

consigo misma (de DNA o de proteína)


- Aparece una diagonal de lado a lado

- Hay simetría respecto a esa diagonal

- Las líneas paralelas a ambos lados de la diagonal corresponden a repeticiones de la secuencia.

- Las áreas con alta densidad de puntos son repeticiones cortas de un mismo nucleótido o aminoácido (regiones de poca complejidad)

- Se ve mejor con un filtrado

Comparación de una secuencia consigo misma (1)

- Las repeticiones invertidas o las secuencias palindrómicas aparecen como líneas perpendiculares a la diagonal principal

(Receptor LDL humano)

Alineamiento de secuenciasRegión de poca

complejidad

Comparación de una secuencia consigo misma (2)

Receptor LDL humano

(sin filtrar)

(t = 1 y r =1) (t = 23 y r =7)

Factor de transcripción

humano

Receptor LDL humano (filtrado)

Regiones repetidas

Repeticiones invertidas

(t = 1 y r =1)

Alineamiento de secuenciasProteína SLIT de Drosophila melanogaster

Secuencias repetidas

- En el extremo amino hay 4 regiones repetidas, ricas en leucina (A)

- Hay otro dominio que se repite unas 6 veces en un tramo pequeño y otra vez más cerca del extremo carboxilo (B). Es el dominio EGF.


Repetición en tándem

Repetición en tándem de un

fragmento de la secuencia

…ABCDEFGEFGHIJKLMNO…


En las repeticiones invertidas (inverted repeats), dos segmentos distintos de la doble hélice se leen igual, pero en sentidos opuestos:


5' AGAACAnnnTGTTCT 3'3' TCTTGTnnnACAAGA 5'



- Secuencias implicadas en la unión de los factores de transcripción

- Estructuras secundarias (stem-loop) del RNA (horquillas de terminación de la transcripción)

- Transposones de plantas

Las repeticiones invertidas se pueden encontrar en:

- Genes de retrovirus insertados en el genoma del huésped

- Genes duplicados

Alineamiento de secuenciasHorquilla de terminación en la secuencia del gen UTP-

glucosa-1-fosfato uridililtransferasa de Bacillus subtilis

- En las regiones con apareamientos locales (estructuras stem-loop) la secuencia directa coincide con la de la hebra complementaria escrita en sentido inverso



Secuencias palindrómicas

En las secuencias palindrómicas, la secuencia de una hebra se lee igual que la de su hebra complementaria:

5' GGCC 3'3' CCGG 5'


Secuencias palindrómicas

- Secuencias reconocidas por enzimas de restricción:

Las secuencias palindrómicas se pueden encontrar en:


Regiones con poca complejidad

Receptor LDL humano

- Las regiones de baja complejidad aparecen como zonas con una elevada densidad de puntos


Regiones con poca complejidad

Proteína P21997 (UniProtKB/Swiss-Prot)

- En las regiones de poca complejidad hay un aminoácido que se repite mucho más de lo normal. En este caso es la prolina.

- En el dot plot, estas regiones aparecen como cuadrados con una elevada densidad de puntos.


Comparación de una secuencia de proteína con

su gen de DNA


Identificación de los intrones y exones

- Secuencia horizontal: gen J05545.1 - Secuencia vertical: proteína P60204 (una calmodulina)

- Al comparar un gen con su producto proteico se pueden diferenciar los exones y los intrones.

* En rojo: exones.

* En azul: intrones.

- También se pueden diferenciar intrones y exones al comparar un cDNA, una EST (expressed sequence tag) o un mRNA con el DNA genómico


El programa Dotlet

http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/dotlet


El programa Dnadot

http://www.vivo.colostate.edu/molkit/dnadot/


El programa Dotter

Descárgate el programa (varias plataformas)

http://sonnhammer.sbc.su.se/Dotter.html


El programa Dottup

http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/dottup

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